CN115024374A - 一种含固定化益生菌糖果的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于固定化益生菌技术领域，尤其涉及一种含固定化益生菌糖果的制备方法及应用，包括果肉的制备，益生菌糖果的制备，通过固定化制备技术，糖果含有活菌数达到107 CFU/g以上，且通过固定后在胃肠液中的稳定性显著提高。可用于婴幼儿消化不良、拉稀、便秘等疾病的辅助治疗。
Description
技术领域
本发明属于固定化益生菌技术领域，尤其涉及一种含固定化益生菌糖果的制备方法及应用。
背景技术
联合国粮食及农业组织(The joint Food and Agriculture Organization ofthe UnitedNations,FAO)和世界卫生组织(World Health Organization，WHO)将益生菌定义为“活的微生物，当给予足够的量时，会给宿主带来健康益处”。凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)，革兰阳性，属于硬(或厚)壁菌门，为同型乳酸发酵菌兼性厌氧菌。在有氧及无氧的环境下都可生长，产生的L-乳酸能降低肠道pH值，抑制有害菌，并能促进双歧杆菌等有益菌的生长和繁殖。目前已经广泛用于治疗因肠道菌群失调引起的急、慢性腹泻、慢性便秘、腹胀和消化不良等症。婴幼儿胃肠道发育不健全，经常会出现消化不良、拉稀、便秘等疾病，口服益生菌(凝结芽孢杆菌)可有效的预防和治疗上述症状。常规的益生菌口服剂存在储存稳定性差、胃肠道中死活率高且婴幼儿情绪抵触等问题，使用效果有待进一步提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种含固定化益生菌糖果的制备方法及应用，本发明通过微生物固定化技术，有效地把细菌菌体固定在相应载体上，保证其不会流失，并在固定过程中使其实际应用率得到有效提升，使其被简化处理并提升总体处理效率。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种含固定化益生菌糖果的制备方法，包括以下步骤：
(1)果肉的制备：挑选优质成熟的水果清洗后浸入200mg/L次氯酸钠溶液中消毒，消毒以后用粉碎机粉碎过滤，于82℃/1分钟的条件下进行巴氏杀菌，并于 -18℃的冷室中冷冻备用；
(2)固定化益生菌糖果的制备，包括以下步骤：
S1.将20-25份果肉加水稀释后加热至85℃后，加入6-9份明胶至完全溶解，将混合物于60℃水浴中静置30分钟，做为混合物1备用，果肉和水的重量比为 1:1；
S2.将6-9份葡萄糖浆和0.1份柠檬酸钠加入10-13份水中，搅拌并加热至115℃，浓缩至白利度为86°Brix，冷却至90–100℃后，加入混合物1并均质处理；
S3.将均质以后的混合物冷却至80–90℃后，添加固定化处理后的凝结芽孢杆菌至活菌数浓度为1×108搅拌均匀，导入磨具中于25℃烘干48h至水活度为0.70 即可；
S4.脱模后的糖果上糖霜，包装即制得固定化益生菌糖果。
进一步的，所述步骤S3中的固定化处理后的凝结芽孢杆菌为海藻酸钠-凝结芽孢杆菌复合体或蒙脱石-凝结芽孢杆菌复合体。
进一步的，所述海藻酸钠-凝结芽孢杆菌复合体的制备方法为：取海藻酸钠于无菌水中搅拌，于121℃灭菌30min待用，将菌液离心，弃上清用无菌水洗涤两次后，将沉淀的菌泥加入到海藻酸钠溶液中混匀，混合糊状物装入1mL的无菌注射器内,逐滴挤入1％的无菌CaCl2溶液中，静置固定30min凝固为微状凝胶珠，用滤纸过滤，无菌水冲洗，平铺晾干即得海藻酸钠-凝结芽孢杆菌复合体，晾干后装袋置于4℃冰箱保存。
进一步的，所述钠基蒙脱石-凝结芽孢杆菌复合体的制备方法为：制备钠基蒙脱石，将凝结芽孢杆菌发酵液离心分离后用无菌盐水洗涤，之后悬浮于0.01 -0.02mol/LNaNO3溶液中，加入钠基蒙脱石在30℃下以90r/min的速度振荡孵育90min，再注入60-80％蔗糖溶液进行吸附分离、洗涤即得钠基蒙脱石-凝结芽孢杆菌复合体。
进一步的，所述钠基蒙脱石的制备方法为：将蒙脱石研磨后用无菌水洗涤去除盐，加入无菌水搅拌沉降并收集悬浮液离心分离、干燥，得纯化后的蒙脱石，将纯化后的蒙脱石与氯化钠溶液于震荡器内混合，洗涤即得钠基蒙脱石。
利用以上制备方法制备的含固定化益生菌糖果作为婴幼儿消化不良、拉稀、便秘的辅助治疗。
本发明具有的优点是：通过固定化制备技术，每块糖果含有活菌数达到107以上，且通过胃肠液后存活率达到75％，稳定性显著提高，可用于婴幼儿消化不良、拉稀、便秘等疾病的辅助治疗。
附图说明
图1是本发明中海藻酸钠-凝结芽孢杆菌复合体的SEM照片。
图2是本发明中钠基蒙脱石-凝结芽孢杆菌复合体的SEM照片。
备注：图中a图比例尺为200μm，b图比例尺为10μm，c图比例尺为2 μm，d图比例尺为2μm。
具体实施方式
实施例
一种含固定化益生菌糖果的制备方法，包括以下步骤：
(1)果肉的制备：挑选优质成熟的水果清洗后浸入200mg/L次氯酸钠溶液中消毒，消毒以后用粉碎机粉碎过滤，于82℃/1分钟的条件下进行巴氏杀菌，并于 -18℃的冷室中冷冻备用；
(2)固定化益生菌糖果的制备，包括以下步骤：
S1.将20-25份果肉加水稀释后加热至85℃后，加入6-9份明胶至完全溶解，将混合物于60℃水浴中静置30分钟，做为混合物1备用，果肉和水的重量比为 1:1；
S2.将6-9份葡萄糖浆和0.1份柠檬酸钠加入10-13份水中，搅拌并加热至115℃，浓缩至白利度为86°Brix，冷却至90–100℃后，加入混合物1并均质处理；
S3.将均质以后的混合物冷却至80–90℃后，添加固定化处理后的凝结芽孢杆菌至活菌数浓度为1×108搅拌均匀，导入磨具中于25℃烘干48h至水活度为0.70 即可；
S4.脱模后的糖果上糖霜，包装即制得固定化益生菌糖果。
进一步的，所述步骤S3中的固定化处理后的凝结芽孢杆菌为海藻酸钠-凝结芽孢杆菌复合体或蒙脱石-凝结芽孢杆菌复合体。
进一步的，所述海藻酸钠-凝结芽孢杆菌复合体的制备方法为：取海藻酸钠于无菌水中搅拌，于121℃灭菌30min待用，将菌液离心，弃上清用无菌水洗涤两次后，将沉淀的菌泥加入到海藻酸钠溶液中混匀，混合糊状物装入1mL的无菌注射器内,逐滴挤入1％的无菌CaCl2溶液中，静置固定30min凝固为微状凝胶珠，用滤纸过滤，无菌水冲洗，平铺晾干即得海藻酸钠-凝结芽孢杆菌复合体，晾干后装袋置于4℃冰箱保存。
进一步的，所述钠基蒙脱石-凝结芽孢杆菌复合体的制备方法为：制备钠基蒙脱石，将凝结芽孢杆菌发酵液离心分离后用无菌盐水洗涤，之后悬浮于0.01 -0.02mol/LNaNO3溶液中，加入钠基蒙脱石在30℃下以90r/min的速度振荡孵育90min，再注入60-80％蔗糖溶液进行吸附分离、洗涤即得钠基蒙脱石-凝结芽孢杆菌复合体；所述钠基蒙脱石的制备方法为：将蒙脱石研磨后用无菌水洗涤去除盐，加入无菌水搅拌沉降并收集悬浮液离心分离、干燥，得纯化后的蒙脱石，将纯化后的蒙脱石与氯化钠溶液于震荡器内混合，洗涤即得钠基蒙脱石。
利用以上制备方法制备的含固定化益生菌糖果作为婴幼儿消化不良、拉稀、便秘的辅助治疗。
实验例
材料与方法
1.1实验材料
海藻酸钠(Sodium alginate，购于郑州派尼化学试剂厂)；蒙脱石(Montmorillonite，购于建平县锦坤蒙脱石有限公司)；凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans，购于普通微生物保藏中心)；胃蛋白酶(1200U/g，购于上海金穗生物科技有限公司)；胰蛋白酶(4000U/g，购于上海源叶生物科技有限公司)。
1.2凝结芽孢杆菌培养
凝结芽孢杆菌接种于MRS液体培养基中，37℃，200r/min,摇床培养48h 后,置于4℃冰箱备用。MRS培养基(g/L)配比为:蛋白胨10g/L,酵母提取物10g/L, 葡萄糖20g/L，吐温801mL/L，K2HPO42 g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸钠2g/L， MgSO40.2 g/L，MnSO40.05 g/L，pH6.20-6.60，121℃，30min灭菌后使用。采用2％固体琼脂MRS培养基进行菌落计数，
1.3海藻酸钠-凝结芽孢杆菌复合体的制备
1.3.1海藻酸钠-凝结芽孢杆菌复合体的制备
用分析天平准确称取4.5g海藻酸钠(SA)，加入300ml无菌水在磁力搅拌器上进行搅拌后，121℃，30min灭菌后使用。称取15mL菌液离心，弃上清，再加入5mL的无菌水，震荡后离心，重复洗涤2次，将沉淀的菌泥加入到搅拌好的海藻酸钠溶液中，用玻璃棒将其混匀。
将搅拌均匀的海藻酸钠与菌泥的混合糊状物装入1mL的无菌注射器内,逐滴挤入1％的无菌Cacl2溶液中，静置固定30min，使其凝固为微状凝胶珠。
用滤纸将制备好的凝胶珠过滤出来，用无菌水进行冲洗，洗掉凝胶珠表面的氯化钙溶液，之后平铺在滤纸上晾干，晾干后装袋置于4℃冰箱保存，供后续抗逆性实验使用。
1.3.2海藻酸钠-凝结芽孢杆菌复合体活菌数测定
取1g微囊成品加入49mL，pH 6.8，0.2mol/L的磷酸钠缓冲液，200r/min 孵化2h，此时微囊体已经溶解，开始测定活菌数。
固定化率(％)＝(发酵液体积×发酵液活菌数)/(固定化后总重量×活菌数)
1.4钠基蒙脱石-凝结芽孢杆菌复合体的制备
1.4.1钠基蒙脱石(Na-MMT)的制备
采用沉降法对蒙脱石样品(MMT)进行纯化。称取50g蒙脱石样品用研钵研磨至粉末状，并用无菌去离子水以1g MMT：10mL水的比例反复洗涤3次后，加入750mL的无菌去离子水，常温下用磁力搅拌器搅拌3h,保持静置过夜，目的是去掉蒙脱石样品中的盐离子。第二天从顶部倒出上清，再加入500mL的无菌去离子水，搅拌后沉降30min，由于蒙脱石具有空间结构，和水不分层的蒙脱石比表面积大，内部孔多，因此将上半部分的悬浮液收集起来，离心后放入60℃的鼓风干燥箱中缓慢蒸发至干，研磨后通过300目(48μm)筛子过筛。
对纯化后的蒙脱石样品进行改性，配制250mL，1mol/L的氯化钠溶液，加入10g纯化后的蒙脱石，在室温(24±2℃)下，在机械振荡器上以200r/min 的速度搅拌锥形瓶震荡48h,倒出上清液，并用软化水(1L)洗涤颗粒，直到用 1％硝酸银溶液进行负氯离子测试无氯离子为止。将Na-MMT风干，然后在105℃烘箱中干燥16h，开始实验。
制备好的钠基蒙脱石样品按照国家标准GB/T 27798-2011《有机膨润土》进行pH、吸蓝量和吸氨量的测定。吸蓝量指的是蒙脱石分散于水溶液中，具有吸咐次甲基蓝的能力，其吸附的量被称为吸蓝量，单位为g/100g；吸氨量指的是蒙脱石分散于水溶液中，具有吸附铵离子的能力，吸附铵离子的量被称为吸氨量，单位为mmoL/100g；蒙脱石的含量通过吸蓝量计算，公式为：蒙脱石含量＝吸蓝量/0.442。
蒙脱石改性前后的性质测试见表1，由表1可知吸蓝量在改性后达到44 g/100g,显著高于MMT组42g/100g，差异显著(P<0.05)；吸氨量在改性后达到1100mmoL/100g，显著高于MMT组460mmoL/100g，差异显著(P<0.05)； pH值在改性后为8.16，低于MMT组8.66，差异显著(P<0.05)。
表1蒙脱石改性前后理化指标变化
注：同行小写字母不同，表示差异显著(P＜0.05)，同行小写字母相同，表示差异不显著(P＞0.05)，下同。
1.4.2钠基蒙脱石-凝结芽孢杆菌复合体的制备
凝结芽孢杆菌发酵液通过离心(7000r/min,10min)将菌体从培养基中分离出来，然后用无菌盐水溶液洗涤两次，在离心后测量细菌的湿重(W1)。将已知湿重的细菌悬浮在10mL 0.01mol/LNaNO3溶液(pH＝7)中，并加入100mg Na-MMT,以这种方式制备的混合物在30℃下以90r/min的速度振荡孵育90 min。
通过将3mL 60％蔗糖溶液(蔗糖溶液按重量计)注入蒙脱石-细菌悬浮液的底部，可将未附着的细菌与含有蒙脱石粉末的上部液体和附着细菌的部分分离。因为蔗糖比悬浮在溶液中的细菌密度大，但比蒙脱石颗粒(包括附着细菌的颗粒)密度小，所以蔗糖会产生密度梯度。吸附了细菌的蒙脱石粉末沉到试管底部，未吸附的细菌和水溶液漂浮在蔗糖层的顶部。蔗糖分离后，用移液管提取未附着的细菌部分，用无菌盐水溶液洗涤两次，最后通过离心(7000r/min,10 min)后测定未吸附细菌的湿重(W2)。
对照组实验的测定除不加矿物粉外，其他实验同上。对照实验表明，在分离过程中损失了6％的细菌，因此每个实验中要减去6％以说明吸附效率，钠基蒙脱石表面的吸附百分比计算如下式所示。
吸附百分比(％)＝(W1-W2)/W1×100-6％
1.4.3钠基蒙脱石-凝结芽孢杆菌活菌数的测定
固定后的复合体，准确称量0.1g,加入9.9mL 0.3％NaCl溶液30℃200r/min 孵化10min后，再进行梯度稀释，平板计数。
固定化率(％)＝(发酵液体积×发酵液活菌数)/(固定化后总重量×活菌数)×100％
2.1二种固定化方法对凝结芽孢杆菌固定化率的影响
海藻酸钠包埋法和蒙脱石法对凝结芽孢杆菌的固定化率见表2，其中蒙脱石法的壁材重量4.22g由50g蒙脱石经改性后烘干所得。蒙脱石固定后活菌数量指的是单位量的蒙脱石能够吸附的凝结芽孢杆菌的数量，与蒙脱石的固定化率应进行区分。由表2可知，海藻酸钠法的固定化率为75.33％，蒙脱石法的固定化率为81.67％，蒙脱石法显著高于海藻酸钠法(P<0.05)。
表2二种固定化方法对凝结芽孢杆菌固定化率的影响
2.2两种凝结芽孢杆菌复合体电镜照片
海藻酸钠-凝结芽孢杆菌复合体和蒙脱石-凝结芽孢杆菌复合体SEM照片分别见图1和图2。图1-c照片可见白色晶体结构的海藻酸钠，海藻酸钠表面有空隙；图1-d照片可见海藻酸钠复合体空隙内部固定的凝结芽孢杆菌菌体，且菌体直径大于空隙，菌体被限制在微囊球体内部(圈内标注)。
图2-c照片可见蒙脱石不规则的晶体结构排列，图2-d照片可见蒙脱石表面凝结芽孢杆菌散落吸附在晶体表面(圈内标注)。
2.3 85℃，30min处理条件下对2种复合体活菌数的影响
85℃30min条件下对2种固定化凝结芽孢杆菌活菌数的影响见表4，由表4 可知，对照组在高温处理后存活率为15.72％，处理前后差异显著(P<0.05)； SA-Ba组在高温处理后存活率为56.37％，处理前后，凝结芽孢杆菌活菌数差异显著(P<0.05)；Na-MMT-Ba组在高温处理后存活率为58.77％，处理前后，凝结芽孢杆菌活菌数差异显著(P<0.05)。
表4 85℃，30min处理条件下对2种复合体活菌数的影响
注：SA-Ba组为海藻酸钠固定凝结芽孢杆菌组；Na-MMT-Ba组为蒙脱石固定凝结芽孢杆菌组。对照组为5mL发酵液用淀粉吸附后，晾干后样品。
3.益生菌糖果的制备
3.1果肉的制备
芒果、猕猴桃、草莓等水果丢弃未成熟的水果以及有变质迹象的水果。将它们在流水中清洗并通过浸入次氯酸钠溶液(200mg/L)中进行消毒。粉碎机粉碎后，过滤，在82℃/1分钟的温度下进行巴氏杀菌，并在-18℃的冷室中冷冻备用。
3.2.固定化凝结芽孢杆菌糖果的制备
制备流程为(100份)：
1)20份果肉1:1加水稀释加热到85℃，加入7份明胶至完全溶解，将混合物在60℃水浴中静置30分钟，标记为混合物1。
2)7份糖葡萄糖浆和0.1份柠檬酸钠加入10份水中，一边搅拌一边加热并将混合物加热至115℃，一直浓缩到白利度为86°Brix。冷却至约90–100℃后，加入混合物1，并均质化。
3)将混合物冷却至80-90℃后，分别添加2种固定化后凝结芽孢杆菌、不固定的凝结芽孢杆菌以及不添加芽孢杆菌(活菌数最终浓度1×108)。搅拌均匀后，立即导入磨具中25℃烘干48h，(水活度约为0.70)。
4)脱模后的糖果上糖霜，包装。
4.四种糖果性质对比
4.1成品质量对比
4.2人工胃肠液条件下3种糖果的稳定
人工胃液配制：取稀盐酸16.4ml(相当于盐酸3.84mL),加水约800mL, 与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000mL，pH＝1.5。
人工肠液：每1L胃液加入磷酸二氢钾6.8g，用1mol/L氢氧化钠溶液调节 pH值至6.8，加胰酶10g，混合均匀，即得。
实验共分为3组，分别为对照组(含凝结芽孢杆菌糖果)、实验组1(含海藻酸钠固定凝结芽孢杆菌糖果)以及实验组2(含蒙脱石固定凝结芽孢杆菌糖果)，3组糖果分别加入50mL人工胃液中，在37℃，50r/min条件下孵化30min 后，用1mol/LNaOH溶液调节pH至6.8，取出1mL孵化液进行平板计数，此时结果即为胃液0.5h。
剩余胃液以5000r/min离心5min，弃上清，然后加入50mL新鲜肠液，在 37℃，50r/min条件下孵化4h。取出1mL孵化液进行平板计数，此时结果即为肠液4h。
对照组：取2mL发酵液5000r/min离心5min后，用无菌水洗涤2次，收集菌体加入50mL人工胃液中，其它操作同上。以对照组加入的活菌数为基准，三组样品中加入的活菌数相同。
存活率(％)＝孵化液中活菌数×孵化液体积/加入的总活菌数×100％
模拟人工胃肠液条件下对2种固定化凝结芽孢杆菌活菌数的影响见表3，由表3可知，对照组胃液0.5h后复合体外比例为32.00％，在胃液0.5h+肠液4h 后复合体外比例为18.00％，胃肠液处理前后差异显著(P<0.05)；SA-Ba组胃液0.5h后复合体外比例为0.00％，在胃液0.5h+肠液4h后复合体外比例为 31.55％，胃肠液处理前后差异显著(P<0.05)；Na-MMT-Ba组胃液0.5h后复合体外比例为49.42％，在胃液0.5h+肠液4h后复合体外比例为75.30％，胃肠液处理前后差异显著(P<0.05)。
表3模拟人工胃肠液条件下对2种复合体活菌数的影响
注：SA-Ba组为海藻酸钠-凝结芽孢杆菌组；Na-MMT-Ba组为蒙脱石-凝结芽孢杆菌组。
结论：
1)添加不同形式的益生菌固定化产品质量无影响。
2)蒙脱石固定化效果优于海藻酸钠法，蒙脱石固定化后，对热和胃肠液的稳定性都显著提高，通过该方法，益生菌糖果每g产品活菌数可达到107CFU/g 以上，且通过胃肠液后存活率达到75％，可用于幼儿胃肠道疾病的辅助治疗。
Claims (6)
1.一种含固定化益生菌糖果的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）果肉的制备：挑选优质成熟的水果清洗后浸入200 mg/L次氯酸钠溶液中消毒，消毒以后用粉碎机粉碎过滤，于82 ℃/1分钟的条件下进行巴氏杀菌，并于 -18℃ 的冷室中冷冻备用；
（2）固定化益生菌糖果的制备，包括以下步骤：
S1.将20-25份果肉加水稀释后加热至85℃后，加入6-9份明胶至完全溶解，将混合物于60℃水浴中静置30分钟，做为混合物1备用，果肉和水的重量比为1:1；
S2.将6-9份葡萄糖浆和0.1份柠檬酸钠加入10 -13份水中，搅拌并加热至115℃，浓缩至白利度为86°Brix，冷却至90–100℃后，加入混合物1并均质处理；
S3.将均质以后的混合物冷却至80–90℃后，添加固定化处理后的凝结芽孢杆菌至活菌数浓度为1×108搅拌均匀，导入磨具中于25℃烘干48 h至水活度为 0.70即可；
S4.脱模后的糖果上糖霜，包装即制得固定化益生菌糖果。
2.如权利要求1所述的含固定化益生菌糖果的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中的固定化处理后的凝结芽孢杆菌为海藻酸钠-凝结芽孢杆菌复合体或蒙脱石-凝结芽孢杆菌复合体。
3.如权利要求2所述的含固定化益生菌糖果的制备方法，其特征在于：所述海藻酸钠-凝结芽孢杆菌复合体的制备方法为：取海藻酸钠于无菌水中搅拌，于121℃灭菌30min待用，将菌液离心，弃上清用无菌水洗涤两次后，将沉淀的菌泥加入到海藻酸钠溶液中混匀，混合糊状物装入1 mL的无菌注射器内,逐滴挤入1 %的无菌CaCl2溶液中，静置固定30 min凝固为微状凝胶珠，用滤纸过滤，无菌水冲洗，平铺晾干即得海藻酸钠-凝结芽孢杆菌复合体，晾干后装袋置于4 ℃冰箱保存。
4.如权利要求2所述的含固定化益生菌糖果的制备方法，其特征在于：所述钠基蒙脱石-凝结芽孢杆菌复合体的制备方法为：制备钠基蒙脱石，将凝结芽孢杆菌发酵液离心分离后用无菌盐水洗涤，之后悬浮于0.01-0.02 mol/L NaNO3溶液中，加入钠基蒙脱石在30 ℃下以90 r/min的速度振荡孵育90 min，再注入60-80%蔗糖溶液进行吸附分离、洗涤即得钠基蒙脱石-凝结芽孢杆菌复合体。
5.如权利要求4所述的含固定化益生菌糖果的制备方法，其特征在于：所述钠基蒙脱石的制备方法为：将蒙脱石研磨后用无菌水洗涤去除盐，加入无菌水搅拌沉降并收集悬浮液离心分离、干燥，得纯化后的蒙脱石，将纯化后的蒙脱石与氯化钠溶液于震荡器内混合，洗涤即得钠基蒙脱石。
6.如权利要求1-5任一所述的制备方法制备的含固定化益生菌糖果作为婴幼儿消化不良、拉稀、便秘的辅助治疗。
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