JP2022132100A - ラテックス凝集反応増感剤、ラテックス凝集試薬、及びそれを用いたラテックス凝集法による検体中の標的物質の測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ラテックス凝集反応での使用に適し、感度の増感作用が高く、一方で非特異反応を抑制できる、ポリオキサゾリンを含んでなるラテックス凝集試薬、ラテックス凝集法による検体中の標的物質の測定方法の提供。【解決手段】抗体または抗原を担持させた不溶性担体を用いるラテックス凝集法による検体中の標的物質の測定方法に使用される、下記一般式で表される繰り返し単位を有するポリオキサゾリンを含んでなるラテックス凝集試薬。TIFF2022132100000016.tif3062（式（１）中、Ｒは水素原子又はメチル基、エチル基、プロピル基を表す。ｎは１００以上の整数である。）【選択図】なし

Description

本発明は、ラテックス凝集反応増感剤、ラテックス凝集試薬、及びそれを用いたラテックス凝集法による検体中の標的物質の測定方法に関する。

特定の抗原又は抗体（以後、「標的物質」と呼ぶ）を検出、測定するために、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が、臨床検査等において使用されている。その中でも、抗体または抗原を担持させた不溶性担体（例えばラテックス粒子など）を用いる免疫測定法は、ラテックス凝集法として知られている。

ラテックス凝集法の一例では、標的物質を含む可能性のある検体（血清など）を、標的物質に対する抗体を担持させた粒子（「抗体感作粒子」とも呼ぶ）を含んでなるラテックス凝集試薬と反応させ、この抗原抗体反応により生成した凝集体について、この凝集を目視あるいは光学的に検出することで、標的物質を定性的、定量的に測定することができる。

ラテックス凝集法の他の例では、標的物質を含む可能性のある検体をラテックス凝集試薬の第１試薬（「Ｒ１」と呼ぶことがある）と混合する。次に、標的物質に対する抗体あるいは抗原を固定した感作粒子を含む感作粒子分散液（ラテックス凝集試薬の第２試薬，「Ｒ２」と呼ぶことがある）を、さらに混合する。第１試薬と第２試薬を混合した時、標的物質が存在する場合、抗原抗体反応の結果、感作粒子は凝集するため、この凝集を目視あるいは光学的に検出することで、標的物質を定性的、定量的に測定することができる。

臨床検査では、高感度な化学発光免疫測定法も用いられているが、ＢＦ分離（未反応成分を除去する工程）を必要とするため検査時間は長くなる傾向がある。一方で、ラテックス凝集法では、検査時間が短く、検査処理能（スループット）は高いものの、化学発光免疫測定法と比較すると検出感度が不足することがあり、更なる検出感度の改善が求められている。

ラテックス凝集法の高感度化を目的として、ポリマー化合物が増感剤として用いられている。より具体的には、増感剤を含んでなるラテックス凝集試薬が用いられている。増感剤として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やアルギン酸ナトリウム等の水溶性高分子が凝集反応の促進を目的として、反応系に添加される。特許文献１および特許文献２では、増感剤としてノニオン性のポリマーであるポリエチレングリコールを提案している。特許文献３では、増感剤としてアニオン性のポリマーであるアルギン酸塩を提案している。

しかしながら、これらのポリマーでは、増感作用の一方で、溶液の粘度が高くなることやポリマーの塩析が起こることもあり、抗原抗体反応とは無関係な反応、つまり非特異凝集反応も同時に促進する可能性がある。この結果、ブランク値が高くなる、偽陽性の原因となる、測定精度が低下するなどの問題が生じる可能性がある。よって、増感作用を示す一方で非特異反応は抑制し、かつ測定精度が良好な、増感剤を含んでなるラテックス凝集試薬が望まれている。

また、特許文献４には、化学発光検出を増強させる添加物として、ノニオン性ポリマーであるポリオキサゾリンを提案している。

しかしながら、抗体または抗原を担持させた不溶性担体を用いるラテックス凝集法による検体中の標的物質の測定方法において、ポリオキサゾリンの増感効果については、これまでに知られていなかった。

特開昭５８－４７２５６号公報 特許第２６８２６９７号公報 特開２００３－２９４７５３号公報 特許第３６３２８５６号公報

したがって、本発明は、抗体または抗原を担持させた不溶性担体を用いるラテックス凝集法での使用に適し、増感作用を示す一方で非特異反応は抑制し、かつ測定精度が良好な、新たなラテックス凝集反応増感剤を含んでなるラテックス凝集試薬、及びそれを用いたラテックス凝集法による検体中の標的物質の測定方法を提供することを目的とする。

そこで、本発明者らは上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、ポリオキサゾリンをラテックス凝集反応増感剤として含んでなるラテックス凝集試薬を用いることにより、上記の目的を達成し得ることを見出した。

即ち、本発明は、抗体または抗原を担持させた不溶性担体を用いるラテックス凝集法による検体中の標的物質の測定方法に使用される、下記一般式（１）で表される繰り返し単位を有するポリオキサゾリン（ラテックス凝集反応増感剤）を含んでなるラテックス凝集試薬に関する。

（式中、Ｒは水素原子又はメチル基、エチル基、プロピル基を表す。ｎは１００以上の整数である。）

また本発明は、上記のラテックス凝集試薬を構成成分とするラテックス凝集試薬キットに関する。さらに本発明は、上記のラテックス凝集試薬あるいはラテックス凝集試薬キットを用いた、抗体または抗原を担持させた不溶性担体を用いるラテックス凝集法による検体中の標的物質の測定方法に関する。

本発明のポリオキサゾリンを含んでなるラテックス凝集試薬は、従来の増感剤を含んでなるラテックス凝集試薬と比較して、高い増感効果を示し、一方で非特異反応を抑制することができる。さらに、本発明のラテックス凝集試薬は、測定精度が良好であり、粘度も低いために取り扱いの容易なラテックス凝集試薬が提供される。本発明のラテックス凝集試薬を使用すると、抗体または抗原を担持させた不溶性担体を用いるラテックス凝集法により、検体中の標的物質を、高い感度かつ高い精度で測定することが可能になる。

以下、本発明の実施形態（以下、本実施形態と記載する）に係るラテックス凝集反応増感剤、ラテックス凝集試薬、及びそれを用いたラテックス凝集法による検体中の標的物質の測定方法について説明するが、本発明はこれに限定されない。
本実施形態のラテックス凝集試薬は、抗体または抗原を担持させた不溶性担体を用いるラテックス凝集法による検体中の標的物質の測定に用いられるものである。本明細書において、ラテックス凝集法とは、凝集反応に基づく免疫測定法のことであり、例えばラテックス凝集免疫比濁法、免疫比濁法、免疫比ろう法などと呼ばれる免疫測定法を含む。

（増感剤としてのポリオキサゾリン）
本実施形態のラテックス凝集試薬は、ラテックス凝集反応増感剤として機能する、ポリオキサゾリンを少なくとも含んでなることを特徴とし、例えば、ラテックス凝集法において使用される各種の溶液に、ポリオキサゾリンを含有させて、ラテックス凝集試薬を調製することができる。

本実施形態のラテックス凝集試薬において、ポリオキサゾリンが凝集反応の増感作用を有するメカニズムは、枯渇凝集と考えられる。枯渇凝集とは、粒子が互いに接近すると有限の広がりをもつ溶存高分子が粒子の間隙から排除される結果、粒子間に浸透圧が働くことによる粒子間凝集のことである。枯渇凝集を効果的に起こすためには、水溶液中において媒質、媒体との相互作用の弱い、かつ水溶液で適切なサイズを有するポリマーであることが求められる。本実施形態において、後述するように、ポリオキサゾリンは塩やイオンとの相互作用も弱く、タンパク質や不溶性担体との相互作用も弱い。またポリオキサゾリンは溶液の粘度も増加しにくいために、ラテックス凝集試薬の増感剤として、有効に機能することがわかった。

本実施形態におけるポリオキサゾリンとは、下記一般式（１）で表される繰り返し単位を有するポリマーである。本実施形態では、ポリオキサゾリンは、ポリ（Ｎ－アシルエチレンイミン）の総称である。好ましい態様に従うと、本実施形態に従い使用されるポリオキサゾリンは、２－アルキル－２－オキサゾリンのポリマーであり、ポリ（２－オキサゾリン）と呼ぶことがある。

式（１）中、ポリマー側鎖を構成するＲは水素原子又はメチル基、エチル基、プロピル基およびその組み合わせから選択される。これらの一例としては、ポリ（２－メチル－２－オキサゾリン）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）、ポリ（２－イソプロピル－２－オキサゾリン）、ポリ（２－ノルマルプロピル－２－オキサゾリン）などが挙げられる。前記Ｒは、アルキル鎖が長くなるに伴い、疎水性が増加する。より長いアルキル側鎖を持つポリオキサゾリンはポリマーの疎水性が増加するため、ポリマーの水への溶解性が低下するため、好ましくない場合がある。式（１）中、ポリマー側鎖を構成するＲは、好ましくはメチル基、エチル基であり、より好ましくはエチル基である。好ましいポリマーの例として、ポリ（２－メチル－２－オキサゾリン）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）が挙げられるが、特に、下記一般式（２）で表される、水溶性と疎水性のバランスが良いポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）が良い。

式（１）および式（２）中、ポリマー重合度（繰り返し単位数とも呼ぶ）を示すｎは、１００以上の整数であり、好ましくは、１００以上、１００，０００以下である。式（２）のポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）のホモポリマーである場合、このポリマー重合度の範囲で、ポリマーの重量平均分子量は、約１０，０００以上１，０００，０００以下となる。ポリマー重合度ｎが１００未満であると、分子量が小さいために、増感作用が低下する。一方で、１００，０００を超えると、分子量が大きく溶液の粘度が高くなりすぎるため、好ましくない。

本実施形態におけるポリオキサゾリンとしては、一般式（１）で示される繰り返し単位を有するものであれば、ホモポリマーでもコポリマーでもよい。該コポリマーとしては、具体的には、例えばポリオキサゾリンとポリエチレングリコール、ポリオキサゾリンとポリ乳酸、ポリオキサゾリンとポリアクリル酸などのコポリマーが挙げられる。

これらのポリオキサゾリンは、本実施形態のラテックス凝集試薬及びそれを用いた標的物質の測定方法において、単独で又は組み合わせて使用することができる。好ましくは、式（２）のポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）を含むラテックス凝集試薬であり、それを用いた標的物質の測定方法である。

ポリオキサゾリンは、例えば、オキサゾリンモノマーを、公知の重合反応により重合することにより製造することができる。例えば、適当な条件下、２－オキサゾリンのカチオン開環重合でポリオキサゾリンを合成することができる。ポリオキサゾリンの合成方法の例として、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（以後、「ＰＯＸ」と略すことがある）を例にして説明する。乾燥アルゴン雰囲気下、アセトニトリル中、メチルトシラート（開始剤）と２－エチル－２－オキサゾリン（モノマー）を加え、カチオン開環重合を行う。温度は４０℃で、約１０日間反応させた後、ポリマーの末端に水酸基（停止剤）を導入するため、水酸化ナトリウムを添加して反応を停止させる。反応液を水に対して透析することにより精製し、減圧乾燥にて固形分を得ることで、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）ホモポリマーを合成することができる。

ポリオキサゾリンの末端構造は、特に限られないが、例えば、一方の末端が、重合開始剤に由来する官能基であり、もう一方の末端は重合停止剤に由来する官能基であるものであっても良い。また、カチオン開環重合において、求電子性の重合開始剤と求核性の重合停止剤を適宜選択することで、ポリマー鎖の両末端に任意の官能基を導入することも可能である。求電子性の重合開始剤の例として、ハロゲン化アルキル、酸ハロゲン化物、多官能トシラート、多官能トリフラート、多官能ノシラートなどが挙げられる。求核性の重合停止剤としてはハイドロオキシド、アミン、カルボキシレートなどが挙げられる。ポリオキサゾリンの末端構造の例としては、メチル基、水酸基である。

ポリオキサゾリンの重量平均分子量の範囲は特に限られないが、１０，０００以上１，０００，０００以下が好ましい。ポリマー重合度に関しては、上述した通りであり、増感作用を発揮するためには、ポリマーが水中である程度の広がりが必要であること、一方で溶液の粘度は高すぎないことがラテックス凝集試薬としては望ましいからである。よって、重量平均分子量が５０，０００、更により好ましくは少なくとも２００，０００、および最も好ましくは少なくとも４００，０００の重量平均分子量を有するポリオキサゾリンが使用される場合に、高い増感効果が認められる。重量平均分子量が、１０，０００未満であると、水中での分子サイズが小さいために、十分な増感作用が得にくい。重量平均分子量が、１，０００，０００を超えると溶液の粘度が高くなるため、扱い易さに劣り、かつ十分な効果が得られなくなる。ポリオキサゾリンの重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）や粘度測定に基づいて、求められる。

(ラテックス凝集試薬)
本実施形態のラテックス凝集試薬は、増感剤として機能する、ポリオキサゾリンを少なくとも含んでなることを特徴とし、例えば、ラテックス凝集法において使用される水性媒体に、ポリオキサゾリンを含有させて、ラテックス凝集試薬を調製することができる。

本実施形態のラテックス凝集試薬における、ポリオキサゾリンの濃度は、溶解性の観点から０．０１ｗ／ｖ％以上２．０ｗ／ｖ％以下であることが好ましい。ポリオキサゾリンの濃度がこの範囲の濃度であれば、溶液の粘度も低く、溶液の取り扱いが容易になる。ポリオキサゾリンの濃度が低すぎると十分な増感効果が得られにくい。後述するように、本実施形態のラテックス凝集法に基づく測定方法においては、本実施形態にかかるポリオキサゾリンを、反応液中の最終濃度として、通常０．００５ｗ／ｖ％以上１．９ｗ／ｖ％以下、好ましくは０．１ｗ／ｖ％以上１．９ｗ／ｖ％以下、より好ましくは０．１５ｗ／ｖ％以上１．９ｗ／ｖ％以下となるように添加して用いられる。また、該濃度は、測定対象の標的物質や不溶性担体の種類により設定を変えることができる。

本実施形態のラテックス凝集試薬は、ポリオキサゾリンの水溶液であり、水性媒体としては、精製水、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、アンモニア緩衝液等の各種緩衝液等が挙げられる。特に、リン酸緩衝液、グッド緩衝液が好ましい。

本実施形態のラテックス凝集試薬は、水性媒体にポリオキサゾリンを含んでなるものであるが、それ以外にも、塩類、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、界面活性剤、免疫グロブリン等の添加物を含んでいてもよい。特に、溶液浸透圧の調整やタンパク質の安定化のために、塩化ナトリウムの添加が好ましい。

（不溶性担体）
本実施形態のラテックス凝集試薬と好適に使用できる不溶性担体は、通常のラテックス凝集反応で用いる不溶性担体であればいずれも使用可能であるが、好ましくは粒状担体（以後、「粒子」と略すことがある）である。不溶性担体の材質としては、ポリスチレン、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル(メタ）アクリレート共重合体、アクリル酸重合体、アガロース、デキストランなどの高分子、シリカ、アルミナなどの無機物、金コロイドなどの金属が挙げられる。不溶性担体の合成、調製は公知の方法に従って行うことができる。

好適な担体の例としては、ラテックス粒子が挙げられる。ここでラテックス粒子とは、標的物質に対する抗原あるいは抗体を固定化できる高分子の粒子であり、ラテックス凝集反応に用いられる粒子を意味する。ラテックス粒子の好ましい例としては、ポリスチレン粒子、シロキサンを有するポリスチレン粒子、ポリグリシジル（メタ）アクリレートを有するポリスチレン粒子（以降「ＳＧ粒子」と略すことがある）などが挙げられる。これらの粒子は、ナノサイズの粒子が比較的容易に得られること、目的に応じて粒子表面を化学改変できることなどの利点があり、本実施形態のラテックス凝集試薬と好適に使用できる担体である。

これらの担体の中で、実施例で後述するように、特にシロキサンを有するポリスチレン粒子、ＳＧ粒子は、その粒子表面が化学的に親水性化されており、高度に非特異吸着を抑制できる。そのため、本実施形態にかかるポリオキサゾリンと粒子との相互作用もほとんど無く、枯渇効果による凝集促進において、最も理想的な粒子と増感剤の組合せである。
具体的な効果として、シロキサンを有するポリスチレン粒子、ＳＧ粒子を担体として用いる場合、ポリオキサゾリンが低い粘度を示すこと、ならびにポリオキサゾリンが粒子に吸着しないことから、ポリオキサゾリンの濃度を高めることで感度を高めることができ、更に測定精度が良くなるという利点がある。

不溶性担体のサイズは、長軸径として、０．０１μｍ以上１０μｍ以下が好ましく、０．０５μｍ以上１μｍ以下がより好ましい。不溶性担体のサイズを０．０５μｍ以上とすることにより、ラテックス凝集測定で観測する可視域の吸光度が適度な範囲となる。不溶性担体のサイズを１μｍ以下とすることにより、溶液中の分散安定性が向上し、かつ可視域の吸光度が適度な範囲となる。反応性や分散安定性の観点からは、０．０５μｍ以上０．４０μｍ以下の不溶性担体を用いることが好ましい。上述したように、好適な不溶性担体の一例は、粒子である。よって、サイズの好適な一例は、平均粒子径で表すことができる。平均粒子径は、散乱粒子径分布測定により測定される体積平均粒子径などが用いられる。不溶性担体としての粒子の好ましい平均粒子径は、０．０５μｍ以上１μｍ以下である。

また不溶性担体の使用量は、そのサイズにもよるが、適宜調整でき、反応性や溶液濁度の観点から、凝集反応時の溶液中の不溶性担体濃度が０．０１ｗ／ｖ％以上０．５ｗ／ｖ％以下、もしくは０．０２ｗ／ｖ％以上０．３ｗ／ｖ％以下となるような量である。

不溶性担体には、抗原あるいは抗体が固定化されているものが好ましい。抗原あるいは抗体は、不溶性担体に化学結合で固定化されていても、物理吸着で固定化されていてもよいが、化学結合で固定化されているのが好ましい。抗原あるいは抗体の固定化は常法に従って行えばよいが、不溶性担体の官能基に、抗原又は抗体の有する第１級アミン、第２級アミン、カルボキシル基、チオール基などと反応させることができる。不溶性担体の官能基としては、例えば、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基、チオール基、マレイミド基などが挙げられる。不溶性担体は、これらの官能基を１種類のみ有していてもよいし、２種以上を有していてもよい。

また、抗体の代わりに、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗原結合フラグメントを用いることもできる。

なお、不溶性担体に抗原や抗体を固定した構成以外にも、標的物質に応じて適切な物質を結合させた構成としてもよい。例えば、不溶性担体に、酵素タンパク質やその基質、ホルモンや神経伝達物質といったシグナル物質やその受容体、核酸、アビジンやビオチンといった物質を結合した構成としてもよい。

（標的物質）
本実施形態のラテックス凝集試薬は、標的物質の測定に用いられるものであり、その標的物質は、免疫反応により測定可能な物質であれば良く、抗原や抗体などの物質が挙げられる。例えば、ＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白質）、フェリチン、アルブミン、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＫＬ－６、ペプシノゲン（ＰＧ）、リウマチ因子（ＲＦ）、リポ蛋白、インスリン、感染症関連抗原とそれに対する抗体、ホルモン類、ビタミン類、抗生物質などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

（ラテックス凝集試薬の調製例）
本実施形態にかかるポリオキサゾリンを、免疫測定において使用される各種の試薬に含有させて、増感作用の高いラテックス凝集試薬を調製することができる。
本実施形態のラテックス凝集試薬の一例を示す。

（１液タイプのラテックス凝集試薬）
ポリオキサゾリンをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳと略すことがある）に溶解させる。
このポリオキサゾリン溶液に、標的物質に対する抗体を感作させたポリスチレン粒子（不溶性担体）を添加することで、結果として得られた溶液を、本発明のラテックス凝集試薬の実施形態の一例とすることができる。この１液タイプのラテックス凝集試薬に、血清、血漿等のサンプル（以後、検体と略すことがある）を加えて、濁度を分光光度計で測定する。もし、サンプルに標的物質が含まれない場合、ポリスチレン粒子は分散した状態を維持するため、濁度の時間変化は見られない。一方、サンプルに標的物質が含まれる場合、ポリスチレン粒子は、標的物質と抗原抗体反応によって、凝集する。この凝集により濁度の時間変化が見られる。すなわち、濁度が増加する。濃度既知の標的物質の標準液を用いた濁度測定により検量線（濁度と標的物質の濃度の関係を示すグラフ）を得ることで、サンプルの濁度増加からサンプルに含まれる標的物質の定量が可能になる。本実施形態のラテックス凝集試薬には、各種の添加剤を含有させてもよい。一般的には、ｐＨ緩衝剤（例えばトリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤等）、アルブミンやグロブリン等のタンパク質、アミノ酸、界面活性剤、防腐剤などを含んでも良い。

（ラテックス凝集試薬キット）
本発明の形態の一つは、ポリオキサゾリンを含んでなるラテックス凝集試薬を少なくとも構成成分とするラテックス凝集試薬キットであり、具体的な例として、ラテックス凝集試薬が少なくとも２つ以上の溶液で構成されているものである。これらの溶液としては、検体の希釈液、不溶性担体の分散液、不溶性担体の分散液の希釈液、検量線を取得するための標準液（標的物質の既知濃度を含む溶液）、測定精度を確認するためのコントロールなどが挙げられる。キットの例としては、ポリオキサゾリンを含んでなるラテックス凝集試薬からなる第１試薬と、抗体または抗原を担持させた不溶性担体を含んでなる第２試薬とを少なくとも含んでなるラテックス凝集試薬キットである。ポリオキサゾリンを含んでなるラテックス凝集試薬からなる第１試薬は、検体希釈液と呼ばれることがある。この検体希釈液にポリオキサゾリンを含まず、不溶性担体を含んでなる第２試薬にポリオキサゾリンを含んでも良い。通常、保管安定性の観点から、第１試薬や検体希釈液にポリオキサゾリンを含めるほうが好ましい。

ラテックス凝集法による標的物質の測定では、例えば、ポリオキサゾリンを含んでなるラテックス凝集試薬からなる第１試薬に検体を添加した後、この溶液に、抗体または抗原を担持させた不溶性担体を含んでなる第２試薬とを混合することで行われる。この時、ポリオキサゾリン濃度が０．００５ｗ／ｖ％以上１．０ｗ／ｖ％以下の範囲でラテックス凝集反応を行うことが好ましく、検体の量、第１試薬の量、第２試薬の量を設定した上で、第１試薬中のポリオキサゾリンの濃度を設定すれば良い。ラテックス凝集の反応時、前記のポリオキサゾリン濃度の範囲内では、溶液の粘度も低く、溶液の取り扱いが容易であり、十分な増感効果を得ることが可能である。また、該濃度は、測定対象の標的物質や不溶性担体の種類により適宜設定することができる。

（検体中の標的物質の測定方法）
本実施形態は、抗体または抗原を担持させた不溶性担体を用いるラテックス凝集法による検体中の標的物質の測定方法であって、本実施形態のラテックス凝集試薬あるいはラテックス凝集試薬キットを用いることを特徴とする検体中の標的物質の測定方法である。ここで、測定とは、定性測定ならびに定量測定の意味を含む。
検体中の標的物質の測定方法において、好ましい形態としては、抗体または抗原を担持させたラテックス粒子を用いるラテックス凝集法である。

ラテックス凝集法の一例では、標的物質を含む可能性のある検体（血清など）を、標的物質に対する抗体を担持させたラテックス粒子を含んでなるラテックス凝集試薬と反応させ、この抗原抗体反応により生成した凝集体について、この凝集を目視あるいは光学的に検出することで、標的物質を定性的、定量的に測定することができる。

ラテックス凝集法の他の例では、標的物質を含む可能性のある検体に検体希釈液（ラテックス凝集試薬の第１試薬）を混合する。次に、標的物質に対する抗体あるいは抗原を固定したラテックス粒子を含むラテックス粒子分散液（ラテックス凝集試薬の第２試薬）を、さらに混合する。第１試薬と第２試薬を混合した時、標的物質が存在する場合、抗原抗体反応の結果、ラテックス粒子は凝集するため、この凝集を目視あるいは光学的に検出することで、標的物質を定性的、定量的に測定することができる。

ラテックス凝集法として、上記した通り、反応時のポリオキサゾリン濃度が０．００５ｗ／ｖ％以上１．０ｗ／ｖ％以下の範囲でラテックス凝集法を行うことが好ましい。ポリオキサゾリン濃度がこの範囲である場合、ラテックス凝集法による検体中の標的物質の測定において、高感度であり、高い測定精度で標的物質の測定が可能になる。

ラテックス凝集法の反応温度は、一般的に、４℃以上５０℃以下の範囲で行われる。温度が低い場合、抗原抗体の反応性が低下し、温度が高い場合は抗原抗体の免疫複合体の安定性が低下するため、好ましくは１０℃以上４０℃以下、特に３０℃以上４０℃以下が好ましい。ラテックス凝集法の反応時間は、一般的に、０分以上６０分以下の範囲で行われる。好ましくは、１分以上３０分以下の範囲である。

抗原抗体反応により生成した凝集体は、目視あるいは光学的に検出することで、標的物質を測定することができる。すなわち、標的物質を定性的、定量的に測定することができる。この検出工程においては、目視で凝集形成を観察しても良いが、検出の再現性及びスループットの観点からは、光学的装置を用いて凝集の程度を測定することが好ましい。光学的装置としては、散乱光又は透過光を測定することのできる装置が好ましく、分光光度計などを用いることができる。

本実施形態のラテックス凝集法においては、不溶性担体が、ポリスチレン粒子、シロキサンを有するポリスチレン粒子、ＳＧ粒子であることが好ましい。ラテックス凝集法として、反応時のポリオキサゾリン濃度は、用いる不溶性担体により変えることもできる。

本実施形態のラテックス凝集法で測定する標的物質は、免疫反応により測定可能な物質であれば良く、抗原や抗体などの物質が挙げられる。例えば、ＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白質）、フェリチン、アルブミン、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＫＬ－６、ペプシノゲン（ＰＧ）、リウマチ因子（ＲＦ）、リポ蛋白、インスリン、感染症関連抗原とそれに対する抗体、ホルモン類、ビタミン類、抗生物質などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

ラテックス凝集法として、反応時のポリオキサゾリン濃度は、標的物質により変えることもできる。

以下、本発明の実施例（以下、本実施例と記載する）として、２液で構成されるラテックス凝集試薬キットを説明するが、本発明はこれに限られない。

（実施例１：ラテックス凝集試薬キットの第１試薬の調製例）
２液で構成されるラテックス凝集試薬キットの一例は、検体を希釈するための第１試薬と、抗体感作ラテックスを含む第２試薬からなるものである。ここで、第１試薬の調製例を示す。

＜実施例１－１：ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）を含んでなるラテックス凝集試薬（第１試薬）の調製＞
ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（平均分子量４００，０００、シグマアルドリッチ）をＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に溶解させた。以後、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）を「ＰＯＸ」と略すことがある。ＰＯＸ濃度を０．５ｗ／ｖ％となるように濃度調整して、本実施例のラテックス凝集試薬（第１試薬）とした。以後、この第１試薬をＲ１＋ＰＯＸと表記する。

（比較例１－１：従来のラテックス凝集試薬の調製）
比較のため、実施例１－１と同様にして、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）を含まない第１試薬（すなわちＰＢＳ溶液）を調製した。これをＲ１と表記する。
また、増感剤として汎用されているノニオン性ポリマーであるＰＥＧ（平均分子量４００，０００、シグマアルドリッチ）、アニオン性ポリマーであるアルギン酸ナトリウム（８０－１２０，和光純薬）（ＳＡ）を濃度０．５ｗ／ｖ％となるようにＰＢＳに溶解することで、比較用の第１試薬としてそれぞれ、Ｒ１＋ＰＥＧ、Ｒ１＋ＳＡを調製した。

＜実施例１－２：ラテックス凝集試薬（第１試薬）の粘度測定＞
本実施例のラテックス凝集試薬（第１試薬）Ｒ１＋ＰＯＸの粘度を測定した。粘度測定はＥ型回転粘度計（ＲＥ－８０，東機産業）により測定した。結果を表１に示す。

（比較例１－２）
比較のために、Ｒ１＋ＰＥＧ、Ｒ１＋ＳＡの粘度測定を行なった。結果を表１に示す。

表１の結果より、同じポリマー濃度溶液において、Ｒ１＋ＰＯＸは、比較例であるＲ１よりも粘度が高くなるが、従来の凝集剤を含む溶液であるＲ１＋ＰＥＧ、Ｒ１＋ＳＡと比較すると粘度は低かった。本実施例のポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）は、同様の性質を有し、同様の分子量のポリマーであるＰＥＧと比べ、溶液の粘度を高めないことがわかった。ＳＡは特に粘度が高くなったが、分子量が数百万であることが推定されるため、分子量の効果も含まれると考えられる。

＜実施例１－３：ラテックス凝集試薬（第１試薬）の粘度測定＞
本実施例のラテックス凝集試薬（第１試薬）Ｒ１＋ＰＯＸについて、ＰＯＸ濃度を変えた時の粘度を測定した。粘度測定はＥ型回転粘度計（ＲＥ－８０，東機産業）により測定した。結果を表２に示す。

（比較例１－３）
比較のために、実施例１－３と同様にして、ポリマー濃度を変えた時のＲ１＋ＰＥＧ、Ｒ１＋ＳＡの粘度測定を行なった。結果を表２に示す。”－”は未測定を表す。

表２の結果より、Ｒ１＋ＰＯＸは、ポリマー濃度が増えるとともに粘度が増加するが、その増加は比較例であるＲ１＋ＰＥＧやＲ１＋ＳＡに比べ、緩やかに粘度が増加することがわかった。本実施例のポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）は、同様のポリマーであるＰＥＧやＳＡと比べ、溶液の粘度を緩やかに調整できるという利点がある。

（実施例２：ラテックス凝集試薬キットの第２試薬の調製例）
２液で構成されるラテックス凝集試薬キットの一例は、検体を希釈するための第１試薬と、抗体感作ラテックスを含む第２試薬からなるものである。ここで、第２試薬の調製例を示す。

（合成例２－１：ＳＧ粒子の合成）
２Ｌの四つ口セパラブルフラスコに１２．０ｇのスチレン（Ｓｔ：キシダ化学工業株式会社）と１７．９ｇのグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ：東京化成工業株式会社）、０．４５ｇのジビニルベンゼン（ＤＶＢ：キシダ化学工業株式会社）、２１６８．６ｇのイオン交換水をはかりとって混合液とした後、この混合液を２００ｒｐｍで撹拌しながら７０℃に保持し、２００ｍｌ／分の流量で窒素フローを行うことで、前記四つ口セパラブルフラスコ内を脱酸素した。次に、別途調整しておいた１．１３ｇのＶ－５０（富士フイルム和光純薬株式会社）を３０ｇのイオン交換水に溶解させた溶解液を前記混合液に加えることで、ソープフリー乳化重合を開始させた。重合開始から２時間後、前記四つ口セパラブルフラスコに３．１ｇのＧＭＡを加え、さらに２２時間、２００ｒｐｍで撹拌しながら７０℃に保持することによって粒状共重合体Ａを含有する水分散液を得た。前記分散液を室温まで徐冷した後にその一部を採取し、プロトンＮＭＲ，ガスクロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーを用いて重合転化率を評価したところ、重合転化率は実質的に１００％であることを確認した。粒状共重合体Ａの乾燥粒径は１５１．４ｎｍ、水中粒径は１６０．２ｎｍであった。粒状共重合体Ａは２．５ｗ／ｖ％の水分散液となるように限外ろ過濃縮、或いはイオン交換水を加えて希釈し、遮光条件下、４℃にて保管した。次に、１００ｍｌ丸底フラスコに２４ｇの粒状共重合体Ａの２．５ｗ／ｖ％水分散液と、３．３ｇのイオン交換水と４０ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）のメルカプトこはく酸（富士フイルム和光純薬株式会社）と０．２１４ｍＬ（２．３４ｍｍｏｌ）の３－メルカプト－１，２－プロパンジオール（富士フイルム和光純薬株式会社）をはかりとり、トリエチルアミン（キシダ化学株式会社）を加えてｐＨ＝１０に調整した。次に、前記丸底フラスコの内容物を２００ｒｐｍで撹拌しながら７０℃に昇温し、さらに１８時間この状態で保持することにより、ＳＧ粒子（以後、「ラテックスＡ粒子」と略す）の分散液を得た。遠心分離機により前記分散液からラテックスＡ粒子を分離し、さらにイオン交換水中にラテックスＡ粒子を再分散する操作を８回繰り返してラテックスＡ粒子を精製し、最終的にラテックスＡ粒子が１．０ｗ／ｖ％になるように調整した水分散液の状態で保管した。保管条件は、遮光条件下、４℃とした。ラテックスＡ粒子の水中粒径は２０２．０ｎｍであった。

（合成例２－２：シロキサンを含むポリスチレン粒子の合成）
５０ｍＭの２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ、東京化成工業社製）緩衝液（ｐＨ７．０）を１５７ｇと、ポリビニルピロリドンＫ－３０（キシダ化学社製、分子量４００００）を１．３ｇとを混合した。次に３－メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（信越化学工業社製 ＬＳ－３３８０）を４ｇ、スチレン（キシダ化学社製）を１３ｇ添加し、その混合物を室温で窒素を吹き込みながら撹拌を１０分間行った。その後オイルバスでフラスコ内の乳濁液を７０℃に加熱した。０．５ｇのペルオキソ二硫酸カリウム（和光純薬工業社製）をイオン交換水に溶かし、得られた溶液を、前記７０℃に加熱した乳濁液中に添加した。７０℃のまま７時間撹拌した後、加温を停止して一晩撹拌し、シロキサンを含むポリスチレン粒子前駆体の分散液を得た。次に、シロキサンを含むポリスチレン粒子前駆体の分散液を遠心分離器にかけ、シロキサンを含むポリスチレン粒子前駆体を回収し、上澄みは捨てた。回収したシロキサンを含むポリスチレン粒子前駆体を、イオン交換水中に再分散した後、遠心分離器にかける操作を複数回繰り返すことで洗浄した。粒子径分析装置（商品名：ゼータサイザー、マルバーン・パナリティカル社製）を用い、動的光散乱により、このようにして得られたシロキサンを含むポリスチレン粒子前駆体の平均粒径を評価したところ、２０３ｎｍであった。次に、シロキサンを含むポリスチレン粒子前駆体０．４ｇを、終濃度１ｗ／ｖ％となるようなＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（東京化成工業社製）、及び、イオン交換水４０ｍＬと混合した。この混合液を室温で１５分間撹拌した後、カルボキシ基を有するシランカップリング剤であるＸ－１２－１１３５（信越化学工業社製）を０．０４ｍＬ添加し一晩室温で撹拌した。続いて、この分散液を遠心分離機にかけ、上澄みは捨てた。回収した粒子を、イオン交換水中に再分散した後、遠心分離器にかける操作を複数回繰り返すことで洗浄した。得られた粒子をシロキサンを含むポリスチレンラテックス粒子（以後、「ラテックスＢ粒子」と略す）とした。

＜実施例２－１：ラテックス凝集試薬キットの第２試薬の調製例＞
公知の方法で、合成例２－１ならびに合成例２－２で得られたラテックスＡ粒子、ラテックスＢ粒子のカルボキシ基をＷＳＣ／ＮＨＳ（水溶性カルボジイミド／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）を用いて、活性化させた。活性化したラテックスＡ粒子、ラテックスＢ粒子の１０ｗ／ｖ％水溶液０．０５ｍＬと抗ヒトＣＲＰポリクローナル抗体（オリエンタル酵母工業（株）製）１ｍｇ／ｍＬを含む５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）０．０５ｍＬとを混合し、室温で１時間反応させた。その後、溶液を遠心分離で洗浄して得られた抗体固定化粒子を、それぞれ、抗体感作ラテックスＡ粒子、抗体感作ラテックスＢ粒子と呼び、その水分散液を抗体感作ラテックスＡ粒子分散液、抗体感作ラテックスＢ粒子分散液と呼び、これらを第２試薬とした。抗体感作ラテックスＡ粒子、抗体感作ラテックスＢ粒子を、それぞれ、Ｒ２－Ａ、Ｒ２－Ｂと呼ぶ。また、市販の粒径２００ｎｍのポリスチレンラテックスＣ粒子（ＪＳＲ社製 ＩＭＭＵＴＥＸ（登録商標） Ｐ０１１３）を用いること、ならびに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）でポストコートを行う以外は、上記と同様にして、調製したものを、抗体感作ラテックスＣ粒子分散液、すなわち第２試薬とした。これをＲ２－Ｃと呼ぶ。

（試料）
人血清に対する非特異反応を確認するために、ＣＲＰフリー人血清（オリエンタル酵母）を用いた。増感効果を確かめるため、感度測定用の抗原溶液として、ＣＲＰ溶液を用いた。ＣＲＰ濃度が、０．５ｍｇ／ｄＬのＣＲＰ溶液を用いた。

＜実施例２－２：ラテックス凝集測定による非特異反応性と増感効果の評価１＞
本実施例のラテックス凝集試薬について、非特異反応性を人血清を用いたラテックス凝集測定により確認した。上記試料におけるＣＲＰフリー人血清の１μＬを、実施例１－１で得た本実施例の上記第１試薬（Ｒ１＋ＰＯＸ）の５０μＬに加えた。これを分光光度計測定セル（光路長１０ｍｍ）に入れて、３７℃で５分間、保持した。次に、本実施例の上記第２試薬（Ｒ２－Ａ溶液）の５０μＬを、前記Ｒ１溶液の５１μＬに加えて十分に混合した。この後、分光光度計を用いて、５７２ｎｍの吸光度を測定した（０分の吸光度とする）。５分後、再び５７２ｎｍの吸光度を測定した（５分後の吸光度とする）。得られた２点の吸光度の差（（５分後の吸光度）－（０分の吸光度））を求め、１０，０００倍にしたものを吸光度変化量と表記する。非特異反応がなければゼロに近くなる。非特異反応が起きれば、数値は高くなる。ここでは、吸光度変化量が１００以上であれば非特異反応が起きたことと定義する。上記の測定方法に従い、Ｒ１＋ＰＯＸの非特異反応を評価した。その結果を、表３～４に示す。ここで非特異反応性とは、上記の非特異反応の程度を意味し、吸光度変化量で表される。

また、本実施例のラテックス凝集試薬における増感効果をＣＲＰのラテックス凝集測定により確認した。上記試料のＣＲＰ濃度が０．５ｍｇ／ｄＬであるＣＲＰ溶液１μＬを、実施例１－１で得た本実施例の上記第１試薬（Ｒ１＋ＰＯＸ）の５０μＬに加えた。これを分光光度計測定セル（光路長１０ｍｍ）に入れて、３７℃で５分間、保持した。次に、本実施例の上記第２試薬（Ｒ２－Ａ溶液）の５０μＬを、前記Ｒ１溶液の５１μＬに加えて十分に混合した。この後、分光光度計を用いて、５７２ｎｍの吸光度を測定した（０分の吸光度とする）。５分後、再び５７２ｎｍの吸光度を測定した（５分後の吸光度とする）。得られた２点の吸光度の差（（５分後の吸光度）－（０分の吸光度））を求め、１０，０００倍にしたものを吸光度変化量と表記する。ＣＲＰと抗体抗原反応による粒子凝集が起きれば、吸光度変化量が高くなる。吸光度変化量が高いほど、感度が高いことを意味する。上記の測定方法に従い、Ｒ１＋ＰＯＸのＣＲＰ測定感度（ＣＲＰ濃度０．５ｍｇ／ｄＬ）を評価した。その結果を、表３に示す。ここでＣＲＰ測定感度とは、ＣＲＰと抗体抗原反応による粒子凝集の程度を意味し、吸光度変化量で表される。

（比較例２－２）
比較のために、実施例２－２と同様にして、Ｒ１＋ＰＥＧ、Ｒ１＋ＳＡの非特異反応性ならびに増感効果を評価した。結果を表３に示す。

表３に、第２試薬をＲ２－Ａ溶液とする、すなわち、不溶性担体としてＳＧ粒子を用い、第１試薬のポリマー濃度を変えた時の、ラテックス凝集測定による非特異反応性と増感効果の評価結果を示す。

Ｒ１＋ＰＯＸは、増感剤を含まないＲ１（比較例）よりも感度が高くなり、ＰＯＸ濃度に依存してＣＲＰ測定感度は向上した。すなわち、ＰＯＸはラテックス凝集試薬の増感剤として機能することが確認された。さらに、Ｒ１＋ＰＯＸは、０．８６６％までの濃度において、人血清に対する非特異反応性は非常に小さかった。一方、比較例のＲ１＋ＰＥＧやＲ１＋ＳＡでは、感度は高くなり増感剤として機能したが、一方で非特異反応が生じた。表中＊で示すように、特に、Ｒ１＋ＳＡでは、反応時のポリマー濃度が０．１８６％以上になると、０分の吸光度の測定時、急激に凝集が起こり、分光光度計の測定上限である吸光度３．０以上（レンジオーバー）となったため、測定が出来なかった（表中に測定不可と示す）。ＰＥＧやアルギン酸では塩による凝集などが起こる可能性があり、また溶液の粘度も高いため、撹拌時の気泡発生や反応再現性などの課題がある。比較例２－２のＲ１＋ＰＥＧやＲ１＋ＳＡの結果と比較すると、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）を含む本実施例のラテックス凝集試薬では、非特異反応が起きない場合を吸光度変化量が１００以下として見ると、最大感度は１０，６００であり、吸光度変化量を高くすることができる。比較例の最大感度は、非特異反応が起きない場合において、ＰＥＧでは３，３１０、ＳＡでは７，０３０であった。

以上の結果より、不溶性担体としてＳＧ粒子を用いた時、本実施例のポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）を含むラテックス凝集試薬を用いると、非特異反応を抑制しながら増感効果を発現することが可能であり、高い感度でラテックス凝集測定が可能になった。

＜実施例２－３：ラテックス凝集測定による非特異反応性と増感効果の評価２＞
実施例２－２と同様にして、第２試薬をＲ２－Ｃ溶液とする、すなわち、不溶性担体としてポリスチレンラテックス粒子を用いた時の、ラテックス凝集測定による非特異反応性と増感効果の評価を行った。
表４に結果を示す。

（比較例２－３）
比較のために、実施例２－３と同様にして、Ｒ１＋ＰＥＧ、Ｒ１＋ＳＡの非特異反応性ならびに増感効果を評価した。結果を表４に示す。

表４に、第２試薬をＲ２－Ｃ溶液とする、すなわち、不溶性担体としてポリスチレンラテックス粒子を用い、第１試薬のポリマー濃度を変えた時の、ラテックス凝集測定による非特異反応性と増感効果の評価結果を示す。

実施例２－２の結果と同様に、第２試薬をＲ２－Ｃ溶液とする、すなわち、不溶性担体としてポリスチレンラテックス粒子を用いた時においても、Ｒ１＋ＰＯＸは、増感剤を含まないＲ１（比較例）よりも感度が高くなり、ＰＯＸ濃度に依存してＣＲＰ測定感度は向上した。すなわち、ＰＯＸはラテックス凝集試薬の増感剤として機能することが確認された。さらに、Ｒ１＋ＰＯＸは、０．８６６％までの濃度において、人血清に対する非特異反応性は示さなかった。一方、比較例２－３のＲ１＋ＰＥＧやＲ１＋ＳＡでは、感度は高くなり増感剤として機能したが、一方で非特異反応が生じた。表中＊で示すように、特に、Ｒ１＋ＳＡでは、反応時のポリマー濃度が０．２４８％以上になる場合、Ｒ１＋ＰＥＧでは、反応時のポリマー濃度が０．４９５％以上になる場合に、０分の吸光度の測定時、急激に凝集が起こり、分光光度計の測定上限である吸光度３．０以上（レンジオーバー）となったため、測定が出来なかった（表中に測定不可と示す）。比較例２－３のＲ１＋ＰＥＧやＲ１＋ＳＡの結果と比較すると、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）を含む本実施例のラテックス凝集試薬では、非特異反応性を吸光度変化量が１００以下として見ると、最大感度は１１，４１０であり、非常に高くすることができる。比較例の最大感度は、ＰＥＧでは５，２４０、ＳＡでは８，２５０であった。

以上の結果より、不溶性担体としてポリスチレンラテックス粒子を用いた時、本実施例のポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）を含むラテックス凝集試薬を用いると、非特異反応を抑制しながら増感効果を発現することが可能であり、高い感度でラテックス凝集測定が可能になった。

＜実施例２－４：測定精度の評価＞
測定精度を評価するために、実施例２－２、２－３と同様に、ラテックス凝集測定による増感効果（ＣＲＰ濃度０．５ｍｇ／ｄＬ）について、繰り返し測定を行った。
第１試薬をＲ１＋ＰＯＸ、第２試薬をＲ２－Ａ溶液、すなわち、不溶性担体としてＳＧ粒子を用いた時の繰り返し測定の結果を表５に示す。
第１試薬をＲ１＋ＰＯＸ、第２試薬をＲ２－Ｃ溶液とする、すなわち、不溶性担体としてポリスチレンラテックス粒子を用いた時の繰り返し測定の結果を表６に示す。

（比較例２－４）
比較のために、実施例２－４と同様にして、第１試薬をＲ１＋ＰＥＧ、Ｒ１＋ＳＡの繰り返し測定を行った。結果を表５、表６に示す。

表５の結果より、比較例に比べて、本実施例のＲ１＋ＰＯＸは変動係数が小さく、不溶性担体としてＳＧ粒子を用いた時の繰り返し測定精度が高いことが分かった。

表６の結果より、比較例に比べて、本実施例のＲ１＋ＰＯＸは変動係数が小さく、不溶性担体としてポリスチレンラテックス粒子を用いた時の繰り返し測定精度が高いことが分かった。

（実施例３：ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）の分子量の効果）
平均分子量が２００，０００であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（シグマアルドリッチ）を、実施例１－１と同様にして、ＰＢＳに溶解させて、本実施例のラテックス凝集試薬Ｒ１＋ＰＯＸ－２００ｋを調製した。平均分子量が５０，０００であるポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（シグマアルドリッチ）を、実施例１－１と同様にして、ＰＢＳに溶解させて、本実施例のラテックス凝集試薬Ｒ１＋ＰＯＸ－５０ｋを調製した。実施例２－２と同様に、ラテックス凝集測定による非特異反応性と増感効果の評価を行った。分子量の効果を確認するため、Ｒ１＋ＰＯＸ（ＰＯＸの平均分子量４００，０００）も同様に評価した。結果を表７に示す。

表７の結果より、本実施例のポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）を含むラテックス凝集試薬において、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）の分子量が大きいほど、増感効果が高くなることが分かった。

（実施例４：ラテックス凝集測定による非特異反応性と増感効果の評価３）
実施例２－２と同様にして、第２試薬をＲ２－Ｂ溶液とする、すなわち、不溶性担体としてシロキサンを含むポリスチレンラテックス粒子を用いた時の、ラテックス凝集測定による非特異反応性と増感効果の評価を行った。
表８に結果を示す。

表８に示すように、第２試薬をＲ２－Ｂ溶液とする、すなわち、不溶性担体としてシロキサンを含むポリスチレンラテックス粒子を用いた時においても、Ｒ１＋ＰＯＸ（第１試薬のポリマー濃度が０．５ｗ／ｖ％であるもの）は、増感剤を含まないＲ１（第１試薬のポリマー濃度が０ｗ／ｖ％であるもの）よりも吸光度変化量が大きくなった。すなわち、ＰＯＸは、シロキサンを含むポリスチレンラテックス粒子を含むラテックス凝集試薬の増感剤として機能することが確認された。

（実施例５：ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）を含んでなるラテックス凝集試薬（第１試薬Ｂ）の調製）
ＰＯＸ（平均分子量４００，０００、シグマアルドリッチ）をＨＥＰＥＳーＴ溶液（ｐＨ７．９、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）に溶解させた。ＰＯＸ濃度を１．５ｗ／ｖ％となるように濃度調整して、本実施例のラテックス凝集試薬（第１試薬Ｂ）とした。以後、この第１試薬をＲ１＋ＰＯＸーＢと表記する。

（比較例５：従来のラテックス凝集試薬の調製）
比較のため、実施例５と同様にして、ＰＯＸを含まない第１試薬（すなわちＨＥＰＥＳーＴ溶液）を調製した。これをＲ１ーＢと表記する。

（実施例６）
＜実施例６－１：ラテックス凝集試薬キットの第２試薬の調製例＞
公知の方法で、市販の粒径１５３ｎｍのポリスチレンラテックスＤ粒子（ＪＳＲ社製 ＩＭＭＵＴＥＸ（登録商標） Ｐ２１１８）を用いて、抗体感作ラテックスＤ粒子分散液、すなわち第２試薬とした。抗体感作は、ポリスチレンラテックスＤ粒子の表面に抗体を物理吸着させ、ＢＳＡでポストコートした。
以下に調製方法の一例を示す。
ポリスチレンラテックスＤ粒子を固形分濃度３％になるように、ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．９）で希釈した。同様のバッファーにて、抗ヒトＣＲＰポリクローナル抗体を希釈し濃度約１．０ｍｇ／ｍｌの抗体溶液を調製した。抗体溶液０．１ｍＬとポリスチレンラテックスＤ粒子０．１ｍＬを混合し、４℃で一晩攪拌した。２００００Ｇで１５分間、遠心分離した後に上清を除去し、沈殿物にブロッキング剤として０．２％ＢＳＡのＨＥＰＥＳ溶液を添加した。室温で６０分間攪拌後、２００００Ｇで１５分間遠心分離して上清を除去した。沈殿物をＨＥＰＥＳーＴ溶液で２回洗浄した後、最終的にラテックス固形分濃度が０．１％となるよう、ＨＥＰＥＳーＴ溶液を添加して再分散し、抗ヒトＣＲＰ抗体結合ラテックス試薬とした。これをＲ２－Ｄと呼ぶ。

＜実施例６－２：ラテックス凝集測定による非特異反応性とＣＲＰ測定の増感効果の評価＞
実施例２－２と同様にして、第１試薬はＲ１＋ＰＯＸーＢを用いて、第２試薬をＲ２－Ｄ溶液とする、すなわち、不溶性担体としてポリスチレンラテックス粒子（抗体を物理吸着させたもの）を用いた時の、ラテックス凝集測定による非特異反応性と増感効果の評価を行った。非特異反応性については、ＣＲＰフリー人血清（ＣＲＰ濃度 ０ ｍｇ／ｄＬ）を、増感効果については、ＣＲＰ濃度が０．５、１、２、４ｍｇ／ｄＬであるＣＲＰ溶液を用いて、実施例２－２と同様にして評価した。表９に結果を示す。

（比較例６）
比較のために、第１試薬をＲ１－Ｂとする以外は、実施例６－２と同様にして、非特異反応性ならびに増感効果を評価した。結果を表９に示す。

表９に示すように、標的物質（測定対象）をＣＲＰとして評価した結果、第２試薬をＲ２－Ｄ溶液とする、すなわち、不溶性担体としてポリスチレンラテックス粒子（抗体を物理吸着させたもの）を用いた時においても、Ｒ１＋ＰＯＸーＢは、増感剤を含まないＲ１－Ｂよりも吸光度変化量が大きくなった。また、非特異反応性も非常に小さかった。すなわち、ＰＯＸは、ポリスチレンラテックス粒子（抗体を物理吸着させたもの）を含むラテックス凝集試薬の増感剤として機能することが確認された。

（実施例７）
＜実施例７－１：ラテックス凝集試薬キットの第２試薬の調製例＞
抗体を抗ヒトフェリチン抗体（ミクリ免疫研究所株式会社製、クローンＮｏ．１３）、最終的なラテックス固形分濃度を０．３％とする以外は、実施例６－１と同様にして、抗体感作ラテックスＤ粒子分散液、すなわち第２試薬とした。これは、抗ヒトフェリチン抗体結合ラテックス試薬であり、これをＲ２－Ｆと呼ぶ。

＜実施例７－２：ラテックス凝集測定による非特異反応性とフェリチン測定の増感効果の評価＞
実施例２－２と同様にして、第１試薬はＲ１＋ＰＯＸーＢを用いて、第２試薬をＲ２－Ｆ溶液とする、すなわち、不溶性担体としてポリスチレンラテックス粒子（抗体を物理吸着させたもの）を用いた時の、ラテックス凝集測定による非特異反応性と増感効果の評価を行った。非特異反応性については、リン酸緩衝生理食塩水（フェリチン濃度 ０ μｇ／ｍｌ）を、増感効果については、フェリチン濃度が１５、１５０μｇ／ｍｌであるフェリチン溶液を検体として用いて評価した。上記検体は１０μＬを、上記第１試薬（Ｒ１＋ＰＯＸーＢ）は１００μＬ、分光光度計測定セルの光路長は２ｍｍ、とする以外は、実施例２－２と同様にして評価した。表１０に結果を示す。

（比較例７）
比較のために、第１試薬をＲ１－Ｂとする以外は、実施例７－２と同様にして、非特異反応性ならびに増感効果を評価した。結果を表１０に示す。

表１０に示すように、第２試薬をＲ２－Ｆ溶液とする、すなわち、不溶性担体としてポリスチレンラテックス粒子（抗体を物理吸着させたもの）を用い、標的物質（測定対象）がフェリチンの時においても、Ｒ１＋ＰＯＸーＢは、増感剤を含まないＲ１－Ｂよりも吸光度変化量が大きくなった。また、非特異反応性も非常に小さかった。すなわち、ＰＯＸは、ポリスチレンラテックス粒子（抗体を物理吸着させたもの）を含むラテックス凝集試薬の増感剤として機能することが確認された。

（実施例８）
＜実施例８－１：ラテックス凝集試薬キットの第２試薬の調製例＞
抗体を抗ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）抗体（ミクリ免疫研究所株式会社製、クローン９Ｇ１１、クローン３Ｆ１０）、最終的なラテックス固形分濃度を０．３％とする以外は、実施例６－１と同様にして、抗体感作ラテックスＤ粒子分散液、すなわち第２試薬とした。これは、抗ヒトＴＳＨ抗体結合ラテックス試薬であり、これをＲ２－Ｔと呼ぶ。

＜実施例８－２：ラテックス凝集測定による非特異反応性とＴＳＨ測定の増感効果の評価＞
実施例２－２と同様にして、第１試薬はＲ１＋ＰＯＸーＢを用いて、第２試薬をＲ２－Ｔ溶液とする、すなわち、不溶性担体としてポリスチレンラテックス粒子（抗体を物理吸着させたもの）を用いた時の、ラテックス凝集測定による非特異反応性と増感効果の評価を行った。非特異反応性については、０．１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＴＳＨ濃度０μｇ／ｍｌ）を、増感効果については、ＴＳＨ濃度が１０μｇ／ｍｌであるＴＳＨ溶液（０．１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水）を検体として用いて評価した。上記検体は２０μＬを、上記第１試薬（Ｒ１＋ＰＯＸーＢ）は１００μＬ、分光光度計測定セルの光路長は２ｍｍ、とする以外は、実施例２－２と同様にして、評価した。表１１に結果を示す。

（比較例８）
比較のために、第１試薬をＲ１－Ｂとする以外は、実施例８－２と同様にして、非特異反応性ならびに増感効果を評価した。結果を表１１に示す。

表１１に示すように、第２試薬をＲ２－Ｔ溶液とする、すなわち、不溶性担体としてポリスチレンラテックス粒子（抗体を物理吸着させたもの）を用い、標的物質（測定対象）がＴＳＨの時においても、Ｒ１＋ＰＯＸーＢは、増感剤を含まないＲ１－Ｂよりも吸光度変化量が大きくなった。また、非特異反応性も非常に小さかった。すなわち、ＰＯＸは、ポリスチレンラテックス粒子（抗体を物理吸着させたもの）を含むラテックス凝集試薬の増感剤として機能することが確認された。

Claims (11)

1. 抗体または抗原を担持させた不溶性担体を用いるラテックス凝集法による検体中の標的物質の測定方法に使用される、
   下記一般式（１）で表される繰り返し単位を有するポリオキサゾリンを含んでなるラテックス凝集反応増感剤。
   

   

   （式（１）中、Ｒは水素原子、メチル基、エチル基、またはプロピル基を表す。ｎは１００以上の整数である。）
2. 前記一般式（１）におけるＲがエチル基である、請求項１に記載のラテックス凝集反応増感剤。
3. 前記ポリオキサゾリンの重量平均分子量が、１０，０００以上１，０００，０００以下である、請求項１または２に記載のラテックス凝集反応増感剤。
4. 請求項１～３のいずれか一項に記載のラテックス凝集反応増感剤と、不溶性担体とを含むラテックス凝集試薬であって、
   前記不溶性担体が、ポリスチレン粒子、シロキサンを有するポリスチレン粒子、およびポリグリシジル（メタ）アクリレートを有するポリスチレン粒子のいずれかであることを特徴とするラテックス凝集試薬。
5. 前記ポリオキサゾリンの濃度が０．０１ｗ／ｖ％以上２．０ｗ／ｖ％以下である、請求項４に記載のラテックス凝集試薬。
6. 請求項４又は５に記載のラテックス凝集試薬を構成成分として含んでなるラテックス凝集試薬キット。
7. 前記ラテックス凝集試薬が少なくとも２成分以上で構成されており、請求項４～６のいずれか一項に記載のラテックス凝集試薬からなる第１試薬と、抗体または抗原を担持させた不溶性担体を含んでなる第２試薬とを少なくとも含んでなる、請求項６に記載のラテックス凝集試薬キット。
8. 前記ポリオキサゾリンの濃度が０．００５ｗ／ｖ％以上１．９ｗ／ｖ％以下の範囲でラテックス凝集法を行うように調製されている、請求項６または７に記載のラテックス凝集試薬キット。
9. 抗体または抗原を担持させた不溶性担体を用いるラテックス凝集法による検体中の標的物質の測定方法であって、請求項４～８のいずれか一項に記載のラテックス凝集試薬あるいはラテックス凝集試薬キットを用いることを特徴とする検体中の標的物質の測定方法。
10. 前記ラテックス凝集試薬あるいは前記ラテックス凝集試薬キット中のポリオキサゾリンの濃度が０．００５ｗ／ｖ％以上１．９ｗ／ｖ％以下の範囲でラテックス凝集法を行うことを特徴とする請求項９に記載のラテックス凝集法による検体中の標的物質の測定方法。
11. 前記不溶性担体が、ポリスチレン粒子、シロキサンを有するポリスチレン粒子、およびポリグリシジル（メタ）アクリレートを有するポリスチレン粒子のいずれかであることを特徴とする、請求項９または１０に記載のラテックス凝集法による検体中の標的物質の測定方法。