CN115623953A - 一种姬菇液体发酵培养及快速出菇检验的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种姬菇液体发酵培养及快速出菇检验的方法，该方法针对姬菇液体培养基发酵出菇及其新品种引种栽培对它的外观性状、适应性进行快速出菇鉴定(试验)的特点，采用贵州省盛产的玉米粉和豆粕粉作为液体培养基的碳氮源主料，进行菌丝球液体发酵培养，并直接使用液体培养基固化出菇，在出菇过程中喷施适宜的子实体营养液可使液体培养基的出菇效果更好。不仅改变了传统的出菇方式还可应用于对引进的姬菇新品种快速进行生产性状、商品性状、遗传性状和适应性的前期检验。本方法具有利用固化液体培养基直接出菇；缩短菌包制作、灭菌、接种、菌包发菌培养、后熟及出菇的时间；能在较短时间内进行菌种培养及判断菌种质量生产性能、效能的优点。
Description
技术领域
本发明涉及食用菌液体深层发酵培养和液体培养基固化直接出菇等食用菌新品种引种栽培及快速出菇检验技术领域，具体是一种姬菇液体发酵培养及快速出菇检验的方法。
背景技术
在食用菌引种生产实践中，各地不管引进的品种如何，都需要进行小面积的出菇实验，通过观察它的生活习性、适应性、抗逆抗杂性等，筛选出最适宜本地种植的品种，再进行大面积栽培。在新菌种引进过程中，通常会出现品种名称混、同种异名、活性退化等问题，而出菇鉴定(试验)是菌种投入生产前必须做的结实性鉴定试验，是引种工作必不可少的重要组成部分，其目的是进一步确定菌种，是对菌种菌丝生活力、菌种的纯度等质量指标进行检测，判断菌株的产量、质量、抗逆性、适应性等性状；明确是否为需要的优良菌株，能否适应当地栽培。
食用菌引种与一般农作物的引种试验不同，需要经过菌种引进、母种扩繁、原种生产、栽培种生产、菌棒制作、灭菌接种、菌丝培养、出菇试验等多个生产环节，菌种制种扩繁、菌棒制作培养等时间长、中间环节繁琐。出菇试验（检验）是菌种投入生产前必须做的结实性鉴定试验，从出菇的子实体的形态特征、生理特性、栽培性状、产量及经济效益等进一步确定菌种的优劣，以避免菌种选育不当而造成不可估量的损失。
姬菇（Pleurotus cornucopiae）又叫小平菇，指采收直径2-5cm的一种平菇，隶属于担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属。目前，姬菇的出菇方式主要有两种，一种是固体种接种于栽培料菌棒，一种是液体种接种于栽培料菌棒，这两者相对比较而言使用液体种接种菌棒出菇的时间较短。
发明内容
本发明要解决的技术问题提供一种姬菇液体发酵培养及快速出菇检验的方法，以改善姬菇的液体发酵培养条件，促进菌丝球的产量和质量增加；可以利用液体发酵培养在较短时间内进行大量菌种扩繁培养及快速鉴定菌种出菇质量和生产性能。
为了达到上述目的，本方案中的一种姬菇液体发酵培养及快速出菇检验的方法，包括以下步骤：
步骤一 ：姬菇菌种活化：将姬菇菌种接种于改良琼脂培养基中进行活化，培养11d后分离获得活化菌丝体。
改良琼脂培养基配方：葡萄糖20 g、琼脂粉22 g、土豆200 g 、麸皮20g、玉米面5g、黄豆粉5g、磷酸二氢钾2g，硫酸镁2g，VB110mL，平菇子实体100g，加水定容至1000 ml 。
步骤二 ：一级液体培养基的制备：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 2g、VB1 20 mg，加水定容至1000 ml，pH自然，搅拌溶解至均匀，121℃条件下30 min高压灭菌后待使用。将步骤一中活化后的菌丝体使用70 mm打孔器打孔后，转接5块到一级液体培养基中，室温下静置避光培养2 d后，在150 r/min、25℃摇床条件下培养培养7 d后得到姬菇一级液体菌种。
步骤三 ：二级液体培养基的制备：玉米粉24.8 g、豆粕10 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 2g、VB1 20 mg、0.6 mmol GABA，加水定容至1000 ml，pH自然，搅拌溶解至均匀，121℃，30 min高压灭菌后待使用。
步骤四 ：接种：将培养好的姬菇一级液体菌种接3 mL到二级液体培养基中，转入恒温摇床150 r/min、25℃避光培养9 d后，获得液体培养物Ⅰ（姬菇二级液体菌种） ，将培养物1从摇床取出置于20℃恒温培养箱中避光培养15 d后得到固化培养物Ⅱ（固化后的姬菇二级液体菌种），并保持培养箱内湿度在70%～80%。
步骤五 ：出菇管理：将培养好的固化培养物Ⅱ从培养箱内取出，打开组培盖，置于出菇房进行出菇管理，每天通风换气2次，每次30 min，同时也增加适宜的散射光。培养3～5d后进入原基形成阶段，温度控制在15℃～18℃，空气相对湿度控制在70%～80%；在子实体形成时期，温度控制在16℃～21℃，湿度控制在85%～90%；幼菇生长期，结合喷雾，以喷雾方式对菇体喷施“葡萄糖0.1%+磷酸二氢钾2‰”，待姬菇子实体菌盖直径达2～3 cm，菌柄伸长到5～7 cm即可进行采收；
步骤六 ：第一潮菇采收后，清除菌根，保持液体培养基表面菌丝洁净，对固化培养物Ⅱ施用配制好的钙镁氨基酸营养剂，每个组培瓶内喷施5 mL后按照步骤五继续培养；原基形成阶段，温度控制在15℃～18℃，空气相对湿度控制在70%～80%；二潮幼菇生长期，保持菇房的温度控制在16℃～21℃，空气相对湿度在85%～90%，以喷雾方式对菇体喷施“VB15mg/kg+磷酸二氢钾0.2‰” 混合营养液，促进幼菇生长健壮及增加单个子实体重量；在第一潮菇采收后8～11 d，当菌盖直径到2～3 cm，菌柄伸长到5～7 cm时，采收第二潮菇.
钙镁氨基酸营养剂配方：钙镁（钙浓度160 ug·g-1 、镁浓度40 ug·g-1）0.01%～0.05%+ GABA0.01%～0.05%，121℃，30 min高压灭菌后待使用。
步骤七 ：第二潮菇采收后，清除菌根，保持液体培养基表面菌丝洁净，对固化培养物Ⅱ施用配制好的钙镁氨基酸营养剂和三十烷醇1mg/kg,然后按照步骤五继续培养，促进姬菇子实体原基再分化。原基形成阶段，温度控制在15℃～18℃，空气相对湿度控制在70%～80%；三潮幼菇生长期，保持菇房的温度控制在16℃～21℃，空气相对湿度在85%～90%，以喷雾方式对菇体喷施 “葡萄糖0.1%+氨基酸0.05% +磷酸二氢钾0.2‰”混合营养液，促进幼菇生长健壮及增加单个子实体重量；在第二潮菇采收后10～12 d采收第三潮菇。
进一步，所述液体摇瓶为组培瓶（6.5*11 cm)。利用广口瓶瓶口较宽的特点，使培养基能够充分加湿增加其出菇量，同时也能够保持较好的透气和透光性，可增加其培养物的含氧量。
进一步，所述步骤三液体培养基必须产生菌丝固化培养物Ⅱ。因为液体培养基必须固化后才能很好的形成原基，避免出现移动时不稳或者子实体不稳的情况。
进一步，所述步骤四原基形成期间必须保持相对较高的空气湿度。这样的环境湿度能够提供姬菇子实体生长所需水分，保持稳定的产量。
进一步，所述步骤五子实体形成期，出菇后必须进行一定的通风与光照。出菇子实体的色泽跟与菌盖、菌柄外观性状较好。
进一步，所述步骤六第一潮菇采收后，必须清楚干净残留，并喷施营养剂补充营养。
钙镁氨基酸营养剂配方：钙镁（钙浓度160 ug·g-1 、镁浓度40 ug·g-1）0.01%～0.05%+ GABA0.01%～0.05%，121℃，30 min高压灭菌后待使用。对幼菇采用喷雾方式喷施营养液为： “葡萄糖0.1%+氨基酸0.05% +磷酸二氢钾0.2‰”混合营养液，以促进幼菇生长健壮及增加单个子实体重量。
进一步，所述步骤七使用的营养液为配制好的钙镁氨基酸营养剂和三十烷醇1mg/kg。对幼菇采用喷雾方式喷施营养液为：“葡萄糖0.1%+氨基酸0.05% +磷酸二氢钾0.2‰”混合营养液，以促进幼菇生长健壮及增加单个子实体重量。
本发明的工作原理来源于前期研究成果：以玉米粉作碳源的培养基中，其对纤维素酶、多酚氧化酶、漆酶的诱导效果最好；以豆粕作氮源培养基中，其对纤维素酶、多酚氧化酶及漆酶的诱导作用都较强，这两者分别作为姬菇液体菌种培养的主要碳氮源效果最好。本发明改善了姬菇的液体发酵培养条件，在培养基的制备阶段，将玉米粉及豆粕加入到培养基内，玉米粉和豆粕的加入能够使培养基营养充分，玉米粉及豆粕的加入会使培养基的碳氮源营养更加充分，促进菌丝球的产量和质量增加。改变了传统的食用菌引种出菇试验方式，创新利用固化液体培养基直接出菇进行子实体的形态特征、生理特性、栽培性状、产量的快速鉴定，省去了菌包制作、灭菌、接种、菌包发菌培养、后熟及出菇的繁琐的环节和时间；利用液体发酵培养能在较短时间内进行大量菌种扩繁培养及快速鉴定菌种出菇质量和生产性能。本发明具有缩短出菇试验时间和降低成本，能快速进行菌种鉴定的目的。
本发明的有益效果：本发明通过利用液体培养基中菌丝生长扩繁速度快，菌丝生物量高、直径小、密度大、胞外酶活性较高、培养基易固化适宜出菇的特点，改变了传统的食用菌引种出菇试验方式，创新利用固化液体培养基直接出菇进行子实体的形态特征、生理特性、栽培性状、产量的快速鉴定，省去了菌包制作、灭菌、接种、菌包发菌培养、后熟及出菇的繁琐的环节和时间；利用液体发酵培养能在较短时间内进行大量菌种扩繁培养及快速鉴定菌种出菇质量和生产性能。省去了三级菌种生产和出菇试验中繁琐的程序，节省了菇体菌包培养和子实体出菇所需要的大量时间。此外，在出菇管理中，在菌种的不同生长时期控制不同的营养物，利于菌种的子实体原基分化及出菇，并提高其外观品质和产量。
具体实施方式
实施例：以姬菇2803品种液体培养基发酵及出菇方法作为实例进行阐述。
步骤一 ：姬菇菌种活化：将姬菇菌种接种于基础改良琼脂培养基中进行活化，培养后分离获得活化菌丝体。
改良琼脂培养基配方：葡萄糖20 g、琼脂粉22 g、土豆200 g 、麸皮20g、玉米面5g、黄豆粉5g、磷酸二氢钾2g，硫酸镁2g，VB110mL，平菇子实体100g，加水定容至1000 ml 。
步骤二 ：一级液体培养基的制备：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 2g、VB1 20 mg，加水定容至1000 ml，PH自然，搅拌溶解至均匀，121℃条件下30 min高压灭菌后待使用。将步骤一中活化后的菌丝体使用70 mm打孔器打孔后，转接5块到一级液体培养基中，室温下静置避光培养2 d后，在150 r/min、25℃摇床条件下培养培养7 d后得到姬菇一级液体菌种。
步骤三 ：二级液体培养基的制备：玉米粉24.8 g、豆粕10 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 2g、VB1 20 mg、0.6 mmol GABA，加水定容至1000 ml，PH自然，每个摇瓶200 ml，搅拌溶解至均匀，121℃，30 min高压灭菌后待使用。（在二级液体培养基配制时，先使用粉碎机将玉米及豆粕粉碎成粉末状，再将KH2PO4，MgSO4，VB1，GABA等药剂加水与其搅拌均匀，定容至1000ml。装入组培瓶（6.5*11 cm)的组培瓶，灭菌冷却至室温后于无菌的超净工作台中进行接种。）
步骤四 ：接种：将培养好的姬菇一级液体菌种接3 mL到二级液体培养基中，转入恒温摇床150 r/min、25℃避光培养9 d后，获得液体培养物1（姬菇二级液体菌种） ，将培养物1从摇床取出置于20℃恒温培养箱中避光培养15 d后得到固化培养物2（固化后的姬菇二级液体菌种），并保持培养箱内湿度在70%～80%。
步骤五 ：出菇管理：将培养好的固化培养物Ⅱ从培养箱内取出，打开组培盖，置于出菇房进行出菇管理，每天通风换气2次，每次30 min，同时也增加适宜的散射光。培养3～5d后进入原基形成阶段，温度控制在15℃～18℃，空气相对湿度控制在70%～80%；在子实体形成时期，温度控制在16℃～21℃，湿度控制在85%～90%；幼菇生长期，结合喷雾，以喷雾方式对菇体喷施“葡萄糖0.1%+磷酸二氢钾2‰”，待姬菇子实体菌盖直径达2～3 cm，菌柄伸长到5～7 cm即可进行采收。
步骤六 ：第一潮菇采收后，清除菌根，保持液体培养基表面菌丝洁净，对固化培养物Ⅱ施用配制好的钙镁氨基酸营养剂，每个组培瓶内喷施5 mL后按照步骤五继续培养；原基形成阶段，温度控制在15℃～18℃，空气相对湿度控制在70%～80%；二潮幼菇生长期，保持菇房的温度控制在16℃～21℃，空气相对湿度在85%～90%，以喷雾方式对菇体喷施“VB15mg/kg+磷酸二氢钾0.2‰” 混合营养液，促进幼菇生长健壮及增加单个子实体重量；在第一潮菇采收后8～11 d，当菌盖直径到2～3 cm，菌柄伸长到5～7 cm时，采收第二潮菇。
步骤七 ：第二潮菇采收后，清除菌根，保持液体培养基表面菌丝洁净，对固化培养物Ⅱ施用配制好的钙镁氨基酸营养剂和三十烷醇1mg/kg,然后按照步骤五继续培养，促进姬菇子实体原基再分化。原基形成阶段，温度控制在15℃～18℃，空气相对湿度控制在70%～80%；三潮幼菇生长期，保持菇房的温度控制在16℃～21℃，空气相对湿度在85%～90%，以喷雾方式对菇体喷施 “葡萄糖0.1%+氨基酸0.05% +磷酸二氢钾0.2‰”混合营养液，促进幼菇生长健壮及增加单个子实体重量；在第二潮菇采收后10～12 d采收第三潮菇。
采用上述姬菇液体发酵培养及快速出菇检验的方法，能改善姬菇液体发酵培养条件、促进原基分化和子实体生长，实现液体培固化养基直接快速出菇，可及时对新引种的姬菇品种的子实体形态特征、生理特性、栽培性状、产量、适应性进行快速出菇鉴定(试验)。
具体表现为：
1、减少出菇试验流程、缩短出菇试验时间和降低成本。与传统的菌棒出菇试验方式相比，减少了菌包制作、灭菌、接种、菌包发菌培养、后熟及出菇的繁琐的环节和时间，节省了姬菇生长周期50d以上，降低出菇试验的生产成本80%以上。
2、降低了菌种引种过程中检验菌种生活力耗费的时间，可快速检验菌种质量和生产性能。
3、在出菇管理中，在菌种的不同生长时期控制不同的营养物，利于菌种的子实体原基分化及出菇，并提高其外观品质和产量。三潮菇产量累计达40 g/瓶（组培瓶：6.5*11cm)以上，生物转化率达180% 以上。
Claims (5)
1. 一种姬菇液体发酵培养及快速出菇检验的方法，其特征是结合姬菇的生物学特性和菌丝液体发酵培养、液体培养基固化出菇的特点，将整个液体培养及出菇过程确定为以下步骤 ：
步骤一 ：姬菇菌种活化：将姬菇菌种接种于改良琼脂培养基中进行活化，培养11 d后分离获得活化菌丝体；
改良琼脂培养基配方：葡萄糖20 g、琼脂粉22 g、土豆200 g 、麸皮20g、玉米面5g、黄豆粉5g、磷酸二氢钾2g，硫酸镁2g，VB110mL，平菇子实体100g，加水定容至1000 ml ；
步骤二 ：一级液体培养基的制备：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 2 g、VB120 mg，加水定容至1000 ml，pH自然，搅拌溶解至均匀，121℃条件下30 min高压灭菌后待使用；将步骤一中活化后的菌丝体使用打孔器打孔后，转接5块到一级液体培养基中，室温下静置避光培养2 d后，在150 r/min、25℃摇床条件下培养培养7 d后得到姬菇一级液体菌种；
步骤三 ：二级液体培养基的制备：玉米粉24.8 g、豆粕10 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 2 g、VB1 20 mg、0.6 mmol GABA，加水定容至1000 ml，pH自然，搅拌溶解至均匀，121℃，30 min高压灭菌后待使用；
步骤四 ：将步骤二中培养好的姬菇一级液体菌种接3 mL到二级液体培养基中，转入恒温摇床150 r/min、25℃避光培养9 d后，获得液体培养物Ⅰ ，将液体培养物Ⅰ从摇床取出置于20℃恒温培养箱中避光培养15 d后得到固化培养物Ⅱ；
步骤五 ：出菇管理：将培养好的固化培养物Ⅱ从培养箱内取出，打开组培盖，置于出菇房进行出菇管理，每天通风换气2次，每次30 min，同时也增加适宜的散射光。
2.培养3～5 d后进入原基形成阶段，温度控制在15℃～18℃之间，湿度控制在70%～80%；在子实体形成时期，温度控制在16℃～21℃之间，湿度控制在85%～90%；幼菇生长期，结合喷雾，以喷雾方式对菇体喷施“葡萄糖0.1%+磷酸二氢钾2‰”，待姬菇子实体菌盖直径达2～3 cm，菌柄伸长到5～7 cm即可进行采收；
步骤六 ：第一潮菇采收后，清除菌根，保持液体培养基表面菌丝洁净，对固化培养物Ⅱ施用配制好的钙镁氨基酸营养剂，然后按照步骤五继续培养；二潮幼菇生长期，保持菇房的空气湿度在85%～90%，以喷雾方式对菇体喷施“VB1 5mg/kg+磷酸二氢钾0.2‰” 混合营养液，促进幼菇生长健壮及增加单个子实体重量；在第一潮菇采收后8～11 d，当菌盖直径到2～3 cm，菌柄伸长到5～7 cm时，采收第二潮菇；
步骤七 ：第二潮菇采收后，清除菌根，保持液体培养基表面菌丝洁净，对固化培养物Ⅱ施用配制好的钙镁氨基酸营养剂和三十烷醇1mg/kg,，然后按照步骤五继续培养，促进姬菇子实体原基再分化。
3.三潮幼菇生长期，保持菇房的空气湿度在85%～90%，以喷雾方式对菇体喷施 “葡萄糖0.1%+氨基酸0.05% +磷酸二氢钾0.2‰”混合营养液，促进幼菇生长健壮及增加单个子实体重量；在第二潮菇采收后10～12 d采收第三潮菇。
4.根据权利要求1所述的姬菇的出菇方法，其特征在于：所述步骤四中，培养期间保持培养箱内湿度在70%～80%；
根据权利要求1所述的姬菇的出菇方法，其特征在于： 所述步骤六中，钙镁氨基酸营养剂配方：钙镁（钙浓度160 ug·g-1 、镁浓度40 ug·g-1）0.01%～0.05%+ GABA0.01%～0.05%，121℃，30 min高压灭菌后待使用。
5.根据权利要求1所述的姬菇的出菇方法，其特征在于： 所述步骤六中，每个组培瓶内喷施5 mL钙镁氨基酸营养剂后按照步骤五继续培养。
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