CN115399203A - 一种鉴定作物对生物胁迫抗性的均匀接种法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴定作物对生物胁迫抗性的均匀接种法及应用，涉及生物胁迫抗性评价技术领域。本发明采用一定浓度一定剂量的根肿菌休眠孢子悬浮液与一定重量的基质进行充分混匀，然后进行栽培鉴定大白菜对根肿病的抗性。该方法相比于常规菌土接种法，精确了单株接菌量；根系生长环境菌量均匀一致，避免了漏接发生，省去了菌土法单株接种时菌土称量的繁复操作，节省了大量时间和精力。均匀接种法不但适用于种子播种鉴定，也适用于幼苗接种鉴定，提高了单株鉴定的准确度，增加鉴定样品的根系量，有利于开展更深入的科学研究的根系样品准备。
Description
技术领域
本发明属于生物胁迫抗性评价技术领域，具体涉及一种鉴定作物对生物胁迫抗性的均匀接种法及应用。
背景技术
大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)在植物学分类上属于十字花科、芸薹属、芸薹种草本植物，主要食用部位为叶球，叶球中含有大量的可溶性糖、粗纤维以及干物质。大白菜素有“百菜不如白菜”、“冬日白菜美如笋”之说，其全身含有丰富的营养，主要有糖类、脂肪、蛋白质、维生素B1、维生素C、维生素E、钙、磷、铁、胡萝卜素、尼克酸等，大白菜中的维生素C可增加人体的抵抗力并且预防癌症，对于坏血病和牙龈出血的有预防和治疗效果，维生素E有很好的护肤和养颜效果。大白菜起源于中国，为中国本土的特产蔬菜，分布广泛，全国各地均有种植，栽培面积和产量均居蔬菜作物之前列。
大白菜在栽种过程中经常会遭受到许多病虫害的威胁，常见的主要病害有霜霉病、软腐病、肿根病、角斑病、炭疽病等，其中根肿病俗称大根病、菜癌、菜瘤子，是一种由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)侵染引起的专性寄生十字花科植物的一种世界性土传病害。根肿菌可在壤中可休眠存活5～7年，其休眠孢子对环境的抗逆性极强，侵染十字花科植物后，植株感病，生长缓慢，地下部分主根、侧根和须根形成大小不等的肿瘤，地上部萎蔫，严重时直接枯死。
根肿病防治困难，轮作、提高土壤pH、化学药剂、生防防治等防控研究取得了一定的进展，但存在成本高，效果不稳定，防效达不到100％及环境安全等问题。与之相比，抗病品种的应用具有经济、有效、环境友好的特点，可从根本上解决根肿病危害。
抗病品种培育需要准确、易于操作的病害抗性鉴定系统，目前普遍采用的鉴定方法是菌土法。该方法适宜播种鉴定，操作简单，发病快，发病率和病情指数高。但在应用该方法进行根肿病抗性鉴定时发现，单株接菌量很难控制一致，每株菌土均需要单独称量，工作量繁复，菌量过高还会导致抗病品种也出现肿瘤，鉴定数量庞大时经常会出现漏接的情况，导致鉴定结果出现误差。同时播种鉴定发病快，感病材料只会形成较大根瘤，没有根系形成，很难获得足够量的根系样本，难以满足大白菜根肿病抗性机理研究的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴定作物对生物胁迫抗性的均匀接种法及应用，操作简单，节省了大量时间和精力，接种精度更高，避免漏接，大大增加根肿菌的接种效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种鉴定作物对生物胁迫抗性的均匀接种法，包括以下步骤：提取病原微生物的休眠孢子，制成菌液，以能够明显区分作物抗病品种和感病品种的浓度和剂量，与一定质量基质充分混合，得到菌量分布均匀的混菌育苗基质；
在所述混菌育苗基质活化后进行作物播种或移苗，培养一定时间后统计发病率和病情指数，根据发病率和病情指数判断作物的生物胁迫抗性。
优选的，所述作物包括十字花科芸薹属蔬菜。
优选的，所述病原微生物包括根种菌。
优选的，当所述作物为大白菜时，所述根种菌的接种浓度为1×105个孢子/g基质。
优选的，所述基质包括由体积比2:1:1的草炭、珍珠岩和蛭石配制得到的复合基质。
优选的，所述活化包括设施日温25～30℃条件下，基质保湿暗培养3～5d。
优选的，所述播种或移苗后采用0.5倍Hoagland营养液进行管理，设施日温25～30℃，播种30d后调查根系，计算发病率和病情指数。
本发明还提供了上述均匀接种法在筛选抗根肿菌大白菜种质中的应用。
本发明还提供了上述均匀接种法在确定大白菜种质适种范围中的应用。
本发明还提供了上述均匀接种法在大白菜抗根肿病机理精确取样的研究中的应用。
有益效果：本发明提供了一种鉴定作物对生物胁迫抗性的均匀接种法，采用一定浓度一定剂量的根肿菌休眠孢子悬浮液与一定重量的基质进行充分混匀，然后进行栽培鉴定大白菜对根肿病的抗性。该方法相比于常规菌土接种法，精确了单株接菌量；根系生长环境菌量均匀一致，避免了漏接发生，省去了菌土法单株接种时菌土称量的繁复操作，节省了大量时间和精力。均匀接种法不但适用于种子播种鉴定，也适用于幼苗接种鉴定，提高了单株鉴定的准确度，增加鉴定样品的根系量，有利于更深入的科学研究的根系样品准备。
本发明实施例中应用均匀接种法分别对大白菜抗病品种“尚品”和感病品种“鲁春白1号”进行播种鉴定和幼苗鉴定，“鲁春白1号”发病率100％，“尚品”发病率为0，单株鉴定结果准确率100％，说明均匀接种法能够准确区分抗病和感病单株，尤其有利于后代有分离的植株抗性鉴定。对照方法1×107个/g菌土接种法鉴定发病率小于100％，存在漏接现象，适用于播种鉴定，幼苗鉴定发病率下降。利用均匀接种法准确鉴定出多份抗源材料，幼苗鉴定发病率高，根系量显著高于播种鉴定，适宜于根系样品研究的根肿菌抗性鉴定。
具体实施方式
本发明提供了一种鉴定作物对生物胁迫抗性的均匀接种法，包括以下步骤：提取病原微生物的孢子，制成菌液，以能够明显区分作物抗病品种和感病品种的浓度和剂量，与一定质量基质充分混合，得到菌量分布均匀的混菌育苗基质；
在所述混菌育苗基质活化后进行作物播种或移苗，培养一定时间后统计发病率和病情指数，根据发病率和病情指数判断作物的生物胁迫抗性。
本发明所述作物优选包括十字花科芸薹属蔬菜，更优选包括大白菜。本发明所述病原微生物优选包括根种菌，实施例中优选接种根肿菌(采自云南楚雄姚安县前场镇木署村，实验室鉴定为Williams 4)。
当利用本发明所述均匀接种法鉴定大白菜对根肿菌的抗性时，优选包括从病原的根肿病病根中提取出孢子并制成菌液，确定菌液浓度，菌液与基质混匀制作成混菌育苗基质，基质中孢子浓度达到1×l05个/g，温室中活化3天，直接装盘播种。本发明所述基质优选为复合基质，且所述复合基质中草炭、珍珠岩和蛭石的体积比优选为2:1:1。本发明所述活化优选包括在设施日温25～30℃条件下，基质保湿暗培养3～5d。
在本发明中，优选播种或移苗后Hoagland营养液0.5倍液管理，设施日温25～30℃，播种30d后调查根系，计算发病率和病情指数。本发明所述营养液优选包括Hoagland营养液，配方优选包括：Ca(NO3)2·4H2O 945mg/L、KNO3607mg/L、NH4H2PO4115mg/L、MgSO4·7H2O493mg/L。
本发明所述发病率＝(发病植株/总植株)×100％；
病情指数＝100×∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)；
本发明将病情指数＝0记为免疫I，0＜病情指数＜10记为抗病R、病情指数≥10记为感病S。其中大白菜根肿病的病情等级分级标准如表1所示：
表1大白菜根肿病病情等级分级标准
本发明实施例中，优选采用已知抗性的大白菜“尚品”(对云南34地混合根肿菌免疫)和“鲁春白1号”(对所有根肿菌易感)；以及新引进品种资源“传奇”、“釜山”、“小家碧玉”、“新组合”、“德高CR117”、“CR福将”和“CR惠民”，进行根肿菌的抗性研究，各品种来源如表2所示。
表2大白菜品种及来源
本发明所述均匀接种法，可研究大白菜种质对相同或不同来源的根肿菌的抗性。
本发明还提供了上述均匀接种法在筛选抗根肿菌大白菜种质中的应用。
利用本发明所述均匀接种法，可评价同种大白菜对不同种根肿菌的抗性，也能评价不同种大白菜对同种根肿菌的抗性，还能评价不同种大白菜对不同种根肿菌的抗性，从而筛选出对目标根肿菌存在抗性的大白菜种质，确定大白菜种质的适种范围。
本发明还提供了上述均匀接种法在确定大白菜种质适种范围中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一种鉴定作物对生物胁迫抗性的均匀接种法及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中所涉及的实验均为2021年7月21日～2021年8月30日在云南农业大学蔬菜基地进行，其中所用的大白菜品种如表2所示，用的根肿菌为Williams 4根肿菌。在进行培养时，所用的营养液为Hoagland：Ca(NO3)2·4H2O 945mg/L、KNO3607mg/L、NH4H2PO4115mg/L、MgSO4·7H2O 493mg/L。
实施例中所称的接种方法：
均匀接种法：分别将根肿菌制成菌液，菌液与基质(草炭、珍珠岩和蛭石的体积比＝2:1:1)混匀制作成混菌育苗基质，基质中孢子浓度达到1×l05个/g，25～30℃温室中暗培养活化3天，直接装盘播种或移栽20天苗龄穴盘苗；
菌土法：将根肿菌制成菌液和草炭混合制成菌土，让菌土中孢子含量达到1×l07个/g，再在无菌的基质(草炭、珍珠岩和蛭石的体积比＝2:1:1)中挖穴，在穴中放约1g菌土，然后把萌发的种子播在菌土上并且盖上无菌的基质，或者将20天苗龄穴盘苗栽在菌土上，并用无菌基质固定。
实施例1
均匀接种法播种鉴定
以感病品种“鲁春白1号”、抗病品种“尚品”为试材，分别采用均匀接种法和菌土法接种Williams 4根肿菌(采自云南楚雄姚安县前场镇木署村)，催芽播种，72孔穴盘育苗(上口径40mm、底部15mm、外形530×270mm、深度50mm)，0.5倍Hoagland营养液管理，接种30天调查根系肿瘤形成状况，计算发病率和病情指数，结果如表3所示。
表3两种接种方法“鲁春白1号”和“尚品”病情鉴定结果
由表2可见，未接菌感病品种“鲁春白1号”无发病植株，说明无处理外因素影响抗性鉴定结果。采用均匀接种法接种“鲁春白1号”，植株100％发病，病情指数79.11，病情级别3级以上，发病特征明显；抗病品种无发病植株，说明均匀接种法能够准确鉴定根肿病抗病品种和感病品种，可应用于抗源鉴定和抗性品种筛选，应用均匀接种法成功鉴定出“尚品”、“传奇”、“小家碧玉”、“CR福将”4份大白菜抗根种病品种(表4)。所有植株均有较大程度的发病，说明无漏接现象发生，在鉴定时鉴定少量植株即可获得准确结果，在幅降低接种工作量；均匀接种法单株鉴定结果准确，有利于单株取样时的接菌鉴定，适用于有分离的群体中抗性植株的筛选。对照方法菌土法在大量单株接菌条件下，存在3％的漏接率，可应用于抗源鉴定和抗性品种筛选，但单株取样风险大，单株鉴定准确率达不到100％。
表4不同大白菜品种对大棚菌的抗性鉴定结果
实施例2均匀接种法幼苗鉴定
以感病品种“鲁春白1号”为试材，催芽播种，72孔穴盘育苗(上口径40mm、底部15mm、外形530×270mm、深度50mm)，0.5倍营养液管理20天。
均匀接种法：直径7cm营养钵中添加均匀接种根种菌的基质，移栽20天苗龄的穴盘苗；
菌土法：直径7cm营养钵中添加无根肿菌基质，接种1g孢子浓度1×l07个/g的菌土，20天苗龄的穴盘苗移栽在菌土上，用无菌基质固定。
移栽后均采用0.5倍Hoagland营养液管理，同时以播种接种作为对照。接种30天调查根系肿瘤形成状况，计算发病率和病情指数，结果如表4所示。
从表5可见，菌土法的幼苗接种20天，发病率仅有13％，远低于播种接种，说明菌土法不适宜幼苗接种。均匀接种法幼苗接种发病率仍然可达到10％，说该方法适宜幼苗接种鉴定，发病植株可获得单株374.18mg的根系量，是播种鉴定根系量的73.98倍，有利于单株鉴定的根系取样。
表5不同接种方法对发病率和根系生长的影响
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (9)
1.一种鉴定作物对生物胁迫抗性的均匀接种法，其特征在于，包括以下步骤：提取病原微生物的休眠孢子，制成菌液，以能够明显区分作物抗病品种和感病品种的浓度和剂量，与一定重量基质充分混合，得到菌量分布均匀的混菌育苗基质；
在所述混菌育苗基质活化后进行作物播种或移苗，培养一定时间后统计发病率和病情指数，根据发病率和病情指数判断作物的生物胁迫抗性。
2.根据权利要求1所述均匀接种法，其特征在于，所述作物包括十字花科芸薹属蔬菜。
3.根据权利要求1所述均匀接种法，其特征在于，所述病原微生物包括根种菌。
4.根据权利要求1或3所述均匀接种法，其特征在于，当所述作物为大白菜时，所述根种菌的接种浓度为1×105个孢子/g基质。
5.根据权利要求4所述均匀接种法，其特征在于，所述基质包括由体积比2:1:1的草炭、珍珠岩和蛭石配制得到的复合基质。
6.根据权利要求1所述均匀接种法，其特征在于，所述活化包括设施日温25～30℃条件下，基质保湿暗培养3～5d。
7.根据权利要求1所述均匀接种法，其特征在于，所述播种或移苗后采用0.5倍Hoagland营养液进行管理，设施日温25～30℃，播种30d后调查根系，计算发病率和病情指数。
8.权利要求1～7任一项所述均匀接种法在筛选抗根肿菌大白菜种质中的应用。
9.权利要求1～7任一项所述均匀接种法在确定大白菜种质适种范围中的应用。
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