CN113993533A - 包含山茶树提取物作为有效成分的用于预防及治疗病毒感染的药物组合物 - Google Patents

包含山茶树提取物作为有效成分的用于预防及治疗病毒感染的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于预防及治疗病毒感染的药物组合物，其包含天然物质来源的山茶树提取物作为有效成分，通过抑制病毒的复制及细胞脱离来有效地调节病毒感染并表现出优异的抗病毒效果。

Description

包含山茶树提取物作为有效成分的用于预防及治疗病毒感染 的药物组合物
技术领域
本发明涉及用于预防及治疗病毒感染的药物组合物，更详细地，涉及包含山茶树提取物作为有效成分的用于预防及治疗病毒感染的药物组合物。
背景技术
流行性感冒(influenza)是由流感病毒感染引起的急性呼吸道疾病，在每年冬季前后流行。这种流感病毒是属于正粘病毒(orthomyxovirus)科的单链RNA病毒，根据抗原性分为A、B、C型，其中，在A型中出现多种变异并在全世界范围内流行，使得许多人饱受痛苦。另一方面，逆转录酶病毒(retrovirus)也作为RNA病毒(RNA virus)的一种，具有能将包含自身遗传信息的RNA插入宿主细胞的DNA的逆转录酶(reverse transcriptase)。由于这种特征，大部分RNA病毒不遵循遗传中心法则(central dogma)，当脱离宿主细胞时，包裹病毒的RNA的蛋白衣壳(capsid)由用于侵入邻近宿主细胞的膜蛋白质外膜构成，而这种使用逆转录酶以RNA为模板合成DNA是该类病毒的特征。RNA病毒与一般的DNA酶不同，由于不具备合成过程中纠正基因错误的能力，可导致出现多种病毒突变。与一般的病毒相同，其病毒本身进入宿主细胞成为宿主的一部分，因此，人类身体的免疫系统不可能只清除病毒，且在通过强大的免疫系统来攻击感染病毒的宿主细胞的情况下，随着宿主细胞也被破坏，人体器官功能也随之受损。因此，作为根本上治疗病毒感染的有效的方法包括抑制病毒感染的方法以及攻击被病毒感染的细胞来选择性进行破坏的方法，然而，感染人类的逆转录酶病毒还可能会导致人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus)。对此，韩国公开专利第2016-0024092号公开了用于预防或治疗冠状病毒相关疾病的药物组合物，其包含山茶树提取物或由此分离的齐墩果烷三萜(oleanane triterpenes)衍生物。
发明内容
本发明要解决的技术问题
然而，现有技术中，作为化合物的衍生物，存在可能会产生耐药性等副作用和抗病毒效果有限的问题。
本发明的目的在于，提供一种用于预防及治疗病毒感染的药物组合物，其包含天然物质来源的山茶树提取物作为有效成分，通过抑制病毒的复制及细胞脱离来有效地调节病毒感染并表现出优异的抗病毒效果。然而，这种技术问题只是例示性的，本发明的范围不限于此。
技术方案
根据本发明的一个方面，提供用于预防及治疗病毒感染的药物组合物，其包含山茶(Camellia japonica)提取物或通过色谱分离所述山茶提取物而获得的活性分级提取物作为有效成分。
有益效果
根据如上所述的本发明的一实施例，可以实现用于预防及治疗病毒感染的药物组合物的生产效果，所述药物组合物包含天然物质来源的山茶树提取物作为有效成分，其通过抑制病毒的复制及细胞脱离来有效地调节病毒感染并表现出优异的抗病毒效果。当然，本发明的范围不受这种效果的限制。
附图说明
图1是简要示出本发明的山茶叶热水提取物制备工艺的示意图。
图2是示出本发明的山茶叶热水提取物的分离分取条件的曲线图。
图3是示出本发明的山茶叶热水提取物及F2分级提取物的TLC分析结果的凝胶照片。
图4是示出用本发明的山茶叶热水提取物处理后，通过PCR反应在Raw264.7细胞株中分析肌动蛋白基因表达抑制效果的凝胶照片。作为对照组，用1mM的过氧化氢进行处理来进行了比较。
图5是示出用本发明的山茶热水提取物处理后，通过PCR反应在Raw264.7细胞株中分析逆转录酶活性及DNA聚合酶活性抑制效果的凝胶照片。
图6是示出用本发明的山茶热水提取物处理后，在Raw264.7细胞株中用山茶提取物(CWE)和CWE分级提取物(F1～F4)处理后的肌动蛋白基因PCR分析结果的凝胶照片。*CWE：100μg/mL，F1～F4：50μg/mL。
图7是示出在Raw264.7细胞株中，按照不同浓度处理本发明的CWE分级提取物(F2)后的肌动蛋白的蛋白质免疫细胞化学染色分析结果的照片。
图8是示出在GP2-293包装细胞中处理CWE和CWE分级提取物(F2)后的病毒基因(pQCXIP)PCR分析结果的凝胶照片。*CWE：100μg/mL、F2：50μg/mL。
具体实施方式
术语的定义：
在本说明书中使用的术语“山茶树(Camellia japonica)”是一种常绿乔木，最高可达约15米，分布于韩国、中国以及日本等地，长椭圆形的叶子厚而有光泽。山茶树果实是在山茶花凋谢后长出，待完全成熟时长出能够压榨山茶油的种子。在东医宝鉴等最近的研究中，山茶叶对银屑病、缓解咽喉痛、烧伤、抗菌具有效果，树枝及果实对头皮屑、软骨病、月经失调、利尿、出血、吐血及烧伤等具有效果，以往，山茶花被认为对妇科疾病有效，例如作为茶来饮用以缓解淤血等。
在本说明书中使用的术语“流感病毒(influenza virus)”是引起流感的致病病毒，病毒粒子具有包膜且呈80～120nm直径的球状，但也可以呈丝状粒子等的多种形状。1933年作为病原体被发现，1940年其他病毒被发现。对以往病毒有免疫的人也对该病毒没有免疫，只要被感染就会发病。因此，为了区分两者，1933年发现的被归为A型，1940年发现的被归为B型，而1949年又发现了与A型或B型均不同的流行性感冒，并被命名为C型。
具体实施例：
根据本发明的一个方面，提供用于预防及治疗病毒感染的药物组合物，其包含山茶(Camellia japonica)提取物或通过色谱分离所述山茶提取物而获得的活性分级提取物作为有效成分。
所述山茶提取物可以是山茶树的叶子、果实、茎或根部提取物，优选为山茶树的叶子或果实提取物。
在所述药物组合物中，所述提取物可以是用水、C1至C4的低级醇或它们的混合物提取的，所述活性分级提取物可以是通过分取液相色谱工艺制备的。所述分取液相色谱工艺可以是利用三蒸水和甲醇(methanol)的混合液的浓度梯度作为展开溶剂的高性能液相色谱(HPLC)，所述活性分级提取物可以是在30％至70％的甲醇浓度区间、更优选为在40％至60％甲醇浓度区间、最优选为在45％至55％区间洗脱的分级提取物。
在所述药物组合物中，所述病毒可以是RNA病毒，所述RNA病毒可以是负链单链(negative single stranded)RNA病毒，所述负链单链(negative single stranded)RNA病毒可以是呼肠孤病毒(reovirus)、小核糖核酸病毒(Picornavirus)、杯状病毒(calicivirus)、披盖病毒(togavirus)、沙粒病毒(arenavirus)、黄病毒(flavivirus)、正粘病毒(orthomyxovirus)、副粘病毒(paramyxovirus)、布尼亚病毒(bunia virus)、弹状病毒(rhabdovirus)、丝状病毒(filovirus)、冠状病毒(coronavirus)、星状病毒(astrovirus)、博尔纳病毒(borna virus)或动脉炎病毒(arterivirus)，所述正粘病毒可以是流感病毒A、流感病毒B、流感病毒C、流感病毒D、传染性鲑鱼贫血病毒(Isavirus)、托高土病毒(Thogotovirus)或夸兰菲尔病毒(Quaranjavirus)。并且，所述流感病毒A可以是人流感病毒A或禽流感病毒A。
根据本发明另一方面，提供一种保健功能食品，其包含山茶(Camellia japonica)提取物或通过色谱分离所述山茶提取物而获得的活性分级提取物作为有效成分。
根据本发明另一方面，提供山茶(Camellia japonica)提取物或通过色谱分离所述山茶提取物而获得的活性分级提取物在制备用于预防及治疗病毒感染的药物中的用途。
根据本发明另一方面，提供个体病毒感染的治疗方法，其包括向感染病毒的个体施用治疗有效剂量的山茶树提取物或通过色谱分离所述山茶树提取物而获得的活性分级提取物的步骤。
在所述治疗方法中，病毒感染的治疗可以通过抑制所述个体的感染细胞中的肌动蛋白的表达、或抑制所述个体的感染细胞中的病毒的复制或抑制从所述个体的感染细胞分泌病毒体(virion)而实现。
根据本发明另一方面，提供预防个体的病毒感染的方法，其包括向个体施用治疗有效剂量的山茶树提取物或通过色谱分离所述山茶树提取物而获得的活性分级提取物的步骤。
根据本发明另一方面，提供抑制个体的感染细胞中的肌动蛋白的表达的方法，其包括向感染病毒的个体施用治疗有效剂量的山茶树提取物或通过色谱分离所述山茶树提取物而获得的活性分级提取物的步骤。
根据本发明另一方面，提供抑制个体的感染细胞分泌病毒体的方法，其包括向感染病毒的个体施用治疗有效剂量的山茶树提取物或通过色谱分离所述山茶树提取物而获得的活性分级提取物的步骤。
本发明的药物组合物可以以口服方式给药或非经胃肠道方式给药，更优选为口服给药，但不限于此。在以非经胃肠道方式给药的情况下，可以以静脉注射、鼻腔内吸入、肌肉给药、腹腔给药、经皮吸收等多种途径给药。
并且，本发明的用于肝病治疗的药物组合物可以以0.1mg/kg至1g/kg的剂量进行给药，更优选地，以1mg/kg至600mg/kg的剂量进行给药。另一方面，所述剂量可以根据患者的年龄、性别及病情适当调节。
所述药物组合物可以剂型化为各种剂型，可以制成汤剂，包装在蒸煮袋中，可以通过热风干燥、冷冻干燥等方法干燥后，剂型化为散剂、丸剂、胶囊等剂型，也可以与明胶等胶凝成分混合并剂型化为凝胶形态。只要是通常在制备药物制剂时使用的公知剂型均可使用。
并且，在制备本发明的药物组合物时，可以使用一种以上药用载体，这种载体包括常规的各种有机或无机载体，例如，固体制剂可适当包括赋形剂、润滑剂、粘合剂及崩解剂，液体制剂可适当包括溶剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂和止痛剂(soothing agent)。另外，如果需要的情况下，可以适当地以适量使用常规的保存剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、吸附剂、润湿剂等的添加剂。
另外，本发明的保健功能食品是用于改善或预防酒精性脂肪肝的保健功能食品，其特征在于，其为胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂、液剂、丸剂、片状、糊剂、糖浆、凝胶(gel)、胶浆剂(jelly)或棒状制剂。所述保健功能食品可以使用适用于保健功能食品的各种剂型，例如，汤剂、饮料剂、散剂、丸剂、胶囊剂、片剂(包衣片、糖衣丸、舌下含片等)、胶浆(jelly)等。
为了复制病毒及生产病毒体(virion)，病毒感染使宿主细胞的正常功能变为最优。其中，细胞内肌动蛋白的结构变化和重组发生显著变化，从而影响病毒重组和细胞脱离(egression)的所有生命周期(life cycle)。根据病毒感染的这些细胞的转化由劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、禽逆转录病毒(avian retrovirus)、猿猴病毒40(simianvirus 40)和腺病毒(adenovirus)诱导，经几个步骤来导致细胞的异常增殖和形态变形。尤其，当宿主细胞中的病毒组装(assembly)完成并输出到细胞外时，肌动蛋白的作用至关重要，因此可以通过调节肌动蛋白的异常过度表达来抑制作为完整病毒的病毒体的细胞脱离。在本技术中，这种细胞内肌动蛋白的表达在高浓度山茶提取物条件下被非常有效地抑制，从而有可能开发出防止病毒继发感染的新材料。
另一方面，以往，为了治疗病毒，使用了细胞膜融合抑制剂、从RNA转变为DNA的逆转录酶的抑制剂和阻断蛋白水解酶切割蛋白质过程的蛋白酶抑制剂等，除此之外，作为治疗剂还使用了在病毒融合至宿主细胞的阶段结合的CCR5受体的抑制剂、抑制前病毒(provirus)形成的整合酶的抑制剂、以及抑制新产生的病毒从宿主细胞中逃逸的最终成熟阶段的药物等。然而，目前使用的药物大部分为合成药物，不能完全抑制病毒，因此耐药性频发，出现免疫力低下、脂肪分布异常综合征、线粒体毒性、骨代谢异常、肝毒性等副作用。因此，许多研究正在开发副作用少、抗病毒功效优异的天然物质衍生材料。并且，由于实际用于治疗新型猪源甲型流感(novel swine-origin influenza A，H1N1)的达菲源自香料之一的八角茴香(Illicium verum Hooker fil.)，因此天然药物的开发有望爆发式增长。对此，本发明人认识到，天然材料来源的材料具有能够控制感染RNA病毒时诱发的免疫降低并抑制病毒的两种效果的情况下，能够与抗病毒剂一起作为辅助疗法的使用价值非常高，认识到这一点后，经过不懈努力，开发出了一种用于预防及治疗病毒感染的药物组合物，其源自韩国原产山茶树叶中提取的天然产物。
根据本发明，证实了山茶提取物的色谱分级提取物(F2)中所含的活性物质具有抑制病毒的复制，且抑制已在宿主细胞内组装的病毒体向细胞外细胞脱离的效果。另外，从机制的角度来看，证实了分级提取物(F2)通过特异性调节肌动蛋白(actin)细胞骨架的表达来抑制正常病毒的产生和胞外分泌，其中，肌动蛋白对宿主细胞中的病毒生命周期(结合、侵入、核定位、基因复制和逆转录、组装、细胞脱离和传播)非常重要。并且，还含有已知会干扰病毒的原发感染和宿主细胞分泌的病毒与靶细胞结合的对苯二酚，因此证实了本发明的物质能够从病毒的初始结合开始直至在已感染细胞中的病毒的正常组装和细胞脱离进行抑制，从而表现出有效的抗病毒效果。如上所述的结果表明，相比于八角茴香衍生的抗流感药物达菲所具有的神经氨酸酶抑制剂(抑制病毒细胞脱离)效果，本发明具有更有效的双重抗病毒效果，因此它可以有望被开发为下一代新药。因此，本发明可以应用于各种类型的病毒，而不是专门针对特定的病毒。
以下，将通过实施例更详细地说明本发明。然而，本发明不限于以下公开的实施例，而是可以以各种不同的形式实施，提供以下实施例的目的为使本发明的公开完整，并将本发明的范畴充分告知本发明所属领域的普通技术人员。
实施例1：山茶提取物的制备
为了制备山茶提取物，本发明人将完全干燥的100g的未粉碎山茶树叶浸渍在3L水中，在95℃下热水提取3小时，收集所述提取物上清液并用1号(No.1)滤纸过滤。之后，将过滤的提取物冷冻干燥以获得最终22.8g的热水提取物。
实施例2：山茶提取物的分离分取
本发明人将从实施例1中得到的山茶提取物以50mg/mL的浓度溶解在三蒸水中，将10mL装入YMC LC forte/R(YMC，日本)HPLC装置进行分离分取(图1)。具体地，流速为30mL/min，在203nm、254nm和280nm波长处确认吸光度，且作为用于分离分取的色谱柱串联两个YMC-DispoPackAT ODS-25/40g，由此在室温下进行了分取。此时，HPLC梯度条件为A溶剂是三蒸水，B是甲醇(methanol)，为了区分F1至F4，以如下基准进行了分离，即F1是在30％的甲醇浓度区间、F2是在50％甲醇浓度区间、F3是在70％以上的甲醇浓度梯度下的10～16分钟区间以及F4是70％以上的甲醇浓度梯度下的16分钟～20分钟区间，并且，以0分钟为B％＝10％开始，0分钟～3分钟为B％＝10％、3分钟～6分钟为B％＝30％、6分钟～9分钟为B％＝50％、9分钟～12分钟为B％＝70％、12分钟～20分钟为B％＝100％的条件进行了分析(图2)。其结果，如图1及图2所示，F1分级提取物的收率最高(75.2％)，F2分级提取物的收率次之(12.5％)，且按照F3及F4的顺序收率逐渐下降。
实施例3：GC-MS以及TLC分析
本发明人使用得到的CWE(山茶热水提取物)和F2分级提取物进行了GC-MS分析(gas chromatography-mass spectrometer)和TLC分析(thin layer chromatography)。
具体地，对表现出生物活性的分级提取物和CWE的GC-MS分析是通过配备CTCCombiPAL自动进样器系统(Palo，Alto，USA)的GC-MS(安捷伦科技(Agilent Technologies)5975C)进行的。此时，用于样品分析的色谱柱为HP-5色谱柱(Agilent Technologies，250μm×0.25μm×30m)，在50℃静置(holding)5分钟后，每分钟上升10℃，在310℃静置(holding)5分钟后进行分析。另外，对于所有样品(sample)而言，为了GC-MS分析，使用适合的溶剂以10mg/mL进行溶解，然后以5μL的量进行不分流进样(splitless injection)。另外，对于TLC分析而言，将对苯二酚标准品(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，美国)、山茶热水提取物(CWE)和分级提取物(F2)分别以10mg/mL的浓度溶解在蒸馏水中，并滴在TLC玻璃板上，次数为10次。将滴好的TLC玻璃板放入展开缸后，先以甲醇为流动相进行一次展开，展开6cm，切下4cm展开位点后，将乙酸乙酯：甲醇：水(77：13：10，v/v)用作流动相进行二次展开，共展开9cm，展开后的玻璃板通过碘染色和紫外线照射(254nm、365nm)进行了分析。
GC/MS分析结果，证实了包含预期对病毒(HIV)和宿主细胞膜结合(membrane-bound)具有抑制活性的对苯二酚(hydroquinone，91-93％的同质性)，并且证实了CWE和F2分级提取物分别包含11.9％、5.5％的对苯二酚。其中，与CWE相比，尽管F2分级提取物中所含的对苯二酚含量较低，但在F2分级提取物中观察到了更优异的效果，因此预期所述物质在抗病毒效果中起到辅助作用，然而，对本质上完整的病毒体(病毒体，virion)组装的抑制和细胞脱离化的抑制，被证实是通过基于F2分级提取物中活性物质的抗病毒效果。另外，通过TLC分析(薄层色谱法(thin layer chromatography))山茶热水提取物分取的F2分级提取物时，在254nm处确认了对苯二酚(Rf＝0.94)，且分析365nm的结果，与CWE相比，在F2分级提取物中确认了显著高水平的斑点(Rf＝0.52)和仅存在于F2分级提取物中的斑点(Rf＝0.74)(图3)。
实施例4：对细胞骨架肌动蛋白基因表达的抑制
为了复制病毒及生产病毒体(virion)，病毒感染使宿主细胞的正常功能变为最优。其中，细胞内肌动蛋白的结构变化和重组发生显著变化，从而影响病毒重组和细胞脱离(egression)的所有生命周期(life cycle)。根据病毒感染的这些细胞的转化由劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、禽逆转录病毒(avian retrovirus)、猿猴病毒40(simianvirus 40)和腺病毒(adenovirus)诱导，经几个步骤来诱导细胞的异常增殖和形态变形。尤其，当宿主细胞中的病毒组装(assembly)完成并输出到细胞外时，肌动蛋白的作用至关重要，因此可以通过调节肌动蛋白的异常过度表达来抑制作为完整病毒的病毒体的细胞脱离。
为此，本发明人通过使用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法分析了根据用本发明的山茶提取物(CWE)处理的细胞骨架肌动蛋白基因表达的抑制、以及在被病毒感染的宿主细胞中产生并对周围细胞诱导继发感染的病毒体分泌的抑制效果。
具体地，为了研究细胞骨架肌动蛋白基因表达是否受到抑制，本发明人使用了小鼠巨噬细胞株(Raw264.7)，并处理了本发明的山茶热水提取物(CWE)和分级提取物(F1～F4)，并且为了培养上述细胞，使用包含10％胎牛血清的α最少必需培养基(海克隆(Hyclone)，UT，美国(USA))，并在调节为37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，待细胞生长达到90％时用于实验，其中，控制继代培养不超过20次。之后，将培养的细胞用0.25％胰蛋白酶-EDTA悬浮，使用细胞计数器对细胞数进行计数，细胞毒性试验中使培养的细胞在96孔板上以1.0×104细胞/孔的方式进行接种。并且，在基因表达试验中，以1.5×106细胞/孔的方式接种至6孔板，并培养2小时，之后用于肌动蛋白基因表达实验。
通过RT-PCR反应定量了肌动蛋白基因的表达水平。为此，首先使用TRIZOL试剂(英杰(Invitrogen)，MA，美国)从Raw264.7细胞提取培养细胞的总RNA。即添加1mL的TRIZOL试剂溶解细胞，在室温静置5分钟后，添加200μL氯仿，以13500rpm离心15分钟。之后，取透明的上清液(500μL)，转移至新管中，添加相同量的异丙醇后，以13500rpm离心10分钟，以使RNA沉淀。将所述RNA沉淀物用经过焦碳酸二乙酯(DEPC，Sigma-Aldrich)处理的蒸馏水稀释的0.75mL的70％乙醇洗涤，之后，在空气中干燥，用作逆转录样品。另外，对所述总RNA，按照不同浓度(10至100μg/ml)处理了本发明的山茶热水提取物，并用1ml的过氧化氢(H2O2)处理以用作对照组。另一方面，使用1μg的总RNA进行了一级DNA链cDNA的合成，并且使用Improm-Ⅱ逆转录系统(Promega)和寡聚dT引物(参照表1)进行了逆转录反应。并且，PCR使用包含标签-聚合酶(tag-polymerase)的2x预混物(ReddyMix PCR Master Mix，CA，美国)进行了35循环链式反应。在以下的表1中总结了所述PCR反应中使用的引物的核酸序列。
表1
Figure GDA0003423430200000101
结果证实，当用100μg/ml的本发明的山茶热水提取物处理细胞时，肌动蛋白的表达受到抑制(图4)，基因扩增时的未处理组(①)、用溶解在乙醇中的C WE处理cDNA后进行PCR时(②)、用溶解在蒸馏水中的CWE处理cDNA后进行PCR时(③)、用CWE处理总RNA后经cDNA过程进行PCR时(④)、用CWE处理总RNA以及用CWE处理cDNA后进行PCR时(⑤)、以及用蒸馏水处理总RNA处理且用蒸馏水处理cDNA后进行PCR时(⑥)，除了作为阴性对照组的①和⑥以外，肌动蛋白的表达均受到抑制，且根据本发明一实施例的山茶提取物的肌动蛋白基因的表达抑制表现出对逆转录反应以及DNA聚合反应均起到作用(图5)。认为上述结果是出于通过抑制病毒感染时的肌动蛋白的异常过度表达来抑制病毒体的细胞脱离效果。另外，在本发明的山茶热水提取物(CWE)分取的分级提取物(F1～F4)的肌动蛋白基因表达调节效果中，证实了F2分级提取物在低于CWE的浓度下实现了类似的效果，由此证实了包含在F2分级提取物中的活性物质直接表现出抗病毒效果(图6)。
实施例5：免疫细胞化学染色分析
为了比较肌动蛋白的蛋白质表达水平，本发明人分别用1μg/mL、25μg/mL以及50μg/mL的F2分级提取物处理Raw264/7细胞后，进行了免疫细胞化学染色。
具体地，为了进行免疫细胞化学分析，将在玻璃片培养室中培养的Raw264/7细胞在4％多聚甲醛中固定15分钟后，用添加了100mM甘氨酸的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤5分钟，添加作为细胞膜渗透溶液的0.1％的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)(Sigma-Aldrich)溶液，在室温放置30分钟。封闭用1％牛血清白蛋白进行处理，室温反应30分钟，磷酸盐缓冲液洗涤3次。然后，将β-肌动蛋白单克隆抗体在加入了1％牛血清白蛋白的吐温20(Tween 20)-磷酸盐缓冲液中以1：200稀释，并在室温进行3小时的抗原抗体反应后进行洗涤，且利用附着有Alexa fluor-594的二抗反应2小时后，用荧光显微镜进行观察。
结果，表现出了较低的作为细胞骨架的肌动蛋白的整体分布，这种结果意味着通过山茶提取物的肌动蛋白基因调节能够有效进行(图7)。
实施例6：病毒体(virion)分泌的抑制
为了分析根据本发明一实施例的山茶提取物活性分级提取物(F2)的从包装细胞(GP2-293)脱离的病毒，本发明人取GP2-293培养液浓缩病毒后，使用与病毒载体基因对应的引物进行了病毒PCR。
具体地，为了研究山茶提取物对病毒体分泌的抑制效果，使用了商业化构建的病毒感染系统(pQCXIP逆转录病毒载体(Retroviral Vector)，Clontech，CA，美国)。即构成病毒包装(packaging)所需的MMLV Gag-Pol、pCMV-VSVG、病毒表达载体以及用于稳定执行病毒体的生成的转化细胞株来进行了病毒感染样实验。首先，用Retro-x载体和pVSVG(包膜质粒，envelop plasmid)共同感染在细胞内表达gag和pol蛋白质的GP2-293包装细胞(源自人胚胎肾细胞HEK 293)，使得在GP2-293细胞内生成病毒蛋白质，同时使得病毒RNA实现复制。由上述病毒基因和病毒蛋白质组装的病毒体移动到细胞膜，使感染性病毒体逃逸到细胞外(脱离细胞)。上述过程中，比较作为正常细胞株的HEK 293细胞与转化的GP2-293细胞内肌动蛋白的表达，以比较山茶提取物的基因表达的抑制水平，为了确认脱离细胞的病毒是否存在，利用病毒通过RNA基因定性分析证实了山茶提取物的抗病毒效果。
结果，在用CWE(100μg/mL)和F2分级提取物(50μg/mL)处理的实验组中RNA病毒载体基因(194碱基对，5'引物：2141-2164；3'引物：2329-2352)均未扩增，在病毒感染细胞周围有效调节了基于病毒的继发感染(图8)。
实施例7：抗病毒效果实验
为了研究抗病毒效能，本发明人通过体外(in vitro)法使用敏感性细胞进行了细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)抑制试验以及MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide))分析试验。作为阳性对照组，使用作为抗病毒剂的金刚烷胺(amantadine，M2蛋白抑制剂)以及利巴韦林(RNA合成抑制剂)，试验顺序为先使细胞附着，通过细胞病变效应(CPE)试验分析细胞毒性以及对于病毒(Flu A 2种；PR8/中国香港，Flu B 1种；Lee)的抗病毒活性，之后研究了基于MTT分析的抗病毒活性。用于培养各病毒的敏感性细胞使用马丁达比狗肾上皮(Madin-Darby Canine Kindey，MDCK)细胞，MDCK细胞的维持培养培养基使用包含10％胎牛血清并分别包含1％的青霉素/链霉素/制霉菌素的最少必需培养基(MEM)。
另外，所述MDCK接种细胞数维持2.0×105细胞/孔，用于接种病毒的培养基使用包含维生素溶液、D-葡萄糖和胰蛋白酶的无血清MEM培养基。另一方面，用于接种的病毒在75cm2组织培养瓶中培养，当发生CPE而使所附着的细胞脱落时，重复冻结-解冻过程，共重复2次，之后以1500×g离心5分钟，去除细胞残留物后，将含有病毒的上清液分别加到冷冻小瓶，在-80℃保管备用。上述接种用病毒的感染滴度计算50％细胞培养感染量(CCID50)，并以Flu A(PR8，中国香港)、Flu B(Lee)每种培养原液(1.2、0.6、3.8)稀释30000倍来使用，山茶提取物(CWE，F2)的抗病毒效果试验是以与细胞毒性试验时相同的条件培养宿主细胞后，弃去培养基，连续3次以稀释倍数浓度接种了含有提取物的接种用培养液各100μL，TCID50的10倍的病毒100μL。培养两天后，与细胞毒性试验相反地，比较观察了提取物的CPE抑制效果，通过将每个样品的未处理细胞、3种病毒接种细胞以及添加了山茶提取物(CWP、F2)的细胞分别重复准备两次，来比较分析CPE抑制效果。
结果，如下表2所示，CC50(μg/mL)分析中，基于山茶提取物(CWE和F2)的细胞毒性均为>2,400μg/mL，相对于作为公知细胞的MDCK不显示细胞毒性。因此，通过适用由病毒感染诱导的CPE抑制程度判定法探索CWE和F2的抗流行性感冒效果，结果观察到CWE和F2分级提取物中抗病毒活性优异，尤其F2分级提取物在Flu A及Flu B显示出高抗病毒活性，用CC50/EC50分析的选择性指数(selectivity index，SI)也比用于比较的阳性对照组高，因此证实了具有优异的抗病毒活性。
表2
抗病毒活性比较实验结果
Figure GDA0003423430200000131
综上所述，对于包含本发明的山茶树提取物的用于预防及治疗病毒感染的药物组合物而言，从山茶树叶提取的提取物在不影响感染的靶细胞(target cell)的活性和存活的基础上，观察到抑制病毒的逆转录来调节基因扩增和抑制病毒的细胞脱离(egression)所需的细胞骨架(肌动蛋白)蛋白的表达等优异的抗病毒效果，从而可以开发为防止病毒的继发感染的天然药物材料。
尽管本发明参考上述实施例进行了说明，但是应当理解，这仅仅是示例性的，并且本领域技术人员可以从中做出各种修改和等效的其他实施例。因此，本发明真正的技术保护范围应以所附权利要求书的技术思想为准。
<110> 人类科学有限公司
<120> 包含山茶树提取物作为有效成分的用于预防及治疗病毒感染的药物组合物
<130> FP210123PCT
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<151> 2019-05-22
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<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward
<400> 1
tacagcttca ccaccacagc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse
<400> 2
aaggaaggct ggaaaagagc 20

Claims (13)

1.一种用于预防及治疗病毒感染的药物组合物，其中，
包含山茶提取物或通过色谱分离所述山茶提取物而获得的活性分级提取物作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，
所述提取物是用水、C1至C4的低级醇或它们的混合物提取的。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，
所述活性分级提取物是通过分取液相色谱工艺制备的。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，
所述病毒是RNA病毒。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，
所述RNA病毒是负链单链RNA病毒。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，
所述负链单链RNA病毒是呼肠孤病毒、小核糖核酸病毒、杯状病毒、披盖病毒、沙粒病毒、黄病毒、正粘病毒、副粘病毒、布尼亚病毒、弹状病毒、丝状病毒、冠状病毒、星状病毒、博尔纳病毒或动脉炎病毒。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中，
所述正粘病毒是流感病毒A、流感病毒B、流感病毒C、流感病毒D、传染性鲑鱼贫血病毒、托高土病毒或夸兰菲尔病毒。
8.一种抗病毒保健功能食品，其中，
包含山茶提取物或通过色谱分离所述山茶提取物而获得的活性分级提取物作为有效成分。
9.一种山茶提取物或通过色谱分离所述山茶提取物而获得的活性分级提取物在制备用于预防及治疗病毒感染的药物中的用途。
10.一种个体病毒感染的治疗方法，其中，
包括向感染病毒的个体施用治疗有效剂量的山茶树提取物或通过色谱分离所述山茶树提取物而获得的活性分级提取物的步骤。
11.一种预防个体的病毒感染的方法，其中，
包括向个体施用治疗有效剂量的山茶树提取物或通过色谱分离所述山茶树提取物而获得的活性分级提取物的步骤。
12.一种抑制个体的感染细胞中的肌动蛋白的表达的方法，其中，
包括向感染病毒的个体施用治疗有效剂量的山茶树提取物或通过色谱分离所述山茶树提取物而获得的活性分级提取物的步骤。
13.一种抑制个体的感染细胞分泌病毒体的方法，其中，
包括向感染病毒的个体施用治疗有效剂量的山茶树提取物或通过色谱分离所述山茶树提取物而获得的活性分级提取物的步骤。
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