CN113016510A - 一种花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定方法。该方法为：肿根和蒸馏水的比例为1：50，配制为1×10⁷～2×10⁸个/mL的根肿病菌悬浮液；在花菜类蔬菜的幼苗长到两叶一心时，将前述配制的菌液在幼苗基部用注射法进行注射，每株幼苗注射2ml；接种后对幼苗进行常规培养，在接种7天、14天后，分别在每个穴盘的底部进行均匀浇灌400ml根肿病悬浮液，培养35天后，鉴定并筛选未感根肿病的花菜类蔬菜。利用本发明，在花菜类蔬菜幼苗长到两叶一心时，利用注射法对幼苗接种根肿病菌，通过调查植株的发病情况，鉴定抗病或感病的花菜类蔬菜。

Description

一种花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定方法

技术领域

本发明属于十字花科作物抗病性鉴定技术领域，具体涉及一种花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定方法。

背景技术

根肿病，又称根瘤病，由鞭毛菌亚门芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicaeWoron)引起，是一种危害严重的世界性土传病害，该病传染力强，传播速度快，防治难度大，主要危害十字花科蔬菜的根，使其根部出现大小不一的肿瘤，进而导致地上部发育受阻，生长逐渐迟缓、矮小，严重可致植株整株死亡。目前，全世界有60多个国家受均根肿病的影响，致使十字花科作物严重减产，约为10～15％，我国20多个省、市及自治区都有根肿病的发生，在西部和中部地区则更为严重。根肿病病原菌可在土壤中存活长达20年之久，发过病的田块，将不再适合十字花科蔬菜的种植，严重威胁十字花科蔬菜的生产。

花菜类蔬菜(Brassica oleracea Linnaeus var.botrytis Linnaeus)是十字花科芸薹属甘蓝种中以花球为产品的一个变种，是我国重要的栽培蔬菜之一。花菜原产地中海沿岸，最早在19世纪中末期传入中国，其营养丰富，风味鲜美，现己成为国内的主要蔬菜之一。然而近年来，四川、贵州、安徽、湖北等地花菜类蔬菜根肿病发病逐年加重，导致产量严重下降，甚至绝收，影响花菜市场的正常供应，这给产业发展和农民增收带来极大的挑战。

目前国内外对十字花科根肿病的研究比较多，无论是抗病育种还是根肿菌生理小种的鉴定，都需要对植株做根肿病性状调查，但主要集中于大白菜、甘蓝、油菜等，而花菜类蔬菜抗性鉴定方法研究则较少，因此急需要一个能够快速、准确的鉴定抗根肿病的鉴定方法，为花菜类蔬菜抗根肿病材料的筛选提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的是，提供一种花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定方法，解决现有技术中缺少关于花菜类蔬菜抗根肿病的快速而又准确的鉴定方法。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

本发明所述的一种花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定方法，包括如下步骤：

(1)配制根肿病菌悬浮液；

(2)在花菜类蔬菜的幼苗长到两叶一心时，将前述配制的根肿病悬浮液在幼苗基部用注射法进行注射；

(3)将前述接种后的幼苗进行常规培养，收集未感根肿病的花菜类蔬菜。

进一步地，所述步骤(1)中配制的根肿病菌悬浮液的浓度为1×10⁷～2×10⁸个/mL。

进一步地，所述步骤(1)中根肿病悬浮液的配制方法为：收集发病的花菜类蔬菜的新鲜肿根，清水洗净晾干后，在蔬菜组织粉碎机内粉碎、过滤、3000r/min离心10min，肿根和蒸馏水的比例为1：50，用灭菌水调制成根肿病菌悬浮液，所述收集的花菜类蔬菜的新鲜肿根以及配制好的根肿病悬浮液放入-20℃条件下保存。

进一步地，所述步骤(2)中根肿病悬浮液对幼苗根部进行注射时，每株幼苗注射2ml。

进一步地，所述花菜类蔬菜的培育方式为：选择50孔塑料穴盘及可盛水的托盘，将所述花菜类蔬菜播种在穴盘中进行生长发育。具体地，所述塑料盘的尺寸为54cm×26cm×9cm。

进一步地，当穴盘中的花菜类蔬菜在接种7天、14天后，分别在每个穴盘的底部进行均匀浇灌400ml根肿病悬浮液，并使其在塑料拖盘中保存3天。

进一步地，所述步骤(3)中幼苗常规培养的条件为：白天26℃条件下培养10小时，晚上18℃条件下培养14小时。所述幼苗常规培养的时间为35天。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1，本发明通过注射接种法，将配制的根肿病悬浮液对花菜类蔬菜幼苗进行注射处理后，抗病的植株根部正常，而感病的植株根部组织异常增生、膨大形成瘤状的肿根，从而将抗病和感病植株区分开来，达到获得抗根肿病植株材料的目的。

2，本发明发现花菜类蔬菜幼苗在两叶一心时期对根肿病病菌敏感性更强，更容易感病。因此，选择花菜类蔬菜在两叶一心时期，对花菜类蔬菜幼苗进行注射法接种，使得筛选出的抗病植株具有更强的抗感染性。

3，本发明不仅区分了花菜类蔬菜种质资源对十字花科根肿病的抗感能力，而且通过注射法能够提高某一花菜类蔬菜材料群体的抗根肿病性，花菜类蔬菜抗根肿病新品种的选育提供更多的抗病材料，对于花菜类蔬菜抗病育种实践及其理论研究上都很有价值。

附图说明

图1是本发明实施例中是50孔的塑料穴盘；

图2是本发明实施例中感染根肿病的花菜类蔬菜的植株；

图3是本发明实施例中未感染根肿病的花菜类植株。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。

实施例1，花菜类蔬菜在不同时期感染根肿病的鉴定分析

对上海主栽的花菜类蔬菜的常规品种沪绿88和耐热品种芥蓝在不同的生长期(子叶期和两叶一心期)以相同时间、相同浓度进行根肿病悬浮液注射处理。

试验方法：试验在上海市农业科学院园艺研究所试验基地温室中进行。首先，在重庆市武隆区病圃田采集花菜类蔬菜根肿病的新鲜组织(即花菜类蔬菜的根肿瘤)，清水洗净晾干后分装于塑料袋中，在-20℃冰箱中保藏。试验时取出肿块，用蔬菜组织粉碎机打成匀浆，八层纱布过滤，冷冻离心机3000r/min离心10min，弃上清，用蒸馏水悬浮，重复3次，肿根和蒸馏水的比例为1：50，最后悬浮至根肿病菌浓度为1×10⁷～2×10⁸个/ml，制得根肿病悬浮液，于4℃保存备用。

将无菌土和基质(该基质的主要成分为蛭石、泥炭和珍珠岩，购于大益农业科技股份有限公司)以体积比为1：3的比例混合拌匀，选择50孔塑料穴盘及可盛水的拖盘，在穴盘内播种花菜类蔬菜种子。参见图1，该图展示了50孔塑料穴盘及可盛水的拖盘。

分别在花菜类蔬菜幼苗长到子叶期和两叶一心时期进行注射接种处理。处理的具体方法为：用注射器吸取2ml根肿病悬浮液，在每个穴盘的幼苗根部进行注射，根肿病悬浮液通过幼苗流入塑料盘中，根肿病悬浮液在塑料盘中保存3d。3d后花菜类蔬菜幼苗进行常规培养，白天26℃、10小时，晚上18℃、14小时，然后在接种7天、14天后，分别在每个穴盘的底部进行均匀浇灌400ml的根肿病菌悬浮液，并使其在塑料拖盘中保存3天。常规培养35d后，将花菜类蔬菜植株挖出，清水洗净根部，调查植株的发病情况，根据花菜类蔬菜的根部是否有根肿瘤判断是否感染了根肿病。参见图2，该图展示了感染根肿病的花菜类蔬菜。参见图3，该图展示了未感染根肿病的花菜类蔬菜。统计发病株数，计算病情指数，根据病情指数计算值进行根肿病鉴定；其中，所述病情指数计算方法如式(Ⅰ)所示：

病情指数＝∑[各级病株数×相对病级数]×100/(调查总株数×3) (Ⅰ)

根据病情指数计算值进行根肿病鉴定标准如下：在病情指数小于等于30时，判定为抗病；病情指数大于30时为感病；

所述相对病级数为：

0级：根系正常生长，未发病；

1级：主根未发病，侧根发病有小瘤；

2级：主根有小瘤，或侧根有大瘤；

3级：主根侧根均有较大的根瘤。

参见表1，为两个品种的花菜类蔬菜在不同生长期感染根肿病的结果。

表1花菜类蔬菜在不同生长期感染根肿病的结果

从表1可以看出：两个品种的花菜类蔬菜在子叶期根肿病的病情指数分别为11.67、5，而两叶一心时期根肿病病情指数分别为63、18.33。通过数据结果，可以确定花菜类蔬菜在两叶一心时期对根肿病病原菌敏感性更强，更容易感染该病。因此，本发明技术方案中，待花菜类蔬菜幼苗长到两叶一心时期，进行注射接种处理。

实施例2，不同品种的花菜类蔬菜的根肿病抗性鉴定

供试材料：实施例中的所有材料均由上海农科院园艺研究所花菜课题组提供。其中编号为1至62为该课题组经过多年纯化的自交系材料；编号为63-68为中间材料；编号69-72为引进的抗根肿病花菜品种。

试验方法：试验在上海市农业科学院园艺研究所试验基地温室中进行。首先，在重庆市武隆区病圃田中采集的花菜类蔬菜根肿病新鲜组织(即花菜类蔬菜的根肿瘤)，清水洗净晾干后分装于塑料袋中，在-20℃冰箱中保藏。试验时取出根肿瘤，用蔬菜组织粉碎机打成匀浆，八层纱布过滤，冷冻离心机3000r/min离心10min，弃上清，用蒸馏水悬浮，重复3次，肿根和蒸馏水的比例为1：50，最后悬浮至根肿病菌浓度为1×10⁷～2×10⁸个/ml，制得根肿病悬浮液，于4℃保存备用。

将无菌土和基质以体积比为1：3的比例混合拌匀，选择50孔的塑料穴盘及可盛水的塑料托盘，在穴盘内播种花菜类蔬菜种子。其中，所述基质的主要成分为蛭石、泥炭和珍珠岩，购于大益农业科技股份有限公司。

待花菜类蔬菜幼苗长到两叶一心时，用注射器吸取2ml根肿病悬浮液，在每个穴盘的幼苗根部进行注射，根肿病悬浮液通过幼苗流入塑料盘中，根肿病悬浮液在塑料盘中保存3d。3d后花菜类蔬菜幼苗进行常规培养，白天26℃、10小时，晚上18℃、14小时，然后在接种7天、14天后，分别在每个穴盘的底部进行均匀浇灌400ml根肿病菌悬浮液，常规培养35d后，将花菜类蔬菜植株挖出，清水洗净根部，调查植株的发病情况，根据花菜类蔬菜的根部是否存在根肿瘤判断是否感染了根肿病。参见图2，该图展示了感染根肿病的花菜类蔬菜。参见图3，该图展示了未感根肿病的花菜类蔬菜。统计发病株数，计算病情指数，根据病情指数计算值进行根肿病鉴定；其中，所述病情指数计算方法如式(Ⅰ)所示：

病情指数＝∑[各级病株数×相对病级数]×100/(调查总株数×3)(Ⅰ)

根据病情指数计算值进行根肿病鉴定标准如下：在病情指数小于等于30时，判定为抗病；病情指数大于30时为感病；

所述相对病级数为：

0级：根系正常生长，未发病；

1级：主根未发病，侧根发病有小瘤；

2级：主根有小瘤，或侧根有大瘤；

3级：主根侧根均有较大的根瘤。

参见表2，为不同品种花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定结果。

表2花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定结果

从表2可以看出：自交系材料和中间材料的花菜类蔬菜病情指数基本都＞30，为感病材料，而所选的对照材料抗根肿病花菜类品种均＜30为抗性材料，说明试验基本符合抗病鉴定试验要求。本试验中，62份自交系材料均有不同程度的感病，病情指数最低的为36.67；病情指数最高的高达84.33。中间材料的病情指数也有所不同，其中65病情指数最低为30.67；67的病情指数最高为42.67。说明各花菜类种质资源对十字花科根肿病的感抗能力不同，通过此种注射鉴定方法能够获得各花菜类蔬菜材料对根肿病的感抗程度，为选育花菜类蔬菜抗根肿病新品种提供依据。对于中间材料，可以根据不同的感抗能力进一步有针对性的分离筛选抗性材料，为花菜类蔬菜抗根肿病新品种的选育提供更多的种质资源。

Claims (9)

1.一种花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制根肿病菌悬浮液；

(2)在花菜类蔬菜的幼苗长到两叶一心时，将前述配制的根肿病悬浮液在幼苗基部用注射法进行注射；

(3)将前述接种后的幼苗进行常规培养，收集未感根肿病的花菜类蔬菜。

2.如权利要求1所述的一种花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定方法，其特征在于：所述步骤1中配制的根肿病菌悬浮液的浓度为1×10⁷～2×10⁸个/mL。

3.如权利要求1所述的一种花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定方法，其特征在于，所述步骤1中根肿病悬浮液的配制方法为：收集发病花菜类蔬菜的新鲜肿根，清水洗净晾干后，在蔬菜组织粉碎机内进行粉碎、过滤、离心，肿根和蒸馏水的比例为1：50，用蒸馏水调制成根肿病菌悬浮液。

4.如权利要求1所述的一种花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定方法，其特征在于：所述步骤2中根肿病菌悬浮液对幼苗根部进行注射时，每株幼苗注射2ml菌液。

5.如权利要求1所述的一种花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定方法，其特征在于，所述花菜的培育方式为：选择50孔塑料穴盘及可盛水的托盘，将所述花菜种子播种在穴盘中进行生长发育。

6.如权利要求5所述的一种花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定方法，其特征在于，所述花菜接种根肿病的方式为：当穴盘中的花菜幼苗接种到7天、14天后，分别在每个穴盘的底部进行均匀浇灌400ml的根肿病菌悬浮液，并使其在塑料拖盘中保存3天。

7.如权利要求1所述的一种花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定方法，其特征在于，所述步骤(3)中幼苗常规培养的条件为：白天26℃条件下培养10小时，晚上18℃条件下培养14小时。

8.如权利要求1所述的一种花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定方法，其特征在于：所述步骤(3)中幼苗常规培养的时间为35天。

9.如权利要求1所述的一种花菜类蔬菜抗根肿病的鉴定方法，其特征在于，所述根肿病抗病性鉴定包括以下具体步骤：

计算病情指数，根据病情指数计算值进行根肿病鉴定；其中，所述病情指数计算方法如式(Ⅰ)所示：

病情指数＝∑[各级病株数×相对病级数]×100/(调查总株数×3)(Ⅰ)

根据病情指数计算值进行根肿病鉴定标准如下：在病情指数小于等于30时，判定为抗病；病情指数大于30时为感病；

所述相对病级数为：

0级：根系正常生长，未发病；

1级：主根未发病，侧根发病有小瘤；

2级：主根有小瘤，或侧根有大瘤；

3级：主根侧根均有较大的根瘤。

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