JP2003185667A - イムノアッセイ用の粒子およびその処理方法 - Google Patents
イムノアッセイ用の粒子およびその処理方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 粒子凝集イムノアッセイにおける干渉を低減
させるイムノアッセイ用の粒子を提供する。 【解決手段】 カルボキシル基を含む粒子を、N-ヒドロ
キシスクシンイミドもしくはN-ヒドロキシスルホスクシ
ンイミド、ならびにカルボジイミドカップリング剤と反
応させて、スクシンイミドエステル基を含む活性化粒子
を提供し；該活性化粒子を抗体と接触させて、共有結合
した抗体および残存スクシンイミドエステルを含む感作
粒子を提供し；そして、該感作粒子を水性混合液中にお
いてアミン化合物：H２N-R-X [式中、-Xは-NH２、-OHも
しくは-CO２CH２CH３であり、Rはアルキル基もしくはア
ルキルエーテル基であり、ここで、-Xが-NH２もしくは-
CO２CH２CH３である場合には、Rは1〜20個の炭素原子を
含み、-Xが-OHである場合には、Rは4〜20個の炭素原子
を含む]で処理する；ことを特徴とする、イムノアッセ
イ用の粒子の調製方法。
させるイムノアッセイ用の粒子を提供する。 【解決手段】 カルボキシル基を含む粒子を、N-ヒドロ
キシスクシンイミドもしくはN-ヒドロキシスルホスクシ
ンイミド、ならびにカルボジイミドカップリング剤と反
応させて、スクシンイミドエステル基を含む活性化粒子
を提供し；該活性化粒子を抗体と接触させて、共有結合
した抗体および残存スクシンイミドエステルを含む感作
粒子を提供し；そして、該感作粒子を水性混合液中にお
いてアミン化合物：H２N-R-X [式中、-Xは-NH２、-OHも
しくは-CO２CH２CH３であり、Rはアルキル基もしくはア
ルキルエーテル基であり、ここで、-Xが-NH２もしくは-
CO２CH２CH３である場合には、Rは1〜20個の炭素原子を
含み、-Xが-OHである場合には、Rは4〜20個の炭素原子
を含む]で処理する；ことを特徴とする、イムノアッセ
イ用の粒子の調製方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、イムノアッセイの
分野に関し、より詳細には、粒子凝集イムノアッセイに
おける干渉を低減させるために粒子を処理する方法に関
するものである。
分野に関し、より詳細には、粒子凝集イムノアッセイに
おける干渉を低減させるために粒子を処理する方法に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】薬物分子などのアナライト（測定対象物
質）の試験においてイムノアッセイは特に有用性を示し
てきた。イムノアッセイでは、アナライト、それは時に
抗原を意味するが、そのアナライトと特異的な受容体、
それは典型的には抗体であるが、その受容体との相互作
用は抗原抗体複合体の形成をもたらす。この複合体は種
々の測定法、例えば放射活性、蛍光、吸光度、および光
散乱などで検出することができる。その後、結果はアナ
ライトの存在、不在、理想的には濃度と相関させること
ができる。
質）の試験においてイムノアッセイは特に有用性を示し
てきた。イムノアッセイでは、アナライト、それは時に
抗原を意味するが、そのアナライトと特異的な受容体、
それは典型的には抗体であるが、その受容体との相互作
用は抗原抗体複合体の形成をもたらす。この複合体は種
々の測定法、例えば放射活性、蛍光、吸光度、および光
散乱などで検出することができる。その後、結果はアナ
ライトの存在、不在、理想的には濃度と相関させること
ができる。
【０００３】あるタイプの粒子ベースの凝集イムノアッ
セイは、抗原と、粒子に結合された抗体との結合に基づ
くものである。用いる粒子は通常はポリスチレンおよび
ポリ(メチルメタクリレート)などのポリマー粒子で、典
型的には乳化重合法によって調製される。その他の粒子
系も用いることができ、そのようなものとしては、金ナ
ノ粒子および金コロイドなどの金粒子、シリカなどのセ
ラミック粒子、ガラス、および金属酸化物粒子などが含
まれる。抗体は粒子上に物理的に吸着させることができ
る。しかし、抗体を共有結合で結合させれば安定性がよ
り高く、有効期間がより長いものが得られる。たとえ
ば、J. L. Ortega-Vinuesaら, J. Biomater. Sci. Poly
mer Edn., 12(4), 379-408(2001)を参照されたい。
セイは、抗原と、粒子に結合された抗体との結合に基づ
くものである。用いる粒子は通常はポリスチレンおよび
ポリ(メチルメタクリレート)などのポリマー粒子で、典
型的には乳化重合法によって調製される。その他の粒子
系も用いることができ、そのようなものとしては、金ナ
ノ粒子および金コロイドなどの金粒子、シリカなどのセ
ラミック粒子、ガラス、および金属酸化物粒子などが含
まれる。抗体は粒子上に物理的に吸着させることができ
る。しかし、抗体を共有結合で結合させれば安定性がよ
り高く、有効期間がより長いものが得られる。たとえ
ば、J. L. Ortega-Vinuesaら, J. Biomater. Sci. Poly
mer Edn., 12(4), 379-408(2001)を参照されたい。
【０００４】共有結合で抗体を結合させた粒子を調製す
るには、典型的には、粒子を活性化し、次いでその活性
化させた粒子へ抗体をカップリングさせる。表面にカル
ボキシル基を結合させた粒子では、活性化は、その粒子
をカルボジイミドカップリング剤の溶液およびN-ヒドロ
キシスクシンイミド(NHS)もしくはN-ヒドロキシスルホ
スクシンイミド(sNHS)などのスクシンイミド試薬と接触
させることによって行われることが多い。表面のカルボ
キシル基はNHS-エステル基もしくはsNHS-エステル基に
変換される。カルボジイミドカプラーとしては、例え
ば、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジ
イミド(EDC)；ジシクロヘキシカルボジイミド(DCC)；お
よびジイソプロピルカルボジイミド(DIC)が挙げられ
る。次いで、抗体、例えばIgGは、水性混合液中で活性
化粒子と抗体を混合することによって、粒子にカッブリ
ングさせることができ、それによって感作された粒子が
形成される。そのプロセスの説明を下記の反応スキーム
に示す。
るには、典型的には、粒子を活性化し、次いでその活性
化させた粒子へ抗体をカップリングさせる。表面にカル
ボキシル基を結合させた粒子では、活性化は、その粒子
をカルボジイミドカップリング剤の溶液およびN-ヒドロ
キシスクシンイミド(NHS)もしくはN-ヒドロキシスルホ
スクシンイミド(sNHS)などのスクシンイミド試薬と接触
させることによって行われることが多い。表面のカルボ
キシル基はNHS-エステル基もしくはsNHS-エステル基に
変換される。カルボジイミドカプラーとしては、例え
ば、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジ
イミド(EDC)；ジシクロヘキシカルボジイミド(DCC)；お
よびジイソプロピルカルボジイミド(DIC)が挙げられ
る。次いで、抗体、例えばIgGは、水性混合液中で活性
化粒子と抗体を混合することによって、粒子にカッブリ
ングさせることができ、それによって感作された粒子が
形成される。そのプロセスの説明を下記の反応スキーム
に示す。
【０００５】
【化１】
【０００６】次いで、その感作粒子を、典型的には、ポ
ストブロッカー、例えばウシ血清アルブミン(BSA)で処
理する。これらのプロセスでは、共有結合、例えば、ア
ミド結合(-NH-C(=O)-)が粒子表面と抗体との間、および
粒子表面とBSAの間に形成される。このような共有結合
の形成は、典型的には、完全に行われているわけではな
く、残存NHS-エステルもしくはsNHS-エステルが粒子表
面上に残りうる。
ストブロッカー、例えばウシ血清アルブミン(BSA)で処
理する。これらのプロセスでは、共有結合、例えば、ア
ミド結合(-NH-C(=O)-)が粒子表面と抗体との間、および
粒子表面とBSAの間に形成される。このような共有結合
の形成は、典型的には、完全に行われているわけではな
く、残存NHS-エステルもしくはsNHS-エステルが粒子表
面上に残りうる。
【０００７】感作粒子を水性環境中で分析すべきサンプ
ルと混合すると、サンプル中の抗原がその抗体と特異的
に結合することとなり、その結果、粒子は、個々の粒子
のサイズより大きな集合サイズを持つ粒子のクラスター
へと凝集する。この凝集はそのサンプルによる吸光度の
変化もしくは光散乱の変化を測定することによって検出
することができる。理想的には、粒子ベースの凝集イム
ノアッセイでは、凝集の程度はサンプル中の抗原量と相
関する。しかし、粒子とサンプルの間の非特異的な相互
作用によって抗原−抗体相互作用とは無関係の粒子の凝
集がもたらされることもある。これらの望ましくない相
互作用によって偽陽性もしくは偽陰性の結果が生ずるこ
とがあり、対象の抗原の濃度と凝集反応との不正確な相
関性をもたらしうる。
ルと混合すると、サンプル中の抗原がその抗体と特異的
に結合することとなり、その結果、粒子は、個々の粒子
のサイズより大きな集合サイズを持つ粒子のクラスター
へと凝集する。この凝集はそのサンプルによる吸光度の
変化もしくは光散乱の変化を測定することによって検出
することができる。理想的には、粒子ベースの凝集イム
ノアッセイでは、凝集の程度はサンプル中の抗原量と相
関する。しかし、粒子とサンプルの間の非特異的な相互
作用によって抗原−抗体相互作用とは無関係の粒子の凝
集がもたらされることもある。これらの望ましくない相
互作用によって偽陽性もしくは偽陰性の結果が生ずるこ
とがあり、対象の抗原の濃度と凝集反応との不正確な相
関性をもたらしうる。
【０００８】粒子表面上の残存NHS-エステルもしくはsN
HS-エステルはサンプル成分と非特異的な化学反応を起
こすと考えられ、特に問題になるのは、サンプル成分の
うちポリペプチドである。非特異的結合を最小限にする
ために、感作粒子は、イムノアッセイに用いる前に、こ
れらのエステルと反応させるためにグリシンもしくはエ
タノールアミンなどのアミン化合物で処理されてきた
(米国特許第5,486,479号)。このような努力を行った
が、その結果は成否まちまちであった。
HS-エステルはサンプル成分と非特異的な化学反応を起
こすと考えられ、特に問題になるのは、サンプル成分の
うちポリペプチドである。非特異的結合を最小限にする
ために、感作粒子は、イムノアッセイに用いる前に、こ
れらのエステルと反応させるためにグリシンもしくはエ
タノールアミンなどのアミン化合物で処理されてきた
(米国特許第5,486,479号)。このような努力を行った
が、その結果は成否まちまちであった。
【０００９】したがって、粒子に結合されたNHS-エステ
ルもしくはsNHA-エステルとサンプル成分との化学反応
を防止することが望ましい。また、サンプル成分の粒子
表面上への吸着を阻害するように粒子表面を改変するこ
とも望ましい。
ルもしくはsNHA-エステルとサンプル成分との化学反応
を防止することが望ましい。また、サンプル成分の粒子
表面上への吸着を阻害するように粒子表面を改変するこ
とも望ましい。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
のような従来技術の欠点がなく、粒子凝集イムノアッセ
イにおける干渉を低減させるイムノアッセイ用の粒子を
提供することである。
のような従来技術の欠点がなく、粒子凝集イムノアッセ
イにおける干渉を低減させるイムノアッセイ用の粒子を
提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明の1態様において
は、イムノアッセイ用の粒子を調製する方法を提供し、
この方法は、カルボキシル基を含む粒子を、N-ヒドロキ
シスクシンイミドもしくはN-ヒドロキシスルホスクシン
イミドおよびカルボジイミドカップリング剤と反応させ
て、スクシンイミドエステル基を含む活性化粒子を調製
し；該活性化粒子を抗体と接触させて、共有結合で結合
された抗体と残存スクシンイミドエステルを含む感作粒
子を取得し；水性混合液中の該感作粒子を式(I)のアミ
ン化合物： H２N-R-X (I)； [式中、-Xは-NH２、-OH、および-CO２CH２CH３からなる
群から選択され、Rはアルキル基およびアルキルエーテ
ル基からなる群から選択され、ここで、-Xが-NH ２もし
くは-CO２CH２CH３である場合には、Rは1〜20個の炭素
原子を含み、-Xが-OHである場合には、Rは4〜20個の炭
素原子を含む]で処理することを特徴とする。
は、イムノアッセイ用の粒子を調製する方法を提供し、
この方法は、カルボキシル基を含む粒子を、N-ヒドロキ
シスクシンイミドもしくはN-ヒドロキシスルホスクシン
イミドおよびカルボジイミドカップリング剤と反応させ
て、スクシンイミドエステル基を含む活性化粒子を調製
し；該活性化粒子を抗体と接触させて、共有結合で結合
された抗体と残存スクシンイミドエステルを含む感作粒
子を取得し；水性混合液中の該感作粒子を式(I)のアミ
ン化合物： H２N-R-X (I)； [式中、-Xは-NH２、-OH、および-CO２CH２CH３からなる
群から選択され、Rはアルキル基およびアルキルエーテ
ル基からなる群から選択され、ここで、-Xが-NH ２もし
くは-CO２CH２CH３である場合には、Rは1〜20個の炭素
原子を含み、-Xが-OHである場合には、Rは4〜20個の炭
素原子を含む]で処理することを特徴とする。
【００１２】本発明の別の1態様においては、イムノア
ッセイに用いるための感作粒子を提供し、該感作粒子
は、表面をもつ粒子；その表面に共有結合を介して結合
している少なくとも1つの抗体；ならびに、その表面上
の、スクシンイミドエステルと式(I)のアミン化合物： H２N-R-X (I)； [式中、-Xは-NH２、-OH、および-CO２CH２CH３からなる
群から選択され、Rはアルキル基およびアルキルエーテ
ル基からなる群から選択され、ここで、-Xが-NH ２もし
くは-CO２CH２CH３である場合には、Rは1〜20個の炭素
原子を含み、-Xが-OHである場合には、Rは4〜20個の炭
素原子を含む]との反応生成物；を含むことを特徴とす
る。
ッセイに用いるための感作粒子を提供し、該感作粒子
は、表面をもつ粒子；その表面に共有結合を介して結合
している少なくとも1つの抗体；ならびに、その表面上
の、スクシンイミドエステルと式(I)のアミン化合物： H２N-R-X (I)； [式中、-Xは-NH２、-OH、および-CO２CH２CH３からなる
群から選択され、Rはアルキル基およびアルキルエーテ
ル基からなる群から選択され、ここで、-Xが-NH ２もし
くは-CO２CH２CH３である場合には、Rは1〜20個の炭素
原子を含み、-Xが-OHである場合には、Rは4〜20個の炭
素原子を含む]との反応生成物；を含むことを特徴とす
る。
【００１３】本発明のまた別の1態様においては、イム
ノアッセイに用いるための粒子を提供し、該粒子は、表
面をもつポリマー粒子；その表面に共有結合を介して結
合している少なくとも1つの抗体；その表面上のBSA；な
らびに、その表面上の、スクシンイミドエステルとアミ
ン化合物との反応生成物；を含むことを特徴とする。前
記アミン化合物はグリシンエチルエステル；2-(アミノ
エトキシ)エタノール；2,2'-(エチレンジオキシ)ビスエ
チルアミン；および4,7,10-トリオキサ-1,3-トリデカン
ジアミンからなる群から選択されたものであり、さら
に、該粒子は、血清と接触させた場合に、0.35mg/m2未
満の非特異的タンパク質と共有結合し、また、該粒子
は、血清と接触させた場合に、2mg/m2未満の非特異的タ
ンパク質を物理的に吸着するものである。
ノアッセイに用いるための粒子を提供し、該粒子は、表
面をもつポリマー粒子；その表面に共有結合を介して結
合している少なくとも1つの抗体；その表面上のBSA；な
らびに、その表面上の、スクシンイミドエステルとアミ
ン化合物との反応生成物；を含むことを特徴とする。前
記アミン化合物はグリシンエチルエステル；2-(アミノ
エトキシ)エタノール；2,2'-(エチレンジオキシ)ビスエ
チルアミン；および4,7,10-トリオキサ-1,3-トリデカン
ジアミンからなる群から選択されたものであり、さら
に、該粒子は、血清と接触させた場合に、0.35mg/m2未
満の非特異的タンパク質と共有結合し、また、該粒子
は、血清と接触させた場合に、2mg/m2未満の非特異的タ
ンパク質を物理的に吸着するものである。
【００１４】本発明のまた別の1態様においては、試薬
が提供され、該試薬は、各粒子が表面をもつ、複数の粒
子；その表面に共有結合を介して結合している抗体；な
らびに、その表面上の、スクシンイミドエステルと式
(I)のアミン化合物： H２N-R-X (I)； [式中、-Xは-NH２、-OH、および-CO２CH２CH３からなる
群から選択され、Rはアルキル基およびアルキルエーテ
ル基からなる群から選択され、ここで、-Xが-NH ２もし
くは-CO２CH２CH３である場合には、Rは1〜20個の炭素
原子を含み、-Xが-OHである場合には、Rは4〜20個の炭
素原子を含む]との反応生成物；を含むことを特徴とす
る。
が提供され、該試薬は、各粒子が表面をもつ、複数の粒
子；その表面に共有結合を介して結合している抗体；な
らびに、その表面上の、スクシンイミドエステルと式
(I)のアミン化合物： H２N-R-X (I)； [式中、-Xは-NH２、-OH、および-CO２CH２CH３からなる
群から選択され、Rはアルキル基およびアルキルエーテ
ル基からなる群から選択され、ここで、-Xが-NH ２もし
くは-CO２CH２CH３である場合には、Rは1〜20個の炭素
原子を含み、-Xが-OHである場合には、Rは4〜20個の炭
素原子を含む]との反応生成物；を含むことを特徴とす
る。
【００１５】本発明のまた別の1態様においては、抗原
を測定するためのアッセイ法が提供され、このアッセイ
法は、抗原を含むと予想されるサンプルを上記の試薬と
組み合わせること、ただし、該試薬は該抗原に対する抗
体を含み、該抗原との検出可能な複合体を形成すること
ができるものであること；および、該サンプル中の該抗
原の尺度としてその検出可能な複合体の存在もしくは量
を測定すること；を特徴とする。
を測定するためのアッセイ法が提供され、このアッセイ
法は、抗原を含むと予想されるサンプルを上記の試薬と
組み合わせること、ただし、該試薬は該抗原に対する抗
体を含み、該抗原との検出可能な複合体を形成すること
ができるものであること；および、該サンプル中の該抗
原の尺度としてその検出可能な複合体の存在もしくは量
を測定すること；を特徴とする。
【００１６】本発明の別の1態様においては、上記の試
薬もしくは上記の粒子のいずれかを含むテストキットが
提供される。
薬もしくは上記の粒子のいずれかを含むテストキットが
提供される。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明は、粒子凝集イムノアッセ
イにおける干渉を低減させるものである。N-ヒドロキシ
スクシンイミドもしくはN-ヒドロキシスルホスクシンイ
ミドで活性化し、抗体で感作した粒子を、その表面上の
残存N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルもしく
はN-ヒドロキシスルホスクシンイミド(sNHS)エステルを
低減もしくは除去するためにある種のアミン化合物で処
理する。NHS-エステルおよびsNHS-エステルは本明細書
中ではまとめて「スクシンイミドエステル」と呼ぶ。本
発明で用いるアミン化合物は、粒子上でのサンプル成分
と反応性スクシンイミドエステルとの間の共有結合によ
る非特異的な相互作用を防止するのにきわめて有効であ
る。好ましくは、この方法で調製した粒子はサンプル成
分の物理的な吸着をも防ぐものである。本発明はまた、
これらの粒子を調製する方法およびそのイムノアッセイ
への使用にも関する。
イにおける干渉を低減させるものである。N-ヒドロキシ
スクシンイミドもしくはN-ヒドロキシスルホスクシンイ
ミドで活性化し、抗体で感作した粒子を、その表面上の
残存N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルもしく
はN-ヒドロキシスルホスクシンイミド(sNHS)エステルを
低減もしくは除去するためにある種のアミン化合物で処
理する。NHS-エステルおよびsNHS-エステルは本明細書
中ではまとめて「スクシンイミドエステル」と呼ぶ。本
発明で用いるアミン化合物は、粒子上でのサンプル成分
と反応性スクシンイミドエステルとの間の共有結合によ
る非特異的な相互作用を防止するのにきわめて有効であ
る。好ましくは、この方法で調製した粒子はサンプル成
分の物理的な吸着をも防ぐものである。本発明はまた、
これらの粒子を調製する方法およびそのイムノアッセイ
への使用にも関する。
【００１８】本発明の粒子はその表面に抗体を含んでお
り、その抗体は分析すべきサンプル中のアナライトと特
異的に相互作用し、またそのアッセイ混合液中に存在す
るアナライトのコンジュゲートとも相互作用する。この
相互作用によって粒子は凝集し、この凝集をモニターし
てサンプル中のアナライトの量と相関させることができ
る。
り、その抗体は分析すべきサンプル中のアナライトと特
異的に相互作用し、またそのアッセイ混合液中に存在す
るアナライトのコンジュゲートとも相互作用する。この
相互作用によって粒子は凝集し、この凝集をモニターし
てサンプル中のアナライトの量と相関させることができ
る。
【００１９】アナライトとは、液状媒体中のその存在も
しくはその量が測定されることとなる物質もしくは物質
群を意味し、そのような物質としては、限定するもので
はないが、薬物もしくは薬物誘導体、ホルモン、タンパ
ク質抗原、オリゴヌクレオチド、ハプテン、もしくはハ
プテン−担体複合体が含まれる。アナライト類似体と
は、アナライトと同様に挙動する、またはそのアナライ
トに対する抗体の結合親和性および/もしくは特異性に
関して所望のアッセイ結果を達成することを誘導するよ
うに挙動する物質もしくは物質群であり、そのようなも
のとしては、限定するものではないが、アナライトの誘
導体、代謝産物、およびアイソマーが含まれる。
しくはその量が測定されることとなる物質もしくは物質
群を意味し、そのような物質としては、限定するもので
はないが、薬物もしくは薬物誘導体、ホルモン、タンパ
ク質抗原、オリゴヌクレオチド、ハプテン、もしくはハ
プテン−担体複合体が含まれる。アナライト類似体と
は、アナライトと同様に挙動する、またはそのアナライ
トに対する抗体の結合親和性および/もしくは特異性に
関して所望のアッセイ結果を達成することを誘導するよ
うに挙動する物質もしくは物質群であり、そのようなも
のとしては、限定するものではないが、アナライトの誘
導体、代謝産物、およびアイソマーが含まれる。
【００２０】抗体とは、アナライトの特異的な結合相手
を指し、そのアナライトに特異的な結合親和性を有し、
他の物質を排除するような物質もしくは物質群が含まれ
る。この用語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体、および抗体フラグメントを含む。
を指し、そのアナライトに特異的な結合親和性を有し、
他の物質を排除するような物質もしくは物質群が含まれ
る。この用語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体、および抗体フラグメントを含む。
【００２１】ハプテンとは、抗体形成を刺激することは
できないが抗体と反応する、典型的には低分子量の物質
である。抗体との反応は、ハプテンを高分子量の担体と
カップリングさせ、そのカップリングされた産物をヒト
もしくは動物の体内へ注射することによって行われる。
ハプテンの例としては、ジゴキシンおよびテオフィリン
などの治療用薬物；モルヒネ、リゼルギン酸ジエチルア
ミド(LSD)、およびΔ9-テトラヒドロカンナビノール(TH
C)などの濫用される薬物；アミノグリコシドおよびバン
コマイシンなどの抗生物質；エストロゲンおよびプロゲ
ステロンなどのホルモン；ビタミンB12および葉酸など
のビタミン；チロキシン；ヒスタミン；セロトニン；ア
ドレナリン、およびその他のものが挙げられる。
できないが抗体と反応する、典型的には低分子量の物質
である。抗体との反応は、ハプテンを高分子量の担体と
カップリングさせ、そのカップリングされた産物をヒト
もしくは動物の体内へ注射することによって行われる。
ハプテンの例としては、ジゴキシンおよびテオフィリン
などの治療用薬物；モルヒネ、リゼルギン酸ジエチルア
ミド(LSD)、およびΔ9-テトラヒドロカンナビノール(TH
C)などの濫用される薬物；アミノグリコシドおよびバン
コマイシンなどの抗生物質；エストロゲンおよびプロゲ
ステロンなどのホルモン；ビタミンB12および葉酸など
のビタミン；チロキシン；ヒスタミン；セロトニン；ア
ドレナリン、およびその他のものが挙げられる。
【００２２】担体とは、ハプテンと結合しうる免疫原性
を有する物質、通常はタンパク質を意味し、それによっ
てハプテンが免疫応答を刺激することができるようにな
るものをいう。担体物質としては、タンパク質、糖タン
パク質、複合多糖、および核酸が含まれ、それらは非自
己のものとして認識され、それによって宿主から免疫応
答を引き出すものである。
を有する物質、通常はタンパク質を意味し、それによっ
てハプテンが免疫応答を刺激することができるようにな
るものをいう。担体物質としては、タンパク質、糖タン
パク質、複合多糖、および核酸が含まれ、それらは非自
己のものとして認識され、それによって宿主から免疫応
答を引き出すものである。
【００２３】免疫原および免疫原性という用語は、生体
内で免疫応答を生じさせることのできる物質を意味す
る。
内で免疫応答を生じさせることのできる物質を意味す
る。
【００２４】ペプチドは2個以上のアミノ酸をアミド(ペ
プチド)結合で結合させることによって形成された化合
物であって、通常は、直鎖内で各アミノ酸残基のαアミ
ノ基(アミノ末端を除く)が隣接する残基のαカルボキシ
ル基と連結されている、αアミノ酸のポリマーである。
ペプチド、ポリペプチド、およびポリ(アミノ酸)という
用語は、本明細書では同義語として用いられ、それは分
子の大きさに関しての制限を付けず、このクラスの化合
物を意味している。このクラスの最も大きなメンバーは
タンパク質と呼ばれる。
プチド)結合で結合させることによって形成された化合
物であって、通常は、直鎖内で各アミノ酸残基のαアミ
ノ基(アミノ末端を除く)が隣接する残基のαカルボキシ
ル基と連結されている、αアミノ酸のポリマーである。
ペプチド、ポリペプチド、およびポリ(アミノ酸)という
用語は、本明細書では同義語として用いられ、それは分
子の大きさに関しての制限を付けず、このクラスの化合
物を意味している。このクラスの最も大きなメンバーは
タンパク質と呼ばれる。
【００２５】共有結合とは、2つの化学種間の化学結合
であって、単結合および多重結合を含むことができる。
「共有」という用語は疎水性/親水性の相互作用、水素
結合、ヴァンデルワールス相互作用、およびイオン性相
互作用は含まない。
であって、単結合および多重結合を含むことができる。
「共有」という用語は疎水性/親水性の相互作用、水素
結合、ヴァンデルワールス相互作用、およびイオン性相
互作用は含まない。
【００２６】アナライトを含むと予想されるサンプルは
本発明の方法によって分析することができる。そのサン
プルは典型的には宿主由来の体液などの水性溶液であ
り、例えば、尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、糞
便、喀痰、脳脊髄液、涙液、粘液、もしくは類似のもの
であるが、好ましくは尿、血漿、もしくは血清である。
サンプルは所望により前処理することができ、アッセイ
を妨害しないような都合のよいいかなる媒体中にも調製
することができる。水性媒体が好ましい。
本発明の方法によって分析することができる。そのサン
プルは典型的には宿主由来の体液などの水性溶液であ
り、例えば、尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、糞
便、喀痰、脳脊髄液、涙液、粘液、もしくは類似のもの
であるが、好ましくは尿、血漿、もしくは血清である。
サンプルは所望により前処理することができ、アッセイ
を妨害しないような都合のよいいかなる媒体中にも調製
することができる。水性媒体が好ましい。
【００２７】較正物質とは、測定しようとするアナライ
トの既知の量を含んでいる標準物質もしくは参照物質を
意味する。アナライトを含むと予想されるサンプルおよ
び較正物質は類似の条件下でアッセイされる。次いでア
ナライトの濃度は、未知の検体で得られた結果を標準品
で得られた結果と比較することによって計算される。
トの既知の量を含んでいる標準物質もしくは参照物質を
意味する。アナライトを含むと予想されるサンプルおよ
び較正物質は類似の条件下でアッセイされる。次いでア
ナライトの濃度は、未知の検体で得られた結果を標準品
で得られた結果と比較することによって計算される。
【００２８】本発明に従って処理しうる粒子としては、
スクシンイミドエステルを用いて活性化することのでき
るいかなるタイプの粒子をも含む。そのような粒子とし
ては、ポリスチレンおよびポリ(メチルメタクリレート)
を含むポリマー粒子；金ナノ粒子および金コロイドを含
む金粒子；シリカなどのセラミック粒子、ガラス、およ
び金属酸化物粒子などが含まれる。例えば、C. R. Mart
inら、Analytical Chemistry-News & Features, May 1,
1998, 322A-327Aを参照されたい。これらの粒子はスク
シンイミドエステルによって直接的に活性化することが
でき、あるいはそれらの粒子の表面にカルボキシル基が
含まれるように改変してから活性化することができる。
カルボキシル基は、例えば加水分解反応によって、カル
ボキシル化試薬での処理によって、もしくはカルボキシ
ル基を含んでいる自己アセンブルされた単層(SAM)の形
成によって、表面に導入することができる。例えば、J.
G.Chapmanら, J. Am. Chem. Soc. 122, 8303-8304 (20
00)を参照されたい。
スクシンイミドエステルを用いて活性化することのでき
るいかなるタイプの粒子をも含む。そのような粒子とし
ては、ポリスチレンおよびポリ(メチルメタクリレート)
を含むポリマー粒子；金ナノ粒子および金コロイドを含
む金粒子；シリカなどのセラミック粒子、ガラス、およ
び金属酸化物粒子などが含まれる。例えば、C. R. Mart
inら、Analytical Chemistry-News & Features, May 1,
1998, 322A-327Aを参照されたい。これらの粒子はスク
シンイミドエステルによって直接的に活性化することが
でき、あるいはそれらの粒子の表面にカルボキシル基が
含まれるように改変してから活性化することができる。
カルボキシル基は、例えば加水分解反応によって、カル
ボキシル化試薬での処理によって、もしくはカルボキシ
ル基を含んでいる自己アセンブルされた単層(SAM)の形
成によって、表面に導入することができる。例えば、J.
G.Chapmanら, J. Am. Chem. Soc. 122, 8303-8304 (20
00)を参照されたい。
【００２９】本発明の粒子は、活性化され、感作され、
次いで式(I)のアミン化合物： H２N-R-X (I)； [式中、-Xは-NH２、-OH、もしくは-CO２CH２CH３であ
り；Rはアルキル基またはアルキルエーテル基であり；-
Xが-NH２もしくは-CO２CH２CH３である場合には、Rは1
〜20個の炭素原子を含み、-Xが-OHである場合には、Rは
4〜20個の炭素原子を含む]で処理された粒子である。
「アルキル」とは置換されている、もしくは置換されて
いない、直鎖の、分枝した、もしくは環状の炭化水素鎖
を意味する。「アルキルエーテル」とは、少なくとも1
個の-C-O-C-結合を含んでいるアルキル基を意味する。
好ましいアミン化合物とは、-Xが-OHもしくは-NH２であ
って、Rが4〜20個の炭素原子と1〜9個の酸素原子を含ん
でいるアルキルエーテル基であるものである。特に好ま
しいアミンは、2-(アミノエトキシ)エタノール(AEO)；
2,2'-(エチレンジオキシ)ビスエチルアミン(EBE)；およ
び4,7,10-トリオキサ-1,3-トリデカンジアミン(TTD)で
あり、それらは下記の式で表される： H２N-CH２CH２OCH２CH２-OH (AEO); H２N-(CH２)２O(CH２)２O(CH２)２-NH２ (EBE); H２N-(CH２)３O(CH２)２O(CH２)２O(CH２)３-NH２ (TTD)
次いで式(I)のアミン化合物： H２N-R-X (I)； [式中、-Xは-NH２、-OH、もしくは-CO２CH２CH３であ
り；Rはアルキル基またはアルキルエーテル基であり；-
Xが-NH２もしくは-CO２CH２CH３である場合には、Rは1
〜20個の炭素原子を含み、-Xが-OHである場合には、Rは
4〜20個の炭素原子を含む]で処理された粒子である。
「アルキル」とは置換されている、もしくは置換されて
いない、直鎖の、分枝した、もしくは環状の炭化水素鎖
を意味する。「アルキルエーテル」とは、少なくとも1
個の-C-O-C-結合を含んでいるアルキル基を意味する。
好ましいアミン化合物とは、-Xが-OHもしくは-NH２であ
って、Rが4〜20個の炭素原子と1〜9個の酸素原子を含ん
でいるアルキルエーテル基であるものである。特に好ま
しいアミンは、2-(アミノエトキシ)エタノール(AEO)；
2,2'-(エチレンジオキシ)ビスエチルアミン(EBE)；およ
び4,7,10-トリオキサ-1,3-トリデカンジアミン(TTD)で
あり、それらは下記の式で表される： H２N-CH２CH２OCH２CH２-OH (AEO); H２N-(CH２)２O(CH２)２O(CH２)２-NH２ (EBE); H２N-(CH２)３O(CH２)２O(CH２)２O(CH２)３-NH２ (TTD)
【００３０】本発明の処理プロセスに関係する化学反応
の説明は下記の反応スキームのとおりである。
の説明は下記の反応スキームのとおりである。
【化２】
【００３１】-Rと-X部分の性質および長さはアミン化合
物のクエンチング(quenching)試薬としての有効性に著
しい影響を及ぼす。例えば、-Xが-NH２で、Rが十分な長
さを持つものである場合には、その化合物の末端の反応
性アミン(-NH２)基はそれぞれがスクシンイミドエステ
ル基と相互作用することができる。これは「二座」性の
化合物を提供し、スクシンイミドエステルが互いに十分
近接して存在するという条件で、単一の化合物が2個の
スクシンイミドエステルと反応することができる。第1
のアミン-スクシンイミドエステル反応が近位の位置で
起こるため、第2の反応は溶液中の遊離アミンの反応よ
りも高効率で進行することができる。Rが少なくとも6個
の炭素原子を含有していることが好ましい。さらに好ま
しくは、Rが少なくとも6個の炭素原子と少なくとも2個
の酸素原子を含有していることである。しかし、Rが長
すぎる場合には、単一のアミン化合物が別々の粒子上の
スクシンイミドエステルと反応する危険性がある。この
シナリオはR部分をブリッジとして互いに連結された(架
橋された)粒子をもたらすであろう。このような粒子の
架橋は、凝集したサンプルとそうでないサンプルの区別
がより困難なものとなるので、通常は望ましくない。従
って、Rが40個以下の炭素原子を含んでいるものである
ことが好ましい。より好ましくは、Rが30個以下の炭素
原子を含むことである。さらにより好ましくは、Rが20
個以下の炭素原子を含むことである。-R-部分の性質と
長さはまた、サンプル成分が物理的に粒子表面上へ吸着
される傾向にも影響を及ぼす。アルキルエーテルをベー
スとしたR部分、とりわけ、エチレンオキシ単位(-CH２C
H２O-)を用いることは、サンプル成分の粒子表面上への
物理的吸着を阻害するものと考えられている(J. G. Cha
pmanら, J. Am. Chem. Soc., 122, 8303-8304 (200
0))。
物のクエンチング(quenching)試薬としての有効性に著
しい影響を及ぼす。例えば、-Xが-NH２で、Rが十分な長
さを持つものである場合には、その化合物の末端の反応
性アミン(-NH２)基はそれぞれがスクシンイミドエステ
ル基と相互作用することができる。これは「二座」性の
化合物を提供し、スクシンイミドエステルが互いに十分
近接して存在するという条件で、単一の化合物が2個の
スクシンイミドエステルと反応することができる。第1
のアミン-スクシンイミドエステル反応が近位の位置で
起こるため、第2の反応は溶液中の遊離アミンの反応よ
りも高効率で進行することができる。Rが少なくとも6個
の炭素原子を含有していることが好ましい。さらに好ま
しくは、Rが少なくとも6個の炭素原子と少なくとも2個
の酸素原子を含有していることである。しかし、Rが長
すぎる場合には、単一のアミン化合物が別々の粒子上の
スクシンイミドエステルと反応する危険性がある。この
シナリオはR部分をブリッジとして互いに連結された(架
橋された)粒子をもたらすであろう。このような粒子の
架橋は、凝集したサンプルとそうでないサンプルの区別
がより困難なものとなるので、通常は望ましくない。従
って、Rが40個以下の炭素原子を含んでいるものである
ことが好ましい。より好ましくは、Rが30個以下の炭素
原子を含むことである。さらにより好ましくは、Rが20
個以下の炭素原子を含むことである。-R-部分の性質と
長さはまた、サンプル成分が物理的に粒子表面上へ吸着
される傾向にも影響を及ぼす。アルキルエーテルをベー
スとしたR部分、とりわけ、エチレンオキシ単位(-CH２C
H２O-)を用いることは、サンプル成分の粒子表面上への
物理的吸着を阻害するものと考えられている(J. G. Cha
pmanら, J. Am. Chem. Soc., 122, 8303-8304 (200
0))。
【００３２】アミン化合物は、スクシンイミドエステル
との反応を最大にするために、感作粒子へ過剰量で加え
られる。好ましくは、その粒子は、活性化前にその粒子
上にもともと存在していたカルボキシル基の量に対して
少なくとも50当量のアミンを含んでいる溶液と接触させ
る。より好ましくは、その粒子は少なくとも100当量の
アミンを含んでいる溶液と接触させる。さらにより好ま
しくは、その粒子は少なくとも200当量のアミンを含ん
でいる溶液と接触させる。その粒子は接触する溶液に、
許容しうる量の反応を起こさせるのに十分な時間にわた
り、暴露する。この時間とはおそらく数分から数時間で
ある。接触する溶液のpHは7.0を超えることが好まし
い。その粒子をアミンへの暴露によって処理した後、そ
のアミン溶液を粒子表面から洗い流す。その結果、これ
らの粒子は抗体、残存スクシンイミドエステルとアミン
との反応生成物、および任意で固定化BSAを含む表面を
有するようになる。
との反応を最大にするために、感作粒子へ過剰量で加え
られる。好ましくは、その粒子は、活性化前にその粒子
上にもともと存在していたカルボキシル基の量に対して
少なくとも50当量のアミンを含んでいる溶液と接触させ
る。より好ましくは、その粒子は少なくとも100当量の
アミンを含んでいる溶液と接触させる。さらにより好ま
しくは、その粒子は少なくとも200当量のアミンを含ん
でいる溶液と接触させる。その粒子は接触する溶液に、
許容しうる量の反応を起こさせるのに十分な時間にわた
り、暴露する。この時間とはおそらく数分から数時間で
ある。接触する溶液のpHは7.0を超えることが好まし
い。その粒子をアミンへの暴露によって処理した後、そ
のアミン溶液を粒子表面から洗い流す。その結果、これ
らの粒子は抗体、残存スクシンイミドエステルとアミン
との反応生成物、および任意で固定化BSAを含む表面を
有するようになる。
【００３３】これらの粒子は、標準的なイムノアッセイ
技法を用いて、対応する抗体のアナライトについてのイ
ムノアッセイに用いることができる。これらの粒子を用
いるイムノアッセイ混合液にはまた、第3級アミン化合
物を含有させて、粒子表面上の第3級アミン基の存在に
よる干渉を低減させることもできる。適切な第3級アミ
ン化合物としてはトリエタノールアミン(TEO)が含まれ
る。
技法を用いて、対応する抗体のアナライトについてのイ
ムノアッセイに用いることができる。これらの粒子を用
いるイムノアッセイ混合液にはまた、第3級アミン化合
物を含有させて、粒子表面上の第3級アミン基の存在に
よる干渉を低減させることもできる。適切な第3級アミ
ン化合物としてはトリエタノールアミン(TEO)が含まれ
る。
【００３４】本発明の粒子はサンプル成分の非特異的共
有結合の量を低減させる。図1は活性化されアミンで処
理されているが抗体とは反応させていない粒子の特徴を
示している。特に、図1は粒子に共有結合した血清タン
パク質の量を、活性化後に添加されたアミン化合物AEO
の当量数の関数として示したグラフである。抗体が存在
しないため、結合したもしくは吸着したタンパク質は全
て非特異的タンパク質である。アミン処理がなければ(A
EOの0当量)、血清混合物のタンパク質は活性化された粒
子と共有結合し、この場合には表面が1.5mg/m２被覆さ
れることとなる。もともと存在していたカルボキシル基
の量に対して200当量のAEOで処理すると、共有結合する
タンパク質の量を約85%低減させる。
有結合の量を低減させる。図1は活性化されアミンで処
理されているが抗体とは反応させていない粒子の特徴を
示している。特に、図1は粒子に共有結合した血清タン
パク質の量を、活性化後に添加されたアミン化合物AEO
の当量数の関数として示したグラフである。抗体が存在
しないため、結合したもしくは吸着したタンパク質は全
て非特異的タンパク質である。アミン処理がなければ(A
EOの0当量)、血清混合物のタンパク質は活性化された粒
子と共有結合し、この場合には表面が1.5mg/m２被覆さ
れることとなる。もともと存在していたカルボキシル基
の量に対して200当量のAEOで処理すると、共有結合する
タンパク質の量を約85%低減させる。
【００３５】粒子に共有結合している非特異的タンパク
質の量は次の試験法によって測定する。0.5%(w/v)の粒
子、5%(v/v)正常ヒト血清、および50mM 3-モルホリノ-
プロパンスルホン酸バッファー(MOPS), pH7.0を含む750
μLのサンプルを37℃で2時間インキュベートし、遠心(1
5,000 x g, 30分間)する。そのサンプルは粒子に結合し
た抗体と複合体を形成することとなるような抗原を含ん
でいない可能性もある。その粒子を1mLの50mM MOPSバッ
ファー, pH7.0に再懸濁し、再度遠心して過剰の未結合
血清を除去する。この再懸濁と遠心をさらに3回繰り返
す。この結果得られた粒子を手動ピペッティングによっ
て、6%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、10%(v/v)グ
リセロール、および60mM Tris, pH6.2を含有する溶液の
100μL中に再懸濁し、80℃で2時間インキュベートして
粒子表面から共有結合していない分子種を脱着させる。
粒子を遠心して集め(15,000 x g, 1.5時間)、再懸濁
し、1mLの50mM MOPSバッファー, pH7.0を用いて3回洗
う。最後に粒子を100μLの50mM MOPSバッファー, pH7.0
中に再懸濁し、次いでタンパク質含量の分析にかける。
タンパク質含量分析法は、ビシンコニン酸(BCA)アッセ
イ(PIERCE CHEMICAL COMPANY, Rockford, 米国イリノイ
州)を用いて製造者の使用説明書に従って行った。BCAア
ッセイサンプルを0.1μmのWHATMANフィルター(FISHER S
CIENTIC)でろ過した後、562nmでの分析を行った。タン
パク質含量は粒子に共有結合しているタンパク質の量に
対応している。次いで、この結果を、用いたポリマー粒
子の表面全体の面積に対する結合タンパク質の量として
表す。
質の量は次の試験法によって測定する。0.5%(w/v)の粒
子、5%(v/v)正常ヒト血清、および50mM 3-モルホリノ-
プロパンスルホン酸バッファー(MOPS), pH7.0を含む750
μLのサンプルを37℃で2時間インキュベートし、遠心(1
5,000 x g, 30分間)する。そのサンプルは粒子に結合し
た抗体と複合体を形成することとなるような抗原を含ん
でいない可能性もある。その粒子を1mLの50mM MOPSバッ
ファー, pH7.0に再懸濁し、再度遠心して過剰の未結合
血清を除去する。この再懸濁と遠心をさらに3回繰り返
す。この結果得られた粒子を手動ピペッティングによっ
て、6%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、10%(v/v)グ
リセロール、および60mM Tris, pH6.2を含有する溶液の
100μL中に再懸濁し、80℃で2時間インキュベートして
粒子表面から共有結合していない分子種を脱着させる。
粒子を遠心して集め(15,000 x g, 1.5時間)、再懸濁
し、1mLの50mM MOPSバッファー, pH7.0を用いて3回洗
う。最後に粒子を100μLの50mM MOPSバッファー, pH7.0
中に再懸濁し、次いでタンパク質含量の分析にかける。
タンパク質含量分析法は、ビシンコニン酸(BCA)アッセ
イ(PIERCE CHEMICAL COMPANY, Rockford, 米国イリノイ
州)を用いて製造者の使用説明書に従って行った。BCAア
ッセイサンプルを0.1μmのWHATMANフィルター(FISHER S
CIENTIC)でろ過した後、562nmでの分析を行った。タン
パク質含量は粒子に共有結合しているタンパク質の量に
対応している。次いで、この結果を、用いたポリマー粒
子の表面全体の面積に対する結合タンパク質の量として
表す。
【００３６】好ましくは、上述の試験において、その粒
子は粒子の表面積の1平方メートルあたり0.35mg未満の
非特異的タンパク質と共有結合する。より好ましくは、
その粒子は0.30 mg/m２の非特異的タンパク質と共有結
合する。さらにより好ましくは、その粒子は0.20 mg/m
２未満の非特異的タンパク質と共有結合する。さらにい
っそう好ましくは、その粒子は0.10 mg/m２未満の非特
異的タンパク質と共有結合する。さらによりいっそう好
ましくは、その粒子は0.05 mg/m２未満の非特異的タン
パク質と共有結合する。
子は粒子の表面積の1平方メートルあたり0.35mg未満の
非特異的タンパク質と共有結合する。より好ましくは、
その粒子は0.30 mg/m２の非特異的タンパク質と共有結
合する。さらにより好ましくは、その粒子は0.20 mg/m
２未満の非特異的タンパク質と共有結合する。さらにい
っそう好ましくは、その粒子は0.10 mg/m２未満の非特
異的タンパク質と共有結合する。さらによりいっそう好
ましくは、その粒子は0.05 mg/m２未満の非特異的タン
パク質と共有結合する。
【００３７】本発明の粒子はまた、サンプル成分の粒子
表面への物理的吸着に対する抵抗性をも提供する。粒子
上へ物理的に吸着する非特異的タンパク質の量は次の試
験法で測定することができる。0.5%(w/v)の粒子、5%(v/
v)正常ヒト血清、および50mMMOPSバッファー, pH7.0を
含む750μLのサンプルを37℃で2時間インキュベート
し、遠心(15,000 x g, 30分間)する。そのサンプルは粒
子に結合した抗体と複合体を形成することとなるような
抗原を含んでいない可能性もある。その粒子を1mLの50m
M MOPSバッファー, pH7.0に再懸濁し、再度遠心して過
剰の未結合血清を除去する。この再懸濁と遠心をさらに
3回繰り返す。この結果得られた粒子を手動ピペッティ
ングによって、6%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、
10%(v/v)グリセロール、および60mM Tris, pH6.2を含有
する溶液の100μL中に再懸濁し、80℃で2時間インキュ
ベートして粒子表面から共有結合していない分子種を脱
着させる。粒子を遠心して集め(15,000 x g, 1.5時
間)、上清をBCAアッセイによるタンパク質含量の分析に
かける。タンパク質含量は粒子上に物理的に吸着された
タンパク質の量に対応している。次いで、この結果を、
用いたポリマー粒子の表面全体の面積に対する吸着され
たタンパク質の量として表す。
表面への物理的吸着に対する抵抗性をも提供する。粒子
上へ物理的に吸着する非特異的タンパク質の量は次の試
験法で測定することができる。0.5%(w/v)の粒子、5%(v/
v)正常ヒト血清、および50mMMOPSバッファー, pH7.0を
含む750μLのサンプルを37℃で2時間インキュベート
し、遠心(15,000 x g, 30分間)する。そのサンプルは粒
子に結合した抗体と複合体を形成することとなるような
抗原を含んでいない可能性もある。その粒子を1mLの50m
M MOPSバッファー, pH7.0に再懸濁し、再度遠心して過
剰の未結合血清を除去する。この再懸濁と遠心をさらに
3回繰り返す。この結果得られた粒子を手動ピペッティ
ングによって、6%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、
10%(v/v)グリセロール、および60mM Tris, pH6.2を含有
する溶液の100μL中に再懸濁し、80℃で2時間インキュ
ベートして粒子表面から共有結合していない分子種を脱
着させる。粒子を遠心して集め(15,000 x g, 1.5時
間)、上清をBCAアッセイによるタンパク質含量の分析に
かける。タンパク質含量は粒子上に物理的に吸着された
タンパク質の量に対応している。次いで、この結果を、
用いたポリマー粒子の表面全体の面積に対する吸着され
たタンパク質の量として表す。
【００３８】好ましくは、上述の試験において、その粒
子は粒子の表面積の1平方メートルあたり3.0mg(mg/m２)
未満の非特異的タンパク質を物理的に吸着する。より好
ましくは、その粒子が2.0 mg/m２未満の非特異的タンパ
ク質を物理的に吸着する。さらにより好ましくは、その
粒子が1.0 mg/m２未満の非特異的タンパク質を物理的に
吸着する。
子は粒子の表面積の1平方メートルあたり3.0mg(mg/m２)
未満の非特異的タンパク質を物理的に吸着する。より好
ましくは、その粒子が2.0 mg/m２未満の非特異的タンパ
ク質を物理的に吸着する。さらにより好ましくは、その
粒子が1.0 mg/m２未満の非特異的タンパク質を物理的に
吸着する。
【００３９】表1は粒子表面上に物理的に吸着した(非共
有結合で)血清タンパク質の量を、その粒子をクエンチ
（quench）するために用いたAEOの当量数の関数として
示したものである。これらの粒子は抗体で感作されてい
ないが、図に示したようにAEOを用いて活性化および/も
しくは処理されたものである。各々の場合において、受
動的に吸着した血清タンパク質の量は、EDC活性化を行
わなかった粒子を用いた場合(314μg)よりも少なく、活
性化はされているがAEOでの処理は行わなかった粒子で
の量（57μg）に比肩するものであった。このように、
粒子表面上の残存スクシンイミドエステルが本発明のア
ミンと反応してイムノアッセイの際のその粒子と血清タ
ンパク質との共有結合の形成を低減させるのみならず、
粒子とアミンとの反応は血清タンパク質の物理的吸着に
対して抵抗性の表面をもたらすものである。これらの効
果の双方によってイムノアッセイの性能を向上させるこ
とができる。
有結合で)血清タンパク質の量を、その粒子をクエンチ
（quench）するために用いたAEOの当量数の関数として
示したものである。これらの粒子は抗体で感作されてい
ないが、図に示したようにAEOを用いて活性化および/も
しくは処理されたものである。各々の場合において、受
動的に吸着した血清タンパク質の量は、EDC活性化を行
わなかった粒子を用いた場合(314μg)よりも少なく、活
性化はされているがAEOでの処理は行わなかった粒子で
の量（57μg）に比肩するものであった。このように、
粒子表面上の残存スクシンイミドエステルが本発明のア
ミンと反応してイムノアッセイの際のその粒子と血清タ
ンパク質との共有結合の形成を低減させるのみならず、
粒子とアミンとの反応は血清タンパク質の物理的吸着に
対して抵抗性の表面をもたらすものである。これらの効
果の双方によってイムノアッセイの性能を向上させるこ
とができる。
【００４０】
【表１】
【００４１】本発明の粒子は、従来の粒子と比べて、イ
ムノアッセイ条件における干渉の低減を示すが、対象の
抗原と特異的に相互作用する能力は保持している。事
実、これらの粒子の、イムノアッセイに用いる試薬の構
成成分としての性能は、干渉がないことによって改善さ
れている。図2と3は共に、本発明の粒子のイムノアッセ
イにおける性能の改善を示している。図2は、ゲンタマ
イシンについてのイムノアッセイの測定を蛍光偏光(FP)
で行ったものと、ゲンタマイシンのイムノアッセイの測
定を未処理の粒子を用いた粒子凝集によって行ったもの
との相関性を示すグラフである。図3は同じゲンタマイ
シンについてのFP測定値と、本発明に従って処理した粒
子を用いた粒子凝集イムノアッセイでのゲンタマイシン
測定値の相関性を示すグラフである。データポイントを
相関させるような最良適合直線は理想的には勾配が1、y
軸切片が0、相関係数(R)が1の直線になるはずである。3
回測定の全てにおいて処理した粒子の性能は未処理の粒
子の性能より優れている。処理した粒子は最良適合直線
の勾配が1.07であったのに対し、未処理の粒子では最良
適合直線の勾配は1.11であった。処理した粒子では切片
が0.009であるのに対し、未処理の粒子では切片は−0.0
10である。処理した粒子はR値が0.987であるのに対し、
未処理の粒子ではR値は0.974である。定性的には、この
処理した粒子の相関図は、未処理粒子の相関図よりも
「散乱」の程度が低いことが、再現性を持って示されて
いる。
ムノアッセイ条件における干渉の低減を示すが、対象の
抗原と特異的に相互作用する能力は保持している。事
実、これらの粒子の、イムノアッセイに用いる試薬の構
成成分としての性能は、干渉がないことによって改善さ
れている。図2と3は共に、本発明の粒子のイムノアッセ
イにおける性能の改善を示している。図2は、ゲンタマ
イシンについてのイムノアッセイの測定を蛍光偏光(FP)
で行ったものと、ゲンタマイシンのイムノアッセイの測
定を未処理の粒子を用いた粒子凝集によって行ったもの
との相関性を示すグラフである。図3は同じゲンタマイ
シンについてのFP測定値と、本発明に従って処理した粒
子を用いた粒子凝集イムノアッセイでのゲンタマイシン
測定値の相関性を示すグラフである。データポイントを
相関させるような最良適合直線は理想的には勾配が1、y
軸切片が0、相関係数(R)が1の直線になるはずである。3
回測定の全てにおいて処理した粒子の性能は未処理の粒
子の性能より優れている。処理した粒子は最良適合直線
の勾配が1.07であったのに対し、未処理の粒子では最良
適合直線の勾配は1.11であった。処理した粒子では切片
が0.009であるのに対し、未処理の粒子では切片は−0.0
10である。処理した粒子はR値が0.987であるのに対し、
未処理の粒子ではR値は0.974である。定性的には、この
処理した粒子の相関図は、未処理粒子の相関図よりも
「散乱」の程度が低いことが、再現性を持って示されて
いる。
【００４２】陰性サンプルのイムノアッセイを行う場
合、それはアナライトを含まない血清のアッセイである
が、本発明の粒子はそのような場合でも性能の改善を示
す。非特異的なサンプル中の成分、特にリウマチ因子お
よびコレステロールなどの物質は、従来の粒子には結合
することができ、それによってアナライトと粒子との特
異的反応によって生ずるものと類似の凝集反応が生じて
しまう。従って、あるサンプルがアナライトを含んでい
るものとして不適切に同定されてしまう可能性がある。
陰性のサンプル、それにリウマチ因子もしくはコレステ
ロールが多量含まれているものでは、本発明に従ってア
ミン化合物で処理された粒子は、アミン処理ステップに
かけなかった粒子と比較すると、アナライト濃度の平均
値と標準偏差の低下が見られる。すなわち、処理された
粒子は真の測定値であるゼロに近い値を提供し、測定値
はより一貫したものとなる。粒子の調製の際に処理ステ
ップを含めても、得られる較正曲線の質にはわずかな影
響しか与えない。
合、それはアナライトを含まない血清のアッセイである
が、本発明の粒子はそのような場合でも性能の改善を示
す。非特異的なサンプル中の成分、特にリウマチ因子お
よびコレステロールなどの物質は、従来の粒子には結合
することができ、それによってアナライトと粒子との特
異的反応によって生ずるものと類似の凝集反応が生じて
しまう。従って、あるサンプルがアナライトを含んでい
るものとして不適切に同定されてしまう可能性がある。
陰性のサンプル、それにリウマチ因子もしくはコレステ
ロールが多量含まれているものでは、本発明に従ってア
ミン化合物で処理された粒子は、アミン処理ステップに
かけなかった粒子と比較すると、アナライト濃度の平均
値と標準偏差の低下が見られる。すなわち、処理された
粒子は真の測定値であるゼロに近い値を提供し、測定値
はより一貫したものとなる。粒子の調製の際に処理ステ
ップを含めても、得られる較正曲線の質にはわずかな影
響しか与えない。
【００４３】これらの結果は、粒子をベースとしたイム
ノアッセイの性能の向上は粒子を本発明に従ってアミン
化合物で処理することによって得られることを示してい
る。このステップの間に粒子表面上のスクシンイミドエ
ステル、それはカルボジイミドが媒介する活性化反応で
形成され、抗体およびBSAでの感作の際には開裂されな
いものであるが、そのエステルは第１級アミン化合物と
反応する。このような様式での反応が行われなければ、
スクシンイミドエステルはその反応の代わりにイムノア
ッセイの際に血清成分と反応してしまう。このことが、
粒子凝集プロセスの速度および/もしくは温度による挙
動を、標的のアナライトを含有する血清サンプルの場
合、および含有していない血清サンプルの場合の双方に
おいて、妨害し、どちらの場合も誤ったアッセイ結果を
もたらすこととなる。
ノアッセイの性能の向上は粒子を本発明に従ってアミン
化合物で処理することによって得られることを示してい
る。このステップの間に粒子表面上のスクシンイミドエ
ステル、それはカルボジイミドが媒介する活性化反応で
形成され、抗体およびBSAでの感作の際には開裂されな
いものであるが、そのエステルは第１級アミン化合物と
反応する。このような様式での反応が行われなければ、
スクシンイミドエステルはその反応の代わりにイムノア
ッセイの際に血清成分と反応してしまう。このことが、
粒子凝集プロセスの速度および/もしくは温度による挙
動を、標的のアナライトを含有する血清サンプルの場
合、および含有していない血清サンプルの場合の双方に
おいて、妨害し、どちらの場合も誤ったアッセイ結果を
もたらすこととなる。
【００４４】本発明のアミン化合物を用いる粒子の処理
は、単独でもしくはイムノアッセイにおける干渉を低減
するための他の技法と組み合わせて用いることができ
る。粒子の凝集によるイムノアッセイの性能を最適なも
のとするには、本発明に従って第１級アミン化合物で処
理された感作粒子を用いることが好ましく、アッセイ混
合液中に第３級アミン化合物を含ませることも好まし
い。いくつかの場合においては、TEOなどの第３級アミ
ン化合物をイムノアッセイ混合液中に使用することで、
イムノアッセイの際の干渉を所望のレベルまで低減させ
るために十分なものとすることができる。第１級アミン
を粒子の処理に用いること、もしくは第３級アミン化合
物を添加することのいずれかを、単独でもしくは組み合
わせて使用することは、経験的に決めることができ、一
方の技法が他方よりも良いかどうか、もしくは組み合わ
せることによって最良の結果が得られるか否かを決める
ことができる。
は、単独でもしくはイムノアッセイにおける干渉を低減
するための他の技法と組み合わせて用いることができ
る。粒子の凝集によるイムノアッセイの性能を最適なも
のとするには、本発明に従って第１級アミン化合物で処
理された感作粒子を用いることが好ましく、アッセイ混
合液中に第３級アミン化合物を含ませることも好まし
い。いくつかの場合においては、TEOなどの第３級アミ
ン化合物をイムノアッセイ混合液中に使用することで、
イムノアッセイの際の干渉を所望のレベルまで低減させ
るために十分なものとすることができる。第１級アミン
を粒子の処理に用いること、もしくは第３級アミン化合
物を添加することのいずれかを、単独でもしくは組み合
わせて使用することは、経験的に決めることができ、一
方の技法が他方よりも良いかどうか、もしくは組み合わ
せることによって最良の結果が得られるか否かを決める
ことができる。
【００４５】本発明によるアッセイにおいては種々の補
助的な物質もよく用いることができる。例えば、バッフ
ァーは通常はアッセイ用液中に存在しており、アッセイ
用液およびアッセイの構成成分を安定化するための安定
剤も存在している。これらの添加剤に加えてアルブミン
などの他のタンパク質も含むことができ、または界面活
性剤、特に非イオン性界面活性剤および類似のものも含
むことができる。
助的な物質もよく用いることができる。例えば、バッフ
ァーは通常はアッセイ用液中に存在しており、アッセイ
用液およびアッセイの構成成分を安定化するための安定
剤も存在している。これらの添加剤に加えてアルブミン
などの他のタンパク質も含むことができ、または界面活
性剤、特に非イオン性界面活性剤および類似のものも含
むことができる。
【００４６】該粒子は、他の試薬と共に、アナライトの
測定のためのアッセイ法を都合よく行うのに有用なキッ
トとしてパッケージすることができる。本発明の多能性
を増強するために、試薬類の比率がその方法およびアッ
セイに実質的に最適なものを提供することとなるよう
に、試薬をパッケージ化した組み合わせで、同一容器も
しくは別の容器中に、液状もしくは凍結乾燥品の形態で
提供することができる。各試薬はそれぞれ別々の容器に
入れることができ、もしくは種々の試薬は1個以上の容
器に、それらの試薬の交差反応性および安定性の如何に
よって組み合わせることができる。
測定のためのアッセイ法を都合よく行うのに有用なキッ
トとしてパッケージすることができる。本発明の多能性
を増強するために、試薬類の比率がその方法およびアッ
セイに実質的に最適なものを提供することとなるよう
に、試薬をパッケージ化した組み合わせで、同一容器も
しくは別の容器中に、液状もしくは凍結乾燥品の形態で
提供することができる。各試薬はそれぞれ別々の容器に
入れることができ、もしくは種々の試薬は1個以上の容
器に、それらの試薬の交差反応性および安定性の如何に
よって組み合わせることができる。
【００４７】例えば、試薬テストキットには、パッケー
ジ化された組み合わせで、ある特定のアナライトに対し
て特異的な抗体、それと同じ抗体もしくはそれの類似体
もしくは誘導体を含む本発明の粒子を含有することがで
き、また任意で既知の量のアナライトを含んでなる1種
以上の較正物質を含むものとすることができる。そのよ
うなテストキットは、そのアナライトおよび構造的に関
連のある化合物について臨床的な感度が増強されたアッ
セイのための試薬を提供することができる。
ジ化された組み合わせで、ある特定のアナライトに対し
て特異的な抗体、それと同じ抗体もしくはそれの類似体
もしくは誘導体を含む本発明の粒子を含有することがで
き、また任意で既知の量のアナライトを含んでなる1種
以上の較正物質を含むものとすることができる。そのよ
うなテストキットは、そのアナライトおよび構造的に関
連のある化合物について臨床的な感度が増強されたアッ
セイのための試薬を提供することができる。
【００４８】
【実施例】下記の実施例は説明のために示したものであ
って本発明の範囲を限定するものと見なされるべきでは
ない。
って本発明の範囲を限定するものと見なされるべきでは
ない。
【００４９】平均粒径が201ナノメーター(nm)、表面積
が1グラムあたり28.4平方メートル(m ２/g)でラテックス
1gあたり表面のカルボキシル基が0.21ミリ当量(meq)で
あるようなラテックス粒子はSERADYN(米国インディアナ
ポリス)から入手し、それについてはさらに特徴を調べ
ることなく用いた。微粒子凝集イムノアッセイはHITACH
I 717アナライザー(ROCHE DIAGNOSTICS CORPORATION,
米国インディアナポリス)で実施し、その性能は、ROCHE
蛍光偏光(FP)イムノアッセイと、それと並行して行っ
たINTEGRA 700アナライザー(ROCHE DIAGNOSTICS SYSTEM
S)の結果を参照して評価した。ROCHE FP較正物質を微粒
子をベースとしたアッセイの較正曲線を作成するために
用いた。溶液およびラテックス粒子のタンパク質含量は
ビシンコニン酸(BCA)アッセイ(PIERCE CHEMICAL COMPAN
Y, Rockford, 米国イリノイ州)を用いて製造者の使用説
明書に従って測定した。ラテックスを含むBCAアッセイ
サンプルを、0.1μM WHATMAN フィルター(FISHER SCIEN
TIFIC)を通過させてろ過した後、562nmでの分析にかけ
た。ラテックスペレットの再懸濁はULTRASONIC HOMOGEN
IZER-4710 SERIESソニケーター(COLE-PARMER, Vernon H
ills, 米国イリノイ州)を25〜50%の出力で用いて、サン
プルを氷上に保持しつつ行い、ラテックスの単分散性は
COBAS MIRA アナライザー(ROCHE DIAGNOSTICS SYSTEMS)
で多数の波長での光散乱によって調べた。
が1グラムあたり28.4平方メートル(m ２/g)でラテックス
1gあたり表面のカルボキシル基が0.21ミリ当量(meq)で
あるようなラテックス粒子はSERADYN(米国インディアナ
ポリス)から入手し、それについてはさらに特徴を調べ
ることなく用いた。微粒子凝集イムノアッセイはHITACH
I 717アナライザー(ROCHE DIAGNOSTICS CORPORATION,
米国インディアナポリス)で実施し、その性能は、ROCHE
蛍光偏光(FP)イムノアッセイと、それと並行して行っ
たINTEGRA 700アナライザー(ROCHE DIAGNOSTICS SYSTEM
S)の結果を参照して評価した。ROCHE FP較正物質を微粒
子をベースとしたアッセイの較正曲線を作成するために
用いた。溶液およびラテックス粒子のタンパク質含量は
ビシンコニン酸(BCA)アッセイ(PIERCE CHEMICAL COMPAN
Y, Rockford, 米国イリノイ州)を用いて製造者の使用説
明書に従って測定した。ラテックスを含むBCAアッセイ
サンプルを、0.1μM WHATMAN フィルター(FISHER SCIEN
TIFIC)を通過させてろ過した後、562nmでの分析にかけ
た。ラテックスペレットの再懸濁はULTRASONIC HOMOGEN
IZER-4710 SERIESソニケーター(COLE-PARMER, Vernon H
ills, 米国イリノイ州)を25〜50%の出力で用いて、サン
プルを氷上に保持しつつ行い、ラテックスの単分散性は
COBAS MIRA アナライザー(ROCHE DIAGNOSTICS SYSTEMS)
で多数の波長での光散乱によって調べた。
【００５０】溶媒とバッファーはFISHER SCIENTIFIC(Su
wanee, 米国ジョージア州)から入手した。その他の試薬
は全てALDRICH(Milwaukee, 米国ウイスコンシン州)もし
くはFLUKAから入手し、そのまま用いた。
wanee, 米国ジョージア州)から入手した。その他の試薬
は全てALDRICH(Milwaukee, 米国ウイスコンシン州)もし
くはFLUKAから入手し、そのまま用いた。
【００５１】実施例1−アミンを用いた処理の、活性化
したラテックスへの血清成分の共有結合および物理的吸
着に及ぼす影響 21mMのN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を含有する、p
H5.0の10mM 2-モルホリノエタンスルホン酸バッファー
(MES)中の1%(w/v)のラテックス懸濁液へ、1-エチル-3-
(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)の新
鮮な水溶液をその濃度が21mMとなるまで添加した。室温
で2時間インキュベートした後、その懸濁液を遠心し(1
5,000 x g, 30分間)、ラテックスを50mMの3-モルホリノ
プロパンスルホン酸バッファー(MOPS), pH8.0中に再懸
濁した。この懸濁液のアリコートに2-(アミノエトキシ)
エタノール(AEO)(50mMのMOPSバッファーpH8.0中)を添加
してその濃度を0 M、0.002 M、0.011 M、0.021 M、0.10
5 M、0.210 M、および0.420Mとした。これらの懸濁液の
各々の最終液量は1%(w/v)のラテックスを含み1.1mLであ
った。室温で2時間インキュベートした後、ラテックス
を遠心し(15,000 x g, 30分間)、50mMのMOPSバッファ
ー, pH7.0中に再懸濁し、再度遠心した。このプロセス
をさらに3回繰り返した。最終的に得られたラテックス
ペレットを50mMのMOPSバッファー, pH7.0中に再懸濁
し、1%(w/v)懸濁液として4℃で48時間保存した。
したラテックスへの血清成分の共有結合および物理的吸
着に及ぼす影響 21mMのN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を含有する、p
H5.0の10mM 2-モルホリノエタンスルホン酸バッファー
(MES)中の1%(w/v)のラテックス懸濁液へ、1-エチル-3-
(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)の新
鮮な水溶液をその濃度が21mMとなるまで添加した。室温
で2時間インキュベートした後、その懸濁液を遠心し(1
5,000 x g, 30分間)、ラテックスを50mMの3-モルホリノ
プロパンスルホン酸バッファー(MOPS), pH8.0中に再懸
濁した。この懸濁液のアリコートに2-(アミノエトキシ)
エタノール(AEO)(50mMのMOPSバッファーpH8.0中)を添加
してその濃度を0 M、0.002 M、0.011 M、0.021 M、0.10
5 M、0.210 M、および0.420Mとした。これらの懸濁液の
各々の最終液量は1%(w/v)のラテックスを含み1.1mLであ
った。室温で2時間インキュベートした後、ラテックス
を遠心し(15,000 x g, 30分間)、50mMのMOPSバッファ
ー, pH7.0中に再懸濁し、再度遠心した。このプロセス
をさらに3回繰り返した。最終的に得られたラテックス
ペレットを50mMのMOPSバッファー, pH7.0中に再懸濁
し、1%(w/v)懸濁液として4℃で48時間保存した。
【００５２】血清のラテックス粒子との相互作用を下記
のとおり調べた。上述の方法で調製した0.5%(w/v)ラテ
ックス粒子、5%(v/v)正常ヒト血清(SIGMA)、および50mM
MOPSバッファー, pH7.0を含むサンプル(750μL)を37℃
で2時間インキュベートし、遠心した(15,000 x g, 30分
間)。別に、血清を含まない、もしくは活性化していな
いラテックス粒子を用いた対照についてもインキュベー
ションを行った。
のとおり調べた。上述の方法で調製した0.5%(w/v)ラテ
ックス粒子、5%(v/v)正常ヒト血清(SIGMA)、および50mM
MOPSバッファー, pH7.0を含むサンプル(750μL)を37℃
で2時間インキュベートし、遠心した(15,000 x g, 30分
間)。別に、血清を含まない、もしくは活性化していな
いラテックス粒子を用いた対照についてもインキュベー
ションを行った。
【００５３】ペレットを1mLの50mM MOPSバッファー, pH
7.0中に再懸濁し、再度遠心して過剰で結合していない
血清を除去した。このプロセスをさらに3回繰り返し
た。この結果得られたラテックスペレットを手動ピペッ
ティングによって、6%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SD
S)、10%(v/v)グリセロール、および60mM Tris, pH6.2を
含有する溶液100μL中に再懸濁し、80℃で2時間インキ
ュベートしてラテックス表面から共有結合していない分
子種を脱着させた。粒子を遠心して集め(15,000 x g,
1.5時間)、上清をBCAアッセイによるタンパク質含量の
分析にかけた。タンパク質含量は粒子上に物理的に吸着
されたタンパク質の量に対応しており、これらの結果は
表1に示す。
7.0中に再懸濁し、再度遠心して過剰で結合していない
血清を除去した。このプロセスをさらに3回繰り返し
た。この結果得られたラテックスペレットを手動ピペッ
ティングによって、6%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SD
S)、10%(v/v)グリセロール、および60mM Tris, pH6.2を
含有する溶液100μL中に再懸濁し、80℃で2時間インキ
ュベートしてラテックス表面から共有結合していない分
子種を脱着させた。粒子を遠心して集め(15,000 x g,
1.5時間)、上清をBCAアッセイによるタンパク質含量の
分析にかけた。タンパク質含量は粒子上に物理的に吸着
されたタンパク質の量に対応しており、これらの結果は
表1に示す。
【００５４】粒子を再懸濁し、1mL容量の50mM MOPSバッ
ファー, pH7.0を用いて3回洗った。最後にその粒子を10
0μLの50mM MOPSバッファー, pH7.0中に再懸濁し、次い
でこれもタンパク質含量のBCA分析にかけた。タンパク
質含量は粒子に共有結合しているタンパク質の量に対応
しており、これらの結果は図1に示す。
ファー, pH7.0を用いて3回洗った。最後にその粒子を10
0μLの50mM MOPSバッファー, pH7.0中に再懸濁し、次い
でこれもタンパク質含量のBCA分析にかけた。タンパク
質含量は粒子に共有結合しているタンパク質の量に対応
しており、これらの結果は図1に示す。
【００５５】実施例2−イムノアッセイの性能に及ぼす
アミン処理の効果 10mM MESバッファー, pH5.0中の1%(w/v)ラテックス懸濁
液30mLに、0.22M NHSの新たに調製した水溶液を2.86mL
添加し、次いで0.26M EDCの新たに調製した水溶液を2.4
2mL添加した。活性化反応は室温で2時間行い、その後ラ
テックスを遠心して(15,000 x g, 45分間)集めた。その
ペレットを15mLの50mM MOPSバッファー, pH6.4中に再懸
濁した。この懸濁液に、50mg/mLのBSAおよび0.30mg/mL
のゲンタマイシンモノクローナル抗体M-12A9-IgGを含有
する50mM MOPSバッファー, pH6.4を15mL添加した。この
懸濁液を室温で2時間インキュベートして感作を行っ
た。過剰のIgGとBSAは遠心(15,000 x g, 30分間)して除
去し、そのペレットを15mLの50mM MOPSバッファー, pH
8.0中に再懸濁した。この懸濁液に0.84M AEOを含有する
50mM MOPSバッファー, pH8.0を15mL添加し、感作後のラ
テックス表面に残存するNHSエステルを全てクエンチさ
せるために室温で一晩インキュベートした。遠心と50mM
MOPSバッファー, pH8.0中への再懸濁(30mLを3回)を繰
り返すことによって、過剰のAEOを除去し、この結果得
られたラテックスを、0.1%(v/v) BSAおよび0.1%(w/v) N
aN３を含有する50mM MOPSバッファー, pH7.5中に2%(w/
v)の懸濁液として保存した。対照のラテックスのバッチ
はAEOのクエンチステップを行わなかったことを除いて
は全く同一の方法で並行して調製した。クエンチしたも
のおよび対照の粒子の性能は一連の臨床血清サンプルに
対するイムノアッセイによって評価した。
アミン処理の効果 10mM MESバッファー, pH5.0中の1%(w/v)ラテックス懸濁
液30mLに、0.22M NHSの新たに調製した水溶液を2.86mL
添加し、次いで0.26M EDCの新たに調製した水溶液を2.4
2mL添加した。活性化反応は室温で2時間行い、その後ラ
テックスを遠心して(15,000 x g, 45分間)集めた。その
ペレットを15mLの50mM MOPSバッファー, pH6.4中に再懸
濁した。この懸濁液に、50mg/mLのBSAおよび0.30mg/mL
のゲンタマイシンモノクローナル抗体M-12A9-IgGを含有
する50mM MOPSバッファー, pH6.4を15mL添加した。この
懸濁液を室温で2時間インキュベートして感作を行っ
た。過剰のIgGとBSAは遠心(15,000 x g, 30分間)して除
去し、そのペレットを15mLの50mM MOPSバッファー, pH
8.0中に再懸濁した。この懸濁液に0.84M AEOを含有する
50mM MOPSバッファー, pH8.0を15mL添加し、感作後のラ
テックス表面に残存するNHSエステルを全てクエンチさ
せるために室温で一晩インキュベートした。遠心と50mM
MOPSバッファー, pH8.0中への再懸濁(30mLを3回)を繰
り返すことによって、過剰のAEOを除去し、この結果得
られたラテックスを、0.1%(v/v) BSAおよび0.1%(w/v) N
aN３を含有する50mM MOPSバッファー, pH7.5中に2%(w/
v)の懸濁液として保存した。対照のラテックスのバッチ
はAEOのクエンチステップを行わなかったことを除いて
は全く同一の方法で並行して調製した。クエンチしたも
のおよび対照の粒子の性能は一連の臨床血清サンプルに
対するイムノアッセイによって評価した。
【００５６】各サンプルのゲンタマイシン含量は、ラテ
ックスをベースとしたアッセイと同じゲンタマイシンモ
ノクローナル抗体を用いてROCHE FP ゲンタマイシンイ
ムノアッセイで測定した。FP 参照イムノアッセイおよ
びラテックス凝集イムノアッセイはサンプルの分解を避
けるために並行して行った。ROCHE FPシステムで測定し
たゲンタマイシン濃度の、粒子をベースとした凝集アッ
セイで測定したゲンタマイシン濃度との相関性は図2お
よび図3に示す。
ックスをベースとしたアッセイと同じゲンタマイシンモ
ノクローナル抗体を用いてROCHE FP ゲンタマイシンイ
ムノアッセイで測定した。FP 参照イムノアッセイおよ
びラテックス凝集イムノアッセイはサンプルの分解を避
けるために並行して行った。ROCHE FPシステムで測定し
たゲンタマイシン濃度の、粒子をベースとした凝集アッ
セイで測定したゲンタマイシン濃度との相関性は図2お
よび図3に示す。
【００５７】実施例3−陰性サンプルのイムノアッセイ
Roche FP イムノアッセイで試験した結果ゲンタマイシ
ンが陰性であった血清サンプル30検体のセットについて
イムノアッセイを行った。このサンプルセットの見かけ
の平均ゲンタマイシン濃度はクエンチしたラテックスで
は約0.03μg/mLで標準偏差は0.17μg/mLであり、これに
対してクエンチしていないラテックスではそれぞれ約0.
09μg/mLおよび0.31μg/mLであった。
ンが陰性であった血清サンプル30検体のセットについて
イムノアッセイを行った。このサンプルセットの見かけ
の平均ゲンタマイシン濃度はクエンチしたラテックスで
は約0.03μg/mLで標準偏差は0.17μg/mLであり、これに
対してクエンチしていないラテックスではそれぞれ約0.
09μg/mLおよび0.31μg/mLであった。
【００５８】実施例4−効果的な処理を行いうる他のア
ミン化合物 10mM MESバッファー, pH5.0中に1%(w/v)ラテックスを含
む50mLの懸濁液に、0.22M NHSの新鮮な水溶液を4.78mL
添加した後、0.26M EDCの新鮮な水溶液を4.03mL添加し
た。室温で2時間インキュベートした後、その懸濁液を
遠心し(15,000 x g, 30分間)、ラテックスを50mM MOPS
バッファー, pH8.0中に再懸濁して2%(w/v)の懸濁液を得
た。その懸濁液を1.5mLアリコートに分け、その各々に
下記のアミン化合物のうちの1種の1M溶液の1.29mLを添
加した：ヒドロキシルアミン；エタノールアミン；2-
(メチルアミノ)エタノール；ジエタノールアミン；グリ
シン；グリシンエチルエステル；サルコシン；サルコシ
ンエチルエステル；(メチルアミノ)アセトアルデヒドジ
メチルアセタール；N-メチル-D-グルカミン；AEO；EB
E；およびTTD。各化合物は50mM MOPSバッファー, pH8.0
中に溶解したそれらの塩酸塩の溶液とし、それを添加し
た。別に対照実験を、アミンのない条件、もしくは活性
化反応にかけていないラテックスを用いて行った。反応
混合液を室温で2時間インキュベートした後、遠心した
(15,000 x g, 30分間)。過剰のアミンはそのラテックス
を、1mLの50mM MOPSバッファー, pH7.0による処理で3回
洗って除去した。最終的に得られたラテックスペレット
を50mM MOPSバッファー, pH7.0中に再懸濁し、2%(w/v)
の懸濁液とし、4℃で48時間保存した。
ミン化合物 10mM MESバッファー, pH5.0中に1%(w/v)ラテックスを含
む50mLの懸濁液に、0.22M NHSの新鮮な水溶液を4.78mL
添加した後、0.26M EDCの新鮮な水溶液を4.03mL添加し
た。室温で2時間インキュベートした後、その懸濁液を
遠心し(15,000 x g, 30分間)、ラテックスを50mM MOPS
バッファー, pH8.0中に再懸濁して2%(w/v)の懸濁液を得
た。その懸濁液を1.5mLアリコートに分け、その各々に
下記のアミン化合物のうちの1種の1M溶液の1.29mLを添
加した：ヒドロキシルアミン；エタノールアミン；2-
(メチルアミノ)エタノール；ジエタノールアミン；グリ
シン；グリシンエチルエステル；サルコシン；サルコシ
ンエチルエステル；(メチルアミノ)アセトアルデヒドジ
メチルアセタール；N-メチル-D-グルカミン；AEO；EB
E；およびTTD。各化合物は50mM MOPSバッファー, pH8.0
中に溶解したそれらの塩酸塩の溶液とし、それを添加し
た。別に対照実験を、アミンのない条件、もしくは活性
化反応にかけていないラテックスを用いて行った。反応
混合液を室温で2時間インキュベートした後、遠心した
(15,000 x g, 30分間)。過剰のアミンはそのラテックス
を、1mLの50mM MOPSバッファー, pH7.0による処理で3回
洗って除去した。最終的に得られたラテックスペレット
を50mM MOPSバッファー, pH7.0中に再懸濁し、2%(w/v)
の懸濁液とし、4℃で48時間保存した。
【００５９】血清とこれらのラテックス粒子との相互作
用を調べた。上述の方法で調製した0.5%(w/v)ラテック
ス粒子、5%(v/v)正常ヒト血清、および50mM MOPSバッフ
ァー,pH7.0を含むサンプル(750μL)を37℃で2時間イン
キュベートし、遠心した(15,000 x g, 30分間)。選択し
たラテックスについて血清の存在しない条件下で対照の
インキュベーションを行った。ペレットを1mLの50mM MO
PSバッファー, pH7.0中に再懸濁し、再度遠心して過剰
で結合していない血清を除去した。このプロセスをさら
に3回繰り返した。この結果得られたラテックスペレッ
トを手動ピペッティングによって、6%(w/v)SDS、10%(v/
v)グリセロール、および60mM Tris, pH6.2を含有する溶
液の100μL中に再懸濁し、80℃で2時間インキュベート
してラテックス表面から共有結合していない分子種を脱
着させた。粒子を遠心して集め(15,000 x g, 1.5時
間)、上清を取り、BCA分析にかけた。粒子を再懸濁し、
1mLの50mM MOPSバッファー, pH7.0を用いて3回洗った。
最後にその粒子を100μLの50mMMOPSバッファー, pH7.0
中に再懸濁し、供試化合物の各々のクエンチについて評
価するためにBCA分析にかけた。
用を調べた。上述の方法で調製した0.5%(w/v)ラテック
ス粒子、5%(v/v)正常ヒト血清、および50mM MOPSバッフ
ァー,pH7.0を含むサンプル(750μL)を37℃で2時間イン
キュベートし、遠心した(15,000 x g, 30分間)。選択し
たラテックスについて血清の存在しない条件下で対照の
インキュベーションを行った。ペレットを1mLの50mM MO
PSバッファー, pH7.0中に再懸濁し、再度遠心して過剰
で結合していない血清を除去した。このプロセスをさら
に3回繰り返した。この結果得られたラテックスペレッ
トを手動ピペッティングによって、6%(w/v)SDS、10%(v/
v)グリセロール、および60mM Tris, pH6.2を含有する溶
液の100μL中に再懸濁し、80℃で2時間インキュベート
してラテックス表面から共有結合していない分子種を脱
着させた。粒子を遠心して集め(15,000 x g, 1.5時
間)、上清を取り、BCA分析にかけた。粒子を再懸濁し、
1mLの50mM MOPSバッファー, pH7.0を用いて3回洗った。
最後にその粒子を100μLの50mMMOPSバッファー, pH7.0
中に再懸濁し、供試化合物の各々のクエンチについて評
価するためにBCA分析にかけた。
【００６０】表2は、血清サンプル中の、活性化および
処理を行ったラテックスの各々に共有結合したタンパク
質の量をBCAアッセイで測定した結果を示している。
処理を行ったラテックスの各々に共有結合したタンパク
質の量をBCAアッセイで測定した結果を示している。
【００６１】
【表２】
【００６２】このデータは、試験した13種の化合物のう
ち5種のみが、これらの条件下でラテックス粒子の表面
上のスクシンイミドエステルの官能基と効果的に反応す
ることを示しており、それら5種とは：エタノールアミ
ン、グリシンエチルエステル、AEO、EBE、およびTTDで
ある。これら5種は全て、粒子へのタンパク質の共有結
合が0.50 mg/m２未満である。これらの効果的なアミン
化合物のうち、AEOおよび2種のジアミノ化合物EBEおよ
びTTDは粒子へのタンパク質の共有結合が0.30mg/m ２未
満で、一般的なアミンであるエタノールアミン(0.42mg/
m２)およびグリシン(0.95mg/m２)よりも著しく改善され
ている。
ち5種のみが、これらの条件下でラテックス粒子の表面
上のスクシンイミドエステルの官能基と効果的に反応す
ることを示しており、それら5種とは：エタノールアミ
ン、グリシンエチルエステル、AEO、EBE、およびTTDで
ある。これら5種は全て、粒子へのタンパク質の共有結
合が0.50 mg/m２未満である。これらの効果的なアミン
化合物のうち、AEOおよび2種のジアミノ化合物EBEおよ
びTTDは粒子へのタンパク質の共有結合が0.30mg/m ２未
満で、一般的なアミンであるエタノールアミン(0.42mg/
m２)およびグリシン(0.95mg/m２)よりも著しく改善され
ている。
【００６３】EBEおよびTTDの2種の化合物およびそれら
の類似体は、単一の分子で2つのスクシンイミドエステ
ルを開裂させる能力があり、それによってラテックス粒
子上に閉鎖された(末端の閉じた)表面エレメントを形成
し、それは血清成分との相互作用に特に抵抗性のものと
なると考えられるので、それらの化合物は処理に用いる
分子として興味深いものとなる可能性がある。EBEおよ
びTTD処理ラテックスの単分散性を調べたところ、ラテ
ックス粒子間のジアミンの架橋は生じていなかった。
の類似体は、単一の分子で2つのスクシンイミドエステ
ルを開裂させる能力があり、それによってラテックス粒
子上に閉鎖された(末端の閉じた)表面エレメントを形成
し、それは血清成分との相互作用に特に抵抗性のものと
なると考えられるので、それらの化合物は処理に用いる
分子として興味深いものとなる可能性がある。EBEおよ
びTTD処理ラテックスの単分散性を調べたところ、ラテ
ックス粒子間のジアミンの架橋は生じていなかった。
【００６４】この血清吸着実験での脱着上清の分析で
は、これらのラテックスに受動的に吸着した血清タンパ
ク質の量は、活性化していない対照のラテックスに対し
て39%(AEO)、41%(EBE)、および36%(TTD)であった。この
ように、ラテックス上の残存スクシンイミドエステル基
をAEO、EBE、およびTTDで反応させると、血清タンパク
質の物理的吸着に対して適度な抵抗性のある望ましい特
性を持ったラテックスの表面が作り出される。これらの
ラテックスは、非可逆的(共有結合的)結合もしくは可逆
的(受動的)結合のいずれかによる血清タンパク質との相
互作用が最小限のものであるので、イムノアッセイ法の
進展に適したものである。
は、これらのラテックスに受動的に吸着した血清タンパ
ク質の量は、活性化していない対照のラテックスに対し
て39%(AEO)、41%(EBE)、および36%(TTD)であった。この
ように、ラテックス上の残存スクシンイミドエステル基
をAEO、EBE、およびTTDで反応させると、血清タンパク
質の物理的吸着に対して適度な抵抗性のある望ましい特
性を持ったラテックスの表面が作り出される。これらの
ラテックスは、非可逆的(共有結合的)結合もしくは可逆
的(受動的)結合のいずれかによる血清タンパク質との相
互作用が最小限のものであるので、イムノアッセイ法の
進展に適したものである。
【００６５】実施例5−イムノアッセイの性能改善のた
めの添加剤としてのトリエタノールアミンの使用 ゲンタマイシンモノクローナル抗体で感作し、AEOで処
理したラテックス粒子を用いてラテックス凝集イムノア
ッセイを行った。イムノアッセイはトリエタノールアミ
ン(TEO)不含の条件およびTEOを最終濃度で2.5〜15mMの
範囲で存在させた条件で行った。供試した各血清サンプ
ルのゲンタマイシン含量は市販のRocheFP ゲンタマイシ
ンイムノアッセイで測定したが、このアッセイはラテッ
クスをベースとしたアッセイで用いたものと同じゲンタ
マイシンモノクローナル抗体を用いている。FP参照イム
ノアッセイおよびラテックス凝集イムノアッセイはサン
プルの分解を避けるために並行して実施した。ラテック
スイムノアッセイバッファーにTEOを添加しても得られ
た較正曲線の質には顕著な影響はなかった。
めの添加剤としてのトリエタノールアミンの使用 ゲンタマイシンモノクローナル抗体で感作し、AEOで処
理したラテックス粒子を用いてラテックス凝集イムノア
ッセイを行った。イムノアッセイはトリエタノールアミ
ン(TEO)不含の条件およびTEOを最終濃度で2.5〜15mMの
範囲で存在させた条件で行った。供試した各血清サンプ
ルのゲンタマイシン含量は市販のRocheFP ゲンタマイシ
ンイムノアッセイで測定したが、このアッセイはラテッ
クスをベースとしたアッセイで用いたものと同じゲンタ
マイシンモノクローナル抗体を用いている。FP参照イム
ノアッセイおよびラテックス凝集イムノアッセイはサン
プルの分解を避けるために並行して実施した。ラテック
スイムノアッセイバッファーにTEOを添加しても得られ
た較正曲線の質には顕著な影響はなかった。
【００６６】図4および5は、微粒子をベースとしたイム
ノアッセイをTEO不含の条件とTEOを12.5mM存在させた条
件のいずれかで行ったものと、Roche FPイムノアッセイ
で行ったものとの相関性のグラフである。添加剤として
TEOを用いると、ラテックス凝集イムノアッセイの性能
に劇的な効果が現れる。対照の実験(TEO不含)と比較す
ると、最良適合直線の勾配は1.11から1.01へと減少し、
y軸切片は-0.11から0.05へ、R相関係数は0.976から0.98
5へと増加する。このように、最良適合直線(実践)が標
的直線(点線(勾配＝1、切片＝0))と合一することから視
覚的に明らかなように、3つのパラメーターが最適な値
である1.00、0.00、および1.000へとそれぞれ近付く。R
oche FPイムノアッセイで試験した結果ゲンタマイシン
が陰性であった血清サンプルのセットを用いてラテック
スを試験したところ、微粒子をベースとしたアッセイの
試薬中にTEOを含めることにも、FPアッセイの場合と類
似の利点が認められた。アッセイ混合液中に最終的に1
2.5mMのTEOが含有されていると、このサンプルセットの
見かけのゲンタマイシン濃度の平均はTEO不含の条件で
の0.42μg/mLと比較して約0.32μg/mLであった。このア
ッセイの望ましい検出限界は0.17μg/mLである。TEOの
最適濃度を調べた実験では、最終のTEO濃度として5mMあ
ればこの添加剤によってもたらされる利点が完全に発揮
されるには十分であることが示唆される。
ノアッセイをTEO不含の条件とTEOを12.5mM存在させた条
件のいずれかで行ったものと、Roche FPイムノアッセイ
で行ったものとの相関性のグラフである。添加剤として
TEOを用いると、ラテックス凝集イムノアッセイの性能
に劇的な効果が現れる。対照の実験(TEO不含)と比較す
ると、最良適合直線の勾配は1.11から1.01へと減少し、
y軸切片は-0.11から0.05へ、R相関係数は0.976から0.98
5へと増加する。このように、最良適合直線(実践)が標
的直線(点線(勾配＝1、切片＝0))と合一することから視
覚的に明らかなように、3つのパラメーターが最適な値
である1.00、0.00、および1.000へとそれぞれ近付く。R
oche FPイムノアッセイで試験した結果ゲンタマイシン
が陰性であった血清サンプルのセットを用いてラテック
スを試験したところ、微粒子をベースとしたアッセイの
試薬中にTEOを含めることにも、FPアッセイの場合と類
似の利点が認められた。アッセイ混合液中に最終的に1
2.5mMのTEOが含有されていると、このサンプルセットの
見かけのゲンタマイシン濃度の平均はTEO不含の条件で
の0.42μg/mLと比較して約0.32μg/mLであった。このア
ッセイの望ましい検出限界は0.17μg/mLである。TEOの
最適濃度を調べた実験では、最終のTEO濃度として5mMあ
ればこの添加剤によってもたらされる利点が完全に発揮
されるには十分であることが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、血清タンパク質のカーボジイミド活性
化ラテックス粒子への共有結合の、EDC/NHS活性化後に
添加された2-アミノエトキシエタノール(AEO)の量への
依存性を示すグラフである。
化ラテックス粒子への共有結合の、EDC/NHS活性化後に
添加された2-アミノエトキシエタノール(AEO)の量への
依存性を示すグラフである。
【図２】図２は、未処理の粒子を用いた、蛍光偏光によ
るゲンタマイシンイムノアッセイと、粒子凝集によるゲ
ンタマイシンイムノアッセイとの測定値の相関性を示す
グラフである。
るゲンタマイシンイムノアッセイと、粒子凝集によるゲ
ンタマイシンイムノアッセイとの測定値の相関性を示す
グラフである。
【図３】図３は、処理された粒子を用いた、蛍光偏光に
よるゲンタマイシンイムノアッセイと、粒子凝集による
ゲンタマイシンイムノアッセイとの測定値の相関性を示
すグラフである。
よるゲンタマイシンイムノアッセイと、粒子凝集による
ゲンタマイシンイムノアッセイとの測定値の相関性を示
すグラフである。
【図４】図４は、トリエタノールアミン(TEO)の存在し
ない条件での、蛍光偏光によるゲンタマイシンイムノア
ッセイと、粒子凝集によるゲンタマイシンイムノアッセ
イとの測定値の相関性を示すグラフである。
ない条件での、蛍光偏光によるゲンタマイシンイムノア
ッセイと、粒子凝集によるゲンタマイシンイムノアッセ
イとの測定値の相関性を示すグラフである。
【図５】図５は、TEOの存在する条件での、蛍光偏光に
よるゲンタマイシンイムノアッセイと、粒子凝集による
ゲンタマイシンイムノアッセイとの測定値の相関性を示
すグラフである。
よるゲンタマイシンイムノアッセイと、粒子凝集による
ゲンタマイシンイムノアッセイとの測定値の相関性を示
すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１２月１０日（２００２．１２．
１０）
１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/551 Ｇ０１Ｎ 33/551
33/553 33/553
(72)発明者 クリストファー シー．ロウレンス
アメリカ合州国 46038 インディアナ州,
フィッシャーズ，チャドウェル コート
9072，＃104
(72)発明者 ウェイ ユアン
アメリカ合州国 46038 インディアナ州,
フィッシャーズ，ウッドストック ウェイ
9000
(72)発明者 アーメン ビー．シャナフェルト
アメリカ合州国 46032 インディアナ州,
カーメル，トリーティ ライン ストリー
ト 12613
Ｆターム(参考） 4H045 AA11 AA20 AA30 BA60 CA40
DA75 EA50 EA61 FA51
Claims (34)
- 【請求項１】 イムノアッセイ用の粒子を調製する方法
であって、 カルボキシル基を含む粒子を、N-ヒドロキシスクシンイ
ミドもしくはN-ヒドロキシスルホスクシンイミド、およ
びカルボジイミドカップリング剤と反応させて、スクシ
ンイミドエステル基を含む活性化粒子を取得し；該活性
化粒子を抗体と接触させて、共有結合した抗体および残
存スクシンイミドエステル基を含む感作粒子を取得し；
そして該感作粒子を水性混合液中において式(I)のアミ
ン化合物： H２N-R-X (I)； [式中、-Xは、-NH２、-OH、および-CO２CH２CH３からな
る群から選択され、 Rは、アルキル基およびアルキルエーテル基からなる群
から選択され、 ここで、-Xが-NH２もしくは-CO２CH２CH３である場合に
は、Rは1〜20個の炭素原子を含み、-Xが-OHである場合
には、Rは4〜20個の炭素原子を含む]で処理する；こと
を特徴とする上記方法。 - 【請求項２】 -Xが、-OHおよび-NH２からなる群から選
択され、Rが4〜20個の炭素原子および1〜9個の酸素原子
を含むアルキルエーテル基である、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 アミン化合物がグリシンエチルエステ
ル；2-(アミノエトキシ)エタノール；2,2'-(エチレンジ
オキシ)ビスエチルアミン；および4,7,10-トリオキサ-
1,3-トリデカンジアミンからなる群から選択される、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 アミン化合物の当量とカルボキシル基の
当量の比が少なくとも50である、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項５】 アミン化合物の当量とカルボキシル基の
当量の比が少なくとも100である、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項６】 アミン化合物の当量とカルボキシル基の
当量の比が少なくとも200である、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項７】 前記水性混合液のpHが少なくとも7.0で
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 前記粒子を血清と接触させた場合に、該
粒子が0.35mg/m２未満の非特異的タンパク質と共有結合
する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 前記粒子を血清と接触させた場合に、該
粒子が0.30mg/m２未満の非特異的タンパク質と共有結合
する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記粒子を血清と接触させた場合に、
該粒子が0.20mg/m２未満の非特異的タンパク質と共有結
合する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記粒子を血清と接触させた場合に、
該粒子が0.10mg/m２未満の非特異的タンパク質と共有結
合する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記粒子を血清と接触させた場合に、
該粒子が0.05mg/m２未満の非特異的タンパク質と共有結
合する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記粒子を血清と接触させた場合に、
該粒子が3mg/m２未満の非特異的タンパク質を物理的に
吸着する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記粒子を血清と接触させた場合に、
該粒子が2mg/m２未満の非特異的タンパク質を物理的に
吸着する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記粒子を血清と接触させた場合に、
該粒子が1mg/m２未満の非特異的タンパク質を物理的に
吸着する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１６】 イムノアッセイ用の感作粒子であっ
て、表面をもつ粒子；該表面に共有結合を介して結合さ
れた少なくとも1つの抗体；および該表面上の、スクシ
ンイミドエステルと式(I)のアミン化合物： H２N-R-X (I)； [式中、-Xは、-NH２、-OH、および-CO２CH２CH３からな
る群から選択され、 Rは、アルキル基およびアルキルエーテル基からなる群
から選択され、 ここで、-Xが-NH２もしくは-CO２CH２CH３である場合に
は、Rは1〜20個の炭素原子を含み、-Xが-OHである場合
には、Rは4〜20個の炭素原子を含む]との反応生成物；
を含むことを特徴とする上記感作粒子。 - 【請求項１７】 -Xが、-OHおよび-NH２からなる群から
選択され、Rが4〜20個の炭素原子および1〜9個の酸素原
子を含むアルキルエーテル基である、請求項１６に記載
の感作粒子。 - 【請求項１８】 アミン化合物がグリシンエチルエステ
ル；2-(アミノエトキシ)エタノール；2,2'-(エチレンジ
オキシ)ビスエチルアミン；および4,7,10-トリオキサ-
1,3-トリデカンジアミンからなる群から選択される、請
求項１６に記載の感作粒子。 - 【請求項１９】 前記表面上にBSAをさらに含む、請求
項１６に記載の感作粒子。 - 【請求項２０】 前記表面をもつ粒子が、金粒子、セラ
ミック粒子、およびポリマー粒子からなる群から選択さ
れる、請求項１６に記載の感作粒子。 - 【請求項２１】 前記粒子を血清と接触させた場合に、
該粒子が0.35mg/m２未満の非特異的タンパク質と共有結
合する、請求項１６に記載の感作粒子。 - 【請求項２２】 前記粒子を血清と接触させた場合に、
該粒子が0.30mg/m２未満の非特異的タンパク質と共有結
合する、請求項１６に記載の感作粒子。 - 【請求項２３】 前記粒子を血清と接触させた場合に、
該粒子が0.20mg/m２未満の非特異的タンパク質と共有結
合する、請求項１６に記載の感作粒子。 - 【請求項２４】 前記粒子を血清と接触させた場合に、
該粒子が0.10mg/m２未満の非特異的タンパク質と共有結
合する、請求項１６に記載の感作粒子。 - 【請求項２５】 前記粒子を血清と接触させた場合に、
該粒子が0.05mg/m２未満の非特異的タンパク質と共有結
合する、請求項１６に記載の感作粒子。 - 【請求項２６】 前記粒子を血清と接触させた場合に、
該粒子が3mg/m２未満の非特異的タンパク質を物理的に
吸着する、請求項１６に記載の感作粒子。 - 【請求項２７】 前記粒子を血清と接触させた場合に、
該粒子が2mg/m２未満の非特異的タンパク質を物理的に
吸着する、請求項１６に記載の感作粒子。 - 【請求項２８】 前記粒子を血清と接触させた場合に、
該粒子が1mg/m２未満の非特異的タンパク質を物理的に
吸着する、請求項１６に記載の感作粒子。 - 【請求項２９】 イムノアッセイ用の粒子であって、表
面をもつポリマー粒子；該表面に共有結合を介して結合
された少なくとも1つの抗体；該表面上のBSA；および該
表面上の、スクシンイミドエステルとアミン化合物との
反応生成物；を含んでなり、ここにおいて、 該アミン化合物は、グリシンエチルエステル；2-(アミ
ノエトキシ)エタノール；2,2'-(エチレンジオキシ)ビス
エチルアミン；および4,7,10-トリオキサ-1,3-トリデカ
ンジアミンからなる群から選択され、 該粒子は、血清と接触させた場合に、0.35mg/m２未満の
非特異的タンパク質と共有結合し、そして該粒子は、血
清と接触させた場合に、2mg/m２未満の非特異的タンパ
ク質を物理的に吸着する、ことを特徴とする上記粒子。 - 【請求項３０】 試薬であって、 各粒子が表面をもつ、複数の粒子；該表面に共有結合を
介して結合された抗体；および該表面上の、スクシンイ
ミドエステルと式(I)のアミン化合物： H２N-R-X (I)； [式中、-Xは、-NH２、-OH、および-CO２CH２CH３からな
る群から選択され、 Rは、アルキル基およびアルキルエーテル基からなる群
から選択され、 ここで、-Xが-NH２もしくは-CO２CH２CH３である場合に
は、Rは1〜20個の炭素原子を含み、-Xが-OHである場合
には、Rは4〜20個の炭素原子を含む]との反応生成物；
を含むことを特徴とする上記試薬。 - 【請求項３１】 -Xが-OHおよび-NH２からなる群から選
択され、Rが4〜20個の炭素原子および1〜9個の酸素原子
を含むアルキルエーテル基である、請求項３０に記載の
試薬。 - 【請求項３２】 アミン化合物がグリシンエチルエステ
ル；2-(アミノエトキシ)エタノール；2,2'-(エチレンジ
オキシ)ビスエチルアミン；および4,7,10-トリオキサ-
1,3-トリデカンジアミンからなる群から選択される、請
求項３０に記載の試薬。 - 【請求項３３】 抗原を測定するアッセイ法であって、 抗原を含むと予想されるサンプルを請求項３０に記載の
試薬と組み合わせること、ただし、該試薬は該抗原に対
する抗体を含んでなり、該試薬は該抗原との検出可能な
複合体を形成することができるものであること；および
検出可能な該複合体の存在もしくは量を、該サンプル中
の該抗原の尺度として測定すること；を特徴とする上記
方法。 - 【請求項３４】 請求項３０に記載の試薬を含んでなる
テストキット。
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