CN114965980A - 胶乳凝集反应敏化剂、胶乳凝集试剂和由使用其的胶乳凝集法测量被检体中目标物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及胶乳凝集反应敏化剂、胶乳凝集试剂和由使用其的胶乳凝集法测量被检体中目标物质的方法。提供一种包含聚噁唑啉的胶乳凝集试剂，其优选用于胶乳凝集反应中并且灵敏度的致敏作用高同时可以抑制非特异反应；和通过胶乳凝集法测量被检体中的目标物质的方法。胶乳凝集试剂用于通过使用携带抗体或抗原的不溶性载体的胶乳凝集法测量被检体中的目标物质的方法中，且包含具有由以下通式表示的重复单元的聚噁唑啉：

Description

胶乳凝集反应敏化剂、胶乳凝集试剂和由使用其的胶乳凝集 法测量被检体中目标物质的方法
技术领域
本公开涉及胶乳凝集反应敏化剂、胶乳凝集试剂和通过使用该胶乳凝集试剂的胶乳凝集法测量被检体中的目标物质的方法。
背景技术
为了检测和测量特定的抗原或抗体(以下称为“目标物质”)，在临床检查等中使用由抗原-抗体反应进行的免疫测定法。其中，使用携带抗体或抗原的不溶性载体(例如胶乳颗粒)的免疫测定法已知为胶乳凝集法。
在胶乳凝集法的一个实例中，可能包含目标物质的被检体(血清等)与包含携带针对该目标物质的抗体的颗粒(也称为“抗体致敏颗粒”)的胶乳凝集试剂反应以通过该抗原-抗体反应产生凝集体，并且目视或光学检测该凝集体的凝集，从而能够定性和定量地测量目标物质。
在胶乳凝集法的另一个实例中，将可能包含目标物质的被检体与胶乳凝集试剂的第一试剂(在某些情况下称为“R1”)混合。接着，进一步混合包含固定有针对目标物质的抗体或抗原的致敏颗粒的致敏颗粒分散液(胶乳凝集试剂的第二试剂，可以称为“R2”)。在第一试剂和第二试剂混合时存在目标物质的情况下，作为抗原-抗体反应的结果，致敏颗粒凝集。因此，可以通过目视或光学检测该凝集体来定性和定量地测量目标物质。
在临床检查中，虽然也使用高灵敏度化学发光免疫测定法，但是由于需要BF分离(除去未反应成分的步骤)，因此检查时间倾向于变长。相对地，在胶乳凝集法中，虽然检查时间短并且检查处理能力(吞吐量)高，但是与化学发光免疫测定法相比，检测灵敏度可能不充分，并且需要检测灵敏度的进一步改善。
为了提高胶乳凝集法的灵敏度的目的，使用聚合物化合物作为敏化剂。更具体地，使用包含敏化剂的胶乳凝集试剂。作为敏化剂，为了促进凝集反应的目的，在反应体系中添加如聚乙二醇(PEG)或海藻酸钠等水溶性高分子。在日本专利申请特开No.S58-47256和日本专利No.2682697中，提出了非离子性聚合物的聚乙二醇作为敏化剂。在日本专利申请特开No.2003-294753中，提出了阴离子性聚合物的海藻酸盐作为敏化剂。
相对地，虽然这些聚合物具有致敏作用，但溶液的粘度可能增加或聚合物可能盐析，并且可能同时促进与抗原-抗体反应无关的反应，即非特异凝集反应。结果，可能出现如空白值增加、伪阳性的原因以及测量精度降低等问题。因此，需要一种包含发挥致敏作用的敏化剂、抑制非特异反应并且具有良好的测量精度的胶乳凝集试剂。
在日本专利No.3632856中，提出了非离子性聚合物的聚噁唑啉作为用于增强化学发光检测的添加剂。
相对地，在通过使用携带抗体或抗原的不溶性载体的胶乳凝集法测量被检体中的目标物质的方法中，聚噁唑啉的致敏效果至今未知。
发明内容
因此，本公开的目的是提供一种往日未曾出现的包含胶乳凝集反应敏化剂的胶乳凝集试剂，该胶乳凝集试剂在使用携带抗体或抗原的不溶性载体的胶乳凝集法中是优选的，在抑制非特异反应的同时发挥致敏作用，具有良好的测量精度；和一种通过使用该胶乳凝集试剂的胶乳凝集法测量被检体中的目标物质的方法。
作为本发明人为了解决上述问题而深入研究的结果，本发明人通过使用包含聚噁唑啉作为胶乳凝集反应敏化剂的胶乳凝集试剂实现了上述目的。
即，本公开涉及一种胶乳凝集试剂，其用于通过使用携带抗体或抗原的不溶性载体的胶乳凝集法测量被检体中的目标物质的方法中，该胶乳凝集试剂包含具有由以下通式(1)表示的重复单元的聚噁唑啉(胶乳凝集反应敏化剂)：
Figure BDA0003520781220000031
(在上式中，R表示氢原子或甲基、乙基、或丙基，和n为100以上的整数)。
本公开还涉及一种胶乳凝集试剂盒，其包括上述胶乳凝集试剂作为构成成分。本公开进一步涉及通过使用携带抗体或抗原的不溶性载体的胶乳凝集法测量被检体中的目标物质的方法，其中上述胶乳凝集试剂或胶乳凝集试剂盒用于测量被检体中的目标物质的方法中。
从以下示例性实施方案的描述，本公开的进一步特征将变得显而易见。
具体实施方式
以下，根据本公开的一个实施方案(以下，称为本实施方案)，将描述胶乳凝集反应敏化剂、胶乳凝集试剂和通过使用该胶乳凝集试剂的胶乳凝集法测量被检体中的目标物质的方法，但是本公开不限于此。
本实施方案的胶乳凝集试剂用于通过使用携带抗体或抗原的不溶性载体的胶乳凝集法测量被检体中的目标物质。在本说明书中，胶乳凝集法为基于凝集反应的免疫测定法，并且其实例包括称为胶乳凝集透射免疫比浊法、透射免疫比浊法、或散射免疫比浊法(Nephelometric Immunoassay)等的免疫测定法。
(作为敏化剂的聚噁唑啉)
本实施方案的胶乳凝集试剂具有至少包含起到胶乳凝集反应敏化剂作用的聚噁唑啉的特征，例如，可以使聚噁唑啉包含在胶乳凝集法中使用的各种溶液中以制备胶乳凝集试剂。
在本实施方案的胶乳凝集试剂中，聚噁唑啉具有凝集反应的致敏作用的机理被认为是耗尽絮凝(depletion flocculation)。耗尽絮凝是由于作用于颗粒之间的渗透压而导致的颗粒间凝集，这是作为当颗粒彼此接近时具有有限延展性的溶解高分子从颗粒间隙中去除的结果而出现的。为了有效地引起耗尽絮凝，要求聚合物在水溶液中与介质和媒介的相互作用弱，并且在水溶液中具有合适的尺寸。在本实施方案中，如下文所述，聚噁唑啉与盐和离子的相互作用弱，并且与蛋白质和不溶性载体的相互作用也弱。还发现聚噁唑啉有效地起到用于胶乳凝集试剂的敏化剂的作用，因为溶液的粘度不容易增加。
本实施方案中的聚噁唑啉为包含由以下通式(1)表示的重复单元的聚合物。在本实施方案中，聚噁唑啉为聚(N-酰基亚乙基亚胺)的总称。根据优选的方面，根据本实施方案使用的聚噁唑啉为2-烷基-2-噁唑啉的聚合物，并且可以称为聚(2-噁唑啉)。
Figure BDA0003520781220000041
在式(1)中，形成在聚合物侧链上的R选自氢原子或甲基、乙基、丙基或它们的组合。其实例包括聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚(2-异丙基-2-噁唑啉)和聚(2-正丙基-2-噁唑啉)等。R的疏水性随着烷基链更长而增加。具有较长烷基侧链的聚噁唑啉可能不是优选的，因为聚合物的疏水性增加并且聚合物在水中的溶解性由此降低。在式(1)中，聚合物侧链上形成的R可以为甲基或乙基，并且可以更优选为乙基。优选的聚合物的实例包括聚(2-甲基-2-噁唑啉)和聚(2-乙基-2-噁唑啉)，特别是，由以下通式(2)表示的水溶性和疏水性良好平衡的聚(2-乙基-2-噁唑啉)是良好的。
Figure BDA0003520781220000051
在式(1)和(2)中，表示聚合物的聚合度(也称为重复单元数)的n为100以上的整数，并且优选为100以上且100,000以下。在式(2)的聚(2-乙基-2-噁唑啉)的均聚物的情况下，在聚合物的聚合度的范围内聚合物的重均分子量为约10,000以上且1,000,000以下。当表示聚合物的聚合度的n小于100时，由于分子量小，致敏作用降低。相对地，当n大于100,000时，分子量增大并且溶液的粘度过高，这是不优选的。
本实施方案中的聚噁唑啉可以为均聚物或者共聚物，只要聚噁唑啉包含由通式(1)表示的重复单元即可。共聚物的具体实例包括聚噁唑啉和聚乙二醇的共聚物、聚噁唑啉和聚乳酸的共聚物、以及聚噁唑啉和聚丙烯酸的共聚物等。
在本实施方案的胶乳凝集试剂和使用其测量目标物质的方法中，这些聚噁唑啉可以单独使用或者组合使用。胶乳凝集试剂可以包含式(2)的聚(2-乙基-2-噁唑啉)，并且该方法优选为使用其测量目标物质的方法。
聚噁唑啉可以通过例如使噁唑啉单体利用已知的聚合反应聚合来生产。例如，在适当的条件下，可以通过2-噁唑啉的阳离子开环聚合来合成聚噁唑啉。作为聚噁唑啉的合成方法的一个实例，以聚(2-乙基-2-噁唑啉)(以下，可以简称为“POX”)为例进行描述。在干燥的氩气气氛下，将甲苯磺酸甲酯(引发剂)和2-乙基-2-噁唑啉(单体)添加至乙腈中，并且进行阳离子开环聚合。在40℃的温度下进行反应约10天，然后，添加氢氧化钠以停止反应，从而将羟基(终止剂)引入至聚合物的末端。将反应溶液用水透析以纯化并且减压干燥以获得固成分，因此，可以合成聚(2-乙基-2-噁唑啉)均聚物。
对聚噁唑啉的末端结构没有特别地限制，但是例如，一末端为源自聚合引发剂的官能团，并且另一末端为源自聚合终止剂的官能团。在阳离子开环聚合中，适当地选择亲电聚合引发剂和亲核聚合终止剂，使得可以将任何官能团引入至聚合物链的两末端。亲电聚合引发剂的实例包括卤代烷、酰基卤、多官能甲苯磺酸酯、多官能三氟甲磺酸酯和多官能间硝基苯磺酸酯(nosylate)等。亲核聚合终止剂的实例包括羟基氧化物、胺和羧酸酯等。聚噁唑啉的末端结构的实例包括甲基和羟基。
对聚噁唑啉的重均分子量的范围没有特别地限制，但是优选10,000以上且1,000,000以下。聚合物的聚合度如上所述，并且为了发挥致敏作用，需要在溶液的粘度不会过高的同时将聚合物在水中分散到一定程度作为胶乳凝集试剂。因此，在使用重均分子量为50,000、甚至更优选重均分子量为200,000以上、并且最优选重均分子量为400,000以上的聚噁唑啉的情况下，观察到高致敏效果。当重均分子量小于10,000时，由于水中的分子尺寸小，难以获得充分的致敏作用。当重均分子量大于1,000,000时，溶液的粘度高，使得处理性差，不能得到充分的效果。聚噁唑啉的重均分子量基于凝胶渗透色谱(GPC)和粘度测量来确定。
(胶乳凝集试剂)
本实施方案的胶乳凝集试剂具有至少包含起到敏化剂作用的聚噁唑啉的特征，例如，可以使聚噁唑啉包含在胶乳凝集法中使用的水性介质中以制备胶乳凝集试剂。
本实施方案的胶乳凝集试剂中的聚噁唑啉的浓度，从溶解性的观点，优选为0.01w/v％以上且2.0w/v％以下。当聚噁唑啉的浓度在该范围内时，溶液的粘度低，并且溶液易于处理。当聚噁唑啉的浓度过低时，难以获得充分的致敏效果。如下文所述，在本实施方案的基于胶乳凝集法的测量方法中，根据本实施方案的聚噁唑啉通常以0.005w/v％以上且1.9w/v％以下，优选0.1w/v％以上且1.9w/v％以下，并且更优选0.15w/v％以上且1.9w/v％以下作为反应溶液中的最终浓度添加并使用。浓度可以根据待测目标物质和不溶性载体的类型而改变。
本实施方案的胶乳凝集试剂为聚噁唑啉的水溶液，并且水性媒介的实例包括如纯化水、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、Good氏缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液和氨缓冲液等各种缓冲液。特别地，优选使用磷酸盐缓冲液和Good氏缓冲液。
本实施方案的胶乳凝集试剂在水性介质中包含聚噁唑啉，但是也可以包含如盐、牛血清白蛋白(BSA)、表面活性剂和免疫球蛋白等其它添加剂。特别地，为了调节溶液的渗透压和使蛋白质稳定化，优选添加氯化钠。
(不溶性载体)
作为可以适合与本实施方案的胶乳凝集试剂一起使用的不溶性载体，可以使用在通常的胶乳凝集反应中使用的任何不溶性载体，并且可以使用粒状载体(以下，简称为“颗粒”)。不溶性载体的材料的实例包括聚苯乙烯，苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物，苯乙烯-(甲基)丙烯酸缩水甘油酯共聚物，丙烯酸聚合物，如琼脂糖和葡聚糖等高分子，如二氧化硅和氧化铝等无机物，和金胶体等金属。不溶性载体的合成和制备可以根据已知的方法来进行。
合适的载体的实例包括胶乳颗粒。此处，胶乳颗粒是能够将针对目标物质的抗原或抗体固定化的高分子颗粒，并且是指用于胶乳凝集反应的颗粒。胶乳颗粒的优选实例包括聚苯乙烯颗粒、包含硅氧烷的聚苯乙烯颗粒和包含聚(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的聚苯乙烯颗粒(以下，可以简称为“SG颗粒”)等。这些颗粒具有如可以相对容易地获得纳米级颗粒、可以根据目的对各颗粒的表面化学改性的事实等优点，并且是可以适合与本实施方案的胶乳凝集试剂一起使用的载体。
在这些载体当中，如下文将在实施例中描述的，各自具有化学亲水性颗粒表面的包含硅氧烷的聚苯乙烯颗粒和SG颗粒可以高度抑制非特异吸附。因此，根据本实施方案的聚噁唑啉与颗粒之间几乎没有相互作用，并且是通过耗尽效果促进凝集的最理想的颗粒与敏化剂的组合。
作为具体的效果，在使用包含硅氧烷的聚苯乙烯颗粒或SG颗粒作为载体的情况下，有利的是通过增加聚噁唑啉的浓度可以提高灵敏度，并且测量精度得到进一步改善，这是因为聚噁唑啉表现出低粘度，并且聚噁唑啉不被吸附在颗粒上。
不溶性载体的尺寸的长轴直径优选为0.01μm以上且10μm以下，更优选为0.05μm以上且1μm以下。通过将不溶性载体的尺寸设为0.05μm以上，通过胶乳凝集测量观察到的可见区域的吸光度在适当的范围内。通过将不溶性载体的尺寸设为1μm以下，溶液中的分散稳定性得到改善，并且可见区域的吸光度在适当的范围内。从反应性和分散稳定性的观点，优选使用0.05μm以上且0.40μm以下的不溶性载体。如上所述，合适的不溶性载体的实例为颗粒。因此，尺寸的合适实例可以用平均粒径来表示。作为平均粒径，使用通过分散粒度分布的测量而测量的体积平均粒径等。作为不溶性载体的颗粒的平均粒径优选为0.05μm以上且1μm以下。
不溶性载体的使用量也可以根据其尺寸适当地调节，从反应性和溶液浊度的观点，凝集反应期间溶液中不溶性载体的浓度为0.01w/v％以上且0.5w/v％以下、或者0.02w/v％以上且0.3w/v％以下的量。
不溶性载体优选为其上固定有抗原或抗体的不溶性载体。可以通过化学键或物理吸附将各抗原或抗体固定在不溶性载体上，但是各抗原或抗体优选通过化学键来固定。抗原或抗体的固定可以根据相关领域的方法来进行，但不溶性载体的官能团可以与包含在抗原或抗体中的伯胺、仲胺、羧基或硫醇基等反应。不溶性载体的官能团的实例包括羧基、氨基、醛基、环氧基、硫醇基和马来酰亚胺基等。不溶性载体可以在这些官能团中仅具有一种官能团，或者可以具有两种以上的官能团。
另外，也可以使用如Fab、F(ab')2、F(ab')、Fv、scFv等抗原结合片段来代替抗体。
除了将各抗原或抗体固定在不溶性载体上的构造之外，还可以采用根据目标物质结合适当物质的构造。例如，不溶性载体可以与酶蛋白或其底物、如激素或神经递质等信号物质或其受体、核酸、或如抗生物素蛋白或生物素等物质结合。
(目标物质)
本实施方案的胶乳凝集试剂用于目标物质的测量，该目标物质可以是可通过免疫反应而测量的物质，并且其实例包括如抗原和抗体等物质。其实例包括C-反应蛋白(CRP)、铁蛋白、白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白E(IgE)、α-甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、KL-6、胃蛋白酶原(PG)、类风湿因子(RF)、脂蛋白、胰岛素、感染相关抗原及其抗体、激素、维生素和抗生素等，但是本实施方案的胶乳凝集试剂不限于此。
(胶乳凝集试剂的制备例)
可以使根据本实施方案的聚噁唑啉包含在免疫测定中使用的各种试剂中，以制备具有高致敏作用的胶乳凝集试剂。
示出本实施方案的胶乳凝集试剂的实例。
(1液型胶乳凝集试剂)
将聚噁唑啉溶解在磷酸盐缓冲盐水(可简称为PBS)中。
向该聚噁唑啉溶液中添加使针对目标物质的抗体致敏的聚苯乙烯颗粒(不溶性载体)，从而可以获得所得溶液而作为本公开的胶乳凝集试剂的实施方案的一个实例。将血清或血浆等样品(以下，可以简称为被检体)添加至1液型胶乳凝集试剂中，并且用分光光度计测量浊度。由于在样品不包含目标物质的情况下聚苯乙烯颗粒保持分散状态，因此不存在浊度的经时变化。相对地，在样品包含目标物质的情况下，聚苯乙烯颗粒通过与目标物质的抗原-抗体反应而凝集。由于这种凝集，浊度经时变化。即，浊度增加。由于通过使用已知浓度的目标物质的标准溶液测量浊度而获得校准曲线(说明浊度和目标物质的浓度之间关系的图表)，因此包含在被检体中的目标物质可以由样品的浊度的增加来量化。本实施方案的胶乳凝集试剂可以包含各种添加剂。通常，胶乳凝集试剂可以包含pH缓冲剂(例如，三羟甲基氨基甲烷缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂或Good氏缓冲剂等)，如白蛋白和球蛋白等蛋白质，氨基酸，表面活性剂，和防腐剂等。
(胶乳凝集试剂盒)
本公开的一种形式是一种胶乳凝集试剂盒，其至少包括包含聚噁唑啉作为构成成分的胶乳凝集试剂，并且作为具体实例，胶乳凝集试剂由至少两种以上的溶液构成。这些溶液的实例包括被检体的稀释液、不溶性载体的分散液、不溶性载体的分散液的稀释液、用于获得校准曲线的标准溶液(包含已知浓度的目标物质的溶液)，以及用于确认测量精度的控制等。试剂盒的一个实例为胶乳凝集试剂盒，其至少包括由包含聚噁唑啉的胶乳凝集试剂构成的第一试剂和包含携带抗体或抗原的不溶性载体的第二试剂。由包含聚噁唑啉的胶乳凝集试剂构成的第一试剂可称为被检体稀释液。聚噁唑啉可以包含在包含不溶性载体的第二试剂中，而聚噁唑啉不包含在该被检体稀释液中。通常，从贮存稳定性的观点，聚噁唑啉优选包含在第一试剂或被检体稀释液中。
在通过胶乳凝集法测量目标物质时，例如，将被检体添加至由包含聚噁唑啉的胶乳凝集试剂构成的第一试剂中，然后，将包含携带抗体或抗原的不溶性载体的第二试剂混合至该溶液中。在这种情况下，优选在聚噁唑啉浓度为0.005w/v％以上且1.0w/v％以下的范围内进行胶乳凝集反应，并且设定被检体的量、第一试剂的量和第二试剂的量，然后，可以设定第一试剂中的聚噁唑啉浓度。在胶乳凝集反应期间，在该聚噁唑啉浓度范围内，溶液的粘度低，溶液易于处理，并且可获得充分的致敏效果。浓度可以根据待测目标物质和不溶性载体的类型而适当设定。
(被检体中的目标物质的测量方法)
本实施方案是一种通过使用携带抗体或抗原的不溶性载体的胶乳凝集法测量被检体中的目标物质的方法，其中，在测量被检体中的目标物质的方法中，使用根据本实施方案的胶乳凝集试剂或胶乳凝集试剂盒。这里，测量包括定性测量和定量测量的含义。
在被检体中的目标物质的测量方法中，优选的形式为使用携带抗体或抗原的胶乳颗粒的胶乳凝集法。
在胶乳凝集法的一个实例中，可能包含目标物质的被检体(血清等)与包含携带针对目标物质的抗体的胶乳颗粒的胶乳凝集试剂反应，从而通过该抗原-抗体反应产生凝集体，并且目视或光学检测凝集体的这种凝集，从而能够定性和定量测量目标物质。
在胶乳凝集法的另一个实例中，将可能包含目标物质的被检体与被检体稀释液(胶乳凝集试剂的第一试剂)混合。接着，进一步混合包含固定有针对目标物质的抗体或抗原的胶乳颗粒的胶乳颗粒分散液(胶乳凝集试剂的第二试剂)。在当混合第一试剂和第二试剂时存在目标物质的情况下，胶乳颗粒由于抗原-抗体反应而凝集。因此，可以通过目视或光学检测该凝集来定性和定量地测量目标物质。
作为胶乳凝集法，如上所述，优选在反应期间的聚噁唑啉浓度为0.005w/v％以上且1.0w/v％以下的范围内进行胶乳凝集法。在聚噁唑啉浓度在该范围内的情况下，在通过胶乳凝集法测量被检体中的目标物质时，可以以高灵敏度和高测量精度来测量目标物质。
胶乳凝集法通常在4℃以上且50℃以下的反应温度范围内进行。在温度低的情况下，抗原-抗体的反应性降低，并且在温度高的情况下，抗原-抗体的免疫复合物的稳定性降低。因此，反应温度优选为10℃以上且40℃以下，特别优选为30℃以上且40℃以下。胶乳凝集法通常在0分钟以上且60分钟以下的反应时间范围内进行。该范围优选为1分钟以上且30分钟以下。
可以目视或光学检测由抗原-抗体反应产生的凝集体，从而测量目标物质。即，可以定性和定量地测量目标物质。在该检测步骤中，可以目视观察凝集形成，但从检测再现性和吞吐量的观点，优选使用光学装置测量凝集程度。作为光学装置，优选使用能够测量散射光或透射光的装置，并且可以使用分光光度计等。
在本实施方案的胶乳凝集法中，不溶性载体优选为聚苯乙烯颗粒、包含硅氧烷的聚苯乙烯颗粒或SG颗粒。作为胶乳凝集法，反应期间聚噁唑啉浓度也可以根据所使用的不溶性载体而改变。
通过本实施方案的胶乳凝集法测量的目标物质可以为任何物质，只要该物质可以通过免疫反应测量即可，并且其实例包括如抗原和抗体等物质。其实例包括C-反应蛋白(CRP)、铁蛋白、白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白E(IgE)、α-甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、KL-6、胃蛋白酶原(PG)、类风湿因子(RF)、脂蛋白、胰岛素、感染相关抗原及其抗体、激素、维生素和抗生素等，但本实施方案的胶乳凝集试剂不限于此。
作为胶乳凝集法，反应期间聚噁唑啉浓度也可以根据目标物质而改变。
[实施例]
以下，作为本公开的实施例(以下，称为本实施例)，将描述由两种液体构成的胶乳凝集试剂盒，但本公开不限于此。
<实施例1：胶乳凝集试剂盒的第一试剂的制备例>
由两种液体构成的胶乳凝集试剂盒的实例包括用于稀释被检体的第一试剂和包含抗体致敏胶乳的第二试剂。此处，说明第一试剂的制备例。
<实施例1-1：包含聚(2-乙基-2-噁唑啉)的胶乳凝集试剂(第一试剂)的制备>
将聚(2-乙基-2-噁唑啉)(平均分子量为400,000，sigma-aldrich)溶解在PBS溶液(pH 7.4)中。在下文中，聚(2-乙基-2-噁唑啉)可以缩写为“POX”。将POX浓度调节至0.5w/v％的浓度，从而得到本实施例的胶乳凝集试剂(第一试剂)。以下，将该第一试剂称为R1+POX。
(比较例1-1：现有技术中胶乳凝集试剂的制备)
为了比较，以与实施例1-1相同的方式制备不含聚(2-乙基-2-噁唑啉)的第一试剂(即，PBS溶液)。将其称为R1。
将作为广泛用作敏化剂的非离子性聚合物的PEG(平均分子量为400,000，Sigma-Aldrich)、和作为阴离子性聚合物的海藻酸钠(80-120，Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)(SA)溶解在PBS中以具有0.5w/v％的浓度，从而制备R1+PEG和R1+SA各自作为比较用第一试剂。
<实施例1-2：胶乳凝集试剂(第一试剂)的粘度测量>
测量本实施例的胶乳凝集试剂(第一试剂)R1+POX的粘度。使用E型旋转粘度计(RE-80，Toki Sangyo Co.,Ltd.)测量粘度。结果在表1中示出。
(比较例1-2)
为了比较，测量R1+PEG和R1+SA的粘度。结果在表1中示出。
[表1]
第一试剂 敏化剂的浓度w/v％ 粘度mPa·s
实施例1-2 R1+POX 0.5 1.45
比较例1-1 R1 0.0 0.94
比较例1-2 R1+PEG 0.5 4.10
比较例1-2 R1+SA 0.5 8.00
从表1的结果中，在彼此具有相同浓度的聚合物溶液中，R1+POX与比较例的R1相比粘度高，但与作为包含现有技术中的凝聚剂的溶液的R1+PEG和R1+SA相比粘度低。发现本实施例的聚(2-乙基-2-噁唑啉)与作为具有相似分子量的聚合物的PEG相比具有相似的性质并且没有增加溶液的粘度。尽管SA具有特别高的粘度，但据推测其分子量为数百万，因此，认为还包括分子量的效果。
<实施例1-3：胶乳凝集试剂(第一试剂)的粘度测量>
测量在改变POX浓度的情况下本实施例的胶乳凝集试剂(第一试剂)R1+POX的粘度。使用E型旋转粘度计(RE-80，Toki Sangyo Co.,Ltd.)测量粘度。结果在表2中示出。
(比较例1-3)
为了比较，以与实施例1-3相同的方式测量在改变聚合物浓度的情况下R1+PEG和R1+SA的粘度。结果在表2中示出，并且“-”表示“未测量”。
[表2]
Figure BDA0003520781220000151
从表2的结果中，发现R1+POX的粘度随着聚合物浓度的增加而增加，但与R1+PEG和R1+SA的比较例相比，粘度的增加逐渐增大。本实施例的聚(2-乙基-2-噁唑啉)与类似聚合物PEG和SA相比，具有可以更缓和地调节溶液粘度的优点。
<实施例2：胶乳凝集试剂盒的第二试剂的制备例>
由两种液体构成的胶乳凝集试剂盒的实例包括用于稀释被检体的第一试剂和包含抗体致敏胶乳的第二试剂。此处，说明第二试剂的制备例。
(合成例2-1：SG颗粒的合成)
称量12.0g苯乙烯(St：Kishida Chemical Co.,Ltd.)、17.9g甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA：Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.)、0.45g二乙烯基苯(DVB：Kishida ChemicalCo.,Ltd.)、2168.6g离子交换水，并且将其装入2L的四颈可分离烧瓶中，以制得混合溶液，将该混合溶液在以200rpm搅拌的同时保持在70℃，并且以200ml/min的流量进行氮气流动，从而使上述四颈可分离烧瓶的内部脱氧。接着，在混合溶液中添加将单独调节的1.13g V-50(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)溶解于30g离子交换水而制备的溶解液，从而开始无皂乳液聚合。聚合开始2小时后，将3.1g GMA添加至上述四颈可分离烧瓶中，将混合物在以200rpm搅拌的同时保持在70℃下22小时，从而获得包含粒状共聚物A的水分散液。在将分散液缓慢冷却至室温后，对其一部分取样，并使用质子NMR、气相色谱和凝胶渗透色谱评价聚合转化率。结果，确认聚合转化率基本为100％。粒状共聚物A的干燥粒径为151.4nm，在水中的粒径为160.2nm。将粒状共聚物A通过超滤浓缩或离子交换水稀释成2.5w/v％的水分散液，并且在遮光条件下在4℃下贮存。接着，称量包含24g粒状共聚物A的2.5w/v％水分散液、3.3g离子交换水、40mg(0.26mmоl)巯基琥珀酸(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation)和0.214mL(2.34mmоl)3-巯基-1,2-丙二醇(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation)，并且将其装入100ml圆底烧瓶中，添加三乙胺(Kishida ChemicalCo.,Ltd.)以调节pH＝10。接着，将上述圆底烧瓶中的内容物在以200rpm搅拌的同时加热至70℃，并且在该状态下再保持18小时，从而得到SG颗粒(以下，简称为“胶乳A颗粒”)的分散液。通过离心分离机将胶乳A颗粒从上述分散液中分离出来，将胶乳A颗粒再分散在离子交换水中的操作重复8次以纯化胶乳A颗粒，最后，将胶乳A颗粒调节至1.0w/v％，并且以水分散液的状态贮存。贮存条件为在遮光条件下4℃。胶乳A颗粒在水中的粒径为202.0nm。
(合成例2-2：包含硅氧烷的聚苯乙烯颗粒的合成)
将157g 50mM 2-吗啉乙磺酸(MES，由Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.制造)缓冲液(pH 7.0)和1.3g聚乙烯吡咯烷酮K-30(分子量40,000，由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)混合。接着，添加4g 3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(LS-3380，由Shin-Etsu Chemical Co.,Ltd.制造)和13g苯乙烯(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)，并且在室温下吹送氮气的同时搅拌混合物10分钟。然后，将烧瓶中的乳液在油浴中加热至70℃。将0.5g过硫酸钾(由Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造)溶解于离子交换水中，并且将得到的溶液添加到加热至70℃的乳液中。在70℃下搅拌7小时后，停止加热，并且进行搅拌整夜，从而得到包含硅氧烷的聚苯乙烯颗粒前体的分散液。接着，对包含硅氧烷的聚苯乙烯颗粒前体的分散液离心分离，以收集包含硅氧烷的聚苯乙烯颗粒前体，并且弃去上清液。将收集的包含硅氧烷的聚苯乙烯颗粒前体再分散在离子交换水中，然后，通过重复多次离心分离操作来洗涤。在使用粒度分析仪(商品名：Zetasizer，由Malvern PanalyticalLtd制造)通过动态光散射评价由此得到的包含硅氧烷的聚苯乙烯颗粒前体的平均粒径的情况下，平均粒径为203nm。接着，将0.4g包含硅氧烷的聚苯乙烯颗粒前体与最终浓度为w/v％的Tween(注册商标)20(由Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.制造)和40mL离子交换水混合。将该混合溶液在室温下搅拌15分钟后，添加0.04mL作为具有羧基的硅烷偶联剂的X-12-1135(由Shin-Etsu Chemical Co.,Ltd.制造)，并且在室温下搅拌整夜。随后，将该分散液离心分离并且弃去上清液。将收集的颗粒再分散在离子交换水中，然后，通过重复多次离心分离操作来洗涤。得到的颗粒为包含硅氧烷的聚苯乙烯胶乳颗粒(以下，简称为“胶乳B颗粒”)。
<实施例2-1：胶乳凝集试剂盒的第二试剂的制备例>
合成例2-1和合成例2-2中得到的胶乳A颗粒和胶乳B颗粒的羧基通过使用WSC/NHS(水溶性碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺)的公知方法来活化。将0.05mL 10w/v％活化胶乳A颗粒和胶乳B颗粒的水溶液和0.05mL包含1mg/mL抗人CRP多克隆抗体(由Oriental YeastCo.,Ltd.制造)的50mM MES缓冲液(pH 5.0)混合并且在室温下彼此反应1小时。此后，将通过由离心分离洗涤溶液得到的抗体固定化颗粒分别称为抗体致敏胶乳A颗粒和抗体致敏胶乳B颗粒，并且将其水分散液称为抗体致敏胶乳A颗粒分散液和抗体致敏胶乳B颗粒分散液，这些用作第二试剂。将抗体致敏胶乳A颗粒分散液和抗体致敏胶乳B颗粒分散液分别称为R2-A和R2-B。另外，除了使用市售的粒径为200nm的聚苯乙烯胶乳C颗粒(IMMUTEX(注册商标)P0113，由JSR Corporation制造)并且用牛血清白蛋白(BSA)进行后涂覆以外，以与上述同样地方式制备的制备结果用作抗体致敏胶乳C颗粒分散液，即第二试剂。将其称为R2-C。
(样品)
将不含CRP的人血清(由Oriental Yeast Co.,Ltd.制造)用于确认对人血清的非特异反应。将CRP溶液用作用于灵敏度测量的抗原溶液以确认致敏效果。使用CRP浓度为0.5mg/dL的CRP溶液。
<实施例2-2：通过胶乳凝集测量的非特异反应性和致敏效果的评价1>
本实施例的胶乳凝集试剂的非特异反应性通过使用人血清的胶乳凝集测量来确认。将样品中的不含CRP的人血清1μL添加至实施例1-1中得到的本实施例的第一试剂(R1+POX)50μL中。将其装入分光光度计测量单元(光程长度为10mm)中并且在37℃下保持5分钟。接着，将50μL本实施例的第二试剂(R2-A溶液)添加至51μL R1溶液中，并且充分混合。之后，使用分光光度计测量572nm处的吸光度(称为0分钟时的吸光度)。5分钟后，再次测量572nm处的吸光度(称为5分钟后的吸光度)。求出所得到的两个点的吸光度之差((5分钟后的吸光度)-(0分钟时的吸光度))，将求出的差乘以10,000而得到的值称为吸光度变化量。在没有非特异反应的情况下，该值将接近于零。在发生非特异反应的情况下，该值将增大。此处，在吸光度变化量为100以上的情况下，定义为发生了非特异反应。R1+POX的非特异反应根据上述测量方法来评价。结果在表3和表4中示出。此处，非特异反应性是指上述非特异反应的程度，并且由吸光度变化量来表示。
本实施例的胶乳凝集试剂的致敏效果通过CRP的胶乳凝集测量来确认。将上述样品的CRP浓度为0.5mg/dL的CRP溶液1μL添加至在实施例1-1中得到的上述本实施例的第一试剂(R1+POX)50μL中。将其装入分光光度计测量单元(光程长度为10mm)中并且在37℃下保持5分钟。接着，将50μL本实施例的第二试剂(R2-A溶液)添加至51μL R1溶液中，并且充分混合。之后，使用分光光度计测量572nm处的吸光度(称为0分钟时的吸光度)。5分钟后，再次测量572nm处的吸光度(称为5分钟后的吸光度)。求出所得到的两个点的吸光度之差((5分钟后的吸光度)-(0分钟时的吸光度))，将求出的差乘以10,000而得到的值称为吸光度变化量。在由于CRP和抗体-抗原反应而发生颗粒凝集的情况下，吸光度变化量增大。吸光度变化量越大，灵敏度越高。R1+POX的CRP测量灵敏度(CRP浓度0.5mg/dL)根据上述测量方法来评价。结果在表3中示出。此处，CRP测量灵敏度是指由CRP与抗体-抗原反应引起的颗粒凝集程度，并且由吸光度变化量来表示。
(比较例2-2)
为了比较，以与实施例2-2相同的方式评价R1+PEG和R1+SA的非特异反应性和致敏效果。结果在表3中示出。
[表3]
Figure BDA0003520781220000201
在R2-A溶液用作第二试剂，即SG颗粒用作不溶性载体，并且改变第一试剂的聚合物浓度的情况下，通过胶乳凝集测量的非特异反应性和致敏效果的评价结果在表3中示出。
R1+POX的灵敏度高于不含敏化剂的R1(比较例)，并且CRP测量灵敏度取决于POX浓度而改善。即，确认了POX起到胶乳凝集试剂的敏化剂的作用。此外，R1+POX在浓度高达0.866％时对人血清的非特异反应性非常低。相对地，比较例的R1+PEG和R1+SA具有高灵敏度并起到敏化剂的作用，但是发生了非特异反应。如表中的*所示，具体而言，在反应期间的R1+SA的聚合物浓度为0.186％以上的情况下，当测量0分钟时的吸光度时迅速发生凝集，并且吸光度为通过分光光度计测量的上限的3.0以上(超出范围)，因此无法进行测量(在表中表示为不可测量)。PEG和海藻酸的凝集可能因盐而发生，并且由于溶液粘度高，使得存在如搅拌期间产生气泡和反应再现性等问题。当将比较例2-2的R1+PEG的结果和R1+SA的结果进行比较时，推测本实施例的包含聚(2-乙基-2-噁唑啉)的胶乳凝集试剂的吸光度变化量在不发生非特异反应的情况下为100以下，最大灵敏度为10,600，可以增大吸光度变化量。在不发生非特异反应的情况下，比较例的最大灵敏度对于PEG为3,310，并且对于SA为7,030。
从以上结果中，在当SG颗粒用作不溶性载体时使用本实施例的包含聚(2-乙基-2-噁唑啉)的胶乳凝集试剂的情况下，可以在抑制非特异反应的同时表现出致敏效果，并且可以以高灵敏度测量胶乳凝集。
<实施例2-3：通过胶乳凝集测量的非特异反应性和致敏效果的评价2>
与实施例2-2类似，当R2-C溶液用作第二试剂、即聚苯乙烯胶乳颗粒用作不溶性载体时，通过胶乳凝集测量来评价非特异反应性和致敏效果。
结果在表4中示出。
(比较例2-3)
为了比较，以与实施例2-3相同的方式评价R1+PEG和R1+SA的非特异反应性和致敏效果。结果在表4中示出。
[表4]
Figure BDA0003520781220000211
在R2-C溶液用作第二试剂，即聚苯乙烯胶乳颗粒用作不溶性载体，并且改变第一试剂的聚合物浓度的情况下，通过胶乳凝集测量的非特异反应性和致敏效果的评价结果在表4中示出。
与实施例2-2的结果类似，即使当R2-C溶液用作第二试剂，即聚苯乙烯胶乳颗粒用作不溶性载体时，R1+POX的灵敏度也高于不含敏化剂的R1(比较例)，并且CRP测量灵敏度依赖于POX浓度而改善。即，确认了POX起到胶乳凝集试剂的敏化剂的作用。此外，R1+POX在高达0.866％的浓度下对人血清没有非特异反应性。相对地，比较例2-3的R1+PEG和R1+SA灵敏度高，并且起到敏化剂的作用，但发生了非特异反应。如表中的*所示，具体而言，在反应期间R1+SA的聚合物浓度为0.248％以上的情况下和在反应期间R1+PEG的聚合物浓度为0.495％以上的情况下，当测量0分钟时的吸光度时迅速发生凝集，吸光度为通过分光光度计测量的上限的3.0以上(超过范围)，从而无法进行测量(表中表示为不可测量)。当将比较例2-3的R1+PEG的结果和R1+SA的结果进行比较时，推测本实施例的包含聚(2-乙基-2-噁唑啉)的胶乳凝集试剂的非特异反应性中的吸光度变化量为100以下，最大灵敏度为11,410，并且可以非常高。比较例的最大灵敏度对于PEG为5,240，并且对于SA为8,250。
从以上结果中，在当聚苯乙烯胶乳颗粒用作不溶性载体时使用本实施例的包含聚(2-乙基-2-噁唑啉)的胶乳凝集试剂的情况下，可以在抑制非特异反应的同时表现出致敏效果，并且可以以高灵敏度测量胶乳凝集。
<实施例2-4：测量精度的评价>
为了评价测量精度，以与实施例2-2和2-3相同的方式反复测量通过胶乳凝集测量的致敏效果(CRP浓度为0.5mg/dL)。
表5示出当第一试剂为R1+POX并且第二试剂为R2-A溶液、即SG颗粒用作不溶性载体时重复测量的结果。
表6示出当R1+POX用作第一试剂并且R2-C溶液用作第二试剂、即聚苯乙烯胶乳颗粒用作不溶性载体时的重复测量的结果。
(比较例2-4)
为了比较，以与实施例2-4相同的方式用R1+PEG和R1+SA重复测量第一试剂。结果在表5和表6中示出。
[表5]
Figure BDA0003520781220000231
从表5的结果中，发现与比较例相比，本实施例的R1+POX具有较小的变化系数和较高的当SG颗粒用作不溶性载体时的重复测量精度。
[表6]
Figure BDA0003520781220000241
从表6的结果中，发现与比较例相比，本实施例的R1+POX具有较小的变化系数和较高的当聚苯乙烯胶乳颗粒用作不溶性载体时的重复测量精度。
<实施例3：聚(2-乙基-2-噁唑啉)的分子量的效果>
将平均分子量为200,000的聚(2-乙基-2-噁唑啉)(sigma-aldrich)以与实施例1-1相同的方式溶解在PBS中，并且制备本实施例的胶乳凝集试剂R1+POX-200k。将平均分子量为50,000的聚(2-乙基-2-噁唑啉)(sigma-aldrich)以与实施例1-1相同的方式溶解在PBS中，并且制备本实施例的胶乳凝集试剂R1+POX-50k。以与实施例2-2相同的方式评价通过胶乳凝集测量的非特异反应性和致敏效果。为了确认分子量的效果，R1+POX(POX的平均分子量为400,000)也以相同的方式来评价。结果在表7中示出。
[表7]
Figure BDA0003520781220000251
从表7的结果中，发现在本实施例的包含聚(2-乙基-2-噁唑啉)的胶乳凝集试剂中，聚(2-乙基-2-噁唑啉)的分子量越大，致敏效果越高。
<实施例4：通过胶乳凝集测量的非特异反应性和致敏效果的评价3>
与实施例2-2类似，当R2-B溶液用作第二试剂、即包含硅氧烷的聚苯乙烯胶乳颗粒用作不溶性载体时，通过胶乳凝集测量来评价非特异反应性和致敏效果。
结果在表8中示出。
[表8]
Figure BDA0003520781220000252
如表8所示，即使当R2-B溶液用作第二试剂，即包含硅氧烷的聚苯乙烯胶乳颗粒用作不溶性载体时，R1+POX(第一试剂的聚合物浓度为0.5w/v％)的吸光度变化量大于不含敏化剂的R1(第一试剂的聚合物浓度为0w/v％)的吸光度变化量。即，确认了POX起到包括包含硅氧烷的聚苯乙烯胶乳颗粒的胶乳凝集剂的敏化剂的作用。
<实施例5-1：包含聚(2-乙基-2-噁唑啉)的胶乳凝集试剂(第一试剂B)的制备>
将POX(平均分子量为400,000，sigma-aldrich)溶解在HEPES-T溶液(pH7.9，包含0.01％Tween 20)中。将POX浓度调节至1.5w/v％的浓度，从而得到本实施例的胶乳凝集试剂(第一试剂B)。以下，将该第一试剂称为R1+POX-B。
(比较例5-1：现有技术中的胶乳凝集试剂的制备)
为了比较，以与实施例5-1相同的方式制备不含POX的第一试剂(即HEPES-T溶液)。将其称为R1-B。
<实施例6-1：胶乳凝集试剂盒的第二试剂的制备例>
通过公知的方法，使用市售的粒径为153nm的聚苯乙烯胶乳D颗粒(IMMUTEX(注册商标)P2118，由JSR Corporation制造)，从而制备抗体致敏胶乳D颗粒分散液，即第二试剂。对于抗体敏化，将抗体物理吸附至聚苯乙烯胶乳D颗粒的表面上并且用BSA后涂覆。
以下示出制备方法的一个实例。
用HEPES缓冲液(pH 7.9)稀释聚苯乙烯胶乳D颗粒以具有3％的固成分浓度。用相同的缓冲液稀释抗人CRP多克隆抗体，以制备浓度为约1.0mg/ml的抗体溶液。将0.1mL抗体溶液和0.1mL聚苯乙烯胶乳D颗粒彼此混合并且在4℃下搅拌整夜。在20000G下离心分离15分钟后，去除上清液，并且将0.2％BSA HEPES溶液作为封端剂添加至沉淀物中。在室温下搅拌60分钟后，通过在20000G下离心分离15分钟而去除上清液。在用HEPES-T溶液洗涤沉淀物两次后，添加HEPES-T溶液并且再分散，使得胶乳固成分浓度最终为0.1％，所得物用作抗人CRP抗体结合胶乳试剂。将其称为R2-D。
<实施例6-2：通过胶乳凝集测量的非特异反应性和CRP测量的致敏效果的评价>
与实施例2-2类似，当R1+POX-B用作第一试剂，并且R2-D溶液用作第二试剂，即聚苯乙烯胶乳颗粒(抗体物理吸附至其上)用作不溶性载体时，通过胶乳凝集测量来评价非特异反应性和致敏效果。对于非特异反应性，使用不含CRP的人血清(CRP浓度为0mg/dL)，并且对于致敏效果，使用CRP浓度为0.5、1、2和4mg/dL的CRP溶液，以与实施例2-2相同的方式进行评价。结果在表9中示出。
(比较例6)
为了比较，除了第一试剂为R1-B以外，以与实施例6-2相同的方式评价非特异反应性和致敏效果。结果在表9中示出。
[表9]
Figure BDA0003520781220000271
如表9所示，作为评价目标物质(测量目标)为CRP的结果，即使当R2-D溶液用作第二试剂，即聚苯乙烯胶乳颗粒(抗体物理吸附至其上)用作不溶性载体时，R1+POX-B的吸光度变化量也大于不含敏化剂的R1-B的吸光度变化量。非特异反应性也非常小。即，确认了POX起到包含聚苯乙烯胶乳颗粒(抗体物理吸附至其上)的胶乳凝集试剂的敏化剂的作用。
<实施例7-1：胶乳凝集试剂盒的第二试剂的制备例>
除了抗人铁蛋白抗体(克隆No.13，由Mikuri Immunological Lab.Co.制造)用作抗体，并且最终胶乳固成分浓度为0.3％以外，以与实施例6-1相同的方式制备抗体致敏胶乳D颗粒分散液，即第二试剂。第二试剂是抗人铁蛋白抗体结合胶乳试剂，将其称为R2-F。
<实施例7-2：通过胶乳凝集测量的非特异反应性和铁蛋白测量的致敏效果的评价>
与实施例2-2类似，当R1+POX-B用作第一试剂，并且R2-F溶液用作第二试剂，即聚苯乙烯胶乳颗粒(抗体物理吸附至其上)用作不溶性载体时，通过胶乳凝集测量来评价非特异反应性和致敏效果。使用磷酸盐缓冲盐水(铁蛋白浓度为0μg/ml)评价非特异反应性，并且使用铁蛋白浓度为15和150μg/ml的铁蛋白溶液作为被检体评价致敏效果。除了使用10μL的被检体、使用100μL的第一试剂(R1+POX-B)和分光光度计测量单元的光程长度为2mm以外，以与实施例2-2相同的方式评价上述被检体。结果在表10中示出。
(比较例7)
为了比较，除了第一试剂为R1-B以外，以与实施例7-2相同的方式评价非特异反应性和致敏效果。结果在表10中示出。
[表10]
Figure BDA0003520781220000281
如表10所示，即使当R2-F溶液用作第二试剂，即聚苯乙烯胶乳颗粒(抗体物理吸附至其上)用作不溶性载体，并且目标物质(测量目标)为铁蛋白时，R1+POX-B的吸光度变化量也大于不含敏化剂的R1-B的吸光度变化量。非特异反应性也非常小。即，确认了POX起到包含聚苯乙烯胶乳颗粒(抗体物理吸附至其上)的胶乳凝集试剂的敏化剂的作用。
<实施例8-1：胶乳凝集试剂盒的第二试剂的制备例>
除了抗人促甲状腺激素(TSH)抗体(克隆9G11和克隆3F10，由MikuriImmunological Lab.Co.制造)用作抗体，并且最终胶乳固成分浓度为0.3％以外，以与实施例6-1相同的方式制备抗体致敏胶乳D颗粒分散液，即第二试剂。第二试剂是抗人TSH抗体结合胶乳试剂，将其称为R2-T。
<实施例8-2：通过胶乳凝集测量的非特异性反应性和TSH测量的致敏效果的评价>
与实施例2-2类似，当R1+POX-B用作第一试剂，并且R2-T溶液用作第二试剂，即聚苯乙烯胶乳颗粒(抗体物理吸附至其上)用作不溶性载体时，通过胶乳凝集测量来评价非特异反应性和致敏效果。使用包含0.1％BSA(TSH浓度为0μg/ml)的磷酸盐缓冲盐水来评价非特异反应性，并且使用TSH浓度为10μg/ml的TSH溶液(包含0.1％BSA的磷酸盐缓冲盐水)作为被检体来评价致敏效果。除了使用20μL的被检体、使用100μL的第一试剂(R1+POX-B)和分光光度计测量单元的光程长度为2mm以外，以与实施例2-2相同的方式评价上述被检体。结果在表11中示出。
(比较例8)
为了比较，除了第一试剂为R1-B以外，以与实施例8-2相同的方式评价非特异反应性和致敏效果。结果在表11中示出。
[表11]
Figure BDA0003520781220000301
如表11所示，即使当R2-T溶液用作第二试剂，即聚苯乙烯胶乳颗粒(抗体物理吸附至其上)用作不溶性载体，并且目标物质(测定目标)为TSH时，R1+POX-B的吸光度变化量也大于不含敏化剂的R1-B的吸光度变化量。非特异性反应性也非常小。即，确认了POX起到包含聚苯乙烯胶乳颗粒(抗体物理吸附至其上)的胶乳凝集试剂的敏化剂的作用。
虽然已参考示例性实施方案描述了本公开，但应理解本发明并不局限于公开的示例性实施方案。所附权利要求的范围符合最宽泛的解释以涵盖所有此类改进以及等同的结构和功能。

Claims (11)

1.一种胶乳凝集反应敏化剂，其特征在于，其用于通过使用携带抗体或抗原的不溶性载体的胶乳凝集法测量被检体中的目标物质的方法中，所述胶乳凝集反应敏化剂包含具有由以下通式(1)表示的重复单元的聚噁唑啉：
Figure FDA0003520781210000011
在式(1)中，R表示氢原子、甲基、乙基或丙基，和
n为100以上的整数。
2.根据权利要求1所述的胶乳凝集反应敏化剂，其中，所述通式(1)中的R为乙基。
3.根据权利要求1所述的胶乳凝集反应敏化剂，其中，所述聚噁唑啉的重均分子量为10,000以上且1,000,000以下。
4.一种胶乳凝集试剂，其特征在于，其包含：
根据权利要求1所述的胶乳凝集反应敏化剂；和
不溶性载体，
其中，所述不溶性载体为聚苯乙烯颗粒、包含硅氧烷的聚苯乙烯颗粒和包含聚(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的聚苯乙烯颗粒中的任意一者。
5.根据权利要求4所述的胶乳凝集试剂，其中，所述聚噁唑啉的浓度为0.01w/v％以上且2.0w/v％以下。
6.一种胶乳凝集试剂盒，其特征在于，其包括根据权利要求4所述的胶乳凝集试剂作为构成成分。
7.根据权利要求6所述的胶乳凝集试剂盒，其中
所述胶乳凝集试剂至少包含两种以上的成分，和
所述胶乳凝集试剂盒至少包括包含根据权利要求4所述的胶乳凝集试剂的第一试剂，和包含携带抗体或抗原的不溶性载体的第二试剂。
8.根据权利要求6所述的胶乳凝集试剂盒，其中，制备所述胶乳凝集试剂盒以在所述聚噁唑啉的浓度为0.005w/v％以上且1.9w/v％以下的范围内进行胶乳凝集法。
9.一种通过胶乳凝集法测量被检体中的目标物质的方法，其特征在于，所述胶乳凝集法使用携带抗体或抗原的不溶性载体，其中，在所述方法中，使用根据权利要求4所述的胶乳凝集试剂或根据权利要求6所述的胶乳凝集试剂盒。
10.根据权利要求9所述的通过胶乳凝集法测量被检体中的目标物质的方法，其中，在所述胶乳凝集试剂或所述胶乳凝集试剂盒中的所述聚噁唑啉的浓度为0.005w/v％以上且1.9w/v％以下的范围内进行胶乳凝集法。
11.根据权利要求9所述的通过胶乳凝集法测量被检体中的目标物质的方法，其中，所述不溶性载体为聚苯乙烯颗粒、包含硅氧烷的聚苯乙烯颗粒和包含聚(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的聚苯乙烯颗粒中的任意一者。
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