CN117257713A - 一种含有乳酸杆菌的大米发酵物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种含有乳酸杆菌的大米发酵物及其制备方法和用途，其制备方法包括制备大米发酵底物、制备大米发酵液粗品、制备大米发酵后生元产物、制备乳酸杆菌微囊、制备含有乳酸杆菌的大米发酵物的步骤。含有本发明大米发酵物的化妆品可维持皮肤生态系统的平衡，改善菌群失衡状态，加强皮肤抵抗力和屏障作用，消除或环节敏感肌症状，提高皮肤含水量和皮肤弹性，增加皮肤光泽；同时具有良好的安全性。

Description

一种含有乳酸杆菌的大米发酵物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于化妆品领域，具体涉及一种含有乳酸杆菌的大米发酵物及其制备方法和用途。
背景技术
皮肤微生态，又称皮肤微生物组，是由细菌、真菌、病毒、节肢动物等多种微生物与皮肤表面的组织、细胞及各种分泌物和微环境组成的动态多变的生态系统。尽管人体皮肤表面具有弱酸性且呈现低湿度和高盐度的特点，同时所含的具有抗菌作用的分子（如游离脂肪酸、免疫球蛋白和抗菌肽等）能从一定程度上破坏微生物的生活环境，但是，人体皮肤仍然携带着1000多个物种的约1000亿个微生物，其中74%-80%是细菌；5%-10%是真菌；10%-20%是病毒。这些微生物主要存在于皮肤表面和皮肤附属物，如毛囊、汗腺和皮脂腺，形成相对稳定的微生物菌群，也被称为驻留微生物，其中最具代表性的是葡萄球菌、丙酸杆菌属、柯氏杆菌和马拉色菌（皮肤微生态与皮肤健康专家共识第1部分：皮肤微生态概述，中国人体健康科技促进会皮肤病专业委员会等，临床皮肤科杂志，第51卷第11期，第701-704页，2022）。
在健康状态下，皮肤微生物呈现稳态，即皮肤微生物、宿主及外环境三者相互作用与制约并保持动态平衡。然而，当人体免疫力下降、生活环境改变或微生物群失调时，会引发宿主内源性感染，产生例如痤疮等皮肤疾病和亚健康问题。已有研究者通过使用微生物的次级代谢产物、益生元、益生菌或皮肤护理产品来改善皮肤微生态的失衡状态：（1）利用皮肤表面的特定微生物的次级代谢产物来修复皮肤屏障；（2）通过在皮肤表面应用益生元提高有益菌活性，进而修复因药物、激素或其他因素导致的菌群失衡，益生元大多是由天然物质提取，安全且无细胞毒性；（3）益生菌移植，将单株或多株益生菌经培养提纯后施用于皮肤，从而对局部皮肤微生态进行有益替换或整体强化，达到改善并治愈皮肤亚健康状态或疾病的目的；（4）通过使用能够改变皮肤表面的pH值、潮湿度和皮脂含量等理化性质的皮肤护理产品，影响皮肤菌群的多样性，使皮肤整体状态发生变化（皮肤微生态与皮肤疾病研究进展，杨沛峥等，药学进展，第46卷第7期，第545-553页，2022）。
因此，在化妆品领域，开发具有维持或改善皮肤微生态平衡功能的化妆品是有必要且有迫切需求的，已有研究采用含有益生菌的大米发酵物尝试解决这一需求并已证实具有一定的可行性和成功可能。随着人们对于天然、有机、绿色化妆品的追求，大米发酵物在此类化妆品领域得到了越来越广泛的应用。例如，韩国专利KR10-2020-0161987记载了一种包含乳酸菌发酵的大米作为活性成分的抗炎或美白化妆品组合物，并验证具有抑制痤疮、增加赖氨酸和乳酸、抑制色素生成和沉着、抗炎的作用；中国专利申请CN202110773720.1记载了一种大米发酵物的制备方法及其产品的抗氧化功效。在大米发酵物的应用方面，中国专利申请CN202210439466.6记载了一种包含大米发酵物滤液和乳酸杆菌发酵产物的组合物，并初步验证了该组合物对于益生菌以及有害菌的作用；中国专利申请CN202010415186.2记载了一种包含由大米发酵物、酒糟提取物等的保湿剂及其水含、水散和体外抑制酪氨酸酶活性的作用。另外，乳酸杆菌/大米发酵产物也已在我国境内生产和销售的化妆品中被使用（已使用化妆品原料目录（2021年版），序号05658）
随着化妆品技术的发展，在化妆品中添加活菌的方案逐渐被研究人员所关注。2022年6月，巴斯夫公司（BASF）开发了新的化妆品成分Probiolift™（INCI：麦芽糊精，乳酸杆菌），其中以活体形式在化妆品中使用了卷曲乳酸杆菌（Lactobacillus crispatus，菌株保藏号为CNCM I-5579，参见BASF申请的PCT/FR2021/052325的专利申请）。另外，比利时YUNProbiotherapy公司研发了通过将鼠李糖乳杆菌、戊糖乳杆菌和植物乳杆菌三种乳杆菌包裹在水包油乳膏中生产含有活菌的水性护肤品，其对于痤疮病变具有明显的改善作用，并且已在上百位受试者身上进行安全性测试且未出现不良反应。根据中国目前的化妆品相关法律法规，乳酸杆菌是唯一被允许添加的活菌成分（已使用化妆品原料目录（2021年版），序号05654）。
鉴于此，如何开发一种包含活益生菌成分的大米发酵物，使其富含多种营养物质、能够有效改善皮肤微生态从而改善皮肤状态、并且可长时间保持益生菌活性，成为本领域希望解决的技术问题。
发明内容
为解决上述技术问题，发明人经过研究，提供了本发明的技术方案。
在本发明的第一方面，提供了一种含有乳酸杆菌的大米发酵物，其特征在于，所述含有乳酸杆菌的大米发酵物采用如下方法制备：
（1）制备大米发酵底物
将大米研磨为80-120目的大米粉，并加入5~7倍质量的无菌水，加热至85~90℃并保持1~2小时，冷却至室温后加入2.2~4.8wt%的第一复合益生元，搅拌均匀后获得大米发酵底物；其中，所述第一复合益生元为β-葡聚糖、果胶低聚糖、海藻多糖和红酒多酚的混合物，其中β-葡聚糖∶果胶低聚糖∶海藻多糖∶红酒多酚的质量比为5~8∶2~4∶2~4∶1；
（2）制备大米发酵液粗品
将保藏号为GDMCC NO. 1.1516（植物乳杆菌，Lactiplantibacillus plantarum）的植物乳杆菌、保藏号为GDMCC NO. 2.90（酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae）的酿酒酵母、以及保藏号为GDMCC NO. 1.326（假交替单胞菌，Pseudoalteromonas nigrifaciens）的假交替单胞菌，将所述植物乳酸杆菌、所述酿酒酵母、所述假交替单胞菌分别按照0.7~1×1010cfu、0.3~0.5×1010cfu、0.2~0.6×1010cfu的接种量依次接种至步骤（1）获得的所述大米发酵底物中，并在机械搅拌式发酵罐共培养，共培养温度为35-40℃，共培养时间为68-72小时，搅拌速度为270-300rpm，并且在培养过程中以0.5-0.6L/min的通气速率持续通入无菌空气，发酵结束后按照8-10g/L的量加入絮凝剂，搅拌均匀静置1-2小时后压滤，分别获得粗品滤饼和粗品滤液；其中，所述絮凝剂为由35~45wt%的壳聚糖和55~65wt%的葡萄糖组成的混合物；
（3）制备大米发酵后生元产物
（i）将步骤（2）获得的粗品滤饼用无菌水洗涤1-3次后，加入1-2倍体积的无菌水重悬浮获得菌体悬浮液，然后使用珠磨机研磨所述菌体悬浮液以破碎菌体，收集研磨后的溶胞浆液；（ii）将步骤（2）获得的粗品滤液负压蒸发浓缩至原体积的1/4~1/3，获得次级代谢产物浓缩液；（iii）将所述溶胞浆液与所述次级代谢产物浓缩液混合并搅拌均匀，冷冻干燥后获得大米发酵后生元产物；
（4）制备乳酸杆菌微囊
在已灭菌的改良MRS液体培养基中接种保藏号为GDMCC NO. 1.648（植物乳杆菌，Lactiplantibacillus plantarum）的乳酸杆菌，在37℃恒温培养24-30小时后，在4℃以8000rpm离心15分钟，收集菌体粗品；将所述菌体粗品用生理盐水洗涤三次后使用0.22μm的微孔滤膜过滤获得纯化乳酸杆菌；将所述纯化乳酸杆菌以10wt%的量加入菌体保护剂溶液中混合均匀，并通过静电喷雾干燥后获得乳酸杆菌微囊；其中，所述改良MRS液体培养基的配方和制备方法为：牛肉膏7.0g，蛋白胨8.0g，酵母膏粉3.0g，无水醋酸钠4.0g，葡萄糖22.0g，柠檬酸铵2.0g，七水硫酸镁0.58g，磷酸二氢钾2.5g，四水硫酸锰0.3g，吐温-801.0mL，琼脂15.0g,蒸馏水1000mL，pH6.5，搅拌加热煮沸至完全溶解，并在121℃灭菌20min；其中，所述菌体保护剂溶液的组成为海藻糖18wt%、亚麻酸12wt%、磷酸氢二钠6wt%、β-环糊精14wt%、无菌水50 wt%；其中，所述静电喷雾干燥的条件为：进风温度70℃，出风温度30℃，气体流速30N3/h，进液泵速22r/min，静电压力25kV，雾化压力240kPa；
（5）制备含有乳酸杆菌的大米发酵物
将步骤（4）获得的所述乳酸杆菌微囊、步骤（3）获得的所述大米发酵后生元产物以及第二复合益生元混合均匀，获得含有乳酸杆菌的大米发酵物；其中乳酸杆菌微囊∶大米发酵后生元产物∶第二复合益生元的质量比为1∶15~20∶20~30；其中，所述第二复合益生元由20~30wt%的菊粉、15~20wt%的鼠李糖、以及50~65wt%的葡甘聚糖组成。
在本发明的第二方面，提供了一种制备含有乳酸杆菌的大米发酵物的制备方法，所述方法为：
（1）制备大米发酵底物
将大米研磨为80-120目的大米粉，并加入5~7倍质量的无菌水，加热至85~90℃并保持1~2小时，冷却至室温后加入2.2~4.8wt%的第一复合益生元，搅拌均匀后获得大米发酵底物；其中，所述第一复合益生元为β-葡聚糖、果胶低聚糖、海藻多糖和红酒多酚的混合物，其中β-葡聚糖∶果胶低聚糖∶海藻多糖∶红酒多酚的质量比为5~8∶2~4∶2~4∶1；
（2）制备大米发酵液粗品
将保藏号为GDMCC NO. 1.1516（植物乳杆菌，Lactiplantibacillus plantarum）的植物乳杆菌、保藏号为GDMCC NO. 2.90（酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae）的酿酒酵母、以及保藏号为GDMCC NO. 1.326（假交替单胞菌，Pseudoalteromonas nigrifaciens）的假交替单胞菌，将所述植物乳酸杆菌、所述酿酒酵母、所述假交替单胞菌分别按照0.7~1×1010cfu、0.3~0.5×1010cfu、0.2~0.6×1010cfu的接种量依次接种至步骤（1）获得的所述大米发酵底物中，并在机械搅拌式发酵罐共培养，共培养温度为35-40℃，共培养时间为68-72小时，搅拌速度为270-300rpm，并且在培养过程中以0.5-0.6L/min的通气速率持续通入无菌空气，发酵结束后按照8-10g/L的量加入絮凝剂，搅拌均匀静置1-2小时后压滤，分别获得粗品滤饼和粗品滤液；其中，所述絮凝剂为由35~45wt%的壳聚糖和55~65wt%的葡萄糖组成的混合物；
（3）制备大米发酵后生元产物
（i）将步骤（2）获得的粗品滤饼用无菌水洗涤1-3次后，加入1-2倍体积的无菌水重悬浮获得菌体悬浮液，然后使用珠磨机研磨所述菌体悬浮液以破碎菌体，收集研磨后的溶胞浆液；（ii）将步骤（2）获得的粗品滤液负压蒸发浓缩至原体积的1/4~1/3，获得次级代谢产物浓缩液；（iii）将所述溶胞浆液与所述次级代谢产物浓缩液混合并搅拌均匀，冷冻干燥后获得大米发酵后生元产物；
（4）制备乳酸杆菌微囊
在已灭菌的改良MRS液体培养基中接种保藏号为GDMCC NO. 1.648（植物乳杆菌，Lactiplantibacillus plantarum）的乳酸杆菌，在37℃恒温培养24-30小时后，在4℃以8000rpm离心15分钟，收集菌体粗品；将所述菌体粗品用生理盐水洗涤三次后使用0.22μm的微孔滤膜过滤获得纯化乳酸杆菌；将所述纯化乳酸杆菌以10wt%的量加入菌体保护剂溶液中混合均匀，并通过静电喷雾干燥后获得乳酸杆菌微囊；其中，所述改良MRS液体培养基的配方和制备方法为：牛肉膏7.0g，蛋白胨8.0g，酵母膏粉3.0g，无水醋酸钠4.0g，葡萄糖22.0g，柠檬酸铵2.0g，七水硫酸镁0.58g，磷酸二氢钾2.5g，四水硫酸锰0.3g，吐温-801.0mL，琼脂15.0g,蒸馏水1000mL，pH6.5，搅拌加热煮沸至完全溶解，并在121℃灭菌20min；其中，所述菌体保护剂溶液的组成为海藻糖18wt%、亚麻酸12wt%、磷酸氢二钠6wt%、β-环糊精14wt%、无菌水50 wt%；其中，所述静电喷雾干燥的条件为：进风温度70℃，出风温度30℃，气体流速30N3/h，进液泵速22r/min，静电压力25kV，雾化压力240kPa；
（5）制备含有乳酸杆菌的大米发酵物
将步骤（4）获得的所述乳酸杆菌微囊、步骤（3）获得的所述大米发酵后生元产物以及第二复合益生元混合均匀，获得含有乳酸杆菌的大米发酵物；其中乳酸杆菌微囊∶大米发酵后生元产物∶第二复合益生元的质量比为1∶15~20∶20~30；其中，所述第二复合益生元由20~30wt%的菊粉、15~20wt%的鼠李糖、以及50~65wt%的葡甘聚糖组成。
在本发明的第三个方面，提供了一种含有根据本发明第一方面所述的含有乳酸杆菌的大米发酵物的化妆品。优选地，所述化妆品为护肤品。更优选地，所述护肤品为面膜、精华液、面霜、乳液或化妆水中的任意一种。
在本发明的第四个方面，提供了根据本发明第一方面所述的含有乳酸杆菌的大米发酵物在制备化妆品中的用途。优选地，所述化妆品为护肤品。更优选地，所述护肤品为面膜、精华液、面霜、乳液或化妆水中的任意一种。
本发明中所用的“wt%”指质量百分比。
与现有技术相比，本发明提供的含有乳酸杆菌的大米发酵物包含了对皮肤有益微生物发酵后的后生元成分、促进皮肤益生菌生长的特定益生元组合、以及能够改善皮肤微生态环境的乳酸杆菌。通过制备含有本发明提供的乳酸杆菌的大米发酵物的化妆品，可使其与皮肤原有的微生物、皮肤表面组织细胞、分泌物、微环境等共同组成有益于皮肤状态的生态系统，维持生态系统的平衡，改善菌群失衡状态，加强皮肤抵抗力和屏障作用，消除或环节敏感肌症状，提高皮肤含水量和皮肤弹性，增加皮肤光泽；不仅能够满足人们对于护肤品绿色、有机、自然的需求，同时也能够为肌肤带来更健康、更美丽的效果；同时具有良好的安全性，在长期保存后仍符合化妆品微生物学检验标准。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
（1）制备大米发酵底物
将大米研磨为80目的大米粉，并加入5倍质量的无菌水，加热至85℃并保持1小时，冷却至室温后加入2.2wt%的第一复合益生元，搅拌均匀后获得大米发酵底物；其中，所述第一复合益生元为β-葡聚糖、果胶低聚糖、海藻多糖和红酒多酚的混合物，其中β-葡聚糖∶果胶低聚糖∶海藻多糖∶红酒多酚的质量比为5∶2∶2∶1；
（2）制备大米发酵液粗品
将保藏号为GDMCC NO. 1.1516（植物乳杆菌，Lactiplantibacillus plantarum，购买自广东省微生物菌种保藏中心）的植物乳杆菌、保藏号为GDMCC NO. 2.90（酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae，购买自广东省微生物菌种保藏中心）的酿酒酵母、以及保藏号为GDMCC NO. 1.326（假交替单胞菌，Pseudoalteromonas nigrifaciens，购买自广东省微生物菌种保藏中心）的假交替单胞菌，将所述植物乳酸杆菌、所述酿酒酵母、所述假交替单胞菌分别按照0.7×1010cfu、0.3×1010cfu、0.2×1010cfu的接种量依次接种至步骤（1）获得的所述大米发酵底物中，并在机械搅拌式发酵罐共培养，共培养温度为35℃，共培养时间为68小时，搅拌速度为270rpm，并且在培养过程中以0.5L/min的通气速率持续通入无菌空气，发酵结束后按照8g/L的量加入絮凝剂，搅拌均匀静置1小时后压滤，分别获得粗品滤饼和粗品滤液；其中，所述絮凝剂为由35wt%的壳聚糖和65wt%的葡萄糖组成的混合物；
（3）制备大米发酵后生元产物
（i）将步骤（2）获得的粗品滤饼用无菌水洗涤1次后，加入1倍体积的无菌水重悬浮获得菌体悬浮液，然后使用珠磨机研磨所述菌体悬浮液以破碎菌体，收集研磨后的溶胞浆液；（ii）将步骤（2）获得的粗品滤液负压蒸发浓缩至原体积的1/4，获得次级代谢产物浓缩液；（iii）将所述溶胞浆液与所述次级代谢产物浓缩液混合并搅拌均匀，冷冻干燥后获得大米发酵后生元产物；
（4）制备乳酸杆菌微囊
在已灭菌的改良MRS液体培养基中接种保藏号为GDMCC NO. 1.648（植物乳杆菌，Lactiplantibacillus plantarum，购买自广东省微生物菌种保藏中心）的乳酸杆菌，在37℃恒温培养24小时后，在4℃以8000rpm离心15分钟，收集菌体粗品；将所述菌体粗品用生理盐水洗涤三次后使用0.22μm的微孔滤膜过滤获得纯化乳酸杆菌；将所述纯化乳酸杆菌以10wt%的量加入菌体保护剂溶液中混合均匀，并通过静电喷雾干燥后获得乳酸杆菌微囊；其中，所述改良MRS液体培养基的配方和制备方法为：牛肉膏7.0g，蛋白胨8.0g，酵母膏粉3.0g，无水醋酸钠4.0g，葡萄糖22.0g，柠檬酸铵2.0g，七水硫酸镁0.58g，磷酸二氢钾2.5g，四水硫酸锰0.3g，吐温-80 1.0mL，琼脂15.0g,蒸馏水1000mL，pH6.5，搅拌加热煮沸至完全溶解，并在121℃灭菌20min；其中，所述菌体保护剂溶液的组成为海藻糖18wt%、亚麻酸12wt%、磷酸氢二钠6wt%、β-环糊精14wt%、无菌水50 wt%；其中，所述静电喷雾干燥的条件为：进风温度70℃，出风温度30℃，气体流速30N3/h，进液泵速22r/min，静电压力25kV，雾化压力240kPa；
（5）制备含有乳酸杆菌的大米发酵物
将步骤（4）获得的所述乳酸杆菌微囊、步骤（3）获得的所述大米发酵后生元产物以及第二复合益生元混合均匀，获得含有乳酸杆菌的大米发酵物；其中乳酸杆菌微囊∶大米发酵后生元产物∶第二复合益生元的质量比为1∶15∶20；其中，所述第二复合益生元由20wt%的菊粉、15wt%的鼠李糖、以及65wt%的葡甘聚糖组成。
实施例2
（1）制备大米发酵底物
将大米研磨为120目的大米粉，并加入7倍质量的无菌水，加热至90℃并保持2小时，冷却至室温后加入4.8wt%的第一复合益生元，搅拌均匀后获得大米发酵底物；其中，所述第一复合益生元为β-葡聚糖、果胶低聚糖、海藻多糖和红酒多酚的混合物，其中β-葡聚糖∶果胶低聚糖∶海藻多糖∶红酒多酚的质量比为8∶4∶4∶1；
（2）制备大米发酵液粗品
将保藏号为GDMCC NO. 1.1516（植物乳杆菌，Lactiplantibacillus plantarum，购买自广东省微生物菌种保藏中心）的植物乳杆菌、保藏号为GDMCC NO. 2.90（酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae，购买自广东省微生物菌种保藏中心）的酿酒酵母、以及保藏号为GDMCC NO. 1.326（假交替单胞菌，Pseudoalteromonas nigrifaciens，购买自广东省微生物菌种保藏中心）的假交替单胞菌，将所述植物乳酸杆菌、所述酿酒酵母、所述假交替单胞菌分别按照1×1010cfu、0.5×1010cfu、0.6×1010cfu的接种量依次接种至步骤（1）获得的所述大米发酵底物中，并在机械搅拌式发酵罐共培养，共培养温度为40℃，共培养时间为72小时，搅拌速度为300rpm，并且在培养过程中以0.6L/min的通气速率持续通入无菌空气，发酵结束后按照10g/L的量加入絮凝剂，搅拌均匀静置2小时后压滤，分别获得粗品滤饼和粗品滤液；其中，所述絮凝剂为由45wt%的壳聚糖和55wt%的葡萄糖组成的混合物；
（3）制备大米发酵后生元产物
（i）将步骤（2）获得的粗品滤饼用无菌水洗涤3次后，加入2倍体积的无菌水重悬浮获得菌体悬浮液，然后使用珠磨机研磨所述菌体悬浮液以破碎菌体，收集研磨后的溶胞浆液；（ii）将步骤（2）获得的粗品滤液负压蒸发浓缩至原体积的1/3，获得次级代谢产物浓缩液；（iii）将所述溶胞浆液与所述次级代谢产物浓缩液混合并搅拌均匀，冷冻干燥后获得大米发酵后生元产物；
（4）制备乳酸杆菌微囊
在已灭菌的改良MRS液体培养基中接种保藏号为GDMCC NO. 1.648（植物乳杆菌，Lactiplantibacillus plantarum，购买自广东省微生物菌种保藏中心）的乳酸杆菌，在37℃恒温培养30小时后，在4℃以8000rpm离心15分钟，收集菌体粗品；将所述菌体粗品用生理盐水洗涤三次后使用0.22μm的微孔滤膜过滤获得纯化乳酸杆菌；将所述纯化乳酸杆菌以10wt%的量加入菌体保护剂溶液中混合均匀，并通过静电喷雾干燥后获得乳酸杆菌微囊；其中，所述改良MRS液体培养基的配方和制备方法为：牛肉膏7.0g，蛋白胨8.0g，酵母膏粉3.0g，无水醋酸钠4.0g，葡萄糖22.0g，柠檬酸铵2.0g，七水硫酸镁0.58g，磷酸二氢钾2.5g，四水硫酸锰0.3g，吐温-80 1.0mL，琼脂15.0g,蒸馏水1000mL，pH6.5，搅拌加热煮沸至完全溶解，并在121℃灭菌20min；其中，所述菌体保护剂溶液的组成为海藻糖18wt%、亚麻酸12wt%、磷酸氢二钠6wt%、β-环糊精14wt%、无菌水50 wt%；其中，所述静电喷雾干燥的条件为：进风温度70℃，出风温度30℃，气体流速30N3/h，进液泵速22r/min，静电压力25kV，雾化压力240kPa；
（5）制备含有乳酸杆菌的大米发酵物
将步骤（4）获得的所述乳酸杆菌微囊、步骤（3）获得的所述大米发酵后生元产物以及第二复合益生元混合均匀，获得含有乳酸杆菌的大米发酵物；其中乳酸杆菌微囊∶大米发酵后生元产物∶第二复合益生元的质量比为1∶20∶30；其中，所述第二复合益生元由30wt%的菊粉、20wt%的鼠李糖、以及50wt%的葡甘聚糖组成。
实施例3
（1）制备大米发酵底物
将大米研磨为100目的大米粉，并加入6倍质量的无菌水，加热至87℃并保持1.6小时，冷却至室温后加入3wt%的第一复合益生元，搅拌均匀后获得大米发酵底物；其中，所述第一复合益生元为β-葡聚糖、果胶低聚糖、海藻多糖和红酒多酚的混合物，其中β-葡聚糖∶果胶低聚糖∶海藻多糖∶红酒多酚的质量比为6∶3∶2.5∶1；
（2）制备大米发酵液粗品
将保藏号为GDMCC NO. 1.1516（植物乳杆菌，Lactiplantibacillus plantarum，购买自广东省微生物菌种保藏中心）的植物乳杆菌、保藏号为GDMCC NO. 2.90（酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae，购买自广东省微生物菌种保藏中心）的酿酒酵母、以及保藏号为GDMCC NO. 1.326（假交替单胞菌，Pseudoalteromonas nigrifaciens，购买自广东省微生物菌种保藏中心）的假交替单胞菌，将所述植物乳酸杆菌、所述酿酒酵母、所述假交替单胞菌分别按照0.8×1010cfu、0.4×1010cfu、0.5×1010cfu的接种量依次接种至步骤（1）获得的所述大米发酵底物中，并在机械搅拌式发酵罐共培养，共培养温度为37℃，共培养时间为70小时，搅拌速度为280rpm，并且在培养过程中以0.55L/min的通气速率持续通入无菌空气，发酵结束后按照9g/L的量加入絮凝剂，搅拌均匀静置1.5小时后压滤，分别获得粗品滤饼和粗品滤液；其中，所述絮凝剂为由40wt%的壳聚糖和60wt%的葡萄糖组成的混合物；
（3）制备大米发酵后生元产物
（i）将步骤（2）获得的粗品滤饼用无菌水洗涤2次后，加入1.5倍体积的无菌水重悬浮获得菌体悬浮液，然后使用珠磨机研磨所述菌体悬浮液以破碎菌体，收集研磨后的溶胞浆液；（ii）将步骤（2）获得的粗品滤液负压蒸发浓缩至原体积的1/4，获得次级代谢产物浓缩液；（iii）将所述溶胞浆液与所述次级代谢产物浓缩液混合并搅拌均匀，冷冻干燥后获得大米发酵后生元产物；
（4）制备乳酸杆菌微囊
在已灭菌的改良MRS液体培养基中接种保藏号为GDMCC NO. 1.648（植物乳杆菌，Lactiplantibacillus plantarum，购买自广东省微生物菌种保藏中心）的乳酸杆菌，在37℃恒温培养28小时后，在4℃以8000rpm离心15分钟，收集菌体粗品；将所述菌体粗品用生理盐水洗涤三次后使用0.22μm的微孔滤膜过滤获得纯化乳酸杆菌；将所述纯化乳酸杆菌以10wt%的量加入菌体保护剂溶液中混合均匀，并通过静电喷雾干燥后获得乳酸杆菌微囊；其中，所述改良MRS液体培养基的配方和制备方法为：牛肉膏7.0g，蛋白胨8.0g，酵母膏粉3.0g，无水醋酸钠4.0g，葡萄糖22.0g，柠檬酸铵2.0g，七水硫酸镁0.58g，磷酸二氢钾2.5g，四水硫酸锰0.3g，吐温-80 1.0mL，琼脂15.0g,蒸馏水1000mL，pH6.5，搅拌加热煮沸至完全溶解，并在121℃灭菌20min；其中，所述菌体保护剂溶液的组成为海藻糖18wt%、亚麻酸12wt%、磷酸氢二钠6wt%、β-环糊精14wt%、无菌水50 wt%；其中，所述静电喷雾干燥的条件为：进风温度70℃，出风温度30℃，气体流速30N3/h，进液泵速22r/min，静电压力25kV，雾化压力240kPa；
（5）制备含有乳酸杆菌的大米发酵物
将步骤（4）获得的所述乳酸杆菌微囊、步骤（3）获得的所述大米发酵后生元产物以及第二复合益生元混合均匀，获得含有乳酸杆菌的大米发酵物；其中乳酸杆菌微囊∶大米发酵后生元产物∶第二复合益生元的质量比为1∶18∶27；其中，所述第二复合益生元由25wt%的菊粉、18wt%的鼠李糖、以及57wt%的葡甘聚糖组成。
对比例1
采用与制备实施例1相同的制备步骤，仅在步骤（1）中未添加第一复合益生元，其余条件完全相同。
对比例2
采用与制备实施例2相同的制备步骤，仅在步骤（2）中将GDMCC NO. 1.1516的植物乳杆菌替换为保藏号为CCTCC AB 2010210（植物乳杆菌，Lactobacillus plantarum，购买自中国典型培养物保藏中心）的植物乳杆菌，其余条件完全相同。
对比例3
采用与制备实施例2相同的制备步骤，仅在步骤（4）中将静电喷雾干燥替换为乳化冷冻干燥，其余条件完全相同。其中乳化冷冻干燥的具体步骤为：在收集菌体粗品，使用生理盐水洗涤3次，以脱脂乳、海藻糖、海藻酸钠（脱脂乳∶海藻糖∶海藻酸钠的质量比为2∶3∶1）作为保护剂，菌体与保护剂以1∶2重量比例进行乳化保护，1200rpm乳化20min，真空冷冻干燥机中干燥。
对比例4
采用与制备实施例3相同的制备步骤，仅在步骤（4）中将GDMCC NO. 1.648的植物乳杆菌替换为保藏号为GDMCC NO. 1.1797（植物乳杆菌，Lactiplantibacillus plantarum，购买自广东省微生物菌种保藏中心）的植物乳杆菌，其余条件完全相同。
对比例5
采用与制备实施例3相同的制备步骤，仅在步骤（5）中将第二复合益生元调整为由40wt%的菊粉、30wt%的鼠李糖、以及30wt%的葡甘聚糖组成，其余条件完全相同。
实施例6
使用上述实施例1-3及对比例1-5获得的含有乳酸杆菌的大米发酵物，通过如下方法制备面膜，其中各原料组分以重量份计：去离子水 100份，丁二醇 5份，甘油 5份，乙醇 4份，三乙醇胺 0.2份，透明质酸钠 0.2份，黄原胶 0.3份，海藻酸钠 0.3份，1,2-戊二醇 1份，肉豆蔻酰胺丙基甜菜碱 1份，羧甲基纤维素钠 0.5份，月桂酰两性基乙酸钠 5份，含有乳酸杆菌的大米发酵物 3.5份。将海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、月桂酰两性基乙酸钠、黄原胶、透明质酸钠在80℃水浴条件下加热，加入去离子水用量中的30%的去离子水搅拌至完全溶解，再依次加入肉豆蔻酰胺丙基甜菜碱、丁二醇、甘油、乙醇、三乙醇胺、1,2-戊二醇并搅拌均匀，待冷却至30℃时，加入含有乳酸杆菌的大米发酵物，并加入剩余量去离子水，搅拌均匀后即获得面膜液。将面膜液涂布于市购的蚕丝纤维面膜基布，获得待测试面膜。
针对敏感肌的功效测试：由40名患有中度红斑、潮红、丘疹、瘙痒、紧绷、脱屑、或刺痛的敏感肌症状的女性志愿者组成受试者人群，其年龄在30-40岁之间，要求能够按照规范使用化妆品，并配合按要求完成评价工作。将40名受试者随机分为8组，每组5人，实验期为30天。在实验期内每三天在固定时间使用待测试面膜敷脸一次，每次敷脸15分钟。在第0天（即首次使用待测试面膜的前1天）、第15天、第30天分别进行评分。测试项目包括：（1）敏感肌分数，由皮肤科执业医师对受试者皮肤情况进行主观视觉评分，总分为10分，0分为最严重状态，10分为无症状状态，分数越高代表皮肤状态越好；（2）皮肤含水量，采用RealBubeeRBX-916皮肤水分测试仪进行测试；（3）皮肤弹性测试，采用Reviscometer RV600皮肤弹性测试仪进行测定；（4）皮肤光泽测试，采用Skin-Glossymeter GL 200皮肤光泽测试仪进行测试。分别收集各测试项目在0、15、30天的结果，并以第0天的测试结果为基础，计算改善百分比，具体计算公式为：
计算各组平均值，结果分别如下表1（第15天结果）和表2（第30天结果）所示。
表1 待测试面膜改善敏感肌测试第15天结果（单位：%）
表2 待测试面膜改善敏感肌测试第30天结果（单位：%）
根据表1和表2的结果可以看出，相对于对比例1-5，由实施例1-3中的含有乳酸杆菌的大米发酵物制备获得的待测试面膜在敏感肌改善、皮肤含水量改善、皮肤弹性改善、皮肤光泽改善获得了更优异的测试效果。
实施例7
按照广东省包装技术协会的T/GDBZ 008-2021面膜包装用复合膜、袋的技术标准将实施例6中制备的各组面膜进行密封包装，在包装完好的情况下室温存放一年后，在无菌条件下拆开包装并挤压面膜，收集面膜液，按照《化妆品安全技术规范（2015年版）》第五章中记载的方法对微生物进行检验，并确定检验结果是否属于该规范第一章规定的指标，即菌落总数≤1000 CFU/g（或CFU/ml），霉菌和酵母菌总数≤100（或CFU/ml），不得检出耐热大肠菌群、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。结果如下表3所述。
表3 待测试面膜保存一年后的微生物学指标检测结果
从表3的结果可以看出，相对于对比例1-5，实施例1-3中的含有乳酸杆菌的大米发酵物制备获得的待测试面膜在长时间保存下仍然具有良好的微生物学安全性。
综上，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (8)

1. 一种含有乳酸杆菌的大米发酵物，其特征在于，所述含有乳酸杆菌的大米发酵物采用如下方法制备：
（1）制备大米发酵底物
将大米研磨为80-120目的大米粉，并加入5~7倍质量的无菌水，加热至85~90℃并保持1~2小时，冷却至室温后加入2.2~4.8wt%的第一复合益生元，搅拌均匀后获得大米发酵底物；其中，所述第一复合益生元为β-葡聚糖、果胶低聚糖、海藻多糖和红酒多酚的混合物，其中β-葡聚糖∶果胶低聚糖∶海藻多糖∶红酒多酚的质量比为5~8∶2~4∶2~4∶1；
（2）制备大米发酵液粗品
将保藏号为GDMCC NO. 1.1516的植物乳杆菌、保藏号为GDMCC NO. 2.90的酿酒酵母、以及保藏号为GDMCC NO. 1.326的假交替单胞菌，将所述植物乳酸杆菌、所述酿酒酵母、所述假交替单胞菌分别按照0.7~1×1010cfu、0.3~0.5×1010cfu、0.2~0.6×1010cfu的接种量依次接种至步骤（1）获得的所述大米发酵底物中，并在机械搅拌式发酵罐共培养，共培养温度为35-40℃，共培养时间为68-72小时，搅拌速度为270-300rpm，并且在培养过程中以0.5-0.6L/min的通气速率持续通入无菌空气，发酵结束后按照8-10g/L的量加入絮凝剂，搅拌均匀静置1-2小时后压滤，分别获得粗品滤饼和粗品滤液；其中，所述絮凝剂为由35~45wt%的壳聚糖和55~65wt%的葡萄糖组成的混合物；
（3）制备大米发酵后生元产物
（i）将步骤（2）获得的粗品滤饼用无菌水洗涤1-3次后，加入1-2倍体积的无菌水重悬浮获得菌体悬浮液，然后使用珠磨机研磨所述菌体悬浮液以破碎菌体，收集研磨后的溶胞浆液；（ii）将步骤（2）获得的粗品滤液负压蒸发浓缩至原体积的1/4~1/3，获得次级代谢产物浓缩液；（iii）将所述溶胞浆液与所述次级代谢产物浓缩液混合并搅拌均匀，冷冻干燥后获得大米发酵后生元产物；
（4）制备乳酸杆菌微囊
在已灭菌的改良MRS液体培养基中接种保藏号为GDMCC NO. 1.648的乳酸杆菌，在37℃恒温培养24-30小时后，在4℃以8000rpm离心15分钟，收集菌体粗品；将所述菌体粗品用生理盐水洗涤三次后使用0.22μm的微孔滤膜过滤获得纯化乳酸杆菌；将所述纯化乳酸杆菌以10wt%的量加入菌体保护剂溶液中混合均匀，并通过静电喷雾干燥后获得乳酸杆菌微囊；其中，所述改良MRS液体培养基的配方和制备方法为：牛肉膏7.0g，蛋白胨8.0g，酵母膏粉3.0g，无水醋酸钠4.0g，葡萄糖22.0g，柠檬酸铵2.0g，七水硫酸镁0.58g，磷酸二氢钾2.5g，四水硫酸锰0.3g，吐温-80 1.0mL，琼脂15.0g,蒸馏水1000mL，pH6.5，搅拌加热煮沸至完全溶解，并在121℃灭菌20min；其中，所述菌体保护剂溶液的组成为海藻糖18wt%、亚麻酸12wt%、磷酸氢二钠6wt%、β-环糊精14wt%、无菌水50 wt%；其中，所述静电喷雾干燥的条件为：进风温度70℃，出风温度30℃，气体流速30N3/h，进液泵速22r/min，静电压力25kV，雾化压力240kPa；
（5）制备含有乳酸杆菌的大米发酵物
将步骤（4）获得的所述乳酸杆菌微囊、步骤（3）获得的所述大米发酵后生元产物以及第二复合益生元混合均匀，获得含有乳酸杆菌的大米发酵物；其中乳酸杆菌微囊∶大米发酵后生元产物∶第二复合益生元的质量比为1∶15~20∶20~30；其中，所述第二复合益生元由20~30wt%的菊粉、15~20wt%的鼠李糖、以及50~65wt%的葡甘聚糖组成。
2. 一种制备含有乳酸杆菌的大米发酵物的制备方法，所述方法为：
（1）制备大米发酵底物
将大米研磨为80-120目的大米粉，并加入5~7倍质量的无菌水，加热至85~90℃并保持1~2小时，冷却至室温后加入2.2~4.8wt%的第一复合益生元，搅拌均匀后获得大米发酵底物；其中，所述第一复合益生元为β-葡聚糖、果胶低聚糖、海藻多糖和红酒多酚的混合物，其中β-葡聚糖∶果胶低聚糖∶海藻多糖∶红酒多酚的质量比为5~8∶2~4∶2~4∶1；
（2）制备大米发酵液粗品
将保藏号为GDMCC NO. 1.1516的植物乳杆菌、保藏号为GDMCC NO. 2.90的酿酒酵母、以及保藏号为GDMCC NO. 1.326的假交替单胞菌，将所述植物乳酸杆菌、所述酿酒酵母、所述假交替单胞菌分别按照0.7~1×1010cfu、0.3~0.5×1010cfu、0.2~0.6×1010cfu的接种量依次接种至步骤（1）获得的所述大米发酵底物中，并在机械搅拌式发酵罐共培养，共培养温度为35-40℃，共培养时间为68-72小时，搅拌速度为270-300rpm，并且在培养过程中以0.5-0.6L/min的通气速率持续通入无菌空气，发酵结束后按照8-10g/L的量加入絮凝剂，搅拌均匀静置1-2小时后压滤，分别获得粗品滤饼和粗品滤液；其中，所述絮凝剂为由35~45wt%的壳聚糖和55~65wt%的葡萄糖组成的混合物；
（3）制备大米发酵后生元产物
（i）将步骤（2）获得的粗品滤饼用无菌水洗涤1-3次后，加入1-2倍体积的无菌水重悬浮获得菌体悬浮液，然后使用珠磨机研磨所述菌体悬浮液以破碎菌体，收集研磨后的溶胞浆液；（ii）将步骤（2）获得的粗品滤液负压蒸发浓缩至原体积的1/4~1/3，获得次级代谢产物浓缩液；（iii）将所述溶胞浆液与所述次级代谢产物浓缩液混合并搅拌均匀，冷冻干燥后获得大米发酵后生元产物；
（4）制备乳酸杆菌微囊
在已灭菌的改良MRS液体培养基中接种保藏号为GDMCC NO. 1.648的乳酸杆菌，在37℃恒温培养24-30小时后，在4℃以8000rpm离心15分钟，收集菌体粗品；将所述菌体粗品用生理盐水洗涤三次后使用0.22μm的微孔滤膜过滤获得纯化乳酸杆菌；将所述纯化乳酸杆菌以10wt%的量加入菌体保护剂溶液中混合均匀，并通过静电喷雾干燥后获得乳酸杆菌微囊；其中，所述改良MRS液体培养基的配方和制备方法为：牛肉膏7.0g，蛋白胨8.0g，酵母膏粉3.0g，无水醋酸钠4.0g，葡萄糖22.0g，柠檬酸铵2.0g，七水硫酸镁0.58g，磷酸二氢钾2.5g，四水硫酸锰0.3g，吐温-80 1.0mL，琼脂15.0g,蒸馏水1000mL，pH6.5，搅拌加热煮沸至完全溶解，并在121℃灭菌20min；其中，所述菌体保护剂溶液的组成为海藻糖18wt%、亚麻酸12wt%、磷酸氢二钠6wt%、β-环糊精14wt%、无菌水50 wt%；其中，所述静电喷雾干燥的条件为：进风温度70℃，出风温度30℃，气体流速30N3/h，进液泵速22r/min，静电压力25kV，雾化压力240kPa；
（5）制备含有乳酸杆菌的大米发酵物
将步骤（4）获得的所述乳酸杆菌微囊、步骤（3）获得的所述大米发酵后生元产物以及第二复合益生元混合均匀，获得含有乳酸杆菌的大米发酵物；其中乳酸杆菌微囊∶大米发酵后生元产物∶第二复合益生元的质量比为1∶15~20∶20~30；其中，所述第二复合益生元由20~30wt%的菊粉、15~20wt%的鼠李糖、以及50~65wt%的葡甘聚糖组成。
3.一种化妆品，含有根据权利要求1所述的含有乳酸杆菌的大米发酵物、或者根据权利要求2所述的制备方法获得的含有乳酸杆菌的大米发酵物。
4.根据权利要求3中所述的化妆品，其中所述化妆品为护肤品。
5.根据权利要求4中所述的化妆品，其中所述护肤品为面膜、精华液、面霜、乳液或化妆水中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的含有乳酸杆菌的大米发酵物用于制备化妆品中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述化妆品为护肤品。
8.根据权利要求7中所述的用途，其中所述护肤品为面膜、精华液、面霜、乳液或化妆水中的任意一种。
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