CN115349640A - 一种柚皮脱苦方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种柚皮脱苦方法及其应用，属于柚皮加工技术领域。所述脱苦方法包括以下步骤：将柚皮粉加入乙醇溶液中振荡浸提，离心得柚皮，浸提2次，脱除柚皮中的总黄酮。本发明通过优化柚皮总黄酮的提取工艺，有效提取出了柚皮中的柚皮总黄酮，使柚皮达到明显脱除苦味的效果。利用本发明方法得到的总黄酮，经纯化得到高纯度柚皮苷。利用本发明方法脱苦后的柚皮经超微粉碎得到柚皮膳食纤维，经动物实验证实，该柚皮膳食纤维在预防高脂小鼠肥胖和辅助降血脂功能方面有显著效果，同时有助于恢复高脂膳食小鼠肠道菌群的健康。利用本发明方法对柚皮脱苦，有助于柚皮资源的高值化开发，增加蜜柚附加值，为蜜柚深加工多元化提供实践材料和数据支撑。
Description
技术领域
本发明涉及柚皮加工技术领域，特别是涉及一种柚皮脱苦方法及其应用。
背景技术
琯溪蜜柚因其产量高、抗虫害能力强、皮薄肉多、汁多且口感香甜而闻名。柚皮中富含萜烯、黄酮、果胶等生理活性物质，内层白囊占柚子总重的约30％，被认为是膳食纤维和果胶的潜在来源。柚皮膳食纤维被认为拥有良好的理化性质和生理活性，国内外对柚皮膳食纤维的研究主要集中于提取工艺，主要是柚皮果胶提取和纯化，对其作为食物来源的研究鲜少。由于柚皮中的黄酮类物质产生较大的苦味，极大程度的限制了柚皮作为膳食原料的开发。如何有效提取柚皮中的黄酮，是柚皮脱苦的关键。
黄酮类化合物常用的提取方法有微波辅助提取法、超声波辅助提取法以及溶剂提取法等。溶剂提取法运用相似相溶原理，根据提取物的溶解能力，选择相应的溶剂从原料中提取出所需的成分，是提取黄酮最基础的方法，反应温和、设备简单，但黄酮得率不高，不能有效脱除柚皮的苦味。微波辅助提取法兼备溶剂消耗低和提取效果佳两大优点，但不适用于受热易分解物质的提取。超声波辅助提取法具备提取量大、效率高、节能且经济实用的优点。微波和超声辅助提取有助于黄酮得率的提高，但是在反应过程中可能会导致柚皮纤维结构的破坏和柚皮的褐变，不利于柚皮的后续利用，尤其是作为膳食原料的开发。
因此，在不破坏纤维结构的条件下，如何有效提取柚皮中的总黄酮，达到柚皮脱苦的目的，使柚皮更有利于作为膳食原料的开发，是目前亟待解决的问题。对柚皮膳食纤维进行研究，有助于柚皮副食品的开发，增加蜜柚附加值，为蜜柚深加工多元化提供实践材料和数据支撑。
发明内容
本发明的目的是提供一种柚皮脱苦方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过优化乙醇浸提柚皮总黄酮的提取工艺，有效提取出柚皮中的总黄酮，使柚皮达到明显脱苦的效果，提取的柚皮总黄酮进一步纯化制备高纯度柚皮苷，且脱苦后的柚皮纤维在预防肥胖、降血脂以及调节肠道菌群方面有显著效果。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种柚皮脱苦方法，包括以下步骤：将柚皮粉加入乙醇溶液中水浴振荡浸提，离心，收集柚皮沉淀物，浸提2次，脱除柚皮中的总黄酮；
所述柚皮粉为去除外层黄皮后的柚皮白瓤经干燥破碎后得到。
进一步地，所述柚皮粉和所述乙醇溶液的料液比为1g:20mL；所述乙醇溶液的体积浓度为85％；所述浸提时间为4h，浸提温度小于45℃。
本发明还提供一种柚皮总黄酮的提取方法，包括以下步骤：将柚皮粉加入乙醇溶液中，水浴振荡，离心，取上清液，浓缩，冷冻干燥，得到柚皮总黄酮；所述柚皮粉为去除外层黄皮后的柚皮白瓤经干燥破碎后得到。
进一步地，所述柚皮粉和所述乙醇溶液的料液比为1g:20mL；所述乙醇溶液的体积浓度为85％；所述水浴振荡的时间为4h。
本发明还提供一种柚皮苷的分离纯化方法，将所述的提取方法得到的柚皮总黄酮进行复溶后，经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶纯化，得到柚皮苷。
进一步地，所述Sephadex LH-20葡聚糖凝胶纯化时，用乙醇溶液洗脱，所述洗脱的进样量为2ml，洗脱速度为0.5mL/min。
进一步地，所述乙醇溶液的体积分数为30％。
本发明还提供一种柚皮膳食纤维，由柚皮粉经所述的脱苦方法处理后，再经干燥和超微粉碎得到。
本发明还提供一种所述的柚皮膳食纤维在制备预防肥胖和/或降血脂产品中的应用。
本发明还提供一种所述的柚皮膳食纤维在制备调节肠道菌群产品中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
1.本发明在乙醇浸提法的基础上，通过响应面实验设计，优化柚皮总黄酮的提取工艺，优化后的提取工艺下，柚皮总黄酮的得率达到6.01～6.13mg/g，有效地提取出了柚皮中的柚皮总黄酮。柚皮总黄酮经Sephadex LH20分离提纯得到柚皮苷，纯度为95.55～96.01％。
2.利用本发明优化的提取工艺对柚皮中的总黄酮进行提取，重复提取2次，即可使柚皮达到明显脱除苦味的效果，脱苦后的柚皮基本没有苦味。
3.本发明脱苦后的柚皮进行超微粉碎得到柚皮膳食纤维，经动物实验研究结果表明，膳食中补充柚皮膳食纤维，能有效抑制高脂膳食小鼠的体质量和附睾脂肪、肝脏、心脏、肾脏的重量上升，降低肝脏脂肪细胞水平和小鼠附睾脂肪中的脂肪细胞占比面积，还能明显降低小鼠血清中TC、TG、LDL-C的水平及提升HDL-C水平，在预防高脂小鼠肥胖和辅助降血脂功能方面有显著效果，同时有助于恢复高脂膳食小鼠肠道菌群的健康。
4.本发明将脱苦后的柚皮作为食物来源进行研究，有助于柚皮资源的高值化开发，增加蜜柚附加值，为蜜柚深加工多元化提供实践材料和数据支撑。
附图说明
下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为柚皮总黄酮浸提效果与乙醇溶液浓度、浸提时间和料液比之间的关系图；
图2柚皮总黄酮提取率在不同浸提次数下的变化；
图3为柚皮总黄酮的洗脱曲线；
图4为柚皮总黄酮的液相色谱图，其中(a)为柚皮总黄酮粗提物的液相色谱图，(b)为PPF1的液相色谱图，(c)为PPF2的液相色谱图，(d)为柚皮苷标准品的液相色谱图；
图5为不同浓度的柚皮总黄酮粗提物和PPF2的DPPH清除率；
图6为柚皮膳食纤维的粒径分布图；
图7为柚皮膳食纤维的扫描电镜观察图；
图8为柚皮膳食纤维的红外光谱分析图；
图9为柚皮膳食纤维X射线衍射图；
图10为柚皮膳食纤维的热分析；
图11为小鼠体质量变化图；
图12为柚皮膳食纤维对小鼠内脏重量的影响，其中a为柚皮膳食纤维对小鼠肝脏重量的影响，b为柚皮膳食纤维对小鼠肾脏重量的影响，c为柚皮膳食纤维对小鼠心脏重量的影响，d为柚皮膳食纤维对小鼠脾脏重量的影响，e为柚皮膳食纤维对小鼠附睾脂肪质量影响，同列字母不同表示差异性显著(P＜0.05)，同列字母相同表示差异性显著(P＞0.05)；
图13为小鼠肝脏脂肪HE染色放大400倍图；
图14为小鼠附睾脂肪油红O染色图；
图15为柚皮膳食纤维对小鼠血清的影响，其中a为柚皮膳食纤维对小鼠血清TC的影响；b为柚皮膳食纤维对小鼠血清TG的影响，c为柚皮膳食纤维对小鼠血清LDL-C的影响，d为柚皮膳食纤维对小鼠血清HDL-C的影响，e为柚皮膳食纤维对小鼠血清AI值的影响，f为柚皮膳食纤维对小鼠血清LCI值的影响，同列字母不同表示差异性显著(P＜0.05)，同列字母相同表示差异性显著(P＞0.05)；
图16为alpha多样性指数分析图；
图17为各组样品Venn图分析；
图18为门分类水平上各组微生物结构；
图19为属分类水平上各组微生物结构。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
本发明实施例中所用到的试剂和材料，若无特殊说明，均可通过普通购买获得。
实施例1浸提条件对柚皮总黄酮提取效果的影响
1.实验材料
琯溪蜜柚，采自漳州市平和县，剥皮后，去外层黄皮，只留白瓤，干燥(60℃，12h)，破碎过80目筛，获得柚皮粉，置于干燥器中常温保存，用于后续实验。
2.实验方法
2.1乙醇浓度、浸提时间以及料液比对柚皮总黄酮提取效果的影响
准确称量3.00g柚皮粉，于100mL锥形瓶中，设置17个重复，并编号1-18。1-6号按料液比1g：20mL，分别加入体积浓度40％、50％、60％、70％、80％和90％的乙醇溶液，常温下水浴振荡，浸提8h；7-12号按料液比1g：20mL，加入体积分数80％的乙醇溶液，常温下水浴振荡，分别浸提1、2、4、6、8和10h；13-17号分别按照料液比(g：mL)为1：12、1：15、1：18、1：21和1：24加入体积分数为80％的乙醇溶液常温(不超过45℃)下水浴振荡浸提4h，浸提结束后，将1-17号混合物离心(4500r/min，30min)取清液，定容至100mL，测定并计算总黄酮得率。
2.2总黄酮得率的测定
参照文献“Extraction,purification by macrospores resin and in vitroantioxidant activity of flavonoids from Moringa oliefera leaves”(HamedY S等，《South African Journal of Botany》，2019,124:270-279)中的实验方法，测定并绘制芦丁标准曲线，得到方程为y＝0.0012x-0.005，R2＝0.9999。在0-400μg/mL有良好的线性关系。总黄酮的得率计算公式为：
其中，C代表样品液中芦丁浓度，单位为μg/mL；V代表样品液体积，单位为mL；n代表样品测定时的稀释倍数；M代表样品的质量，单位为g。
3.结果与分析
如图1，随着乙醇浓度的增加，柚皮总黄酮的得率也随之提高。当乙醇浓度达到80％时，产物得率为5.56±0.05mg/g，浓度继续增加，柚皮总黄酮的得率上升速度变缓。柚皮中存在大量的纤维素，提取溶剂含一定量的水会促进纤维溶胀，增加原料与溶剂间接触面积，有利于总黄酮的提取。综合考虑，选用体积分数80％的乙醇溶液进行后续实验。
随着浸提时间的延长，总黄酮得率总体呈现出先上升后下降的趋势，总体来看，浸提时间对柚皮总黄酮浸提效果的影响要低于乙醇浓度。浸提时间为4h，柚皮总黄酮得率为5.96±0.19mg/g，达到峰值。浸提时间过长，柚皮中某些黄酮类物质可能被分解破坏，使得总黄酮得率随着浸提时间的增加可能呈现出下降趋势。综合考虑，选用4h提取时间进行后续实验。
随着料液比的增大，柚皮总黄酮得率呈上升趋势，这是由于黄酮的溶出与溶剂的溶解度有关，料液比过低，不利于柚皮总黄酮的溶出。料液比为1g：18mL时，总黄酮得率为5.60±0.16mg/g，料液比继续增大，增速开始减缓。综上，选择料液比为1g：18mL进行后续实验。
实施例2柚皮总黄酮浸提条件的响应面优化
1.响应面实验设计
利用响应面设计实验方法，对柚皮总黄酮提取参数进行优化，考察因素为乙醇浓度、浸提时间和料液比，并在Design-Expert 8.0.6.1软件中设计三因素三水平Box-Behnken中心组合实验。因素水平表见表1。
表1响应面因素水平表
以柚皮总黄酮得率为响应值。实验结果如表2所示。
表2响应面实验方案及结果表
实验结果用Origin进行处理(平均值±标准偏差)，SPSS 19.0软件进行统计学分析。从Design Expert 8.0.6.1软件中得到了二次多项式回归方程式：
Y＝5.93+0.23x1+0.030x2+0.13x3+0.023x1x2+0.10x1x3+0.007500x2x3-0.26x1 2-0.29x2 2-0.18x3 2
2.方差分析
响应面方差分析如表3所示。
表3响应面方差分析表
注：表中“*”表示有显著性差异；“**”表示有极显著性差异
如表3所示，构建的模型F＝175.17数值较高，P＜0.01，表明二次回归方程极其显著。同时失拟项中P＝0.1023>0.05，表明失拟项与纯误差质检关系不显著，无失拟因素的存在。因此表明该模型适用于柚皮总黄酮提取量的预测分析。
由R2为0.9968，证明了实验模型及回归方程的拟合程度良好，精准说明三个因素与黄酮得率之间的关系。表中对黄酮得率的影响程度按乙醇浓度(P<0.0001)，料液比(P<0.0001)和提取时间(P＝0.0281)依次降低。
3.响应面分析
等高线图和响应图由Design Expert 8.0.6.1软件绘制，响应面结果表明，柚皮总黄酮提取的最优工艺参数为乙醇浓度85.37％、浸提时间4.16h、料液比1：19.56(g：mL)，黄酮得率的预测值为6.02mg/g。为了检验实际操作的可行性，校正提取参数为乙醇浓度85％、浸提时间4h、料液比1：20(g：mL)，黄酮得率的实测值6.07±0.06mg/g，与预测值无显著差异。表明该模型能够较好的拟合乙醇浸提柚皮总黄酮的工艺。响应面优化确定柚皮总黄酮的提取条件为乙醇浓度85％、浸提时间4h、料液比1：20(g：mL)。
实施例3提取次数对柚皮膳食纤维苦味的影响
称取5.00g柚皮粉末，参照实施例2优化后的工艺，分别浸提1、2、3、4和5次，提取完成后，离心(4500r/min，30min)，取清液定容至100mL，计算黄酮提取率(图2)，残渣干燥并通过感官评定评价其苦味。
感官评价标准按照无苦味(0-1)、如有若无(阈值)(1-2)、轻微苦味(2-3)、明显苦味(3-4)、强烈苦味(4-5)对5组样品分别进行感官评价。品尝员10人(男5，女5)进行评分。结果见表4。
表4浸提次数对柚皮苦味的影响
多次提取实验结果如图2和表4所示。第一次浸提原料中柚皮总黄酮的提取率为81.22％，经二次提取后，提取率达到88.97％。由表4可知，提取2次后，柚皮已基本脱除苦味。柚皮经两次浸提，浸提液浓缩、冷冻干燥，粗提物得率16.48％，粗提物中黄酮含量4.45％。
实施例4柚皮总黄酮中柚皮苷的分离和纯化
1.方法
采用Sephadex LH20凝胶柱色谱法分离和纯化柚皮苷：
预处理与装柱：称取40g SephadexLH-20，用体积浓度95％的乙醇溶液浸泡24h使其充分溶胀。以湿法上柱(ф16mm×60mm)中，上柱过程中出现柱体断裂或者明显的气泡则需重新装柱。
平衡：用体积浓度30％的乙醇溶液洗脱该柱至少3BV，直到乙醇溶液充满整个柱。
纯化：将冷冻干燥后的0.5g柚皮总黄酮粗提取物，溶于5mL体积浓度85％的乙醇溶液中。进样量2mL，洗脱速度0.5mL/min，洗脱剂为体积浓度30％的乙醇溶液，逐管收集洗脱液(7min/管)，在280nm处测定吸光值并绘制洗脱曲线。收集合并相同组分，浓缩，冷冻干燥后进行下一步分析鉴定。
对分离物质进行HPLC分析：
液相条件：溶剂：超纯水和乙腈；流速：0.4mL/min；检测波长：280nm，进样量：10μL，柱温：35℃，反相对称C18色谱柱(Agilent ZORBAX SB-C18，4.6×250mm，5μm)，洗脱条件见表5。
表5HPLC流动相梯度洗脱时间表
2.结果
柚皮总黄酮粗提物用Sephadex LH20进行柱层析分离后的洗脱曲线如图3所示，图中有两个洗脱峰，且间距大，分离效果明显。收集两个组分，分别命名为PPF1(Pomelo PeelFlavonoids)、PPF2。液相分析结果如图4所示，HPLC结果表明，PPF1(图4b)峰型较杂，且无主峰，PPF2(图4c)，峰型单一，与柚皮苷标准品(图4d)对比，出峰时间一致，可以推定PPF2为柚皮苷。通过外标法检测，PPF2中柚皮苷纯度为95.78±0.23％。
实施例5柚皮黄酮的DPPH自由基清除能力
参照文献“苦丁茶不同提取物抗氧化活性比较及其GC-MS分析”(朱科学等，《热带作物学报》，2020,41(03):579-585)中的方法，对柚皮总黄酮粗提物和纯化物PPF2的DPPH清除能力进行测定。计算DPPH清除率：
其中，Asample为2mL样品+2mLDPPH·溶液的吸光值；Ablank为2mL样品+2mL乙醇溶液的吸光值；Acontrol为2mLDPPH·+2mL乙醇溶液溶液的吸光值。
结果如图5所示，从图5可以看出，柚皮总黄酮粗提物和纯化物PPF2的DPPH自由基清除率随着浓度的增加而增加，经计算，柚皮苷纯化物的IC50值为4.66mg/mL，(回归方程：y＝-0.0037x2+0.1027x-0.0286，R2＝0.9953)，粗提物为IC50值6.72mg/mL(回归方程：y＝-0.0072x2+0.1487x-0.0402，R2＝0.9842)。
实施例6超微粉碎柚皮膳食纤维的理化性质研究
称取5.00g柚皮粉末，参照实施例2优化后的工艺，浸提2次，提取完成后，离心(4500r/min，30min)，收集沉淀后，分为2组，一组干燥后普通粉碎后过80目筛，得到柚皮膳食纤维(PPDF)；另一组干燥后超微粉碎处理(低温高速球磨1h)，得到超微粉碎柚皮膳食纤维(SPPDF)。
1.柚皮膳食纤维的组成成分
参照国际标准分别测定PPDF和SPPDF中的水分、灰分、蛋白质以及膳食纤维。结果如表6。
表6柚皮膳食纤维组成成分
PPDF经超微粉碎处理后，水分含量由12.67±0.23％降低至7.41±0.08％，干基灰分含量小幅度下降，蛋白质和总膳食纤维含量变化不大，但SDF和IDF含量发生明显改变，其中SDF含量从36.32±0.72％上升至51.78±0.44％，IDF含量由53.27±0.44％下降至38.79±0.37％。粒径减小与IDF含量降低以及SDF升高之间存在正相关关系。这可能是由于超微粉碎过程中，极强机械力使纤维素致密晶体结构部分破坏及少量糖苷键断裂，使得PPDF中部分纤维素和半纤维向SDF转化。
2.柚皮膳食纤维持水、持油力、膨胀力和溶解性分析
准确称取PPDF与SPPDF样品，各0.5g于锥形瓶中，分别进行持水力、持油力、膨胀力和溶解性实验。按如下公式计算：
柚皮膳食纤维持水、持油力、膨胀力和溶解性结果见表7。
表7柚皮膳食纤维理化性质
与PPDF相比，SPPDF的持油力与持水力明显降低，持水力与水结合位点的结构、密度、数量和性质以及粒径有关，超微粉碎会导致膳食纤维颗粒粒径显著降低，导致其相互聚集能力增强，有可能阻碍水分子进入纤维内部，另一方面超微粉碎可能会导致纤维基质崩塌，破坏了样品颗粒内的多网状结构，从而降低其将水分保持在基质内部的能力。相比于PPDF，SPPDF的膨胀力由7.85mL/g显著增长为10.14mL/g。其原因可能是由于样品颗粒数目的增多导致溶于水后体积的增大，比表面积增大也会使得更多的亲水基团外露，从而促进SPPDF膨胀力的增加。相比于PPDF，SPPDF的溶解性由35.39±2.34％显著上升到52.19±1.49％。这一方面是由于SPPDF中SDF含量大幅度上升，另一方面可能是由于超微粉碎后样品的颗粒粒度减小，导致空隙率和比表面积增大，毛细吸引力增强，部分亲水基团的外露等原因导致溶解力增加。
3.柚皮膳食纤维吸附能力分析
分别对柚皮膳食纤维的葡萄糖吸附能力和胆固醇吸附能力进行测定，测定吸光值后得到葡萄糖吸附力拟合方程为：y＝0.9439x+0.0012，R2＝0.9999。在0-100μg/mL有良好的线性关系；胆固醇吸附力拟合方程为：y＝0.0292x+0.0231，R2＝0.9993。在0-20μg/mL有良好的线性关系。
分别在100μg/mL的ND2+和Cr6+的溶液中添加1.0g PPDF与SPPDF，水浴37℃振荡4h后离心(4000r/min，20min)，取上清液定容，在ICP-MS测定重金属离子的含量，并计算吸附率。重金属吸附率计算公式为：
PPDF和SPPDF对葡萄糖、胆固醇以及重金属的吸附结果如表8所示。
表8柚皮膳食纤维的吸附能力
SPPDF对葡萄糖的吸附能力是PPDF的1.94倍。可能由于超微粉碎对纤维网状结构的破坏，纤维粒径减小，比表面积大，颗粒出现缝隙，功能性基团暴露，使得葡萄糖更容易进入纤维的内部，而PPDF的结构相对致密，许多功能基团被包围在内部，难以发挥其吸附作用；相比于PPDF，SPPDF粒径减少，增大颗粒的比表面积，使其对胆固醇的吸附率上升；化学吸附是膳食纤维吸附重金属的主要途径，羧基和羟基等基团的数量影响膳食纤维对金属离子的吸附，超微粉碎使糖醛酸等相关基团暴露面积增大导致重金属吸附能力增强，从而导致SPPDF对铬、镉的吸附能力均呈现显著上升，相比于PPDF，SPPDF对铬、镉的吸附能力分别增加了9.1％和8.51％。
4.柚皮膳食纤维结构的测定
对PPDF样品和SPPDF样品分别进行粒径分布、扫描电镜、红外光谱、X-射线衍射以及热分析，研究柚皮膳食纤维的结构。结果见图6-10。
由图6可知，PPDF的颗粒大小分布范围为1.5～632.456μm，平均粒径为154.64μm,SPPDF的颗粒大小分布范围为2.75～111μm,平均粒径为9.21μm，相比于PPDF减少了88.33％。PPDF和SPPDF的粒径分布图中均只有一个主峰，其中SPPDF的峰型更均匀，说明超微粉碎后，SPPDF的粒径显著降低，粒径分布更为集中均匀。
PPDF与SPPDF电镜扫描结果如图7所示，SPPDF表面结构发生明显变化。SPPDF的颗粒明显更为细碎，且表面粗糙，不平整，这是由于超微破碎过程破坏了柚皮结构与完整性。同时超微粉碎过程中产生机械作用、空穴效应也会在一定程度上破坏细胞壁，增加多糖成分的溶出。此外，SPPDF的颗粒发生了分子团聚现象，可能是由于超微破碎过程导致了其颗粒变小，而当颗粒直径小到一定程度后，会显著增加颗粒相互之间的吸附性，这可能是导致SPPDF葡萄糖吸附能力上升的原因之一。
PPDF和SPPDF的红外光谱结果如图8所示，PPDF和SPPDF特征吸收峰的峰形、峰位置基本相似，主要由纤维素和果胶等大分子构成，超微粉碎并没有破坏多糖化学结构，不会影响多糖性质。
纤维素的结晶构型主要有五种，包括：天然纤维素I、人造纤维素II、III、IV和X，SPPDF和PPDF的X射线衍射图如图9所示，由图9可知，PPDF和SPPDF的晶体均属于天然纤维素I晶体构型。PPDF在16.08°和22.19°出现固有衍射峰，SPPDF的衍射峰出现在16.18°和22.29°。这说明超微粉碎不足以使柚皮膳食纤维的晶体结构发生显著破坏，但经过超微粉碎过程后，其衍射峰型宽化，结晶区占比减少。
2个样品升温过程中的TGA曲线如图10所示，在0-350℃，PPDF与SPPDF都有两个明显的峰值，峰面积没有明显的差异性，说明在这两个阶段，PPDF与SPPDF所减少的质量没有明显的差异性；两在加热过程中DSC均为规则的线性，这说明在整个升温过程中都没有放热和吸热的发生。
实施例7柚皮膳食纤维辅助降血脂活性研究
1.实验材料
实施例6制备的柚皮膳食纤维(PPDF)和超微粉碎柚皮膳食纤维(SPPDF)。
SPF级KM种雄性小鼠80只，体重为20±2g，北京华阜康公司，许可证号码：SCXK(京)2019-0008。
小鼠饲料：北京华阜康公司，许可证号：京饲证(2019)06076。其中高脂饲料配方(以质量百分数计)：猪油10％、蔗糖10％、蛋黄粉10％、胆酸钠0.2％、基础饲料69.8％。玉米芯垫料：山东华特威生物科技有限公司。
2.实验方法
参照欧洲食品科学委员会和中国营养学会标准，成人日均膳食纤维推荐摄入量为30g/d，以成人体重60kg，小鼠体重50g，小鼠：人换算系数9.1:1，日进食量5g饲料为基准，计算得小鼠饲料中膳食纤维的占比应为4.55％，取整为5％，以该剂量为中剂量组，2.5％为低剂量组，10％为高剂量组。
择健康的SPF级雄性KM小鼠80只，5只/笼，群养，控制饲养温度24±2℃，相对湿度为50％～60％，12h：12h昼夜间断照明。正式实验之前，先喂养正常饲料，使小鼠适应环境，饲养一周后，所有小鼠随机分为8组，每组10只小鼠，分组情况见表9。
表9分组情况
实验进行6周，期间，每周固定时间称量小鼠体重，第6周结束后，给小鼠称重。禁食过夜，次日取血眼球，脱颈处死并快速取出小鼠肝脏，心脏，脾脏，肾脏及附睾脂肪组织，用生理盐水漂洗干净，滤纸吸干表面水分后称量并记录重量。将附睾脂肪组织样品固定在脂肪固定剂，石蜡包埋，组织切片(5mm)用油红O染色，将肝脏切薄片于组织固定液中固定，组织切片(5mm)用HE染色并在带有照相设备的高分辨率显微镜下检查可能的组织病理学变化。将第6周末采集的血液样本，25℃放置2h后，离心(3000r/min,10min)，取上层血清，-80℃冰箱中保存备用。取血清100μL用全自动生化分析仪测定小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C浓度。计算AI值和LCI值，公式如下：
式中：CTC为血清TC浓度，mmol/L；CHDL-C为血清HDL-C浓度，mmol/L；CTG为血清TG浓度，mmol/L；CLDL-C为血清LDL-C浓度，mmol/L。
采用SPSS 19.0软件对各组数据进行单因素方差分析，P＜0.5表示差异性显著，origin软件绘图，结果用
表示。
3.结果与分析
3.1柚皮膳食纤维对高脂膳食小鼠生长状况的影响
小鼠每周体重变化如图11所示，第一周，各组小鼠重量无明显差异，在2-7周喂养试验期间，PPDF和SPPDF各处理组小鼠平均体重均低于HFD组，H-PPDF、L-SPPDF、M-SPPDF和H-SPPDF组达到显著水平(P＜0.05)。相同剂量条件下，SPPDF各处理组小鼠平均体重始终低于PPDF处理组小鼠，SPPDF能更有效的抑制高脂膳食小鼠的体重上升。
SPPDF各剂量组均有抑制高脂小鼠体重增加的效果，且随着剂量的增加，抑制效果变得更显著，M-SPPDF、H-SPPDF组小鼠的平均体重与ND组无显著性差异(P＞0.05)。同时，H-SPPDF组一直维持在低于ND组体重水平(第四周除外)，进一步提高SPPDF量可能会抑制小鼠的正常生长发育。
3.2柚皮膳食纤维对高脂膳食小鼠生理指标的影响
柚皮膳食纤维对小鼠肝脏、肾脏、心脏、脾脏和附睾脂肪重量的影响如图12，HFD组小鼠肝、肾、心脏和附睾脂肪的重量也显著高于ND组(P＜0.05)，脾脏重量虽也有所上升，但未达显著性差异(P>0.05)，而PPDF和SPPDF各处理小鼠的肝、肾、心脏的重量均低于HFD组，且随着补充剂量的增加，这种效果变得更明显，SPPDF的作用效果也较PPDF更明显。
3.3小鼠的组织学观察
实验组小鼠肝脏切片的HE染色显微照片如图13所示，小鼠附睾脂肪油红O染色结果如图14所示，组织学分析结果表明，相比于ND组，HFD组有大量的肝脏脂肪变性。通过补充PPDF或SPPDF，可明显减少脂肪变性和小鼠附睾脂肪中的脂肪细胞占比面积。相比于PPDF，SPPDF能更有效的减少高脂膳食小鼠肝脂肪细胞变性和附睾脂肪细胞的堆积。预示SPPDF对降低脂肪肝风险有着积极的作用，补充中剂量SPPDF可有效地减少小鼠脂肪细胞占比面积，使其恢复到正常组水平。
3.4柚皮膳食纤维对高脂膳食小鼠血清血脂水平的影响
补充PPDF和SPPDF对高脂膳食小鼠血清血脂水平的影响见图15，经过6周喂养试验，相比于ND组，HFD组的小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平显著上升，HDL-C显著下降(P<0.05)，血脂发生明显异常。相比于HFD组，PPDF和SPPDF各处理小鼠血清中TC、TG、LDL-C的水平均有所降低，HDL-C水平得到提升。其中M-SPPDF组，TC、TG、LDL-C和HDL-C水平皆恢复至正常组水平，效果与ND组无显著差异(P＞0.05)。相比于ND组，HFD组的小鼠的AI、LCI值显著上升，补充PPDF和SPPDF均能显著降低小鼠的AI、LCI值，其中中剂量SPPDF组AI值最接近正常组，且LCI值与正常无显著性差异(P＞0.05)。
实施例8柚皮膳食纤维调节肠道菌群活性研究
1.实验材料
实施例7中ND、HFD、LSPPDF、MSPPDF、HSPPDF五组小鼠喂养六周后，在无菌操作台内，取小鼠粪便：取小鼠盒子，洗净，用酒精消毒后晾干待用，于消毒盒子中铺无菌滤纸，将小鼠放置于布置好的盒子中，待小鼠排便，用无菌镊子收集，置于1.5mL-2mL无菌离心管。
2.试验方法
所取小鼠粪便使用FastDNATM试剂盒(MP Biomedicals，CA，USA)从粪便样本(每组n＝6)中提取DNA，使用Nanodrop检验DNA质量和浓度。严格按照说明书操作。由北京奥维森科技有限公司合成的针对V3-V4区域的16S通用引物(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’和5’-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3’)进行PCR扩增，扩增产物交由北京奥维森科技有限公司进行Illumina测序。
3.结果与分析
对本研究正常饲料组(ND)，高脂模型饲料组(HFD)，超微粉碎柚皮纤维低、中、高三个剂量组(LSPPDF、MSPPDF、HSPPDF)共五组29个样品进行测序，共得到1992884条序列，平均每个样品67720条序列。
3.1Alpha多样性分析
表10alpha多样性指数
注：用Duncan法进行多重比较。同列字母不同表示差异性显著(P＜0.05)，同列字母相同表示差异性显著(P＞0.05)。
各样本的alpha多样性分析见图16和表10。由图17可知，相比于HFD组，SPPDF各剂量组小鼠肠道菌群的Shannon指数、Chao值、observed指数和PD指数均显著上升，与ND组水平无显著性差异，说明补充SPPDF，能恢复和增加高脂膳食小鼠肠道菌群的多样性，MSPPDF组各指数水平均高于其余四组，说明中剂量组肠道菌群的多样性最好。
3.2韦恩图分析
各组样品Venn图分析如图17，五组间共有OTU为216个，HFD组与ND组共有296个OTU，补充SPPDF后这一数值上升至403(LSPPDF)、453(MSPPDF)和409(HSPPDF)。MSPPDF与ND组共有OTU数最多，且MSPPDF组有45个特有OTU，明显高于HFD组、LSPPDF组和HSPPDF组，中剂量SPPDF对高脂膳食小鼠肠道菌群多样性的恢复和提升最有益。
3.2SPPDF对高脂膳食小鼠肠道微生物门水平的影响
各组菌群在门水平的分布情况如图18所示，相比于ND组，HFD组厚壁菌门的相对丰度上升了26.62％，拟杆菌门的相对丰度下降了23.64％，F/B值[244]显著高于ND组(P<0.05)。与HFD组相比，补充SPPDF的高脂膳食小鼠肠道菌群中厚壁菌门的丰度显著下降30.32％(LSPPDF)、30.72(MSPPDF)、29.55％(HSPPDF)，拟杆菌门的相对丰度分别增加了24.94％(LSPPDF)、30.31％(MSPPDF)、22.82％(HSPPDF)，F/B值与ND组无显著性差异(P>0.05)。相比于ND组，HFD组小鼠肠道菌群中放线菌门、变性菌门相对丰度显著减少(P<0.05)，补充SPPDF后，这一情况得到了改善，小鼠肠道菌群的变形菌门和放线菌门相对丰度均升高，其中LSPPDF和HSPPDF组变形菌门和放线菌门的相对丰度显著高于ND组水平(P<0.05)，但MSPPDF组与ND组的差异未达到显著水平(P＞0.05)。
3.3SPPDF对高脂膳食小鼠肠道微生物属水平的影响
各组菌群在属水平的分布情况如图19所示，摄入高脂膳食的小鼠(HFD组)，肠道菌群葡萄球菌属相对丰度占据绝对优势，相比于ND组上升了45.20％，这也是HFD组小鼠肠道菌群厚壁菌门丰度显著上升的主要因素，补充SPPDF后，这一现象得到了有效的抑制，其中在低剂量组葡萄球菌的含量不足1％，其优势地位被FaecalibacuLum取代，FaecalibacuLum和葡萄球属同为厚壁菌门，随着剂量的增大，小鼠肠道菌群中葡萄球菌和FaecalibacuLum的相对丰度由HFD组的46.41％降低至24.42％(L-SPPDF)、20.85％(M-SPPDF)和7.89％(H-SPPDF)，SPPDF的剂量与小鼠肠道菌群中葡萄球菌和FaecalibacuLum的总相对丰度呈负相关关系。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种柚皮脱苦方法，其特征在于，包括以下步骤：将柚皮粉加入乙醇溶液中，振荡浸提，离心，收集柚皮沉淀物，浸提2次，脱除柚皮中的总黄酮；
所述柚皮粉为去除外层黄皮后的柚皮白瓤经干燥破碎后得到。
2.根据权利要求1所述的脱苦方法，其特征在于，所述柚皮粉和乙醇溶液的料液比为1g:20mL；所述乙醇溶液的体积浓度为85％；所述浸提时间为4h，浸提温度小于45℃。
3.一种柚皮总黄酮的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：将柚皮粉加入乙醇溶液中，振荡浸提，离心，取上清液，浓缩，冷冻干燥，得到柚皮总黄酮；所述柚皮粉为去除外层黄皮后的柚皮白瓤经干燥破碎后得到。
4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述柚皮粉和乙醇溶液的料液比为1g:20mL；所述乙醇溶液的体积浓度为85％；所述浸提时间为4h。
5.一种柚皮苷的分离纯化方法，其特征在于，将权利要求3-4任一项所述的提取方法得到的柚皮总黄酮进行复溶后，再经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶纯化，得到柚皮苷。
6.根据权利要求5所述的分离纯化方法，其特征在于，所述Sephadex LH-20葡聚糖凝胶纯化时，用乙醇溶液洗脱，所述洗脱的进样量为2ml，洗脱速度为0.5mL/min。
7.根据权利要求6所述的分离纯化方法，其特征在于，所述乙醇溶液的体积分数为30％。
8.一种柚皮膳食纤维，其特征在于，由柚皮粉经权利要求1-2任一项所述的脱苦方法处理后，再经干燥和超微粉碎得到。
9.一种根据权利要求8所述的柚皮膳食纤维在制备预防肥胖和/或降血脂产品中的应用。
10.一种根据权利要求8所述的柚皮膳食纤维在制备调节肠道菌群产品中的应用。
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