CN114401739A - 能够在鼻腔诱导病毒特异性抗体的季节性流感疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种有效性比裂解疫苗高的季节性流感疫苗。本发明的季节性流感疫苗是在鼻腔粘膜诱导病毒特异性抗体的流感疫苗，以流感病毒灭活全颗粒为有效成分，每1次以抗原量计皮内给药15μgHA/株以上。

Description

能够在鼻腔诱导病毒特异性抗体的季节性流感疫苗

技术领域

本发明涉及一种能够在鼻腔诱导病毒特异性抗体应答的有效性高的流感疫苗。

背景技术

冬季流行的流感是以流感病毒为病原体的急性呼吸道传染病，经由喷嚏等的飞沫或与附着有飞沫的物品的接触来传播。在该流感大流行的季节，由流感和其相关疾病导致的死亡人数增加，这在老年人中特别显著。该现象是发达国家中所共通的现象，在老年人的比率急剧增加的日本也是严重的社会问题。

作为预防该季节性流感最为有效的方法之一，可举出疫苗。目前，日本所使用的流感疫苗是使用裂解抗原的疫苗，该裂解抗原是通过表面活性剂或醚使病毒粒子解裂而得的。具体而言，混合有A/H1N1亚型、A/H3N2亚型、B/Yamagata系统和B/Victoria系统的各抗原的多价裂解疫苗通过皮下给药进行接种。已知该裂解疫苗在疫苗株与流行株的抗原性一致的情况下，显示40～60％左右的有效性。美国的研究报告显示，虽然该裂解疫苗的有效性为40％，看似较低，但通过使40％的国民接种，分别使流感感染者减少2100万人，使因流感而入院者减少13万人，使死亡人数减少6万人(非专利文献1)。

另一方面，在临床现场期望有效性更高的流感疫苗，因此在2013年的厚生科学审议会预防接种、疫苗分科会研究开发和生产流通部会上也举出有效性高的流感疫苗作为开发优先度高的疫苗。欧美已批准经鼻减毒活疫苗、佐剂制剂和高效价疫苗之类的有效性高的流感疫苗，它们是以免疫应答弱的老年人或幼儿为对象的疫苗，并非以所有年龄层为对象。另外，近年来也有经鼻减毒活疫苗的有效性差于裂解疫苗的有效性的研究报告(非专利文献2)，在期待较高有效性的流感疫苗中，其效力尚未确立。

因此，现状是仍然期望开发出有效性高的流感疫苗。

目前的季节性流感疫苗的有效性的基准由欧洲药品管理局(European MedicinesAgency：EMA)的准则来规定(非专利文献3)，以血清的HI抗体效价或SRH抗体效价作为指标。但是，流感病毒是在呼吸道局部增殖并发挥病原性的病毒，血中的抗体对该呼吸道局部的感染显示效力的机制并未明确。

因此，必须明确与流感病毒的感染防御或发病阻止直接相关的免疫学指标，并根据该免疫学指标来创造出有效性高的疫苗。

现有技术文献]

非专利文献

非专利文献1：Sah P,Medlock J,Fitzpatrick MC,Singer BH,GalvaniAP.Optimizing the impact of low-efficacy influenza vaccines.Proc Natl AcadSci U S A.2018May 15；115(20):5151-5156.

非专利文献2：Jackson ML,Chung JR,Jackson LA,Phillips CH,Benoit J,MontoAS,Martin ET,Belongia EA,McLean HQ,Gaglani M,Murthy K,Zimmerman R,Nowalk MP,Fry AM,Flannery B.Influenza Vaccine Effectiveness in the United States duringthe 2015-2016Season.N Engl JMed.2017Aug 10；377(6):534-543.

非专利文献3：Note for guidance on harmonization of requirements forinfluenza vaccines.(CPMP/BWP/214/96)

发明内容

本发明提供一种有效性高于裂解疫苗的季节性流感疫苗。

本申请发明人等进行了深入研究，结果发现，针对季节性流感病毒的灭活全颗粒疫苗在鼻腔粘膜中的病毒特异性抗体(IgG)诱导能力高，该粘膜的IgG对上呼吸道中的病毒排除有效地发挥作用。然后，进一步进行了研究，结果发现，通过以高用量皮内给药该灭活全颗粒疫苗，与以往的给药裂解疫苗相比，鼻腔粘膜的病毒特异性抗体诱导显著提高。

即，本发明涉及以下的1)～8)。

1)一种季节性流感疫苗，是在鼻腔粘膜诱导病毒特异性抗体的流感疫苗，以流感病毒灭活全颗粒为有效成分，每1次以抗原量计皮内给药15μgHA/株以上。

2)根据1)所述的疫苗，其中，流感病毒的灭活全颗粒含有季节性A型流感病毒株或B型流感病毒株中的任一者或两者。

3)一种用于皮内给药的季节性流感疫苗组合物，以血凝素量计每1株含有15μg以上的流感病毒的灭活全颗粒。

4)根据3)所述的疫苗组合物，其中，不含有佐剂。

5)根据1)或2)所述的疫苗、或者3)或4)所述的疫苗组合物，其中，通过皮内针或微针进行给药。

6)一种季节性流感病毒灭活全颗粒的应用，用于制造在鼻腔粘膜诱导病毒特异性抗体的流感疫苗，每1次皮内给药15μgHA/株以上的上述病毒灭活全颗粒。

7)一种病毒灭活全颗粒，是在鼻腔粘膜诱导病毒特异性抗体的流感疫苗疗法中使用的季节性流感病毒灭活全颗粒，每1次皮内给药15μgHA/株以上。

8)一种季节性流感疫苗疗法，是在鼻腔粘膜诱导病毒特异性抗体的流感疫苗疗法，每1次皮内给药15μgHA/株以上的流感病毒灭活全颗粒。

根据本发明，能够提供一种鼻腔粘膜中的病毒特异性抗体诱导能力高、上呼吸道中的病毒排除效果优异的季节性流感疫苗，作为附加价值较高的预防药的创制，能够对医药品产业做出较大贡献。

附图说明

图1是皮下给药疫苗时的血清对B/Phuket/3073/2013株的HI抗体效价。

图2是皮下给药疫苗时的鼻腔清洗液对B/Phuket/3073/2013株的IgG效价。

图3是接种病毒3天后的鼻腔清洗液的病毒含量。

图4A是鼻腔清洗液对A/Singapore/GP1908/2015株的IgG效价。

图4B是鼻腔清洗液对A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016株的IgG效价。

图4C是鼻腔清洗液对B/Phuket/3073/2013株的IgG效价。

图4D是鼻腔清洗液对B/Maryland/15/2016株的IgG效价。

图5是鼻腔清洗液对A/Singapore/GP1908/2015株的中和抗体效价。

具体实施方式

以下对本发明的优选的实施方式详细地进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。

本发明中，“季节性流感疫苗”是季节性流感的疫苗，是指至少包含季节性A型流感病毒或B型流感病毒中的任一者的抗原的疫苗。即，本发明的季节性流感疫苗可以为仅包含季节性A型流感病毒或B型流感病毒中的一者的单价疫苗，也可以为包含这两者的多价疫苗，优选为含有至少3种以上的流感病毒株、例如2种A型流感病毒株和1或2种B型流感病毒株的三价以上的疫苗，优选可举出四价疫苗。更优选可举出包含2种A型株(A/H1N1亚型株和A/H3N2亚型株)、2种B型株(B/Victoria系统株和B/Yamagata系统株)的四价疫苗。

本发明中，在提及“流感病毒”的情况下，表示季节性A型流感病毒或B型流感病毒、或者这两者。另外，流感病毒包含目前已知的所有亚型和将来会被分离、鉴定出的亚型。

本发明的疫苗制备中使用的流感病毒株可以为从感染动物或患者分离出的株，也可以为通过基因工程在培养细胞中构建的重组病毒。

本发明的季节性流感疫苗的抗原即“流感病毒灭活全颗粒”是指保持培养季节性流感病毒而得到的病毒的形态，且经灭活处理的病毒粒颗粒。

本发明的流感病毒灭活全颗粒可以使用鸡胚法或细胞培养法来制备。

“鸡胚法”是指将病毒株接种于孵化鸡蛋进行培养后，将病毒悬浮液澄清、浓缩、纯化和灭活而得到包含病毒粒子的病毒液的方法。另外，“细胞培养法”是指将病毒株接种于培养细胞进行培养后，与上述鸡胚法同样地由培养上清液得到包含病毒粒子的病毒液的方法。

这里，培养是接种流感病毒株，以30～37℃进行1～7天左右，优选以33～35℃进行2天左右。培养结束后，回收病毒悬浮液(感染尿囊腔液或感染细胞培养上清液)，进行离心分离或过滤而使其澄清。接着，进行钡盐吸附溶出反应或超滤而使其浓缩。病毒纯化可以使用蔗糖密度梯度离心分离等超离心分离或液相色谱等方法来进行。

对纯化病毒液进行灭活处理。病毒的灭活方法可举出福尔马林处理、紫外线照射、利用β-丙内酯、二乙烯亚胺等进行的处理。

如后述的实施例所示，在每1株以血凝素(HA)计皮内给药15μg以上的4种流感病毒灭活全颗粒的情况下，鼻腔中的病毒特异性抗体诱导能力显著提高，与裂解疫苗的皮内和皮下给药相比，能够提前实现更高的抗体诱导(图4A-4D)。上述鼻腔的病毒特异性抗体诱导效率良好的疫苗的病毒中和活性高，在鼻腔中具有较高的病毒排除能力(图5)。

因此，皮内给药15μgHA/株以上的流感病毒灭活全颗粒可成为在鼻腔粘膜诱导病毒特异性抗体的季节性流感的疫苗疗法。换言之，流感病毒的灭活全颗粒可成为在鼻腔粘膜诱导病毒特异性抗体的季节性流感疫苗，且皮内给药15μgHA/株以上的疫苗。

这里，在鼻腔粘膜诱导病毒特异性抗体是指例如在鼻腔粘膜中对经疫苗接种的流感病毒抗原所产生的中和抗体效价为80以上，优选为160以上。这里，中和抗体效价可通过评价病毒对MDCK细胞的细胞损伤的抑制活性而测定。

本发明的季节性流感疫苗可制剂成用于皮内给药的疫苗组合物(以下称为“本发明的疫苗组合物”)。

本发明中皮内给药是指给药至皮肤的真皮，并非是指所给药的疫苗组合物仅存在于真皮。真皮层的厚度因个体间和个体内的部位差异而不同，因此所皮内给药的疫苗组合物也有可能仅存在于皮内或主要存在于皮内，或者存在于表皮内，本发明的皮内给药包括这些情况。

皮肤由表皮、真皮和皮下组织这3层构成。表皮为从皮肤表面起0.05～0.2mm的层，真皮为存在于表皮与皮下组织之间的1.5～3.0mm的层，皮下组织为存在于真皮的内侧的3.0～10.0mm的层。给药至真皮的皮内给药使用比皮下给药用针细且短的针，因此，与皮下或肌肉内给药的现有的疫苗相比，可实现减轻针刺时的疼痛、精神负担。

本发明的疫苗组合物除流感灭活全颗粒以外，还可以进一步包含作为医药可允许的载体。作为该载体，可举出疫苗的制造中通常使用的载体，具体而言，可例示缓冲剂、乳化剂、防腐剂(例如硫柳汞)、等渗剂、pH调节剂、灭活剂(例如福尔马林)、佐剂或免疫刺激剂等。佐剂是通过与抗原一起给药而增强对该抗原的免疫应答的物质，本发明的疫苗组合物如上所述作为疫苗抗原的流感灭活全颗粒本身具有较高的抗体诱导能力，因此未必需要添加佐剂，能够制成不含有佐剂的组合物。

本发明的疫苗组合物中的流感病毒灭活全颗粒的含量以血凝素量计每1株病毒为15μg以上，即15μgHA/株以上，优选为15～60μgHA/株，更优选为15～21μgHA/株。应予说明，血凝素含量是通过利用一元放射免疫扩散试验法等由WHO或国家基准所规定的试验法进行测定而得到的值。

本发明的疫苗组合物的1次的给药量只要以抗原(流感病毒灭活全颗粒)计每1株病毒为15μgHA以上即可，可考虑对象的年龄、性别、体重等而适当地增量，可举出以优选为15～60μgHA/株、更优选为15～21μgHA/株、进一步优选为15μgHA/株的方式给药1次或2次以上。优选给药多次，此时，优选隔1～4周进行给药。

作为本发明的疫苗组合物的1次的皮内给药容量，可根据给药部位或给药装置而决定，通常为0.05～0.5mL左右，优选为0.1～0.3mL，更优选为0.2mL。

作为用于皮内给药本发明的疫苗组合物的给药装置，可使用能够给药至皮内的皮内针或微针，例如是针管的突出长度为0.9mm～1.5mm、优选为1.0～1.2mm、更优选为1.2mm的皮内针或微针。

皮内给药装置的针管可以为1根，也可以为多根，优选为1～3根，更优选为具有3根针管的皮内针。

本发明的疫苗组合物的给药对象可举出人和除人以外的哺乳动物，优选为人。作为除人以外的哺乳动物，例如可举出大鼠、豚鼠、兔、猪、牛、马、山羊、绵羊、狗、猫、恒河猴、食蟹猴、红毛猩猩、黑猩猩等。

实施例

以下，通过实施例具体地说明本发明，但本发明并不受这些实施例任何限定。

参考例1利用灭活全颗粒疫苗在鼻腔诱导病毒特异性IgG

将流感HA疫苗“生研”的B/Yamagata系统(B/Phuket/3073/2013株)的原液作为裂解抗原，以每0.2mL中血凝素成为15μgHA的方式通过含1w/w％蔗糖的6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH值7.2)进行调整，将其作为裂解疫苗。另外，如以下记载那样制备的B/Yamagata系统(B/Phuket/3073/2013株)的灭活全颗粒抗原也同样地以每0.2mL中血凝素成为15μgHA的方式通过含1w/w％蔗糖的6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH值7.2)进行调整，将其作为灭活全颗粒疫苗。

本参考例中使用的灭活全颗粒抗原的制备如下所述。将B/Phuket/3073/2013株的病毒接种于12天龄的鸡胚的绒毛尿囊膜腔内，培养3天后采集绒毛尿囊膜腔液。通过过滤器过滤对所采集的绒毛尿囊膜腔液进行澄清后，使其吸附于硫酸钡盐，通过12％柠檬酸钠溶液溶出而回收流感病毒。所回收的病毒进一步通过如下方式纯化：通过超滤置换成6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH值7.2)，缓冲液置换后通过蔗糖密度梯度离心来回收包含流感病毒的级分。在该纯化流感病毒中以最终浓度成为0.05％的方式添加作为灭活剂的β-丙内酯，通过4℃、24小时的反应使流感病毒的感染性灭活。在该灭活反应后通过超滤(MWCO：100000)将缓冲液置换成含1w/w％蔗糖的6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH值7.2)，将其作为灭活全颗粒疫苗。

将如上制备的给药液(表1)以每1只0.2mL的方式给药至BALB/c小鼠(雌，5周龄)的皮下，在自给药起21、42和63天后进行全采血(各时间点分别从8只小鼠采血)。另外，同样地以21天的间隔给药2次各给药液，在从第1次给药起42和62天后(从第2次给药起分别为21及42天后)进行全采血。

全采血后，从上颚的咽侧插入自动移液器，使含有0.175％BSA和蛋白酶抑制剂(Thermo Fisher Scientific公司)的D-PBS流入，将从外鼻孔回收的溶液作为鼻腔清洗液。对于所采集的血液，通过离心分离来制备血清，测定血清对B/Phuket/3073/2013株的HI抗体效价。另外，对鼻腔清洗液测定与B/Phuket/3073/2013株结合的IgG效价。

[表1]

※自第1次给药日起算

血清对B/Phuket/3073/2013株的HI抗体效价如图1所示。在1次给药组的比较中，与灭活全颗粒疫苗相比，裂解疫苗的抗体诱导慢，因此在第21天，裂解疫苗给药组的抗体效价低，但在第42天和第63天，裂解疫苗给药组的抗体效价逐渐提高，在第42天以后，所有疫苗给药组的抗体效价均为相同程度。另外，在2次给药组中，灭活全颗粒疫苗在第42天和第63天为相同程度的抗体效价，但裂解疫苗从第42天至第63天确认到抗体效价稍微降低的趋势。因此，在第42天，灭活全颗粒疫苗与裂解疫苗的HI抗体效价相同，但在第63天显示灭活全颗粒疫苗的HI抗体效价高的趋势。

鼻腔清洗液的病毒特异性IgG效价如图2所示，在1次给药组的比较中，裂解疫苗给药组的抗体效价从第21天至第63天逐渐提高，但抗体效价相对较低，与此相对，灭活全颗粒疫苗给药组系绘制以第42天为峰的钟形，显示与HI抗体效价不同的趋势。因此，对于第42天和第63天时的血清的HI抗体效价，虽然所有疫苗均为相同程度，但鼻腔清洗液的病毒特异性IgG效价在第42天时，灭活全颗粒疫苗给药组显示显著高于裂解疫苗给药组的抗体诱导。

另外，在2次给药组中，虽然裂解疫苗给药组的病毒特异性IgG效价在第42天的鼻腔清洗液中提高，但抗体效价低于灭活全颗粒疫苗给药组。进而，在第63天(从第2次给药起42天后)的比较中，灭活全颗粒疫苗给药组的抗体效价为上升趋势，与此相对，裂解疫苗给药组显示抗体效价降低的趋势，对于鼻腔粘膜的病毒特异性IgG的持续性，也认为灭活全颗粒疫苗优异。

参考例2病毒攻击试验

与参考例1同样地，以每0.2mL中血凝素成为15μgHA的方式通过含1w/w％蔗糖的6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH值7.2)对B/Victoria系统(B/Texas/2/2013株)的裂解抗原或灭活全颗粒抗原进行调整，将其作为裂解疫苗或灭活全颗粒疫苗。

将如上制备的给药液(表2)以每只0.2mL的方式皮下给药至BALB/c小鼠(雌，5周龄)，给药1次或者以3周间隔给药2次。对照组以3周间隔皮下给药生理盐水(大冢制药工场)2次。从第1次给药起42天后，在异氟醚麻醉下将B/Victoria系统的B/Brisbane/60/2008株以1×10⁴TCID₅₀/10μL/head病毒接种于鼻腔。从病毒接种起3天后使各小鼠放血致死，其后通过与参考例1相同的方法回收鼻腔清洗液。

通过qPCR测定所回收的鼻腔清洗液中所含的病毒量，比较评价鼻腔粘膜中的病毒的排除能力。

[表2]

病毒接种3天后的鼻腔清洗液的病毒含量如图3所示。通过皮下给药灭活全颗粒疫苗，鼻腔粘膜中的病毒特异性IgG在1次给药42天后和2次给药后提高(参考例1)，即便在病毒攻击试验中在上述时间点接种的情况下，也几乎未检测出病毒。另一方面，在皮下给药裂解疫苗时，可能是因为1次给药42天后鼻腔粘膜的病毒特异性IgG效价低，因此虽然与对照群相比，病毒含量稍微降低，但确认到鼻腔清洗液的病毒含量高。但是，在皮下给药裂解疫苗时，也由于通过给药2次而第42天的鼻腔粘膜中的病毒特异性IgG效价提高(参考例1)，因此2次给药组的病毒含量小于对照的十分之一，确认到鼻腔粘膜中的病毒含量显著降低。

由这些结果表明以高水平诱导鼻腔粘膜的病毒特异性IgG效价关系到流感疫苗的有效性。

实施例1皮内给药流感疫苗时的鼻腔粘膜的抗体诱导评价

使用与参考例1同样地制备的4株(A/H1N1、A/H3N2、B/Yamagata系统、B/Victoria系统)裂解抗原和灭活全颗粒抗原制备灭活全颗粒疫苗和裂解疫苗。供于皮内给药的疫苗以每0.2mL中血凝素成为15、3或0.6μgHA的方式通过含1w/w％蔗糖的6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH值7.2)进行调整，供于皮下给药的疫苗以每0.5mL中血凝素成为15、3或0.6μgHA的方式通过含1w/w％蔗糖的6.7mM磷酸缓冲生理盐水(pH值7.2)进行调整。

将如上制备的给药液(表3-1、表3-2)以3周间隔2次给药至SD大鼠(雄，9周龄)的后背部，皮内给药每1只给药0.2mL，皮下给药每1只给药0.5mL，在第2次给药的21天后在异氟醚麻醉下除血，其后采集鼻腔清洗液。鼻腔清洗液的采集方法与参考例1同样地，从上颚的咽侧插入自动移液器，使含有0.175％BSA和蛋白酶抑制剂(Thermo Fisher Scientific公司)的D-PBS流入，将从外鼻孔回收的溶液作为鼻腔清洗液。应予说明，皮内给药使用PASKIN3根针(南部化成，34G，1.2mm)。

所回收的鼻腔清洗液供于测定与各疫苗株结合的病毒特异性IgG效价以及测定对A/Singapore/GP1908/2015株的中和抗体效价。

[表3-1]

[表3-2]

鼻腔清洗液的病毒特异性IgG效价的结果如图4A～D所示。对A/Si ngapore/GP1908/2015株(A/H1N1亚型)和A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016株(A/H3N2亚型)的IgG效价在灭活全颗粒疫苗的皮内给药组或灭活全颗粒疫苗的皮下给药组的高用量下确认到诱导，在其它组中几乎未诱导(图4A和B)。另外，在鼻腔粘膜中确认到病毒特异性IgG的诱导的组中，在皮内给药了灭活全颗粒疫苗的15μgHA/株/head的组中确认到诱导效率最高。因此，为了诱导对A型病毒的鼻腔粘膜的病毒特异性IgG，灭活全颗粒疫苗的给药是有效的，特别是通过以高用量皮内给药灭活全颗粒疫苗，能够实现高的抗体诱导。

另外，关于对B/Phuket/3073/2013株和B/Maryland/15/2016株的IgG效价，也在灭活全颗粒疫苗的皮内给药组中显示最高的诱导(图4C和D)。在B型时，在裂解疫苗的皮内给药组中也确认到在鼻腔粘膜诱导病毒特异性IgG，但可知在皮下给药与现行的流感疫苗相同的裂解疫苗(SV(S.C.))时，诱导效率最低。因此，认为对A型和B型的任一病毒均能够有效地在鼻腔粘膜诱导特异性IgG的是皮内给药灭活全颗粒疫苗。

图5中示出鼻腔清洗液对A/Singapore/GP1908/2015株(A/H1N1亚型)的中和抗体效价的结果，但仅皮内给药灭活全颗粒疫苗的15μgHA/株/head的组显示高的病毒中和活性。

因此，在鼻腔粘膜的病毒特异性IgG效价的结果中，灭活全颗粒疫苗(15μgHA/株/head)的皮内给药对所有株的IgG效价均高，另外，病毒的中和活性也最高。即，通过皮内给药高用量的灭活全颗粒疫苗，在鼻腔粘膜排除病毒的抗体诱导提高，成为有效性比现行疫苗高的流感疫苗。

Claims (8)

1.一种季节性流感疫苗，是在鼻腔粘膜诱导病毒特异性抗体的流感疫苗，以流感病毒灭活全颗粒为有效成分，每1次以抗原量计皮内给药15μgHA/株以上。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其中，流感病毒的灭活全颗粒含有季节性A型流感病毒株或B型流感病毒株中的任一者或两者。

3.一种用于皮内给药的季节性流感疫苗组合物，以血凝素量计每1株含有15μg以上的流感病毒的灭活全颗粒。

4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，不含有佐剂。

5.根据权利要求1或2的疫苗、或者权利要求3或4的疫苗组合物，其中，所述疫苗或疫苗组合物通过皮内针或微针进行给药。

6.一种季节性流感病毒灭活全颗粒的应用，用于制造在鼻腔粘膜诱导病毒特异性抗体的流感疫苗，每1次皮内给药15μgHA/株以上的所述病毒灭活全颗粒。

7.一种病毒灭活全颗粒，是在鼻腔粘膜诱导病毒特异性抗体的流感疫苗疗法中使用的季节性流感病毒灭活全颗粒，每1次皮内给药15μgHA/株以上。

8.一种季节性流感疫苗疗法，是在鼻腔粘膜诱导病毒特异性抗体的流感疫苗疗法，每1次皮内给药15μgHA/株以上的流感病毒灭活全颗粒。

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