JPH09503206A - ウイルス誘導腫瘍の予防及び治療用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ウイルス誘導腫瘍の予防及び治療用予防及び治療剤、特に、アスペルギルス発酵抽出液から誘導された組成物及び哺乳動物においてウイルス誘導腫瘍を予防及び治療するための直接のその使用又は製剤を調製するためのその使用。かかる腫瘍としては乳頭腫誘導腫瘍が含まれる。該組成物は局所投与される。

Description

【発明の詳細な説明】 ウイルス誘導腫瘍の予防及び治療用組成物発明の分野 本発明は、ウイルス誘導腫瘍を予防及び治療するための予防及び治療剤に関し 、特に、哺乳動物において乳頭腫ウイルス誘導腫瘍のようなウイルス誘導腫瘍の 予防及び治療用局所剤として有用なアスペルギルス (Aspergillus)発酵抽出液か ら誘導された組成物に関する。発明の背景 哺乳動物において腫瘍を誘導するウイルスは、極めて広範である。実際に、腫 瘍の発生を誘導することができるヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）だけで６８種類 を超える。これらのＨＰＶは普通のいぼのような良性腫瘍に付随したものもある が、感染した哺乳動物の口腔及び性器の異形成及びがん腫の病因として強く関係 したものもある。腫瘍を引き起こすことができる他の種類のウイルスとしては、 種々のＲＮＡウイルス及びヘルペスウイルスが挙げられる。 最近、後天性免疫不全症候群（エイズ）の感染者のような免疫系の低下した個 体が、全身に腫瘍増殖を引き起こすことがあるヒト乳頭腫ウイルス感染症にかか る傾向があり、罹患した個体に大きな精神的及び肉体的苦痛をもたらすことも見 出された。 ウイルス誘導腫瘍を治療するための現在の方法は、（１）外科的介在方法(レ ーザー又は手術);（２）氷酢酸及び／又はサリチル酸のような有機酸を塗布して 腫瘍を“焼く”方法；（３）摩砕した腫瘍から調製された抗腫瘍ワクチンを腫瘍 に注入する方法；及び小さい程度までは（４）薬剤治療の適用［例えば、ポドフ ィリン；インターフェロン及び５−フルオロ−２,４−（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミ ジンージオン；２,４−ジオキソ−５−フルオロピリミジン−フルオロウラシル 又は５−ＦＵとも呼ばれる］のいずれかによって腫瘍を取り除くことを含む。 現在用いられている治療法はウイルス誘導腫瘍を取り除くのに有効であるが、 次の欠点を１つ以上持っている:(１)健康な感染していない組織の破壊を引き起 こすことがある;(２)傷跡が残り外観を損じることがある;(３)治療される哺乳動 物を不快にすることがある；及び（４）周囲組織に維持される潜伏ウイルスＤＮ Ａの破壊を必ずしも引き起こさない。更に、これらの治療で患者は有意の全身性 副作用、不完全な回復及び腫瘍の頻繁な再発を受けた。 また、喉頭乳頭腫症腫瘍を取り除くために光線療法を用いることが開示された 。かかる光線療法は腫瘍増殖を約５０％まで減少させるが、少なくとも６週間全 身性皮膚光線過敏症を生じ他の重要でない反応も生じる。更に、この手法の見掛 けの成功にもかかわらず、潜伏ウイルスＤＮＡの存在はなお周囲組織に維持され ている。 米国特許第 5,073,630号には、抗ウイルス性、抗腫瘍性及び免疫刺激性を有す る高分子無水物又はマグネシウム及びタンパク質アンモニウムホスホリノエート が開示されている。この抗ウイルス剤は、選択アスペルギルス種系の無細胞ろ液 中で生産された。しかしながら、その化合物は、水に不溶でありかつ高分子量を 有する（３１６,０００ダルトン）。更に、その化合物の回収は問題がある。 従って、哺乳動物において健康な感染していない組織を破壊せず、有意の全身 性副作用を引き起こさず、治療された哺乳動物に傷跡を残さず外観を損じること がなく及び／又は不快にすることがなくかつ周囲組織に維持される潜伏ウイルス ＤＮＡの破壊を引き起こさないので、不完全な回復及び腫瘍の頻繁な再発の場合 を減じて、ウイルス誘導腫瘍を予防及び治療することができる予防及び治療用組 成物が依然として求められていることが認められる。更に、かかる予防及び治療 用組成物を提供する方法及び哺乳動物においてウイルス誘導腫瘍を予防及び治療 するためのかかる予防及び治療用組成物の使用方法が依然として求められている ことが認められる。発明の要約 本発明の主要な目的は、哺乳動物において健康な感染していない組織を破壊せ ず、有意の全身性副作用を引き起こさず、治療した哺乳動物に傷跡を残さず外観 を損じることなく又は不快にすることなくかつ周囲組織に維持される潜伏ウイル スＤＮＡの破壊をもたらすので、不完全な回復及び腫瘍の頻繁な再発の場合を減 じる、ウイルス誘導腫瘍を予防及び治療するための予防及び治療用組成物を提供 することである。 更に、本発明の主要な目的は、哺乳動物においてウイルス誘導腫瘍を予防及び 治療するための予防及び治療用組成物を供給する簡便で容易な方法を提供するこ とである。 更に、本発明の主要な目的は、哺乳動物において健康な感染していない組織を 破壊せず、有意の全身性副作用を引き起こさず、治療した哺乳動物に傷跡を残さ ず、外観を損じることなく又は不快にすることなくかつ周囲組織に維持される潜 伏ウイルスＤＮＡの破壊をもたらすので、不完全な回復及び腫瘍の頻繁な再発の 場合を減じる、ウイルス誘導腫瘍を予防及び治療する方法を提供することである 。 本発明の教示に従って、哺乳動物においてウイルス誘導腫瘍を予防及び治療す るための予防及び治療用組成物が開示される。これらの組成物は、健康な感染し ていない組織を破壊せず、有意の全身性副作用を引き起こさず、治療した哺乳動 物に傷跡を残さず、外観を損じることなく、不快にすることもない。更に、これ らの組成物は、周囲組織に維持される潜伏ウイルスＤＮＡの破壊をもたらすので 、不完全な回復及び腫瘍の頻繁な再発の場合を減じる。 これらの予防及び治療用組成物は局所用に適することが好ましい。 本発明の予防及び治療用組成物は、発酵抽出液及び／又はその誘導体であるこ とが好ましい。更に、これらの発酵抽出液はアスペルギルス発酵抽出液であるこ とが好ましい。好ましいアスペルギルス発酵抽出液は、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)発酵抽出液である。アスペルギルス・ニガー 1.2 AN29 及 びアスペルギルス・ニガー 1.2 AN39 発酵抽出液が特に好ましい。 更に、本発明の組成物は、薬学的に許容しうる担体中にこれらの発酵抽出液及 び／又はその誘導体を含むことが好ましい。 好適実施態様においては、本発明の組成物は濃縮発酵抽出液を含む。所望され る場合、これらの抽出液は凍結乾燥される。 特に好適な実施態様においては、これらの発酵抽出液は粗無細胞全抽出液であ る。更に詳細には、かかる粗無細胞全抽出液は１００００分子量（ＭＷ）区分膜 で限外ろ過され、もって、保持液は１００００分子量（ＭＷ）透過液である。 所望される場合、本発明の組成物は本明細書に開示される発酵抽出液の誘導体 及び／又はそれから誘導された酵素組成物であることができる。 本発明の具体的な態様においては、本明細書に記載されるアスペルギルス発酵 抽出液（及び／又はその誘導体）は哺乳動物におけるウイルス誘導腫瘍を予防及 び治療するための予防及び治療用組成物の調製に用いられる。アスペルギルス発 酵抽出液（及び／又はその誘導体）は、それを必要としている哺乳動物に局所適 用されるかかる予防及び治療用組成物の調製に用いることが好ましい。 更に、本発明の教示に従って、本発明の予防及び治療用組成物を供給する方法 が開示される。これらの方法としては、適切な培地上でアスペルギルス種を培養 することが含まれる。この培地は、固形表面培地であることが好ましい。これら の方法は、更に、培地からの細胞外化合物を水で抽出することを含むので、液体 発酵抽出液が得られる。更に、これらの方法は得られた発酵抽出液をろ過して細 胞バイオマス及び胞子を除去することを含み、もって、液体発酵抽出液が得られ る。更に、所望される場合、その開示された方法はその使用まで液体発酵抽出液 を冷凍することを含む。その冷凍は、約４℃で行うことが好ましい。 他の具体的な好適実施態様においては、発酵抽出液は凍結乾燥により濃縮され る。その凍結乾燥から得られる凍結乾燥末（発酵抽出液の）は、使用まで乾燥剤 を用いて室温で貯蔵される。 具体的な好適実施態様においては、発酵抽出液を更に１００００ＭＷ区分膜で 限外ろ過した後、保持液が冷凍される。この１００００ＭＷ限外フィルター保持 液は乾燥固形分７.６％(w/v)を有する。所望される場合、保持液は、例えば蒸発 により濃縮される。 本明細書に開示される方法は、予防及び治療用局所組成物の調製に用いること が好ましい。 更に、本発明の教示に従って、哺乳動物におけるウイルス誘導腫瘍の予防及び 治療方法が開示される。これらの方法の使用は、健康な感染していない組織を破 壊せず、しかも有意の全身性副作用を引き起こさず、治療される哺乳動物に傷跡 を残さず、外観を損じることなく、不快にすることもない。更に、これらの方法 の使用は、周囲組織に維持される潜伏ウイルスＤＮＡの破壊をもたらすので、不 完全な回復及び腫瘍の頻繁な再発の場合を減じる。これらの方法は、薬学的に許 容しうる担体中で発酵抽出液及び／又はその誘導体を調製することを含むので、 予防及び／又は治療用組成物は哺乳動物においてウイルス誘導腫瘍を予防及び／ 又は治療する。これらの方法は、更に、その組成物の治療上有効な量をそれを必 要としている哺乳動物に投与することを含む。予防処置の場合には、かかる予防 治療を必要としていると予想される哺乳動物のその面に投与されるか、治療処置 の場合には、それを必要としている哺乳動物のウイルス誘導腫瘍に直接投与され る。局所適用されることが好ましい。 本発明の予防及び治療用組成物を供給する方法は、発酵抽出液、特にアスペルギルス の発酵抽出液を調製することを含むことが好ましい。その方法は、アスペ ルギルス・ニガー の発酵抽出液を供給することを含むことが更に好ましい。その 方法は、アスペルギルス・ニガー 1.2 AN29 又は 1.2 AN39 の発酵抽出液を供給 することを含むことが最も好ましい。 所望される場合には更に、その方法は発酵抽出液の誘導体の調製が含まれる。 所望される場合には更に、その方法は無細胞全A.ニガー発酵抽出液を１０００ ０ＭＷ区分膜で限外ろ過し、１００００ＭＷ限外フィルター保持液を回収するこ とが含まれる。更に所望される場合には、その方法は蒸発により保持液を濃縮す ることが含まれる。 所望される場合には、その方法は発酵抽出液を凍結乾燥することが含まれ、も って、抽出液が濃縮され、粉末が形成され、凍結乾燥した粉末の貯蔵は乾燥剤の 存在下に室温で行われる。 本発明の具体的な態様においては、哺乳動物におけるエプスタイン・バールウ イルス誘導腫瘍を予防及び治療するための予防及び治療用局所組成物及びその使 用方法が開示される。 本発明の更に具体的な態様においては、哺乳動物におけるワタオウサギ乳頭腫 ウイルス誘導腫瘍を予防及び治療するための予防及び治療用局所組成物及びその 使用方法が開示される。 本発明の更に他の具体的な態様においては、哺乳動物において乳頭腫ウイルス 誘導腫瘍を予防及び治療するための予防及び治療用局所組成物及びその使用方法 が開示される。 本発明のこれらの及び他の目的及び利点は、下記の本発明をその実施例と共に 読み取ることにより容易に明らかになるであろう。好適実施態様の説明 本発明は、哺乳動物においてウイルス誘導腫瘍を予防及び治療するための予防 及び治療用局所組成物に関する。これらの組成物は、発酵抽出液及び／又はその 誘導体から調製される。次に、これらの発酵抽出液及びその誘導体は本発明の治 療用組成物を製造するために薬学的に許容しうる担体と混合される。 “発酵抽出液”なる語は、適切な微生物の培養物を接種しその微生物を培養（ 増殖）した環境、特に発酵環境の抽出液を意味する。 発酵抽出液について用いられる“誘導体”及び“誘導された”なる語は、発酵 抽出液から得られた（誘導された又は単離された）具体的な酵素又は酵素の組合 わせのような組成物又は成分を意味する。具体的な説明として、かかる誘導体の 例は濃縮又はろ過された発酵抽出液である。“誘導体”及び“誘導された”なる 語は同様に用いられ、発酵抽出液の組成物又は成分と同一でありかつ発酵抽出液 と同じ予防及び治療特性を示す組成物及び化合物を意味する。具体的な説明とし て、その定義としては、発酵抽出液から単離された（及び所望される場合には精 製された）発酵抽出液（例えばその活性剤）の成分が含まれる。更に具体的な説 明として、その定義としては、本発明の発酵抽出液の予防及び治療特性を有する 活性剤に似ているように構築された（即ち、合成的に構築された）組成物又は化 合物も含まれる。 更に詳細には、本明細書に開示される発酵抽出液及びその誘導体は、適切な微 生物の培養物を接種した表面発酵の水性抽出液（又はその水性抽出液の誘導体） である。 発酵抽出液は、好ましくはアスペルギルス発酵抽出液、更に詳細にはアスペル ギルス・ニガー 発酵抽出液である。アスペルギルス・ニガー 1.2 AN29 発酵抽出 液及びアスペルギルス・ニガー 1.2 AN39 発酵抽出液が最も好ましい。 特に好適な実施態様においては、発酵抽出液は１００００ＭＷ限外ろ過保持液 [乾燥固形分含量7.6 ％(w/v)]である。保持液は、例えば蒸発により濃縮される 。 特に、アスペルギルス・ニガー培養物を接種した表面発酵の水性抽出液は哺乳 動物においていぼの予防及び消失に効果があることが認められた。 薬学的に許容しうる担体は、当業者に周知の担体であることができる。かかる 担体は、予防及び治療用組成物が皮膚を浸透することを援助する親水性物質であ ることが好ましい。かかる担体の例としては、メタノール水溶液、水、プロピレ ングリコール、ラノリン、ブチルアルコール、無水アルコール、イソプロピルア ルコール、ジメチルスルホキシド、乳酸エチルエーテル及びその混合液が挙げら れるが、これらに限定されない。かかる担体の他の例は、周知の“VEHICLE N” であり、組成はエチルアルコール、イソプロピルアルコール、精製水、LAURETH- 4（界面活性剤）及びプロピレングリコールから構成される。 本発明の予防及び治療用組成物を調製するのに用いる発酵抽出液（及び／又は その誘導体）の正確な量及び薬学的に許容しうる担体は、約１％(w/v)〜約１５ ％(w/v)の濃度の凍結乾燥発酵抽出液（又はその誘導体）であることが好ましい 。約８％(w/v)の濃度の凍結乾燥発酵抽出液が特に好ましい。 予防及び治療用組成物は、保護されるべき哺乳動物の面或いはそれを必要とし ている哺乳動物のいぼのような罹患腫瘍に局所適用するのに所望されるように処 方される。かかる製剤としては、液状組成物、例えば、油性軟膏剤、リニメント 剤及びチンキ剤組成物が挙げられる。皮膚及び／又は腫瘍と長時間の接触させた 予防及び治療用組成物を十分な時間保持する能力に対してはクリーム剤、石ケン 類及びゲル剤が特に好ましい。 厳密には理解されていないが、本発明の組成物の作用機序は必ずしも本来は直 接の抗ウイルス性又は抗腫瘍性でないと考えられる。どちらかというと、本明細 書に開示される組成物の作用機序は免疫系の全身刺激作用の結果であることが可 能であると考えられる。細胞仲介応答は、腫瘍増殖に影響する全身性免疫応答を 誘導することができるＡＮ−１抗原に重要なものである。この点で、我々は本発 明の組成物が免疫増強剤であることができると考える。実際に、以前の研究によ り、細胞仲介応答がおそらく良性及び前がん性腫瘍形成に誘導される乳頭腫ウイ ルスの退縮に関与することが示された。 また、発酵抽出液の活性成分は分子量約１０００〜約１００００ダルトンを有 すると考えれる。更に詳細には、発酵抽出液の活性成分は分子量約１００００ダ ルトンを有すると考えられる。 本発明の予防及び治療用組成物は、ウイルス誘導腫瘍、例えば、ヒト乳頭腫ウ イルス（ＨＰＶ）、ワタオウサギ乳頭腫ウイルス（ＣＲＰＶ）、ウマ乳頭腫ウイ ルス（ＥＰＶ）及びウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）から生じるものの予防及び治 療に有効である。 本発明の予防及び治療用組成物は、まず適切な増殖培地を調製することにより 与えられる。固形表面培地が好ましい。使用する正確な培地は、確認する当該技 術の熟練の範囲内で良好であるように、培養されるべき微生物に従って変動する 。アスペルギルスが培養されるべきである場合には、培地は７.９％(w/w)SOLKA FLOC BNB 100(James River Corp.,U.S.A.)；７.９％(w/w)オート麦外皮；７.９ ％(w/w)落花生ミール；１５.８％(w/w)ビートパルプ；０.３９％(w/w)ＫＨ₂ＰＯ₄ ;１３ ppmＺｎＳＯ₄;及び６０％(w/w)水を含むことが好ましい。 次に、培地を滅菌し、冷却し、培養されるべき正確なアスペルギルス種の胞子 を接種する。接種及び混合後、培地を約０.７５インチの深さの多孔性金属トレ ーに移す。次に、これらのトレーを高湿度環境中３０〜３２℃で約７２時間イン キュベートし、その間にアスペルギルス種が培養される。次に、水中で数時間攪 拌（水抽出）することにより内容物を回収するので、液体発酵抽出液が得られる 。次に、その液体発酵抽出液をろ過して（最終フィルターに通過させて）抽出液 から細胞バイオマス、胞子及び他の不溶分を除去する。 所望される場合には、液体ろ過抽出液がそれだけで用いられるか又は例えば、 濃縮されることにより更に処理されるので、適切なその誘導体が与えられる。 かかる処理の例としては、１００００ＭＷ−ＵＦ保持液を得るように、発酵抽 出液を１００００ＭＷ区分膜で限外ろ過することが含まれる。かかる保持液は、 例えば、７.６％(w/v)の乾燥固形分組成物を有する。かかる処理の他の例は、蒸 発による濃縮（即ち、２.５倍）である。この点で、粗無細胞発酵抽出液或いは １００００ＭＷ（又は他のサイズ）保持液は蒸発によりそのように濃縮されるこ とが認められる。 すぐに用いられない場合には、使用するまで液体ろ過抽出液（及び／又はその 誘導体）を４℃で凍結することが好ましい。 長時間の貯蔵が所望される場合には、液体ろ過抽出液（又はその誘導体）は真 空濃縮され、次に澄明化ろ過される。次に、ろ液（又はその誘導体）が凍結乾燥 される。次に、それから得られる凍結乾燥末を乾燥剤を用いて室温で使用するま で貯蔵される。 得られた発酵抽出液（又はその誘導体）の凍結乾燥末は水に非常に可溶である 。その使用が所望されると、凍結乾燥末は水のような液体及び／又は薬学的に許 容しうる担体に再び溶解される。 本発明の予防及び治療用組成物は、哺乳動物におけるウイルス誘導腫瘍の予防 及び治療方法に用いられる。これらの方法は、薬学的に許容しうる担体中アスペ ルギルス 発酵抽出液（又はその誘導体）を含む予防及び治療用組成物の治療上の 有効量をそれを必要としている哺乳動物に投与することを含む。 “治療上の有効量”なる語は、問題の新規な又は既存のウイルス誘導腫瘍の増 殖を予防又は治療する予防或いは治療目的に有効である量であることを意味する 。 適用されるべき予防及び治療用組成物の正確な量は、それを必要としている哺 乳動物の皮膚の（罹患）面（例えば、ウイルス誘導腫瘍が位置する面）を薄く浸 すのに必要な本発明の予防及び治療用局所組成物の量である。 予防及び治療用組成物は、当業者に周知の適切な方法で投与することができる 。かかる方法としては、皮下又は静脈内注射が含まれる。この投与は、所望され る点眼びん、浸透性塗布具（ガーゼ、綿棒又はクロス、ロールトップ塗布具）、 ブラシ又は他の適切な適用手段によって皮膚又は腫瘍の表面（又はそれを必要と している患部）に適用することによるといった局所投与であることが好ましい。 所望される場合には、予防及び治療用組成物は、最初の感染を予防する予防処 置において感染する前に適用される。我々は、予防及び治療用組成物が感染直後 に適用されるか或いは既存の腫瘍に適用されると顕著な腫瘍減少能を有すること を見出した。腫瘍が存続する限り１日少なくとも１〜２回適用することが企図さ れる。しかしながら、所望又は必要とされるこれらの適用の正確な回数は、決定 する当該技術の熟練の範囲内で良好であるように増減される。組成物に対する皮 膚反応の発生を避けるために注意しなければならないが、いずれにしても我々は かかる反応が試験される被検動物に対して有害でなく最後には消えることを見出 した。 このように本発明の予防及び治療用組成物及びその調製方法及び使用を記載し てきたが、下記の実施例はここでは具体的な説明のためにだけ示され、制限する ものとして読み取ることを意味せずまた読み取るべきものでもない。実施例１ アスペルギルス・ニガー 1.2 AN39 発酵抽出液の調製 まず、７.９％(w/w)SOLKA FLOC BNB 100(James River Corp.,米国)；７.９％( w/w)オート麦外皮；７.９％(w/w)落花生ミール；１５.８％(w/w)ビートパルプ； ０.３９％(w/w)ＫＨ₂ ＰＯ₄；１３ ppmＺｎＳＯ₄;及び６０％(w/w)水から構成さ れる適切な増殖培地を調製した。 次に、培地を滅菌し、冷却し、ブダペスト条約の規定で農事試験場カルチュア コレクション（ＮＲＲＬ）、815 N.ユニバーシティーSt.、ピオリア、イリノイ （米国）に1993年７月30日に受託番号 21126として寄託されたアスペルギルス・ ニガー 1.2 AN39 の胞子を接種した。 接種及び混合後、培地を約０.７５インチの深さの多孔性金属トレーに移した 。次に、これらのトレーを高湿度（水飽和）環境中３０〜３２℃で約７２時間イ ンキュベートして所望のアスペルギルス・ニガー 1.2 AN39 培養物を生産した。 次に、この培養物を水中で数時間攪拌（水抽出）した後、ろ過する（最終フィル ターに通過させる）ことにより回収して細胞バイオマス、胞子及び他の不溶分を 除去した。 次に、ろ液を真空濃縮した後、澄明化ろ過した。得られた組成物は、“ＡＮ− １”と称するアスペルギルス・ニガ ー 1.2 AN39 発酵抽出液であった。 次に、液体ろ過抽出液の一部を凍結乾燥してＡＮ−１発酵抽出末を生成した。 次に、発酵抽出液のこの凍結乾燥末を乾燥剤を用いて室温で使用するまで貯蔵し た。実施例２ アスペルギルス・ニガー 1.2 AN29 発酵抽出液の調製 冷却滅菌培地にブダペスト条約の規定で農事試験場カルチュアコレクション（ ＮＲＲＬ）、815 N.ユニバーシティー St.、ピオリア、イリノイ（米国）1993 年９月７日に受託番号 21139として寄託されたアスペルギルス・ニガー 1.2 AN2 9の胞子を接種した以外は、上記実施例１に記載されたアスペルギルス・ニガー 1.2 AN39 発酵抽出液と同様の方法でアスペルギルス・ニガー 1.2 AN29 発酵抽 出液を調製した。この組成物を、“ＡＮ−２”と称した。 次に、液体ろ過抽出液の一部を凍結乾燥してＡＮ−１発酵抽出末を生成した。 次に、発酵抽出液のこの凍結乾燥末を乾燥剤を用いて室温で使用するまで貯蔵し た。実施例３ A.ニガー発酵抽出液の試験管内治療指数 生体内で本発明の治療用組成物の有用性の可能性を明らかにするために、エプ スタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ヘルペス型ウイルスに対する本発明の酵 素組成物の効能の試験管内評価を求めた。 抗ウイルス剤の効力の標準評価は、細胞毒性に対して得られたＥＤ₅₀のウイル ス抑制に対して得られたＥＤ₅₀に対する比率の比較によるものである。この関係 は“試験管内治療指数”又は“選択性指数”と呼ばれる。本物質に関して、抗ウ イルス剤の選択性指数は（１）に記載される動物実験においてウイルス抑制につ いて有効な作用を示すために１００を超えなければならない。 ここでなされた評価は、Ｒａｊｉ細胞にＰ３ＨＲ−１と一般に呼ばれるＥＢＶ ウイルス細胞系を重感染することにより行った。Ｐ３ＨＲ−１は標準実験用ＥＢ Ｖ種である。重感染後、培養物の初期抗原産生を分析した。 １．ヒト前皮膚線維芽細胞の調製 新生児ヒト前皮膚を、包皮切除術を行った後できるだけ早く入手し、５０μg バンコマイシン、３μg フンギゾン、１００単位ペニシリン及び２５μg ゲンタ マイシン（ＤＭＥＭ１mlあたり）で補足したダルベッコの最小必須培地(ＤＭＥ Ｍ)(GIBCO BRL，Life Technologies社、ゲイザースバーグ、メリーランド、米国 )に３７℃で４時間入れた。 次に、培地を取り出し、前皮膚を小片に切り刻み、カルシウム及びマグネシウ ムを取り除いたダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水(ＤＰＢＳ)(GIBCO BRL)で、赤 色細胞が見えなくなるまで繰り返し洗浄した。 次に、０.２５％(w/v)のトリプシンを用いてＣＯ₂インキュベーター中３７℃ で１５分間連続的に攪拌しながらトリプシン処理した。１５分間の終わりに、組 織がフラスコの底に沈降した。次に、細胞を含む上清を滅菌チーズクロスを介し てＤＭＥＭ及び１０％(v/v)ウシ胎児血清(Hyclone，米国)を含む第２フラスコに 注ぎ入れた。細胞を各々ろ過した後、チーズクロスを少量のＤＭＥＭ含有血清で 洗浄した。新たなトリプシンを上記のように再び前皮膚片に加え、細胞が有効で なくなるまで手順を繰り返した。 第２フラスコ（培地とトリプシン処理細胞を含む）はトリプシン処理手順を通 して氷上に保持した。 次に、第２フラスコ中の細胞含有培地を約１０００ RPM（約１００ｇ）、４℃ で１０分間遠心した（細胞を損傷させずに沈降させるのに要した最小遠心力）。 上清液を捨て、１０％(v/v)ウシ胎児血清を含む約５０mlのＤＭＥＭに懸濁した 。 次に、その細胞を適当な数の２５cm²組織培養フラスコに入れた。その細胞を ５０μg/mlＤＭＥＭバンコマイシン及び３μg/mlＤＭＥＭフンジゾン上で３７℃ で約７２時間細胞が準密集するまで保持した。次に、その細胞をより大きなフラ スコと新たな培地を用いる以外は上記のように継代培養した。次に、この手順を ２回以上４継代が得られるまで繰り返した。 ２．ＥＢＶのスクリーニング分析 Ａ．ウイルス 使用される感染性ＥＢＶの始原型は、（１２）に記載された手順に従ってＰ３ ＨＲ−１細胞系（アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ） 、ロックビル、メリーランド（米国）から受託番号ＶＲ６０３として入手した） の上清液に由来するウイルスとした。この細胞系は、Ｂ細胞系の一次感染又は重 感染後に初期抗原（ＥＡ）を産生させる非形質転換ウイルスを産生する。 Ｂ．細胞系 Ｒａｊｉ（アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）、ロ ックビル、メリーランド（米国）から受託番号ＣＣＬ８６として入手した）は、 ６０ＥＢＶゲノム／細胞を含むバーキットリンパ腫細胞系であり、ＥＢＶ初期抗 原（ＥＡ）発現に対して抗ウイルス活性をスクリーニングするために用いた初代 細胞であった。 全ウイルス細胞系（Ｐ３ＨＲ−１及びＲａｊｉウイルス細胞系）を１０％(v/v )ウシ胎児血清、２.０５ mM/ml培地L-グルタミン及び２５μg/ml培地ゲンタマイ シンで補足したＲＰＭＩ−１６４０培地(GIBCO BRL)中に維持した。１週間に２ 回培地の半量を新たな培地と置き換え（１２）で記載されたように細胞濃度を３ ×１０⁵/mlに調整した。次に、細胞を５％(v/v)ＣＯ₂で湿度を調節した（９０％ ）雰囲気中３７℃で使用するまで維持した。 ３．モノクローナル抗体による免疫蛍光分析 Ｒａｊｉ細胞にＥＢＶのＰ３ＨＲ−１株を（１２）で記載されたように感染さ せた。次に、３７℃で４５分間受動吸着させかつカルシウムとマグネシウムを含 まないほかはダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）を用いて細胞培養物 を洗浄した後、上記実施例１のように得られた組成物を加えた。次に、その培養 物をＲＰＭＩ−１６４０培地（上記）中３７℃で２日間インキュベートしてウイ ルス遺伝子発現した。４８時間インキュベートした後、各試料の細胞数を（１２ ）に記載されたように血球計算板を用いて計数し、次にトキソプラズマ症スライ ド（Bellco Glass社、米国）のウェルにスポットし、風乾した。 次に、初期抗原ＥＡ(Ｄ)(DuPont、米国)を拡散するために(Dr.Gary Pearson, ジョージタウン大学、米国の好意で提供された)モノクローナル抗体を（１２） に記載されたスライドのウェル中のＲａｊｉ細胞に加えた。この後、（１２）に 記載された手順によりフルオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体(Fisher Scie ntific、米国)を加え、スライドのウェル中の蛍光陽性細胞数を蛍光顕微鏡を用 いて目で計数した。次に（１２）で記載されたように、ＥＡ（Ｄ）に陽性の培養 物中の全細胞数を計算及び比較すると、ＥＢＶの初期抗原発現は蛍光を示さない Ｒａｊｉ細胞中で抑制された。 ４．試験管内細胞毒性 ＡＮ−１の試験管内細胞毒性を、上記のように得られたヒト前皮膚線維芽（Ｈ ＦＦ）細胞中で次のように変更した（１３）で記載された手法及び条件によって 求めた：分析の２４時間前に、低継代ＨＦＦ細胞を９６ウェル組織培養プレ ート(８×１２平底ウェル)(Becton Dickinson Labware、米国)に１ウェルあたり ２.５×１０⁴細胞濃度を塗布した。その細胞は、１０％(v/v)ウシ胎児血清(Hycl one、米国)を含有する０.１mlのＤＭＥＭ中とした。次に、その細胞をＣＯ₂イン キュベーター中３７℃で２４時間インキュベートした。次に、培地を吸引し、２ ％(v/v)ウシ胎児血清を含有する１００μl のＤＭＥＭを第１列中８ウェルを除 く全部に加えた。上記実施例１のように得られた凍結乾燥発酵抽出液（ＡＮ−１ ）を２％(v/v)ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭに１００μg/mlの濃度まで溶解 した。次に、第１列の各ウェルに１２５マイクロリットルのＡＮ−１を加えてか ら、Cetus Liquid Handling Machine(Perkin-Elmer社，米国)を用いて２５μl を移すことにより残りのウェル全部を連続して１：５（１００〜０.０３μg/ml のウェルにおけるＡＮ−１濃度範囲を示す）に希釈した［２％(v/v)ウシ胎児血 清を含有するＤＭＥＭで］。次に、このプレートをＣＯ₂インキュベーター中３ ７℃で７日間インキュベートした。次に、ＡＮ−１溶液を含む無細胞培地を吸引 し、ダルベッコのリン酸塩緩衝溶液中２００μl/ウェルの０.０１％(v/v)ニュウ トラルレッドを加えた。これをＣＯ₂インキュベーター中３７℃で１時間インキ ュベートした。次に、その染料を吸引し、細胞をNunc Plate Washer(Nunc社、米 国)を用いて洗浄した。ＤＰＢＳ洗浄液を除去した後、２００μl/ウェルの５０ ％(v/v)ＥｔＯＨ／１％(v/v)氷酢酸（Ｈ₂Ｏ中）を加えた。そのプレートを軌道 シェーカーにより１５分間回転させることにより内容物を混合した。次に、各ウ ェルの光学濃度をプレートリーダー(Beckman Instruments社、米国)を用いて５ ５０nmにおいて読み取った。 １００μg/mlのＡＮ−１で処理した各分析系におけるＨＦＦ細胞（通常静止細 胞）の目視検査は毒性を示さなかった。 また、ＡＮ−１の細胞毒性をＨＦＦ細胞増殖分析で求めた（急速増殖ＨＦＦ細 胞）。急速増殖ヒト前皮膚線維芽細胞のＡＮ−１の細胞増殖分析を行った。分析 の２４時間前に、ＨＦＦ細胞（上記のように得られた）を６ウェル組織培養プレ ート(２×３平底ウェルを有する)(Becton Dickinson Labware、米国)に１０％(v /v)ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中１ウェルあたり２.５×１０⁴細胞の濃度 で播種した。分析日に、ＡＮ−１を１０％(v/v)ウシ胎児血清を含有する ＤＭＥＭに連続的に１：５の増加分で希釈し、１００〜０.０３μg/mlの範囲に わたる種々のウェルの各々のＡＮ−１濃度を得た。次に、細胞からの培地を吸引 してから、各ウェルに２mlのＡＮ−１濃縮物を加えた。次に、その細胞をＣＯ₂ インキュベーター中３７℃で７２時間インキュベートした。次に、溶液中ＡＮ− １を含有する無細胞培地を取り出し、その細胞（単層）をカルシウムもマグネシ ウムも含まないＤＰＢＳで洗浄した。次に、ＤＰＢＳを吸引除去した。各ウェル に１mlの０.２５％(w/v)トリプシンを加え、細胞がプレートのウェルの底から分 離し始めるまでインキュベートした。次に、細胞−培地混合液をピペットで激し く上下して細胞浮遊液を分解し、０.２mlの混合液を９.８mlの希釈剤 ISOTON II I (Coulter Electronics社、米国)に加え、細胞をCoulter カウンター（Coulter Electronics社、米国）を用いて計数した。次に、各試料を１試料あたり３つの 繰り返しウェルで３回計数した。 毒性に対するこの緊縮分析に関して１００μg/mlレベルでＡＮ−１の毒性はな かった。 また、ＡＮ−１は１００μlg/mlレベル（ＩＣ₅₀は１００μg より大きい）の トランスフェクションされていない（無ＥＢＶ）Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細 胞系に対して有毒でなかった。トランスフェクションされていない（無ＥＢＶ） Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞に対するＡＮ−１の毒性分析に用いた方法は８ ５頁の（１２）で記載した。 ５．結果 これらのスクリーニングの結果を以下に示す。ここで、ＥＣ₅₀（５０％有効濃 度）はウイルス細胞変性を５０％だけ阻止するのに要した濃度であり、ＩＣ₅₀（ ５０％阻止濃度）は細胞増殖を５０％だけ阻止するのに要した濃度であり、S.I. は“選択性指数”を表す。ＳＩ＝ＩＣ₅₀／ＥＣ₅₀ （１） ＲＡＪＩ細胞中エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）の初期抗原（ＥＡ） 発現（〜６０ＥＢＶコピー／細胞）に対するＡＮ−１の抗ウイルス活性を試験す ると、得られた選択性指数（ＳＩ）は次の通り１３７（ＩＣ₅₀＞１００μg/ml＋ ＥＣ₅₀ ０.７３μg/ml）より大きかった。 ＥＢＶ（ＲＡＪＩ細胞） 免疫蛍光−マイクログラム（ＭＣＧ）／ml ＥＣ₅₀＝０.７３；ＩＣ₅₀＞１００；ＳＩ＞１３７ ＡＮ−１のＳＩはＲＡＪＩ細胞中１００（＞１３７）を超えたので、哺乳動物 実験におけるウイルス阻止に関して有効な効果を示す。 アシクロビルに対するＥＣ₅₀（数種のヘルペスウイルスに対して阻止活性を有 する抗ウイルス標準）は４.９μg（ＡＣＶＥＣ₅₀４.９）であった。即ち、粗Ａ Ｎ−１試料はアシクロビルより６.７１倍効力があった。精製後、ＡＮ−１組成 物の比活性が増大することは予想される。 ［アシクロビルは、２−アミノ−１,９−ジヒドロ−９−[(２−ヒドロキシエ トキシ)メチル]−６Ｈ−プリン−６−オン；アシクログアノシン；９−[(２−ヒ ドロキシエトキシ)メチル]グアニンである。Ｃ₈Ｈ₁₁Ｎ₅Ｏ₃;分子量２２５.２１ 。数種のヘルペスウイルスに対して阻止活性を有する経口的に活性な非環式ヌク レオシドである。アシクロビルの調製は、米国特許第 4,199,574号に記載されて いる。］ 抗ウイルス剤ＡＮ−１の粗標品は、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペス ウイルス２型、ヒトサイトメガロウイルス又は水痘帯状ヘルペスウイルスを１０ ０μg/mlレベルで試験管内で阻止しなかった。実施例４ A.ニガー発酵抽出液の局所用治療剤としての使用 ヒト乳頭腫ウイルス関連疾患の生体内実験に対して優れた動物モデル系は、Ｎ ＩＨ（アメリカ国立予防衛生研究所）ワタオウサギ乳頭腫ウイルス（ＣＲＰＶ） ウサギモデル系を用いるウサギに見出すことができる。この系は、以前には推定 ウイルス剤の試験に用いられた。 ＣＲＰＶは米国中西部のワタオウサギに特有ものであり、これらの病変の約２ ５％が侵入がん腫に進行する皮膚乳頭腫を生じる。ＣＲＰＶを飼育のウサギの皮 膚に接種すると、一致していぼを生じる。即ち、ＣＲＰＶウサギモデル系はいぼ 増殖を予防又は治療する能力に対する種々の抗ウイルス剤の効能を試験するため に用いることができる。 上記実施例１のように得られた粗無細胞凍結乾燥発酵抽出液（ＡＮ−１）の治 療効果の制御された実験は、NIH CRPVウサギモデル系で行った。本実験の第１段 階においては、腫瘍の存在及び大きさをａ）５０％(v/v)グリセロールのみで局 所治療されたウサギ（グループ１）或いはｂ）５０％(v/v)グリセロール中８％( w/v)ＡＮ−１で治療したウサギ（グループ２）或いはｃ）ＣＲＰＶに感染後９週 まで全く治療せず、次に５０％(v/v)グリセロール中８％(w/v)ＡＮ−１で治療し たウサギと比較した。この方法で、本発明の組成物の予防特性及び治療特性の双 方をグループ２（予防特性の場合）及びグループ３（治療特性の場合）について グループ１及び対照グループと比べて実験することができた。方法と技術 １．ウイルスの調製 ＣＲＰＶを野生のウサギの腫瘍から単離し、細胞デブリを清澄化したワタオウ サギいぼの１０％(w/v)ホモジェネートを生じる（２）に記載される標準法で調 製した。（３）に記載されるように、飼育の雌オランダ産ベルトウサギについて 連続希釈及び乱切することによりウイルスの力価を測定し、もって、約３〜４週 間でいぼを生じた。次に（４）に記載されるように、このウイルスの一部を等密 度ＣｓＣｌ濃度勾配により精製し、精製ビリオンを得た。 次に、切除した腫瘍を液体窒素中で凍結し、乳鉢と乳棒で粉末にし、１０％(w /v)浮遊液を（４）で記載されるように調製した。次に（２）で記載されるよう に、ウイルス上清を４３ｇ／１００ml、３２ｇ／１００ml及び２７ｇ／１００ml のＣｓＣｌの速度段階勾配に加え、７０,０００ｇ（SW27ローターで）、１８℃ で２時間遠心した。次に（２）で記載されるように、ウイルスバンドを集め、４ ８時間透析し、希釈し、ＣｓＣｌで１.３４g/mlの濃度にした。次に（２）で記 載されるように、ウイルスを SW 50.1ローターで１００,０００ｇ、１８℃で４ ０時間バンドにかけ、集め、透析した。 ２．実験プロトコール ２匹のウサギ（Ｃ１及びＣ２）を（２）に記載されるように精製ＣＲＰＶビリ オン（上記のように得た）で免疫した。 各々７匹のウサギの３グループに上記のように得られたＣＲＰＶを感染させた 。各ウサギの背の８部位（左側に４部位及び右側に４部位）に５０μl の保存ウ イ ルス（約３２ＩＤ₅₀単位）の１：４希釈液を感染させた。（３）に記載されるよ うに、かかる感染は乱切することにより行った。 １週間後、局所治療を開始した。グループ１（対照グループ）の被検動物を脱 イオン水中１００μl の５０％(v/v)グルセロールで１日２回処置した。グルー プ２の被検動物を脱イオン水中５０％(v/v)グルセロール中１００μl の８％(w/ v)ＡＮ−１で１日２回処置した。グループ３の被検動物をグループ２の被検動物 に示したのと同じ組成物１００μl で１日２回処置したが、かかる処置はほとん どの感染部位が既に腫瘍を発生した感染後９週目の開始まで開始しなかった。各 グループに対して２ヵ月間処置を続けた。 感染した腫瘍部位を個々の処置物と接触させかつ“ラバーポリスマン”で約５ 秒間接触を維持して処置物を入れることにより処置を行った。 ３．細胞ＤＮＡの単離 ２項の３グループの被検動物の各々からの腫瘍組織を、（５）で記載されるよ うに抽出し、切り刻み、プロテイナーゼで処理（消化）した。次に、塩化カリウ ムとエタノールを冷却した消化物に加えて（５）で記載されるタンパク質複合体 及び全細胞核酸を各々沈澱した。次に（５）で記載されるように、リボヌクレア ーゼＡで処理した後、硫酸ドデシルナトリウム−プロテイナーゼ消化、フェノー ル−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱によりＲＮＡを取り出した。 ４．放射能標識CRPV DNAの調製 次に、CRPV DNAを上記３項のように単離したＤＮＡから得、（２）に記載され るようにｐＢＲ３２２(Clontech Laboratories、米国)中に分子クローン化した 。次に（２）に記載されるように、クローン化したCRPV DNAをＥｃｏＲＩで処理 した後、アガロースゲル電気泳動及び適切なＤＮＡバンドを電気溶出してプラス ミドベクターから切除した。次に（６）に記載されるように、このCRPV DNAをニ ックトランスレーションにより³²Ｐ−ｄＣＴＰで放射能標識した。約３×１０⁸c pm／μｇの比活性が慣用的に得られた。 ５．ＤＮＡ分析 ＤＮＡフィルターハイブリッド形成を（５）で記載されるように緊縮条件下で 行った。上記３項のように単離したＤＮＡからプロテアーゼ及び界面活性剤、フ ェノール及びクロロホルムで（５）に記載されるように細胞ＤＮＡを抽出し、引 き続きＧｅｎｅＡｍｐ(ＴＭ)(Perkin-Elmer、米国)及びＣＰＲＶ Ｅ６オープン リーディングフレーム由来のオリゴマープライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）で分析した。プライマーとして用いられる配列は下記配列とした。 ３５サイクル後、０.５μg の細胞ＤＮＡを増幅した後、放射能標識CRPV DNA プローブに対してハイブリッド形成して原試料中に１fg未満のCRPV DNAを検出す ることができた。（３）参照。 ６．血清学的分析 ＣＲＰＶビリオンタンパク質に対する体液性抗体の酵素結合免疫吸着検定法（ ＥＬＩＳＡ）試験のために２項の被検動物の各々から末梢血を採った。本実施例 の上記１項の精製ビリオンを完全及び不完全フロイントアジュバントと組合わせ て用いて（７）に記載される抗ＣＲＰＶを産生した。（７）に記載される標準Ｅ ＬＩＳＡ分析に１０ngの精製ビリオンタンパク質を用いて、これらの血清が力価 ７.７×１０⁴〜４.７×１０⁵であることがわかった。これらの血清は、実験動物 における体液性ＣＲＰＶ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡ分析[(７)に記載]で陽性 対照とした。アスペルギルス・ニガー発酵抽出液（ＡＮ−１）に対する血清反応 性は、抗原として１mgの凍結乾燥末（上記実施例１のように得られた）を用いて 求めた。両組の分析において、感染前及び実験の終わりの両方のウサギの血清を 分析した。力価が少なくとも４倍だけ増大した比較を有意であるとみなした。 ７．統計的分析 対照グループと比較した個々の試料グループのいぼの有無の有意性を（８）に 記載されるｘ²検定によって測定した。血清抗体応答の陽性の差を（９）、（１ ０）及び（１１）に記載される Fisher Exact Testを用いて評価した。“ｐ値” を、Fisher Exact Testを用いる（９）〜（１１）に記載される方法で算出した 。本明細書に用いられるｐ値は、確率値を意味する。確率値（ｐ）０.０５以下 を有意であるとみなし、５％未満の見込みがありかかる結果がランダムに生じた ことを示す。 ８．結果 Ａ．臨床所見 下記に論じる臨床所見の結果を、次の通り表１に纏める。 治療開始の８週後、グループ１の動物の感染部位の９６％（いずれも組成物を 受けていない）及び何の治療もまだ受けていないグループ３（ｐ＜０.０１）の 動物の９４％に腫瘍が観察された。それと比べて、グループ２では動物の８０％ にしか腫瘍が観察されなかった。グループ２は組成物で予防処置したグループで あり、被検動物はこのときまで任意の組成物を受けた唯一のグループであった。 即ち、ＣＲＰＶによる感染の１週間以内に開始して長期間局所適用した場合、８ 週後の対照と比べたときに観察された腫瘍の数が１７％減少したことがわかる。 更に９週後（更に処置せずに）、被検動物は対照と比べたときに観察された腫瘍 の数が４３％の減少を示した。 これらの１７％及び４３％の腫瘍の減少は、本発明の組成物の予防特性を示す ものである。 グループ３の被検動物に関して（このグループは組成物で治療処置を受けた） 、既存の腫瘍（ＣＲＰＶ感染の９週後に存在する）を有する被検動物にＡＮ−１ を繰り返し局所適用すると、約８週後にかかる被検動物は対照被検動物より腫瘍 が ２４％減少することがわかった（グループ３の被検動物の場合腫瘍を有する感染 部位の％はｐ＞０.０５で５７％であった）。この２４％の腫瘍の減少は、本発 明の組成物の治療特性を示すものである。 要するに、本実験により、ウイルス誘導腫瘍を予防及び治療するための本発明 の組成物の予防特性及び治療特性の双方が証明される。 １）皮膚反応 各グループの被検動物の数匹は、ＡＮ−１投与の数週後に最初は薬剤投与の付 近にのみ“発疹”（発赤、腫瘍面）を発生したことがわかる。しかしながら、実 験が進むにつれて、更に広がっている発疹が見出された。 観察された皮疹は、発赤及び患者におけるいぼを退縮させる際に観察される痒 疹を追憶するものである。 被検動物は、アスペルギルス・ニガー抗原に以前に又は長く曝した結果として 遅延アレルギー応答があったことが疑われる。観察されたような遅延過敏症は、 細胞免疫応答である。動物の解剖により、主要臓器に都合の悪い副作用がないこ とがわかった。ＡＮ−１治療動物の腫瘍部位には、表在性真皮を中位の数のリン パ球及び少数のマクロファージ及び形質細胞で浸透したものがあった。同様の浸 透物は、過敏症応答に付随した非乳頭腫ウイルス結節にも見られた。 ２）いぼの退縮 感染の１１２日後に、全グループが腫瘍退縮を示した。このとき、グループ１ の腫瘍のある感染部位の％は７５％であった。従って、２５％の腫瘍退縮があっ た。発酵抽出液で治療したことにより、グループ３の被検動物の腫瘍では更に２ ４％のいぼの退縮があった。しかしながら、退縮したグループ３の腫瘍には、中 間腫瘍サイズ測定で求められるようにＡＮ−１で治療する以前に退縮過程にある 腫瘍もあった。 Ｂ．血清学的所見 全被検動物からの実験前血清及び実験後血清双方のＥＬＩＳＡ分析によりＣＲ ＰＶ及びＡＮ−１抗原に対する反応性を試験する血清学的実験を表２に示す。Ｃ １及びＣ２は各々対照被検動物#1及び対照被検動物#2を表し、本ＥＬＩＳＡ分析 の対照とした。 血清を１：１０に希釈し、その後２倍に希釈した。陽性対照血清を１：１０に 希釈し、その後６倍に希釈した。力価は希釈度の逆数である。終点は、４９０ナ ノメートルにおける吸光度０.１以上を有する最後の希釈度である。４倍以上の 増加を有意であるとみなす。対照は、上記（３）のように精製ＣＲＰＶビリオン で免疫化した被検動物から構成された。 上記表２に関してわかった結果は、グループ１の１被検動物のみと反対に、グ ループ３の５動物はＣＲＰＶ抗原に対して有意な血清陽性応答を有した（前血清 に対する後血清の比率４以上）ことを示す。グループ１の被検動物（いずれも本 発明の組成物を受けなかった）とグループ３の被検動物（本発明の組成物の治療 処置を受けた）間のＣＲＰＶ抗原に対する応答のこの差は Fisher Exact Testで 有意であった（ｐ＝０．０５）。 また、グループ３の４被検動物は、グループ１の１被検動物のみと比べてＡＮ −１抗原に対する血清陽性応答を有したことがわかる。これは本発明の組成物の 効能を示していると思われるが、統計的にはかかる比率はグループ１の対照動物 の応答とあまり差異がない。 高抗原応答は観察された腫瘍増殖又はその欠除と関係なかったことがわかり、 一般にグループ２及び３において１抗原に対する応答の増強は他の抗原に対する 応答の増強に類似した。このいぼの退縮に対する血清学的応答の役割は明らかで ない。これらの結果から、皮膚反応によって観察されたように、ＡＮ−１が乳頭 腫の退縮を高めた経路としての全身性過敏症が示された。 Ｃ．分子所見 実際にすべてのＣＲＰＶ誘導腫瘍におけるＣＲＰＶの存在を検出するために、 本実験における３グループの被検動物において腫瘍陰性部位の（３）に記載され たＰＣＲ−ハイブリッド形成分析を行った。この実験により、グループ２の試験 部位の６.５％（３１中２つ）及びグループ３の試験部位の９.５％（２１中２つ ）のみと比べてグループ１の試験部位の２３％（１３中３つ）でCRPV DNAの存在 が示された（表３参照）。対照的に、CRPV DNAは陽性対照として用いた腫瘍サン プリングの７６％に見られた。 これらのウサギモデル系における結果は、ヒト及び他の哺乳動物おける予防及 び治療用組成物の効能を示すと考えられる。実施例５ A.ニガー発酵抽出液の局所用治療剤としての使用 鼻にいぼ型腫瘍を各々有する２頭のウマを２週間治療した。上記実施例１に記 載されたように得られた液体ろ過発酵抽出液組成物（凍結乾燥する前のもの）を 各々のウマの鼻の片側のいぼに綿ガーゼで局所適用した。対照として、滅菌リン 酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を各々のウマの鼻の反対側のいぼに綿ガーゼで局所適 用した。 １．プロトコール 数層のガーゼに３０mlの溶液（ＰＢＳ対照の組成物）を置きいぼにしみ込むま で軽くたたくことにより治療した。罹患面にしみ込むように、これを各々の治療 中に２回繰り返した。０、１、２、３、７及び１４日に治療した。０、１、２、 ３、７、１４、２１及び３０日に観察した。 ２．結果 約７日まで、組成物で治療される鼻面の半分のいぼの治療を開始した後、外観 が変化し始めた（白く見え、他はピンクに見えた）。 ２１日まで、ＰＢＳ半分のいぼは非常に大きく、数が増えたかのように見えた ことがわかった。これらのいぼは、ピンク色でかなり生存しうるように見えた。 組成物治療面のいぼはなお存在したが、サイズ或いは数が増えたように見えなか った。また、白色でかなりかさぶたのように見えた。 ３０日まで、２１日からは変化がないように見えた。 ３．結論 本発明の組成物は、いぼに治療効果を示した。ＰＢＳ治療したいぼは大きくな り広がり、いぼが両方の治療の開始には若かったことを示した。従って、３０日 におけるＰＢＳ治療いぼと組成物治療いぼ間の外観の差はかなりのものである。実施例６ A.ニガー発酵抽出液の局所用治療剤としての使用 ヒト乳頭腫ウイルス関連疾患の生体内実験に対して他の優れた動物モデル系は 、 重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスである。 ＳＣＩＤマウスは、マウスに他の動物からの細胞を移植したキメラ動物である 。これらのＳＣＩＤマウスは、移植片対宿主疾患はほとんど示さない。移植した ＳＣＩＤマウスの導入細胞が感染を支持するために、ＳＣＩＤマウスは治療及び 予防組成物の試験に興味深いモデルである。ＳＣＩＤマウスに関する詳細な説明 は、Milman，G．& D'Souza，P.，ASM News（1990）Vol．56，No．12，p.639-642 に見られ、その内容を本明細書に引用する。 このモデルは、ＳＣＩＤマウスの背中に移植したニュージーランドホワイト（ ＮＺＷ）ウサギの耳の皮膚にワタオウサギ乳頭腫ウイルス（ＣＲＰＶ）を感染す ることを含む。次に、可能性のある抗ＰＶ療法のいぼ増殖阻止能を評価した。Ｓ ＣＩＤマウスはＴ及びＢ細胞機能に免疫的に欠陥があるので、このモデルにより これらの免疫因子からの導入に関係なく本発明の治療及び予防化合物（A.ニガー 発酵抽出液ＡＮ−１）の効能が試験される。 上記実施例１に記載されるように得られた凍結乾燥粗無細胞発酵抽出液（ＡＮ −１）の治療効果の対照実験を次のように行った。材料及び方法 ＣＲＰＶ貯蔵液 ： ワタオウサギのいぼを摩砕して１０％(w/v)ホモジェネートを作り、次に遠心 して細胞デブリを除去することによりウイルス貯蔵液を調製した。上清を−７０ ℃で使用するまで貯蔵した。ＮＺＷ皮膚の移植と感染 ： ＮＺＷウサギの耳の皮膚を麻酔したマウスの背中の左右両方に移植し、数週間 治療した。次に、両脇腹の組織を２７Ｇ針（１００×）で引っ掻きかつ擦り剥い た組織に５μl 滴の非希釈ＣＲＰＶ接種物を置くことにより感染させた。化合物の調製 ： 化合物は全て最終濃度８％(w/v)の凍結乾燥抽出液に水性クリームに調製し、 １０％(v/v)ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えた。４００mgの化合物を ４.１ｇのクリームに加え、１５分間攪拌した。化合物の溶解を援助するために 、５６℃の水浴に１時間入れた。最後に、０.５mlのＤＭＳＯを加え、化合物を 再び 攪拌した。化合物は治療の間は４℃で貯蔵した。病変の治療 ： 左右両ＣＲＰＶ感染移植片に１日２回局所療法を適用し、感染後（ＰＩ）３日 目に開始し感染後（ＰＩ）６週間続けた。１０感染移植片／グループの全体に対 して５マウス／治療グループであった。効能の評価 治療効能は、次の病変評点システムを用いて２週から８週まで毎週評価した。評点 臨床的説明 ０ 目に見える感染はない １ 感染部位の皮膚が厚くなる ２ 小さな分離している乳頭腫 ３ 大きな分離している乳頭腫 ４ 半融合乳頭腫 ５ 融合乳頭腫 ６ 密集ケラチン角様構造 データ分析として、治療グループ中の移植片の病変評点を共に平均した。求め た薬物血中濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）及び各治療に対するＡＵＣの低下％を 非治療対照動物に対して算出した。結果 ： 結果を下記表４に纏める。 このモデルにおいて、２０％より大きいＡＵＣの低下は非治療動物と著しく異 なるとみなされ、効果的な治療を示すことができる。粗無細胞A.ニガー発酵抽出 液（ＡＮ−１）を使用すると２１.１％のＡＵＣの低下が生じた。即ち、このモ デルで試験した場合、ＡＮ−１発酵抽出液を使用するといぼの発生の著しい低下 が生じたことがわかる。 本発明の基本的な真意から逸脱することなく多くの変更が行われる。従って、 下記請求の範囲内で、本明細書に詳細に記載された以外の本発明が実施されるこ とは当業者に理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:685）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．薬学的に許容しうる担体中アスペルギルス発酵抽出液又はその誘導体を含む 、哺乳動物においてウイルス誘導腫瘍を予防及び治療するための予防及び治療用 組成物。 ２．該アスペルギルス発酵抽出液がアスペルギルス・ニガー発酵抽出液である請 求項１記載の予防及び治療用組成物。 ３．該アスペルギルス・ニガー発酵抽出液がアスペルギルス・ニガー 1.2 AN29 発酵抽出液である請求項２記載の予防及び治療用組成物。 ４．該アスペルギルス・ニガー発酵抽出液がアスペルギルス・ニガー 1.2 AN39 発酵抽出液である請求項２記載の予防及び治療用組成物。 ５．哺乳動物においてウイルス誘導腫瘍を予防及び治療するための予防及び治療 用組成物を製造するためのアスペルギルス発酵抽出液の使用。 ６．予防及び治療用局所組成物を製造するために該アスペルギルス発酵抽出液を 用いる請求項５記載の使用。 ７．哺乳動物においてウイルス誘導腫瘍を予防及び治療するための予防及び治療 用組成物の調製方法であって、アスペルギルス種を適切な培地上で培養する工程 、該培地からの細胞外化合物を水で抽出して液体発酵抽出液を得る工程、その得 られた液体発酵抽出液をろ過して細胞バイオマス及び胞子を除去し、もって、該 予防及び治療用組成物を調製する工程を含む方法。 ８．培養工程が該アスペルギルス種を適切な固形表面培地上で培養することを含 む請求項７記載の方法。 ９．更に該液体発酵抽出液を使用するまで凍結する工程を含む請求項７記載の方 法。 10．該アスペルギルス種を培養する工程がアスペルギルス・ニガーを適切な培地 上で培養することを含む請求項７記載の方法。 11．該アスペルギルス・ニガーがアスペルギルス・ニガー 1.2 AN29 である請求 項10記載の方法。 12．該アスペルギルス・ニガーがアスペルギルス・ニガー 1.2 AN39 である請求 項10記載の方法。 13．哺乳動物においてウイルス誘導腫瘍を予防及び治療する方法であって、アス ペルギルス 発酵抽出液又はその誘導体及び薬学的に許容しうる担体を含む予防及 び治療用組成物の治療上有効な量をそれを必要としている哺乳動物に投与するこ とを含む方法。 14．該治療上有効な量をそれを必要としている哺乳動物のウイルス誘導腫瘍のよ うな面に局所適用する請求項13記載の方法。 15．該アスペルギルス発酵抽出液がアスペルギルス・ニガー発酵抽出液である請 求項13記載の方法。 16．該アスペルギルス発酵抽出液がアスペルギルス・ニガー 1.2 AN29 発酵抽出 液である請求項13記載の方法。 17．該アスペルギルス発酵抽出液がアスペルギルス・ニガー 1.2 AN39 発酵抽出 液である請求項13記載の方法。 18．該ウイルス誘導腫瘍が乳頭腫ウイルス誘導腫瘍である請求項13記載の方法。 19．アスペルギルス・ニガー 1.2 AN29 の発酵抽出液及びその誘導体。 20．アスペルギルス・ニガー 1.2 AN39 の発酵抽出液及びその誘導体。