CN108375658A - 一套评价杀菌剂对薯苗黑斑病防治效果的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一套评价杀菌剂对薯苗黑斑病防治效果的方法，该方法的接种方法——土壤或其它基质材料混合甘薯黑斑病菌分生孢子悬浮液接种，和培养方法——培养箱或人工气候室，最大限度的模拟大田薯苗的生长条件，能够保证各处理薯苗感病均匀，可满足评价杀菌剂防治效果的条件。同时又能够做到所有试验条件可调可控，与大田试验相比极大提高了试验的成功率、准确率，并缩短了试验周期，大幅改善了传统室内生测结果与实际应用结果差异巨大的弊端。本发明对薯苗感病严重度的分级是通过大量调查总结出来的，符合盆栽接种的实际情况。特别是创新的将薯苗茎段和末端伤口感病进行独立的分级和评价，对综合评价药剂的防治效果有重要的促进作用。
Description
技术领域
本发明涉及农用杀菌剂的效果评价技术，具体涉及一套评价杀菌剂对薯苗黑斑病防治效果的方法。
背景技术
甘薯黑斑病在世界各甘薯产区均有发生，在我国薯区发生普遍且危害严重。每年由该病造成的甘薯产量损失为5％-10％，危害严重时造成损失为20％-50％，甚至更高(中国农作物病虫害(第三版).北京：中国农业出版社，2015，848)。此外，病薯可产生甘薯黑疱霉酮(ipomeamarone)等呋喃萜类有毒物质，人和家畜使用后，可引起中毒，甚至死亡。
土壤带菌和病健混种等原因可引起健康薯苗的感病，而薯苗移栽大田后如果感病，会造成死苗和生长不良，还会侵染新结薯块产生病薯，导致在运输和储藏过程中健薯染病，而且为病原更大范围传播创造了条件。我国大部分地区均适合甘薯生产，随着地区间种苗频繁调运，种植大户专业种植规模扩大，重茬种植面积扩大，病害感染的风险越来越大。保护健康薯苗不被甘薯黑斑病菌侵染十分重要。
在药剂防治薯苗黑斑病方面，主要采取药剂浸苗的方式施药。而目前正式登记防治甘薯黑斑病的杀菌剂只有甲基硫菌灵、多菌灵、代森铵、乙蒜素四种，且施药方式绝大多数为浸薯块，少量的施药方式为浸种，没有正式登记处理薯苗的药剂和处理方法。药剂种类少和施药技术研究的匮乏是薯苗黑斑病防治中存在的突出问题。
筛选适用的杀菌剂是提高薯苗黑斑病防治水平的重要手段，常规的杀菌剂筛选方法主要包括室内筛选和大田试验两大类。甘薯黑斑病防治药剂室内筛选使用最多的是菌丝生长抑制法，主要步骤是制备含药培养基，接种菌饼至含药培养基，通过计算不同浓度杀菌剂对菌饼菌丝生长的抑制作用来评价筛选杀菌剂。由于甘薯黑斑病致病菌的分生孢子在水中萌发率低，直至最近甘薯长喙壳分生孢子促萌发技术建立，孢子萌发法才开始应用于甘薯黑斑病防治药剂筛选(张德胜等，中国生物防治学报，2017,33(5)：681-685)。另一种室内筛选防治甘薯黑斑病药剂的方法为水培薯苗结合人工接种技术。室内筛选虽然简单便捷，条件易于控制，但与病害侵染过程中的环境、寄主条件差异巨大，经常出现室内生测结果与大田试验结果不符的情况。大田防治试验可以对药剂、环境和寄主相互作用下的防治效果进行评价，可用来验证室内筛选的结果，是筛选杀菌剂的重要环节。但大田试验不可控因素较多，试验周期长，成本高，且有一定失败率，结果不稳定。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一套评价杀菌剂对薯苗黑斑病防治效果的方法，该方法能够最大限度的模拟薯苗在大田的生长环境，能够控制病原菌的接种强度，全面的评价药剂对薯苗地下茎段和伤口的保护作用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一套评价杀菌剂对薯苗黑斑病防治效果的方法，将土壤或其它基质材料用常规方法消毒灭菌后作为盆栽基质，用无菌水润湿，将病原菌的分生孢子悬浮液均匀混入润湿后的盆栽基质中，装入底部有孔的营养钵；将待测杀菌剂制成不同浓度的药液，把剪下的新鲜薯苗插入药液进行浸苗处理后扦插进营养钵，得到盆栽薯苗；随后将盆栽薯苗置于培养箱或人工气候室进行培养；培养一段时间后调查薯苗茎段和末端伤口的感病情况，评价杀菌剂对薯苗黑斑病的防治效果。
土壤为农田表层土壤，其它基质材料为市售蛭石和草炭土的混合物，蛭石和草炭土的体积比为1:1。
消毒灭菌的方法为阳光暴晒7-14天；所述无菌水与盆栽基质体积比为1:10-12。
病原菌为甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata)，分生孢子悬浮液的浓度为103-107个孢子/mL。
分生孢子悬浮液与润湿后的盆栽基质的体积比为1:4-7。
新鲜薯苗的茎段长度14-16cm，将薯苗的叶片剪除，保留顶芽和2-3个腋芽。
浸苗的深度为4-5cm。
盆栽薯苗的培养条件为：23-27℃，每24h光照时长12-16h，7天。
茎段感病的分级标准如下：0级，无病斑；1级，有一个长轴小于等于1cm的病斑；3级，有两个长轴小于等于1cm的病斑或一个长轴大于1cm小于等于2cm的病斑；5级，单独病斑或融合病斑长轴大于2cm小于等于3cm，或短轴宽度达到茎粗一半；7级，单独病斑或融合病斑长轴大于3cm，或短轴达到茎粗的三分之二，植株生长不良。
茎段末端伤口感病的分级标准如下：0级，不感病；1级，伤口边缘感病，病斑长度小于等于茎段周长的四分之一，或伤口切面感病，感病面积小于等于切面的四分之一；3级，伤口边缘感病，病斑长度大于茎段周长的四分之一，小于等于茎段周长的二分之一，或伤口切面感病，感病面积大于切面的四分之一，小于等于切面的二分之一；5级，伤口边缘感病，病斑长度大于茎段周长的二分之一，小于等于茎段周长的四分之三，或伤口切面感病，感病面积大于切面的二分之一，小于等于切面的四分之三；7级，伤口边缘感病，病斑长度大于茎段周长的四分之三，或伤口切面感病，感病面积大于切面的四分之三。
本发明有益效果：
1、本发明通过反复试验验证，掌握了一套评价杀菌剂对薯苗黑斑病防治效果的方法。该方法能够有效模拟大田生产条件，快速、准确的通过薯苗的感病和生长情况评价杀菌剂的防治效果和安全性。还可通过控制试验条件来探索影响防治效果的关键因素。
2、本发明的接种方法——土壤或其它基质材料混合甘薯黑斑病菌分生孢子悬浮液接种，和培养方法——培养箱或人工气候室，最大限度的模拟大田薯苗的生长条件，能够保证各处理薯苗感病均匀，可满足评价杀菌剂防治效果的条件。本发明还可以通过改变分生孢子接种量的大小来调节感病的严重度，从而满足不同的试验要求。
3、本发明对薯苗感病严重度的分级是通过大量调查总结出来的，符合盆栽接种的实际情况。特别是创新的将薯苗茎段和末端伤口感病进行独立的分级和评价，对综合评价药剂的防治效果有重要的促进作用。
4、本发明可以最大限度的模拟生产实际，同时又能够做到所有试验条件可调可控，与大田试验相比极大提高了试验的成功率、准确率，并缩短了试验周期，大幅改善了传统室内生测结果与实际应用结果差异巨大的弊端。通过对单独试验条件的调整，还能满足不同层次试验的要求。
附图说明
以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为茎段感病的分级标准。
图2为茎段末端伤口感病的分级标准。
图3为实施例4不同浓度四霉素处理的水培薯苗生长情况。
图4为实施例4不同浓度四霉素处理的盆栽薯苗生长情况。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
1、实验材料：
盆栽基质：将干燥的蛭石和草炭土阳光暴晒7-14天后等体积混匀。加入无菌水润湿，无菌水与盆栽基质体积比为1:10。
甘薯薯苗：薯苗品种均为商薯19。将甘薯薯块采用常规方法催芽，薯苗长至15-20cm高时采取常规的高剪苗方法获得扦插用薯苗，或者在育苗床选取合适茎段进行截取获得扦插用薯苗(每棵薯苗茎段长度15cm左右)，将薯苗的叶片剪除，保留顶芽和2-3个腋芽。
分生孢子悬浮液：将病原菌(甘薯长喙壳菌Ceratocystis fimbriata)接种于PCA培养基或其它适生培养基上，25℃避光培养8-10天，用蒸馏水将分生孢子洗下，配制成浓度103-107个孢子/mL的孢子悬浮液。孢子悬浮液的浓度可根据不同的试验要求进行调节，孢子悬浮液的配制总量根据试验的处理数进行计算。
病土制备：将湿润后的盆栽基质与分生孢子悬浮液按照体积比1:5在容器中充分混匀，移至底部有孔的营养钵中，盆栽基质厚度应在6-8cm。
供试杀菌剂准备：根据试验目的，将待测杀菌剂使用蒸馏水配制成特定的浓度，药液的深度为3-4cm，药液现配现用。
2、实验方法
按试验要求将一定数量的薯苗使用配置好的药液进行浸苗处理，浸苗深度(茎段插入药液的深度)5cm左右。浸苗时间根据试验要求确定，浸苗结束后沥干水分，扦插入含病土的营养钵，保证薯苗插入病土的深度等于或稍大于药液浸苗的深度。将盆栽薯苗置于培养箱或人工气候室光暗交替培养7天左右(每24h光照时长12-16h)，培养温度25℃左右，如需补水，需将水加入盛放营养钵的托盘，不能直接加入营养钵。
3、评价标准
杀菌剂对薯苗黑斑病的防效评价：将培养7天左右的薯苗从营养钵移出，使用清水洗净茎段和根系，晾干后对杀菌剂的防效进行评价。效果评价分为两部分：
茎段感病的分级标准如下(图1)：0级，无病斑；1级，有一个长轴小于等于1cm的病斑；3级，有两个长轴小于等于1cm的病斑或一个长轴大于1cm小于等于2cm的病斑；5级，单独病斑或融合病斑长轴大于2cm小于等于3cm，或短轴宽度达到茎粗一半；7级，单独病斑或融合病斑长轴大于3cm，或短轴达到茎粗的三分之二，植株生长不良。
茎段末端伤口感病的分级标准如下(图2)：0级，不感病；1级，伤口边缘感病，病斑长度小于等于茎段周长的四分之一，或伤口切面感病，感病面积小于等于切面的四分之一；3级，伤口边缘感病，病斑长度大于茎段周长的四分之一，小于等于茎段周长的二分之一，或伤口切面感病，感病面积大于切面的四分之一，小于等于切面的二分之一；5级，伤口边缘感病，病斑长度大于茎段周长的二分之一，小于等于茎段周长的四分之三，或伤口切面感病，感病面积大于切面的二分之一，小于等于切面的四分之三；7级，伤口边缘感病，病斑长度大于茎段周长的四分之三，或伤口切面感病，感病面积大于切面的四分之三。
计算公式为：
病情指数＝∑(各级感病薯苗数×相对级数值)/(调查总薯苗数×7)×100
防治效果(％)＝(无菌水对照病情指数－药剂处理病情指数)/无菌水对照病情指数×100
杀菌剂对薯苗安全性的评价：将薯苗用清水冲洗干净，观察薯苗的茎段有无变色，茎段表皮有无水浸状斑点或斑块；不定根生长是否受到抑制，是否出现畸形；顶芽或腋芽生长是否受抑制。
实施例1、不同接种浓度与薯苗感病率的关系试验
制备浓度5×105个孢子/mL、1×106个孢子/mL、1.5×106个孢子/mL的分生孢子悬浮液，按照病土制备方法接种不同浓度的分生孢子悬浮液作为不同处理，每个营养钵扦插10株薯苗，每钵苗为一个重复，每个处理设4次重复。扦插完成后，将营养钵置入托盘，放入25℃恒温箱培养7天后调查感病情况。结果见表1、表2。
表1不同接种量对薯苗茎段感病的影响
注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平差异显著，不同大写字母表示在0.01水平差异显著。(下同)
表2不同接种量对薯苗茎段末端伤口感病的影响
根据表1、表2的试验结果，对薯苗茎段的感病调查中，病株率和病情指数均随接种的分生孢子浓度增加而增加，分生孢子浓度分别为5×105个孢子/mL、1×106个孢子/mL、1.5×106个孢子/mL的三个处理，平均病株率分别为65％、92.5％、100％；平均病情指数分别为17.14、39.64、57.86，三处理间的病情指数差异极显著。对薯苗茎段末端伤口的感病调查中，病株率和病情指数同样随接种的分生孢子浓度增加而增加，分生孢子浓度分别为5×105个孢子/mL、1×106个孢子/mL、1.5×106个孢子/mL的三个处理，平均病株率分别为87.5％、97.5％、100％；平均病情指数分别为71.07、96.07、100，中高孢子浓度处理间的病情指数差异不显著，均与低孢子浓度处理的病情指数差异极显著。通过调查发现，使用相同浓度的病原菌分生孢子接种，薯苗茎段的末端伤口的感病率和病情指数均高于薯苗的茎段，因此薯苗末端伤口更容易受到病原菌侵染。
实施例2、盆栽与水培条件下不同浓度百菌清处理薯苗对黑斑病的防效比较
试验共6个处理，包括空白对照(不进行杀菌剂处理)和5个不同浓度的百菌清药剂处理，百菌清浓度分别为：300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L。每个处理4次重复，每个重复10株薯苗。将薯苗按重复分别置入不同浓度的百菌清药液中，25℃浸苗6h。
盆栽培养按照实施例1的方法将每个重复扦插入一个营养钵进行培养，病土的分生孢子悬浮液接种浓度为5×105个孢子/mL。水培法是将每重复薯苗转移至单独放置的孢子悬浮液中，浸泡接种6h，接种浓度为5×105个孢子/mL，浸泡深度与药剂处理时相同；后转入无菌水中继续培养，培养条件同盆栽培养。其中水培薯苗茎段感病分级标准为：0级，无病斑；1级，有零星小病斑出现，病斑总数小于5个；3级，病斑较大，病斑总数小于15个；5级，病斑相连，连片长度小于等于1.5cm；7级，病斑相连，连片长度大于1.5cm；水培薯苗末端伤口感病分级标准同盆栽薯苗。7天后调查甘薯黑斑病感病情况并计算防治效果，并观察有无药害现象，结果见表3。
表3盆栽培养与水培条件下不同浓度百菌清处理对薯苗黑斑病防效的影响
根据表3的试验结果，盆栽培养条件下各药剂处理对薯苗茎段和薯苗末端伤口的防治效果随药剂浓度的增加而提高，对薯苗茎段的防治效果为44.01-79.33％，其中百菌清浓度500mg/L、600mg/L和700mg/L处理间防治效果差异不显著，但显著高于其它处理的防治效果；对薯苗茎段末端伤口的防治效果为35.21-70.25％，500mg/L、600mg/L和700mg/L处理间防治效果差异不显著，但显著高于其它药剂处理。通过两组防效的t检验结果可知，P值均大于0.05，两组防效差异不显著，相同浓度的百菌清防治甘薯黑斑病，对薯苗茎段的防治效果与对薯苗茎段末端伤口的防治效果基本一致。
水培条件下各药剂处理对薯苗茎段的防治效果为70.73-93.64％，其中百菌清浓度400-700mg/L处理间防治效果均高于80％；对薯苗茎段末端伤口的防治效果为81.53-98.65％，500mg/L、600mg/L和700mg/L处理间防治效果差异不显著。通过两组防效的t检验结果可知，400mg/L和600mg/L处理P值大于0.05，两组防效差异不显著；其它处理相同浓度下，对薯苗茎段末端伤口的防治效果显著优于对薯苗茎段的防治效果。
盆栽和水培条件下百菌清对薯苗茎段及末端伤口的防治效果均随药剂浓度的增加而增加，但水培条件下的防治效果远高于盆栽培养条件下的防治效果，因此如果根据水培结果确定大田试验的药剂浓度，将产生非常大的防效偏差。且水培条件下薯苗不定根韧性较差，易折断，盆栽条件下薯苗不定根韧性强，植株更加健壮，表明盆栽条件更适合薯苗生长。
百菌清对薯苗安全性的评价：盆栽和水培条件下薯苗的顶芽、腋芽和不定根生长正常，茎段表面无变色，无水浸状斑点，表明百菌清对薯苗安全。
实施例3、不同浓度甲基硫菌灵处理薯苗对黑斑病的防效试验
试验共6个处理，包括空白对照(不进行杀菌剂处理)和5个不同浓度的甲基硫菌灵药剂处理，甲基硫菌灵浓度分别为：300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L。每个处理4次重复，每个重复10株薯苗。将薯苗按重复分别置入不同浓度的甲基硫菌灵药液中，25℃浸苗6h；按照实施例1的方法将每个重复扦插入一个营养钵进行盆栽培养，病土的分生孢子悬浮液接种浓度为5×105个孢子/mL；7天后调查黑斑病感病情况并计算防治效果，结果见表4。
表4不同浓度甲基硫菌灵处理对薯苗黑斑病防效的影响
根据表4的试验结果，各药剂处理对薯苗茎段和薯苗末端伤口的防治效果随药剂浓度的增加而提高，对薯苗茎段的防治效果为17.58-70.52％，其中甲基硫菌灵浓度600mg/L和700mg/L的处理防治效果显著高于其它处理的防治效果；对薯苗茎段末端伤口的防治效果为3.70-44.65％，600mg/L处理的防效与700mg/L处理差异不显著，但显著高于其它药剂处理。通过两组防效的t检验结果可知，P值均小于0.05，两组防效差异明显，表明相同浓度的甲基硫菌灵防治甘薯黑斑病，对薯苗茎段的防治效果优于对薯苗茎段末端伤口的防治效果。
甲基硫菌灵对薯苗安全性的评价：薯苗的顶芽、腋芽和不定根生长正常，茎段表面无变色，无水浸状斑点，表明甲基硫菌灵对薯苗安全。
表5盆栽培养条件下甲基硫菌灵和百菌清对薯苗黑斑病防效差异的比较
分别对比实施例2和实施例3中两种药剂相同浓度下对薯苗茎段和茎段末端伤口的防治效果(表5)，发现具有内吸作用的甲基硫菌灵和不具内吸作用的百菌清使用同样的药剂处理方式，对薯苗黑斑病的防治效果有明显差异。甲基硫菌灵与百菌清对薯苗茎段的防治效果相近，其中浓度500mg/L和600mg/L两处理的P值均大于0.05，防效差异不显著。百菌清对薯苗末端伤口的防治效果要优于甲基硫菌灵，两种药剂相同浓度处理的防治效果均差异显著。
通过表5的数据对比发现，不同作用方式的杀菌剂对薯苗茎段和茎段末端伤口感染黑斑病的防治效果有很大不同，评价杀菌剂防效时将茎段感病情况和茎段末端伤口感病情况分别统计会更精确的反映药剂的效果，也是进一步进行多种药剂混配使用的重要参考。
实施例4、四霉素对甘薯薯苗的安全性试验
针对前期研究中0.3％四霉素水剂水培条件下对薯苗黑斑病有较好防效，但薯苗有药害产生的现象(张德胜等，9种生物制剂对甘薯长喙壳菌的抑制作用及防治效果[J]，中国生物防治学报，2017,33(5)：681-685)，进行了安全性试验。将四霉素处理后的薯苗，采取水培法和盆栽培养法分别培养，培养条件同实施例2。每种培养方式分4个处理，包括空白对照(不进行杀菌剂处理)和3个不同浓度的四霉素药剂处理，四霉素浓度分别为：6mg/L、8mg/L、10mg/L。每个处理4次重复，每个重复10株薯苗。将薯苗按重复分别置入不同浓度的四霉素药液中，25℃浸苗6h。培养7天后调查薯苗的生长情况，有无药害，结果见表6和图3、4。
表6四霉素对甘薯薯苗的安全性试验
通过表6和图3、4的调查，发现0.3％四霉素水剂对甘薯薯苗的表皮有一定的接触性伤害。在水培条件下，伤害不能恢复，逐渐发展成斑块，影响不定根生长。在盆栽培养的条件下，伤害可以恢复，7天后只剩表皮的微小干斑，不定根生长正常。水培和盆栽培养生长条件差异很大，造成对同一种药剂的安全性试验结果评价不同。与大田生产条件近似的盆栽法更适合进行药剂的安全性试验。
以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一套评价杀菌剂对薯苗黑斑病防治效果的方法，其特征在于，将土壤或其它基质材料用常规方法消毒灭菌后作为盆栽基质，用无菌水润湿，将病原菌的分生孢子悬浮液均匀混入润湿后的盆栽基质中，装入底部有孔的营养钵；将待测杀菌剂制成不同浓度的药液，把剪下的新鲜薯苗插入药液进行浸苗处理后扦插进营养钵，得到盆栽薯苗；随后将盆栽薯苗置于培养箱或人工气候室进行培养；培养一段时间后调查薯苗茎段和末端伤口的感病情况，评价杀菌剂对薯苗黑斑病的防治效果。
2.根据权利要求1所述的评价杀菌剂对薯苗黑斑病防治效果的方法，其特征在于，所述土壤为农田表层土壤，其它基质材料为市售蛭石和草炭土的混合物，蛭石和草炭土的体积比为1:1。
3.根据权利要求1所述的评价杀菌剂对薯苗黑斑病防治效果的方法，其特征在于，所述消毒灭菌的方法为阳光暴晒7-14天；所述无菌水与盆栽基质体积比为1:10-12。
4.根据权利要求1所述的评价杀菌剂对薯苗黑斑病防治效果的方法，其特征在于，所述病原菌为甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata)，分生孢子悬浮液的浓度为103-107个孢子/mL。
5.根据权利要求1所述的评价杀菌剂对薯苗黑斑病防治效果的方法，其特征在于，所述分生孢子悬浮液与润湿后的盆栽基质的体积比为1:4-7。
6.根据权利要求1所述的评价杀菌剂对薯苗黑斑病防治效果的方法，其特征在于，所述新鲜薯苗的茎段长度14-16cm，将薯苗的叶片剪除，保留顶芽和2-3个腋芽。
7.根据权利要求1所述的评价杀菌剂对薯苗黑斑病防治效果的方法，其特征在于，所述浸苗的深度为4-5cm。
8.根据权利要求1所述的评价杀菌剂对薯苗黑斑病防治效果的方法，其特征在于，所述盆栽薯苗的培养条件为：23-27℃，每24h光照时长12-16h，7天。
9.根据权利要求1-8任一项所述的评价杀菌剂对薯苗黑斑病防治效果的方法，其特征在于，茎段感病的分级标准如下：0级，无病斑；1级，有一个长轴小于等于1cm的病斑；3级，有两个长轴小于等于1cm的病斑或一个长轴大于1cm小于等于2cm的病斑；5级，单独病斑或融合病斑长轴大于2cm小于等于3cm，或短轴宽度达到茎粗一半；7级，单独病斑或融合病斑长轴大于3cm，或短轴达到茎粗的三分之二，植株生长不良。
10.根据权利要求1-8任一项所述的评价杀菌剂对薯苗黑斑病防治效果的方法，其特征在于，茎段末端伤口感病的分级标准如下：0级，不感病；1级，伤口边缘感病，病斑长度小于等于茎段周长的四分之一，或伤口切面感病，感病面积小于等于切面的四分之一；3级，伤口边缘感病，病斑长度大于茎段周长的四分之一，小于等于茎段周长的二分之一，或伤口切面感病，感病面积大于切面的四分之一，小于等于切面的二分之一；5级，伤口边缘感病，病斑长度大于茎段周长的二分之一，小于等于茎段周长的四分之三，或伤口切面感病，感病面积大于切面的二分之一，小于等于切面的四分之三；7级，伤口边缘感病，病斑长度大于茎段周长的四分之三，或伤口切面感病，感病面积大于切面的四分之三。
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2018
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