CN114711243B - 一种小檗碱衍生物在抗植物病原菌中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物化学领域，公开了一种小檗碱衍生物在防治由水稻白叶枯病病原菌Xanthomonas oryzae ACCC 11602、柑橘溃疡病病原菌Xanthomonas axonopodis pv.Citri和马铃薯黑胫病病原菌Pectobacterium atroseptica ACCC 19901引起的植物细菌性病害和由核盘菌Sclerotinia sclerotiorum、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、禾谷镰刀菌Fusarium graminearum、灰葡萄孢Botrytis cinerea、稻瘟病菌Magnaporthe oryzae以及辣椒疫霉Phytophthora capsici引起的农业病原真菌性病害中的新用途。其结构如下：

Description

一种小檗碱衍生物在抗植物病原菌中的用途
技术领域
本发明属于天然药物化学领域，公开了一种小檗碱衍生物在防治由水稻白叶枯病病原菌Xanthomonas oryzae ACCC 11602、柑橘溃疡病病原菌Xanthomonas axonopodispv.Citri和马铃薯黑胫病病原菌Pectobacterium atroseptica ACCC 19901引起的植物细菌性病害和由核盘菌Sclerotinia sclerotiorum、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、禾谷镰刀菌Fusarium graminearum、灰葡萄孢Botrytis cinerea、稻瘟病菌Magnaportheoryzae以及辣椒疫霉Phytophthora capsici引起的农业病原真菌性病害中的新用途。
背景技术
我国作为农业大国，农业病害对我国国民经济、特别是农业生产常造成重大损失。据统计，我国每年农业病害中，有80％左右是真菌性病害，其次是细菌性病害。在全世界范围内，农业病害严重影响农作物产量。随着现有杀菌剂的长期使用，植物病原菌对大多数植物杀菌剂产生了耐药性。因此，迫切需要研发新型农用杀菌剂。
小檗碱属于异喹啉类生物碱的季胺类化合物，大量研究表明小檗碱具有抗心律失常、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等多种药理作用。近年来，小檗碱在农业方面的研究越来越成为热点。研究者通过细胞生物学，分子生物学等多种生物技术手段研究小檗碱的农用活性，发现小檗碱及其衍生物对多种真菌和细菌有一定的抗菌活性。因此，小檗碱有望作为先导化合物进一步优化以获得高活性农用杀菌剂。
在我们课题组前期进行先导化合物的筛选与优化的过程中，发现一种小檗碱衍生物对植物病原细菌水稻白叶枯病病原菌Xanthomonas oryzae ACCC 11602、柑橘溃疡病病原菌Xanthomonas axonopodis pv.Citri以及马铃薯黑胫病病原菌Pectobacteriumatroseptica ACCC 19901和农业病原真菌核盘菌Sclerotinia sclerotiorum、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、禾谷镰刀菌Fusarium graminearum、灰葡萄孢Botrytis cinerea、稻瘟病菌Magnaporthe oryzae以及辣椒疫霉Phytophthora capsici表现出优异的抑制作用。由此活性结果表明小檗碱衍生物在农药方面具有较好的应用前景，具有进一步开发的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种小檗碱衍生物在抗植物病原菌中的用途，用于防治由水稻白叶枯病病原菌、柑橘溃疡病病原菌、马铃薯黑胫病病原菌、核盘菌、立枯丝核菌、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌、稻瘟病菌以及辣椒疫霉病菌引起的植物病害中的新用途。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方法：
一种小檗碱衍生物作为抗植物病原菌的应用，该化合物的化学结构式如下：
其中，细菌包括水稻白叶枯病病原菌Xanthomonas oryzae ACCC 11602、柑橘溃疡病病原菌Xanthomonas axonopodis pv.Citri、马铃薯黑胫病病原菌Pectobacteriumatroseptica ACCC 19901，真菌包括核盘菌Sclerotinia sclerotiorum、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、禾谷镰刀菌Fusarium graminearum、灰葡萄孢Botrytis cinerea、稻瘟病菌Magnaporthe oryzae以及辣椒疫霉Phytophthora capsici。
本发明提供的一种小檗碱衍生物作为新型杀菌剂，具有以下优势：
1)小檗碱衍生物对植物病原菌具有优异的抑制作用，具有结构简单、原料便宜、易于合成等特点。
2)小檗碱衍生物杀菌活性高。部分植物细菌在低于3.12μg/mL的给药浓度时，抑制率仍在90％以上；部分植物真菌在低于2.50μg/mL的给药浓度时，抑制率仍在50％以上。
3)小檗碱衍生物杀菌谱广泛。小檗碱衍生物对多种农业细菌和农业真菌均具有较好的抑菌活性，可作为先导化合物进一步设计与开发。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，通过以下具体实施例对本发明的上述内容做进一步的详细说明。但不应将此理解为对本发明的限制。下列实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：一种小檗碱衍生物的合成：
本发明所述化合物的合成方法按如下反应式进行：
实验部分：
化合物2合成：在装有23ml 5N氢氧化钠溶液的100ml圆底烧瓶中，加入5g盐酸小檗碱1，再将5ml丙酮缓慢滴加至反应液中。室温下搅拌1h，抽滤，并用80％的甲醇溶液清洗滤渣。真空干燥得到黄色固体粗产物2。
小檗碱衍生物4合成：将4g化合物2溶于适量乙腈溶液，加入1.87g碘化钠和1.5倍当量的化合物3。将反应体系升温至80℃回流搅拌反应4h。反应结束后，真空旋蒸除去溶剂，得粗产品。经柱层析纯化，洗脱剂使用二氯甲烷：甲醇＝20:1(V/V)，得到产物。
小檗碱衍生物4：棕黄色固体；产率91％。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ10.38(s,1H),7.70(d,J＝9.3Hz,1H),7.63(d,J＝9.3Hz,1H),7.36–7.34(m,2H),7.26(s,2H),7.02(d,J＝7.9Hz,2H),6.87(s,1H),6.00(s,2H),5.29(s,1H),4.63(s,2H),4.40(s,3H),4.01(s,3H),3.29(d,J＝6.3Hz,2H),1.31(s,9H).13C NMR(126MHz,Chloroform-d)δ150.41,150.11,149.94,147.16,146.23,145.91,137.46,134.94,133.84,133.45,130.67,127.57,126.35,125.60,121.82,121.20,120.07,109.05,108.52,101.96,63.25,58.20,56.87,36.17,34.53,31.32,28.47.MS(ESI)m/z:482.23(M+,100)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+Calcd forC31H32NO4 +:482.2326,Found:482.2531。
实施例2：小檗碱衍生物抗植物病原细菌活性测定
本实验中所用的菌株为实验室-80℃含30％甘油冻存的菌株。将冻存菌株取出，分别在植物细菌的NB固体培养基(牛肉膏：3g，蛋白胨：5g，酵母粉：1g，蔗糖：10g，琼脂：15g，蒸馏水：1L，pH7.0；121℃灭菌20min)上面进行划线，在28℃(37℃)下恒温培养直到长出单菌落。分别挑取固体培养基上单菌落至植物细菌NB液体培养基(牛肉膏：3g，蛋白胨：5g，酵母粉：1g，蔗糖：10g，蒸馏水：1L；121℃灭菌20min)中，在28℃(37℃)、180rpm恒温摇床振荡培养到对数生长期。将处于对数生长期的菌株用相应的液体培养基稀释至约106CFU/mL备用。将化合物分别用DMSO溶解，加入液体培养基中，混合均匀，配制成浓度为200μg/mL的含药液体培养基。取50μL含药培养基和相同体积的含约106CFU/mL细菌培养物加入到96孔板的孔中，最终给药浓度为100μg/mL。含等量DMSO的相同浓度100μL菌液做对照。将96孔板在28℃(37℃)恒温培养箱中培养24-48h直至对照组菌液长出，在酶标仪上测定孔中菌液的OD值(OD600)。并且另外测定100μL液体培养基和浓度为100μg/mL药剂的OD值，对培养基和药剂本身造成的OD值进行矫正。校正OD值和抑制率的计算公式如下：
校正OD值＝含菌培养基OD值-无菌培养物OD值；
抑制率＝(校正后对照培养基菌液OD值-校正后含药培养基OD值)/校正后对照培养基菌液OD值×100％
所有实验设置三个重复，将活性化合物的含药液体培养基在96孔板中通过二倍稀释法稀释得到系列浓度的50μL含药培养基，然后根据实施例2中相同的试验方法测定系列浓度对应的抑制率。测定得到化合物的抑制率见表1，MIC值见表2。
表1.小檗碱衍生物对植物病原细菌的抗菌活性
注：“-”表示化合物的抗菌活性未测定
表2.小檗碱衍生物对植物病原细菌的MIC90值
注：“-”表示化合物的抗菌活性未测定
由表1、2生测结果可知，本发明涉及的一种小檗碱衍生物4对测定菌株均表现出优异的抑制作用，其在100μg/mL时对测试菌株水稻白叶枯病病原菌和柑橘溃疡病病原菌的抑制率均大于90％。降浓度后发现，一种小檗碱衍生物4在3.12μg/mL时对测试菌株水稻白叶枯病病原菌的抑制率仍大于90％。
综上所述，本发明所述的一种小檗碱衍生物4对植物病原细菌表现出优异的抑制作用，与商业化阳性药和盐酸小檗碱相比活性较强。具有进一步研究和开发的价值。
实施例3：小檗碱衍生物抗农业病原真菌活性测定
本实验中所用的农业病原菌为实验室4℃保存的菌种，采用的培养基为马铃薯琼脂葡萄糖培养基(简称PDA)。PDA培养基配方：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，自然PH。
PDA培养基配置方法：将马铃薯洗净去皮，称200g切成小块，蒸馏水煮20min左右(土豆块软而不烂)，用八层纱布过滤，用蒸馏水将滤液补足至1000mL，加入15g琼脂，20g葡萄糖，搅拌使其充分溶解后，分装于三角瓶中，121℃灭菌20分钟，冷却后备用。室内活性测定采用菌丝生长速率法。
菌种活化：将农业病原菌在PDA平板上25℃培养3～6天。
制备药板：将PDA培养基加热熔化，冷却至45-50℃，分别加入不同浓度混配物制成带药平板。
接种培养：在超净台中，用打孔器在培养3～6天的菌丝边缘(生长状况尽量一致)打取菌饼(直径5mm)，再用接种针挑至药板中央，然后在培养箱(25℃)中倒置培养。
结果测定：空白对照组菌丝长满后，采用十字交叉法测得给药组菌丝的生长直径，计算抑制率。
抑制率(％)＝(对照菌丝直径-处理菌丝直径)/(对照菌丝直径-菌饼直径)×100，每个浓度设置3次平行实验，测定得到化合物的抑制率见表3。
表3.小檗碱衍生物抗农业病原真菌抑菌效果(浓度200μg/mL)
由上述结果表明本发明涉及的小檗碱衍生物4对部分病原菌抑菌效果表现优异，通过降浓度，利用SPSS软件求出半数效应浓度(EC50)。测定得到的活性数据见表4。
表4.小檗碱衍生物抗农业病原真菌的EC50值
注：“-”表示化合物的抗菌活性未测定
由表3、4生测结果可知，本发明涉及的小檗碱衍生物4对所测试病原真菌具有一定的抗菌活性，特别是对核盘菌、灰葡萄孢、乔禾镰刀菌和辣椒疫霉表现出较高的活性且优于阳性对照药和盐酸小檗碱，其EC50分别为2.53μg/mL、1.47μg/mL、5.99μg/mL和4.19μg/mL，且小檗碱衍生物对灰葡萄孢的活性最好。综上所述，本发明所述的小檗碱衍生物在农业上具有进一步研究和开发的价值。

Claims (1)

1.一种小檗碱衍生物在防治植物病原细菌或植物病原真菌中的用途，其具有如下的分子结构特征：所述植物病原细菌为水稻白叶枯病病原菌、柑橘溃疡病病原菌或马铃薯黑胫病病原菌；所述植物病原真菌为立枯丝核菌、核盘菌、禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌、稻瘟病菌或辣椒疫霉菌。
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