CN114712406A - 一种具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，属于益生菌群组合物技术领域，所述益生菌群组合物，按重量份计，由以下成分组成：80‑85份混合菌粉，4‑6份冻干保护剂，2‑5份分散剂，2‑4份表面活性剂，1‑3份改性因子，本发明的益生菌群组合物能够在预防皮肤衰老的同时，避免对益生菌产生依赖和对益生菌产生过敏反应，并且可用于免疫力有问题或者消化道黏膜损坏的人。

Description

一种具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物
技术领域
本发明涉及益生菌群组合物技术领域，具体涉及一种具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物。
背景技术
皮肤衰老通常表现为干燥、脱屑、粗糙、失去光泽且皮肤角质层变薄，皱纹增多，弹性下降，这些变化的潜在原因包括真正的生物老化和环境因素，即内源性老化和外源性老化。内源性老化也被称为自然老化，主要受到遗传、自由基形成、荷尔蒙变化等因素的影响。而外源性老化主要影响因素为紫外线辐射、大气污染、创伤、感染和吸烟等。最近研究表明，压力也会一定程度上导致皮肤老化。
在生物化学和分子机制上讲，皮肤衰老是一个非常复杂的过程，其中涉及大量的生化、分子和细胞变化，包括皮肤菌群的改变、皮肤pH值的升高、角质层脂质水平的降低、氧化应激异常、胶原蛋白水平的降低和免疫应答的改变等。
益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物，通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。益生菌能够通过清除DPPH自由基、羟自由基和其他有害物质，产生超氧化物歧化酶，从而预防皮肤衰老。
但是现有的益生菌存在以下缺点：使用益生菌会引起依赖性，当停用益生菌时，会引起肠道功能紊乱，加剧皮肤衰老；对于免疫力有问题或者消化道黏膜破坏的人，益生菌不仅不会预防皮肤衰老，还会造成感染，诱发炎症；益生菌会造成免疫系统失衡，引起过敏反应。
目前，还没有能够解决上述问题的方法，从而限制了益生菌在预防皮肤衰老方向的应用。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，能够在预防皮肤衰老的同时，避免对益生菌产生依赖和对益生菌产生过敏反应，并且可用于免疫力有问题或者消化道黏膜损坏的人。
为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，按重量份计，由以下成分组成：80-85份混合菌粉，4-6份冻干保护剂，2-5份分散剂，2-4份表面活性剂，1-3份改性因子。
所述混合菌粉的制备方法，由以下步骤组成：制备种子液、制备发酵液、改性干燥。
所述制备种子液的方法为，分别将冷冻保存的乳双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌在固体LB平板上划线进行活化，然后分别从LB平板中挑选单菌落接种于装有100mL液体培养基的250mL锥形瓶中，将250mL锥形瓶放入摇床进行摇床培养，控制摇床培养的温度为36-38℃，转速为220-250rpm，时间为15-16h，摇床培养结束后分别得到乳双歧杆菌种子液、动物双歧杆菌种子液、青春双歧杆菌种子液、长双歧杆菌种子液、婴儿双歧杆菌种子液、短双歧杆菌种子液；
所述液体培养基，由以下成分组成：3-5g/L葡萄糖，2-3g/L胰蛋白胨，0.3-0.5g/L磷酸氢二钠，0.2-0.5g/L磷酸二氢钠，剩余为去离子水；
所述制备发酵液的方法为，分别将乳双歧杆菌种子液、动物双歧杆菌种子液、青春双歧杆菌种子液、长双歧杆菌种子液、婴儿双歧杆菌种子液、短双歧杆菌种子液依次接种于同一MRS液体培养基中，控制乳双歧杆菌种子液的接种量为2-3%，动物双歧杆菌的接种量为1-3%，青春双歧杆菌的接种量为1-2%，长双歧杆菌的接种量为2-4%，婴儿双歧杆菌的接种量为1-2%，短双歧杆菌的接种量为1-3%，接种完成后进行搅拌发酵培养，控制搅拌发酵培养的温度为37-38℃，转速为320-350rpm，通气量为1.5-2vvm，时间为18-20h，搅拌发酵培养结束得到发酵液；
所述MRS液体培养基，由以下成分组成：5-7g/L胰蛋白胨，4-7g/L葡萄糖，4-6g/L酵母膏，2-3g/L牛肉膏，1-3g/L柠檬酸钠，剩余为去离子水。
所述改性干燥的方法为，将发酵液、壳聚糖、大豆磷脂混合后在35-40℃下以300-350rpm的搅拌速度搅拌25-30min，得到改性发酵液，对改性发酵液进行离心分离，控制离心分离时的转速为2600-2800rpm，时间为4-5min，离心分离结束后得到的固相物作为菌泥，对菌泥进行真空冷冻干燥处理，控制真空冷冻干燥处理的温度为-35℃至-30℃，真空度为700-900Pa，处理时间为45-50min，真空冷冻干燥结束得到初级混合菌粉，将初级混合菌粉；将初级混合菌粉置于反应器中，将反应器的温度控制到20-25℃，按照2.5-3L/min的体积流量依次切换通入N2 5-7min、CO2 10-13min、干空气 17-20min、N2 6-8min进行活化，活化结束得到混合菌粉；
所述混合菌粉中的益生菌的总数量为4.0×1010-4.5×1010cfu/g；
所述改性干燥中，发酵液、壳聚糖、大豆磷脂的重量比为40-45:3-5:4-5。
所述冻干保护剂的制备方法为：将蔗糖、麦芽糊精、谷氨酸钠、氯化钠混合后置于球磨机中进行第一次球磨，控制第一次球磨时的球料比为18-20:1，转速为300-350rpm，第一次球磨时间为40-50min，第一次球磨结束后进行低温等离子处理，控制低温等离子处理中的处理温度为8-10℃，处理功率为280-320W，处理时间为6-8min，低温等离子处理结束后得到初级冻干保护剂，将初级冻干保护剂、海藻糖、枸杞多糖混合后置于球磨机中进行第二次球磨，控制第二次球磨时的球料比为15-18:1，转速为350-400rpm，第二次球磨时间为50-55min，第二次球磨结束后得到冻干保护剂；
所述冻干保护剂的制备中，蔗糖、麦芽糊精、谷氨酸钠、氯化钠的重量比为6-8:3-4:1-3:0.1-0.4；
所述冻干保护剂的制备中，初级冻干保护剂、海藻糖、枸杞多糖的重量比为40-45:2-3:3-5。
所述分散剂的制备方法为：将柠檬酸钠、低聚半乳糖、硬脂酰乳酸钙混合后置于球磨机中进行球磨，控制球磨时的球料比为10-12:1，转速为300-350rpm，球磨时间为45-50min，球磨结束后进行紫外照射，控制紫外照射中紫外线的波长为250-280nm，紫外照射的时间为35-40min，紫外照射结束得到分散剂；
所述分散剂的制备中，柠檬酸钠、低聚半乳糖、硬脂酰乳酸钙的重量比为20-24:3-4:1-2。
所述表面活性剂的制备方法为：将甜菜碱、单甘酯、柠檬酸、卡拉胶混合后置于球磨机中进行球磨，控制球磨时的球料比为12-15:1，转速为350-400rpm，球磨时间为40-45min，球磨结束后得到表面活性剂；
所述表面活性剂的制备中，甜菜碱、单甘酯、柠檬酸、卡拉胶的重量比为7-10:3-5:4-6:1-3。
所述改性因子的制备方法为：将微晶纤维素、山梨糖醇、环糊精混合均匀后置于温度为40-45℃，湿度为85-90%的环境下静置40-45min，然后进行真空冷冻干燥，控制真空冷冻干燥处理的温度为-40℃至-35℃，真空度为100-120Pa，处理时间为1-1.2h，真空冷冻干燥结束得到初级改性因子，然后将对初级改性因子进行低温等离子体照射，控制低温等离子体照射中的作用气氛为氮气，电压为30-40kV，照射时间为30-35min，低温等离子体照射结束得到改性因子；
所述改性因子的制备中，微晶纤维素、山梨糖醇、环糊精的重量比为25-30:7-9:2-4。
一种具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物的制备方法，具体为：将混合菌粉、冻干保护剂、分散剂、表面活性剂、改性因子混合后进行机械振荡，控制机械振动中的频率为200-250rpm，时间为15-20min，机械振荡结束后进行真空冷冻干燥，控制真空冷冻干燥处理的温度为-40℃至-35℃，真空度为800-900Pa，处理时间为35-40min，真空冷冻干燥结束得到预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本发明的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，能够预防皮肤衰老，DPPH自由基清除率能达到83.5-84.3%，羟自由基清除率能达到92.0-92.8%，对雌性昆明小鼠进行试验，连续饲喂60d后，小鼠皮肤HYP含量为4.45-4.57µg/mg；
（2）本发明的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，能够预防皮肤衰老，能够降低对益生菌的过敏现象，对雌性昆明小鼠进行试验，连续饲喂60d后，小鼠无皮肤过敏现象；
（3）本发明的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，能够避免对益生菌产生依赖，对雌性昆明小鼠进行试验，连续饲喂60d后，停止使用益生菌群组合物，并继续饲养30d后，小鼠皮肤HYP含量仍能达到4.01-4.10µg/mg；
（4）本发明的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，能够适用于免疫力抑制人群，对雌性昆明小鼠进行试验，通过腹腔注射的方式对每只小鼠注射三次环孢菌素A溶液后，连续饲喂60d益生菌群组合物，小鼠皮肤HYP含量能达到4.11-4.24µg/mg；
（5）本发明的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，能够适用于消化道黏膜损坏的人群，使用添加酒精的液体饲料连续饲喂8周后，连续饲喂60d益生菌群组合物，小鼠皮肤HYP含量能达到4.01-4.18µg/mg。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现说明本发明的具体实施方式。
实施例1
一种具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，按重量份计，由以下成分组成：80份混合菌粉，4份冻干保护剂，2份分散剂，2份表面活性剂，1份改性因子。
所述混合菌粉的制备方法，由以下步骤组成：制备种子液、制备发酵液、改性干燥。
所述制备种子液的方法为，分别将冷冻保存的乳双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌在固体LB平板上划线进行活化，然后分别从LB平板中挑选单菌落接种于装有100mL液体培养基的250mL锥形瓶中，将250mL锥形瓶放入摇床进行摇床培养，控制摇床培养的温度为36℃，转速为220rpm，时间为15h，摇床培养结束后分别得到乳双歧杆菌种子液、动物双歧杆菌种子液、青春双歧杆菌种子液、长双歧杆菌种子液、婴儿双歧杆菌种子液、短双歧杆菌种子液；
所述液体培养基，由以下成分组成：3g/L葡萄糖，2g/L胰蛋白胨，0.3g/L磷酸氢二钠，0.2g/L磷酸二氢钠，剩余为去离子水；
所述制备发酵液的方法为，分别将乳双歧杆菌种子液、动物双歧杆菌种子液、青春双歧杆菌种子液、长双歧杆菌种子液、婴儿双歧杆菌种子液、短双歧杆菌种子液依次接种于同一MRS液体培养基中，控制乳双歧杆菌种子液的接种量为2%，动物双歧杆菌的接种量为1%，青春双歧杆菌的接种量为1%，长双歧杆菌的接种量为2%，婴儿双歧杆菌的接种量为1%，短双歧杆菌的接种量为1%，接种完成后进行搅拌发酵培养，控制搅拌发酵培养的温度为37℃，转速为320rpm，通气量为1.5vvm，时间为18h，搅拌发酵培养结束得到发酵液；
所述MRS液体培养基，由以下成分组成：5g/L胰蛋白胨，4g/L葡萄糖，4g/L酵母膏，2g/L牛肉膏，1g/L柠檬酸钠，剩余为去离子水。
所述改性干燥的方法为，将发酵液、壳聚糖、大豆磷脂混合后在35℃下以300rpm的搅拌速度搅拌25min，得到改性发酵液，对改性发酵液进行离心分离，控制离心分离时的转速为2600rpm，时间为4min，离心分离结束后得到的固相物作为菌泥，对菌泥进行真空冷冻干燥处理，控制真空冷冻干燥处理的温度为-35℃，真空度为700Pa，处理时间为45min，真空冷冻干燥结束得到初级混合菌粉，将初级混合菌粉；将初级混合菌粉置于反应器中，将反应器的温度控制到20℃，按照2.5L/min的体积流量依次切换通入N2 5min、CO2 10min、干空气17min、N2 6min进行活化，活化结束得到混合菌粉；
所述混合菌粉中的益生菌的总数量为4.0×1010cfu/g；
其中，发酵液、壳聚糖、大豆磷脂的重量比为40:3:4。
所述冻干保护剂的制备方法为：将蔗糖、麦芽糊精、谷氨酸钠、氯化钠混合后置于球磨机中进行第一次球磨，控制第一次球磨时的球料比为18:1，转速为300rpm，第一次球磨时间为40min，第一次球磨结束后进行低温等离子处理，控制低温等离子处理中的处理温度为8℃，处理功率为280W，处理时间为6min，低温等离子处理结束后得到初级冻干保护剂，将初级冻干保护剂、海藻糖、枸杞多糖混合后置于球磨机中进行第二次球磨，控制第二次球磨时的球料比为15:1，转速为350rpm，第二次球磨时间为50min，第二次球磨结束后得到冻干保护剂；
其中，蔗糖、麦芽糊精、谷氨酸钠、氯化钠的重量比为6:3:1:0.1；
初级冻干保护剂、海藻糖、枸杞多糖的重量比为40:2:3。
所述分散剂的制备方法为：将柠檬酸钠、低聚半乳糖、硬脂酰乳酸钙混合后置于球磨机中进行球磨，控制球磨时的球料比为10:1，转速为300rpm，球磨时间为45min，球磨结束后进行紫外照射，控制紫外照射中紫外线的波长为250nm，紫外照射的时间为35min，紫外照射结束得到分散剂；
其中，柠檬酸钠、低聚半乳糖、硬脂酰乳酸钙的重量比为20:3:1。
所述表面活性剂的制备方法为：将甜菜碱、单甘酯、柠檬酸、卡拉胶混合后置于球磨机中进行球磨，控制球磨时的球料比为12:1，转速为350rpm，球磨时间为40min，球磨结束后得到表面活性剂；
其中，甜菜碱、单甘酯、柠檬酸、卡拉胶的重量比为7:3:4:1。
所述改性因子的制备方法为：将微晶纤维素、山梨糖醇、环糊精混合均匀后置于温度为40℃，湿度为85%的环境下静置40min，然后进行真空冷冻干燥，控制真空冷冻干燥处理的温度为-40℃，真空度为100Pa，处理时间为1h，真空冷冻干燥结束得到初级改性因子，然后将对初级改性因子进行低温等离子体照射，控制低温等离子体照射中的作用气氛为氮气，电压为30kV，照射时间为30min，低温等离子体照射结束得到改性因子；
其中，微晶纤维素、山梨糖醇、环糊精的重量比为25:7:2。
一种具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物的制备方法，具体为：将混合菌粉、冻干保护剂、分散剂、表面活性剂、改性因子混合后进行机械振荡，控制机械振动中的频率为200rpm，时间为15min，机械振荡结束后进行真空冷冻干燥，控制真空冷冻干燥处理的温度为-40℃，真空度为800Pa，处理时间为35min，真空冷冻干燥结束得到预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物。
实施例2
一种具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，按重量份计，由以下成分组成：82份混合菌粉，5份冻干保护剂，3份分散剂，3份表面活性剂，2份改性因子。
所述混合菌粉的制备方法，由以下步骤组成：制备种子液、制备发酵液、改性干燥。
所述制备种子液的方法为，分别将冷冻保存的乳双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌在固体LB平板上划线进行活化，然后分别从LB平板中挑选单菌落接种于装有100mL液体培养基的250mL锥形瓶中，将250mL锥形瓶放入摇床进行摇床培养，控制摇床培养的温度为37℃，转速为230rpm，时间为15.5h，摇床培养结束后分别得到乳双歧杆菌种子液、动物双歧杆菌种子液、青春双歧杆菌种子液、长双歧杆菌种子液、婴儿双歧杆菌种子液、短双歧杆菌种子液；
所述液体培养基，由以下成分组成：4g/L葡萄糖，2.5g/L胰蛋白胨，0.4g/L磷酸氢二钠，0.3g/L磷酸二氢钠，剩余为去离子水；
所述制备发酵液的方法为，分别将乳双歧杆菌种子液、动物双歧杆菌种子液、青春双歧杆菌种子液、长双歧杆菌种子液、婴儿双歧杆菌种子液、短双歧杆菌种子液依次接种于同一MRS液体培养基中，控制乳双歧杆菌种子液的接种量为2.5%，动物双歧杆菌的接种量为2%，青春双歧杆菌的接种量为1.5%，长双歧杆菌的接种量为3%，婴儿双歧杆菌的接种量为1.5%，短双歧杆菌的接种量为2%，接种完成后进行搅拌发酵培养，控制搅拌发酵培养的温度为37.5℃，转速为330rpm，通气量为1.7vvm，时间为19h，搅拌发酵培养结束得到发酵液；
所述MRS液体培养基，由以下成分组成：6g/L胰蛋白胨，5g/L葡萄糖，5g/L酵母膏，2.5g/L牛肉膏，2g/L柠檬酸钠，剩余为去离子水。
所述改性干燥的方法为，将发酵液、壳聚糖、大豆磷脂混合后在37℃下以320rpm的搅拌速度搅拌27min，得到改性发酵液，对改性发酵液进行离心分离，控制离心分离时的转速为2700rpm，时间为4.5min，离心分离结束后得到的固相物作为菌泥，对菌泥进行真空冷冻干燥处理，控制真空冷冻干燥处理的温度为-32℃，真空度为800Pa，处理时间为47min，真空冷冻干燥结束得到初级混合菌粉，将初级混合菌粉；将初级混合菌粉置于反应器中，将反应器的温度控制到22℃，按照2.7L/min的体积流量依次切换通入N2 6min、CO2 12min、干空气 18min、N2 7min进行活化，活化结束得到混合菌粉；
所述混合菌粉中的益生菌的总数量为4.2×1010cfu/g；
其中，发酵液、壳聚糖、大豆磷脂的重量比为42:4:4.5。
所述冻干保护剂的制备方法为：将蔗糖、麦芽糊精、谷氨酸钠、氯化钠混合后置于球磨机中进行第一次球磨，控制第一次球磨时的球料比为19:1，转速为320rpm，第一次球磨时间为45min，第一次球磨结束后进行低温等离子处理，控制低温等离子处理中的处理温度为9℃，处理功率为300W，处理时间为7min，低温等离子处理结束后得到初级冻干保护剂，将初级冻干保护剂、海藻糖、枸杞多糖混合后置于球磨机中进行第二次球磨，控制第二次球磨时的球料比为16:1，转速为370rpm，第二次球磨时间为52min，第二次球磨结束后得到冻干保护剂；
其中，蔗糖、麦芽糊精、谷氨酸钠、氯化钠的重量比为7:3.5:2:0.3；
初级冻干保护剂、海藻糖、枸杞多糖的重量比为42:2.5:4。
所述分散剂的制备方法为：将柠檬酸钠、低聚半乳糖、硬脂酰乳酸钙混合后置于球磨机中进行球磨，控制球磨时的球料比为11:1，转速为320rpm，球磨时间为47min，球磨结束后进行紫外照射，控制紫外照射中紫外线的波长为260nm，紫外照射的时间为37min，紫外照射结束得到分散剂；
其中，柠檬酸钠、低聚半乳糖、硬脂酰乳酸钙的重量比为22:3.5:1.5。
所述表面活性剂的制备方法为：将甜菜碱、单甘酯、柠檬酸、卡拉胶混合后置于球磨机中进行球磨，控制球磨时的球料比为13:1，转速为370rpm，球磨时间为42min，球磨结束后得到表面活性剂；
其中，甜菜碱、单甘酯、柠檬酸、卡拉胶的重量比为9:4:5:2。
所述改性因子的制备方法为：将微晶纤维素、山梨糖醇、环糊精混合均匀后置于温度为42℃，湿度为87%的环境下静置42min，然后进行真空冷冻干燥，控制真空冷冻干燥处理的温度为-37℃，真空度为110Pa，处理时间为1.1h，真空冷冻干燥结束得到初级改性因子，然后将对初级改性因子进行低温等离子体照射，控制低温等离子体照射中的作用气氛为氮气，电压为35kV，照射时间为32min，低温等离子体照射结束得到改性因子；
其中，微晶纤维素、山梨糖醇、环糊精的重量比为27:8:3。
一种具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物的制备方法，具体为：将混合菌粉、冻干保护剂、分散剂、表面活性剂、改性因子混合后进行机械振荡，控制机械振动中的频率为220rpm，时间为17min，机械振荡结束后进行真空冷冻干燥，控制真空冷冻干燥处理的温度为-37℃，真空度为850Pa，处理时间为37min，真空冷冻干燥结束得到预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物。
实施例3
一种具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，按重量份计，由以下成分组成：85份混合菌粉，6份冻干保护剂，5份分散剂，4份表面活性剂，3份改性因子。
所述混合菌粉的制备方法，由以下步骤组成：制备种子液、制备发酵液、改性干燥。
所述制备种子液的方法为，分别将冷冻保存的乳双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌在固体LB平板上划线进行活化，然后分别从LB平板中挑选单菌落接种于装有100mL液体培养基的250mL锥形瓶中，将250mL锥形瓶放入摇床进行摇床培养，控制摇床培养的温度为38℃，转速为250rpm，时间为16h，摇床培养结束后分别得到乳双歧杆菌种子液、动物双歧杆菌种子液、青春双歧杆菌种子液、长双歧杆菌种子液、婴儿双歧杆菌种子液、短双歧杆菌种子液；
所述液体培养基，由以下成分组成：5g/L葡萄糖，3g/L胰蛋白胨，0.5g/L磷酸氢二钠，0.5g/L磷酸二氢钠，剩余为去离子水；
所述制备发酵液的方法为，分别将乳双歧杆菌种子液、动物双歧杆菌种子液、青春双歧杆菌种子液、长双歧杆菌种子液、婴儿双歧杆菌种子液、短双歧杆菌种子液依次接种于同一MRS液体培养基中，控制乳双歧杆菌种子液的接种量为3%，动物双歧杆菌的接种量为3%，青春双歧杆菌的接种量为2%，长双歧杆菌的接种量为4%，婴儿双歧杆菌的接种量为2%，短双歧杆菌的接种量为3%，接种完成后进行搅拌发酵培养，控制搅拌发酵培养的温度为38℃，转速为350rpm，通气量为2vvm，时间为20h，搅拌发酵培养结束得到发酵液；
所述MRS液体培养基，由以下成分组成：7g/L胰蛋白胨，7g/L葡萄糖，6g/L酵母膏，3g/L牛肉膏，3g/L柠檬酸钠，剩余为去离子水。
所述改性干燥的方法为，将发酵液、壳聚糖、大豆磷脂混合后在40℃下以350rpm的搅拌速度搅拌30min，得到改性发酵液，对改性发酵液进行离心分离，控制离心分离时的转速为2800rpm，时间为5min，离心分离结束后得到的固相物作为菌泥，对菌泥进行真空冷冻干燥处理，控制真空冷冻干燥处理的温度为-30℃，真空度为900Pa，处理时间为50min，真空冷冻干燥结束得到初级混合菌粉，将初级混合菌粉；将初级混合菌粉置于反应器中，将反应器的温度控制到25℃，按照3L/min的体积流量依次切换通入N2 7min、CO2 13min、干空气20min、N2 8min进行活化，活化结束得到混合菌粉；
所述混合菌粉中的益生菌的总数量为4.5×1010cfu/g；
其中，发酵液、壳聚糖、大豆磷脂的重量比为45:5:5。
所述冻干保护剂的制备方法为：将蔗糖、麦芽糊精、谷氨酸钠、氯化钠混合后置于球磨机中进行第一次球磨，控制第一次球磨时的球料比为20:1，转速为350rpm，第一次球磨时间为50min，第一次球磨结束后进行低温等离子处理，控制低温等离子处理中的处理温度为10℃，处理功率为320W，处理时间为8min，低温等离子处理结束后得到初级冻干保护剂，将初级冻干保护剂、海藻糖、枸杞多糖混合后置于球磨机中进行第二次球磨，控制第二次球磨时的球料比为18:1，转速为400rpm，第二次球磨时间为55min，第二次球磨结束后得到冻干保护剂；
其中，蔗糖、麦芽糊精、谷氨酸钠、氯化钠的重量比为8:4:3:0.4；
初级冻干保护剂、海藻糖、枸杞多糖的重量比为45:3:5。
所述分散剂的制备方法为：将柠檬酸钠、低聚半乳糖、硬脂酰乳酸钙混合后置于球磨机中进行球磨，控制球磨时的球料比为12:1，转速为350rpm，球磨时间为50min，球磨结束后进行紫外照射，控制紫外照射中紫外线的波长为280nm，紫外照射的时间为40min，紫外照射结束得到分散剂；
其中，柠檬酸钠、低聚半乳糖、硬脂酰乳酸钙的重量比为24:4:2。
所述表面活性剂的制备方法为：将甜菜碱、单甘酯、柠檬酸、卡拉胶混合后置于球磨机中进行球磨，控制球磨时的球料比为15:1，转速为400rpm，球磨时间为45min，球磨结束后得到表面活性剂；
其中，甜菜碱、单甘酯、柠檬酸、卡拉胶的重量比为10:5:6:3。
所述改性因子的制备方法为：将微晶纤维素、山梨糖醇、环糊精混合均匀后置于温度为45℃，湿度为90%的环境下静置45min，然后进行真空冷冻干燥，控制真空冷冻干燥处理的温度为-35℃，真空度为120Pa，处理时间为1.2h，真空冷冻干燥结束得到初级改性因子，然后将对初级改性因子进行低温等离子体照射，控制低温等离子体照射中的作用气氛为氮气，电压为40kV，照射时间为35min，低温等离子体照射结束得到改性因子；
其中，微晶纤维素、山梨糖醇、环糊精的重量比为30:9:4。
一种具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物的制备方法，具体为：将混合菌粉、冻干保护剂、分散剂、表面活性剂、改性因子混合后进行机械振荡，控制机械振动中的频率为250rpm，时间为20min，机械振荡结束后进行真空冷冻干燥，控制真空冷冻干燥处理的温度为35℃，真空度为900Pa，处理时间为40min，真空冷冻干燥结束得到预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物。
对比例1
采用实施例1所述的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物的原料、制备方法及原料的制备方法，其不同之处在于：混合菌粉的制备中，改性干燥步骤中省略活化步骤，即直接将初级混合菌粉作为混合菌粉使用。
对比例2
采用实施例1所述的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物的原料、制备方法及原料的制备方法，其不同之处在于：省略分散剂的加入。
对比例3
采用实施例1所述的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物的原料、制备方法及原料的制备方法，其不同之处在于：省略表面活性剂的加入。
对比例4
采用实施例1所述的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物的原料、制备方法及原料的制备方法，其不同之处在于：省略改性因子的加入。
试验例1
配制40mL 0.2mmol/L DPPH的无水乙醇溶液，平分为8份，每份5mL，标记为A1-A8号溶液，然后分别向A1-A7号溶液中加入0.2g实施例1-3和对比例1-4制备的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，对应关系如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
A8号溶液不作任何处理，作为空白对照液；
待充分混匀后，分别于25±2℃下避光反应30min，然后分别进行离心分离，控制离心分离时的转速为10000rpm，时间为2min，离心分离结束后分别取上清液，作为A1-A7号处理液，然后分别测定A1-A7号处理液和空白对照液在517nm处的吸光度，得到A1-A7号处理液的吸光度和空白对照液的吸光度，然后按照下面的计算公式计算DPPH自由基的清除率：
DPPH自由基清除率=（处理液的吸光度-空白对照液的吸光度）/空白对照液的吸光度×100%
计算结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
试验例2
将8mL pH为7.4的摩尔浓度为0.025mol/L的磷酸缓冲液，8mL质量体积浓度为40µg/mL的番茄花红溶液，8mL质量分数为3%的过氧化氢溶液，8mL摩尔浓度为0.945mmol/L的Fe(II)-EDTA溶液混合均匀后得到待处理液，将待处理液平分为8份，每份4mL，标记为B1-B8号溶液，然后分别向B1-B7号中加入0.2g实施例1-3和对比例1-4制备的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，对应关系如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
B8号溶液不作任何处理，作为空白对照液；
待充分混匀后，分别于35±2℃下反应30min后，得到B1-B7号处理液，然后分别测定B1-B7号处理液和空白对照液在520nm处的吸光度，得到B1-B7号处理液的吸光度和空白对照液的吸光度，然后按照下面的计算公式计算羟自由基清除率：
羟自由基清除率=（处理液的吸光度-空白对照液的吸光度）/空白对照液的吸光度×100%
计算结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
试验例3
按照实施例1-3和对比例1-4的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物的组成及各原料的制备方法，分别制备出益生菌群组合物后密封保存且保证1个月内使用，然后进行小鼠试验，试验方法及结果如下：
选择160只SPF级12-13周龄的雌性昆明小鼠，平分为8组，编号C1-C8组，每组20只，均饲喂于同一动物房，保证动物房内的温度为24±2℃，湿度为60±2%，动物自由进食，对雌性昆明小鼠进行7d适应性饲养，然后分别对C1-C8组饲喂实施例1-3和对比例1-4的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，具体对应关系如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
C8组作为空白对照，不进行任何饲喂。
每天每只小鼠的饲喂量为0.5g，连续饲喂60d后，每组取2只小鼠，将小鼠背后毛发剪短，再用剃须刀剃毛，然后分别选取背部皮肤组织0.5g，用冰浴预冷的生理盐水漂洗后，用滤纸擦干，加入冰浴预冷的生理盐水，使用匀浆器研磨成浓度为10%的匀浆液，然后将得到的匀浆液在温度为0℃，转速为3000rpm下离心10min，取上清液，使用超微量微孔板分光光度计测定吸光度，计算各实验组小鼠皮肤HYP含量，计算结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
同时观察每只小鼠的皮肤过敏情况，统计每组小鼠的皮肤过敏小鼠的数量，统计结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
然后将剩余的未进行皮肤HYP含量测试的小鼠进行继续饲养30d，继续饲养期间不饲喂任何益生菌群组合物，继续饲养结束后，每组选取2只小鼠，继续选取背部皮肤组织0.5g，按照上述方法处理后使用超微量微孔板分光光度计测定吸光度，计算各实验组小鼠皮肤HYP含量，计算结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
试验例4
按照实施例1-3和对比例1-4的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物的组成及各原料的制备方法，分别制备出益生菌群组合物后密封保存且保证1个月内使用，然后进行小鼠试验，试验方法及结果如下：
选择160只SPF级12-13周龄的雌性昆明小鼠，平分为8组，编号D1-D8组，每组20只，均饲喂于同一动物房，保证动物房内的温度为24±2℃，湿度为60±2%，动物自由进食，对雌性昆明小鼠进行7d适应性饲养后，通过腹腔注射的方式对每只小鼠注射质量浓度为100g/ml的环孢菌素A溶液，每次的注射剂量为40mg/kg小鼠体重，隔天注射一次，总共注射三次；注射结束后分别对D1-D8组饲喂实施例1-3和对比例1-4的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，具体对应关系如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
D8组作为空白对照，不进行任何饲喂。
每天每只小鼠的饲喂量为0.5g，连续饲喂60d后，每组取2只小鼠，将小鼠背后毛发剪短，再用剃须刀剃毛，然后分别选取背部皮肤组织0.5g，用冰浴预冷的生理盐水漂洗后，用滤纸擦干，加入冰浴预冷的生理盐水，使用匀浆器研磨成浓度为10%的匀浆液，然后将得到的匀浆液在温度为0℃，转速为3000rpm下离心10min，取上清液，使用超微量微孔板分光光度计测定吸光度，计算各实验组小鼠皮肤HYP含量，计算结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
试验例5
按照实施例1-3和对比例1-4的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物的组成及各原料的制备方法，分别制备出益生菌群组合物后密封保存且保证1个月内使用，然后进行小鼠试验，试验方法及结果如下：
选择160只SPF级12-13周龄的雌性昆明小鼠，平分为8组，编号E1-E8组，每组20只，均饲喂于同一动物房，保证动物房内的温度为24±2℃，湿度为60±2%，动物自由进食液体饲料，对雌性昆明小鼠进行7d液体饲料的适应性饲养后，向小鼠的液体饲料中添加酒精，控制酒精在液体饲料中的体积浓度为25%，连续饲喂8周后分别对E1-E8组饲喂实施例1-3和对比例1-4的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，具体对应关系如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
E8组作为空白对照，不进行任何饲喂。
每天每只小鼠的饲喂量为0.5g，连续饲喂60d后，每组取2只小鼠，将小鼠背后毛发剪短，再用剃须刀剃毛，然后分别选取背部皮肤组织0.5g，用冰浴预冷的生理盐水漂洗后，用滤纸擦干，加入冰浴预冷的生理盐水，使用匀浆器研磨成浓度为10%的匀浆液，然后将得到的匀浆液在温度为0℃，转速为3000rpm下离心10min，取上清液，使用超微量微孔板分光光度计测定吸光度，计算各实验组小鼠皮肤HYP含量，计算结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，其特征在于，按重量份计，由以下成分组成：80-85份混合菌粉，4-6份冻干保护剂，2-5份分散剂，2-4份表面活性剂，1-3份改性因子；
所述混合菌粉的制备方法，由以下步骤组成：制备种子液、制备发酵液、改性干燥；
所述制备种子液的方法为，分别将冷冻保存的乳双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌在固体LB平板上划线进行活化，然后分别从LB平板中挑选单菌落接种于装有100mL液体培养基的250mL锥形瓶中，将250mL锥形瓶放入摇床进行摇床培养，控制摇床培养的温度为36-38℃，转速为220-250rpm，时间为15-16h，摇床培养结束后分别得到乳双歧杆菌种子液、动物双歧杆菌种子液、青春双歧杆菌种子液、长双歧杆菌种子液、婴儿双歧杆菌种子液、短双歧杆菌种子液；
所述制备发酵液的方法为，分别将乳双歧杆菌种子液、动物双歧杆菌种子液、青春双歧杆菌种子液、长双歧杆菌种子液、婴儿双歧杆菌种子液、短双歧杆菌种子液依次接种于同一MRS液体培养基中，控制乳双歧杆菌种子液的接种量为2-3%，动物双歧杆菌的接种量为1-3%，青春双歧杆菌的接种量为1-2%，长双歧杆菌的接种量为2-4%，婴儿双歧杆菌的接种量为1-2%，短双歧杆菌的接种量为1-3%，接种完成后进行搅拌发酵培养，控制搅拌发酵培养的温度为37-38℃，转速为320-350rpm，通气量为1.5-2vvm，时间为18-20h，搅拌发酵培养结束得到发酵液；
所述MRS液体培养基，由以下成分组成：5-7g/L胰蛋白胨，4-7g/L葡萄糖，4-6g/L酵母膏，2-3g/L牛肉膏，1-3g/L柠檬酸钠，剩余为去离子水；
所述改性干燥的方法为，将发酵液、壳聚糖、大豆磷脂混合后在35-40℃下搅拌25-30min，得到改性发酵液，对改性发酵液进行离心分离，控制离心分离时的转速为2600-2800rpm，时间为4-5min，离心分离结束后得到的固相物作为菌泥，对菌泥进行真空冷冻干燥处理，控制真空冷冻干燥处理的温度为-35℃至-30℃，真空度为700-900Pa，处理时间为45-50min，真空冷冻干燥结束得到初级混合菌粉，将初级混合菌粉；将初级混合菌粉置于反应器中，将反应器的温度控制到20-25℃，按照2.5-3L/min的体积流量依次切换通入N2 5-7min、CO2 10-13min、干空气17-20min、N2 6-8min进行活化，活化结束得到混合菌粉；
所述混合菌粉中的益生菌的总数量为4.0×1010-4.5×1010cfu/g；
所述改性干燥中，发酵液、壳聚糖、大豆磷脂的重量比为40-45:3-5:4-5；
所述冻干保护剂的制备方法为：将蔗糖、麦芽糊精、谷氨酸钠、氯化钠混合后置于球磨机中进行第一次球磨，控制第一次球磨时的球料比为18-20:1，转速为300-350rpm，第一次球磨时间为40-50min，第一次球磨结束后进行低温等离子处理，控制低温等离子处理中的处理温度为8-10℃，处理功率为280-320W，处理时间为6-8min，低温等离子处理结束后得到初级冻干保护剂，将初级冻干保护剂、海藻糖、枸杞多糖混合后置于球磨机中进行第二次球磨，控制第二次球磨时的球料比为15-18:1，转速为350-400rpm，第二次球磨时间为50-55min，第二次球磨结束后得到冻干保护剂；
所述冻干保护剂的制备中，蔗糖、麦芽糊精、谷氨酸钠、氯化钠的重量比为6-8:3-4:1-3:0.1-0.4；
所述冻干保护剂的制备中，初级冻干保护剂、海藻糖、枸杞多糖的重量比为40-45:2-3:3-5；
所述分散剂的制备方法为：将柠檬酸钠、低聚半乳糖、硬脂酰乳酸钙混合后置于球磨机中进行球磨，控制球磨时的球料比为10-12:1，转速为300-350rpm，球磨时间为45-50min，球磨结束后进行紫外照射，控制紫外照射中紫外线的波长为250-280nm，紫外照射的时间为35-40min，紫外照射结束得到分散剂；
所述分散剂的制备中，柠檬酸钠、低聚半乳糖、硬脂酰乳酸钙的重量比为20-24:3-4:1-2；
所述表面活性剂的制备方法为：将甜菜碱、单甘酯、柠檬酸、卡拉胶混合后置于球磨机中进行球磨，控制球磨时的球料比为12-15:1，转速为350-400rpm，球磨时间为40-45min，球磨结束后得到表面活性剂；
所述表面活性剂的制备中，甜菜碱、单甘酯、柠檬酸、卡拉胶的重量比为7-10:3-5:4-6:1-3；
所述改性因子的制备方法为：将微晶纤维素、山梨糖醇、环糊精混合均匀后置于温度为40-45℃，湿度为85-90%的环境下静置40-45min，然后进行真空冷冻干燥，控制真空冷冻干燥处理的温度为-40℃至-35℃，真空度为100-120Pa，处理时间为1-1.2h，真空冷冻干燥结束得到初级改性因子，然后将对初级改性因子进行低温等离子体照射，控制低温等离子体照射中的作用气氛为氮气，电压为30-40kV，照射时间为30-35min，低温等离子体照射结束得到改性因子；
所述改性因子的制备中，微晶纤维素、山梨糖醇、环糊精的重量比为25-30:7-9:2-4。
2.根据权利要求1所述的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，其特征在于，所述制备种子液的方法中的液体培养基，由以下成分组成：3-5g/L葡萄糖，2-3g/L胰蛋白胨，0.3-0.5g/L磷酸氢二钠，0.2-0.5g/L磷酸二氢钠，剩余为去离子水。
3.根据权利要求1所述的具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物，其特征在于，所述具有预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物的制备方法，具体为：将混合菌粉、冻干保护剂、分散剂、表面活性剂、改性因子混合后进行机械振荡，控制机械振动中的频率为200-250rpm，时间为15-20min，机械振荡结束后进行真空冷冻干燥，控制真空冷冻干燥处理的温度为-40℃至-35℃，真空度为800-900Pa，处理时间为35-40min，真空冷冻干燥结束得到预防皮肤衰老功能的益生菌群组合物。
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