JPWO2015152360A1 - 不活化全粒子ワクチンを含有するマイクロニードルアレイ製剤およびその投与方法 - Google Patents
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Abstract
抗体産生能を向上させることができ、簡便にインフルエンザワクチンを投与することのできるマイクロニードルアレイを提供する。不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包する針部と、シート部と、を含むマイクロニードルアレイ。マイクロニードルアレイを投与した後、２４時間以上２ヶ月未満の間隔をあけて２回目の投与を行う投与方法。
Description
本発明は、不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包するマイクロニードルアレイに関する。
インフルエンザは、呼吸器飛沫感染を介して拡散するインフルエンザウイルスによって引き起こされる急性の伝染性呼吸器疾患である。インフルエンザの予防には、インフルエンザワクチンを接種する方法が有効と考えられ、最近では、特に新型インフルエンザに対応したプレパンデミックワクチンの開発が進んでいる。
インフルエンザワクチンは、弱毒化生ワクチン、不活化全粒子ワクチン、不活化スプリットワクチンの３種類に分類される。現在、日本において不活化スプリットワクチンが広く使用されている。
ワクチンの効率的な投与方法として、マイクロニードルアレイによるインフルエンザワクチンの投与方法が提案されている。特許文献１には、インフルエンザワクチンの経皮デリバリー装置および投与方法が開示されている。
特許文献２には、Ａ型（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ型（Ｈ３Ｎ２）株およびＢ型株を有効成分とする抗原からなるインフルエンザワクチンをコーティングしたポリ乳酸製のマイクロニードルを備えるマイクロニードルデバイスが開示されている。
非特許文献３には、三価季節性インフルエンザＨＡ抗原を装填した皮膚内溶解型マイクロニードルを作製し、ヒトにおける免疫誘導特性が評価されている。
日本薬剤学会第２８年会要旨集 口頭発表Ｎｏ．２３−３−１４ 「臨床研究におけるインフルエンザ経皮ワクチン製剤の免疫誘導特性に関する解析」
不活化スプリットワクチンは、日本において広く使用されているが、有効性が低い。また、インフルエンザの大流行を想定した場合、少ないワクチン量で多くのヒトの免疫を惹起させることが重要であり、ワクチンの効率的で簡便な投与方法が必要とされる。
特許文献１は、このインフルエンザワクチンの経皮デリバリー装置による投与量と抗体産生量の相関について確認していない。また、特許文献２および非特許文献３では 上述のようにマイクロニードルアレイによりインフルエンザワクチンを投与する方法が検討されているが、スプリットワクチンが使用されており、ワクチンの投与量に対して抗体の産生量が十分ではなかった。また、そのため、インフルエンザワクチンを効率的で簡便に投与することのできる、さらに優れたマイクロニードルアレイの開発が強く求められている。
本発明の目的は、抗体産生能を向上させることができ、簡便にインフルエンザワクチンを投与することのできるマイクロニードルアレイを提供することにある。
本発明の目的は、抗体産生能を向上させることができ、簡便にインフルエンザワクチンを投与することのできるマイクロニードルアレイを提供することにある。
このような状況下において、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包する針部と、シート部とを組み合わせたマイクロニードルアレイを投与することで、抗体産生能に優れることを見出し、本発明を完成させた。
本発明は下記を提供する。
［１］ 不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包する針部と、シート部と、を含むマイクロニードルアレイ。
［２］ 針部が水溶性高分子を含み、体内に挿入された後に溶解する［１］に記載のマイクロニードルアレイ。
［３］ 水溶性高分子が、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも１種である［２］に記載のマイクロニードルアレイ。
［４］ インフルエンザワクチンがＡ／Ｈ１Ｎ１型、Ａ／Ｈ３Ｎ２型、Ａ／Ｈ５Ｎ１型、およびＢ型からなる群より選択される少なくとも１種である［１］〜［３］のいずれか１つに記載のマイクロニードルアレイ。
［５］ 不活化全粒子インフルエンザワクチンの全質量に対する９０質量％以上が、針部の高さに対して先端から８０％以内に含まれる［１］〜［４］のいずれか１つに記載のマイクロニードルアレイ。
［６］ 不活化全粒子インフルエンザワクチンの全質量に対する９０質量％以上が、針部の先端から５００μｍ以内に含まれる［１］〜［４］のいずれか１つに記載のマイクロニードルアレイ。
［７］ ［１］〜［６］のいずれか１つに記載のマイクロニードルアレイを投与した後、２４時間以上２ヶ月未満の間隔をあけて２回目の投与を行う投与方法。
［１］ 不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包する針部と、シート部と、を含むマイクロニードルアレイ。
［２］ 針部が水溶性高分子を含み、体内に挿入された後に溶解する［１］に記載のマイクロニードルアレイ。
［３］ 水溶性高分子が、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも１種である［２］に記載のマイクロニードルアレイ。
［４］ インフルエンザワクチンがＡ／Ｈ１Ｎ１型、Ａ／Ｈ３Ｎ２型、Ａ／Ｈ５Ｎ１型、およびＢ型からなる群より選択される少なくとも１種である［１］〜［３］のいずれか１つに記載のマイクロニードルアレイ。
［５］ 不活化全粒子インフルエンザワクチンの全質量に対する９０質量％以上が、針部の高さに対して先端から８０％以内に含まれる［１］〜［４］のいずれか１つに記載のマイクロニードルアレイ。
［６］ 不活化全粒子インフルエンザワクチンの全質量に対する９０質量％以上が、針部の先端から５００μｍ以内に含まれる［１］〜［４］のいずれか１つに記載のマイクロニードルアレイ。
［７］ ［１］〜［６］のいずれか１つに記載のマイクロニードルアレイを投与した後、２４時間以上２ヶ月未満の間隔をあけて２回目の投与を行う投与方法。
本発明のマイクロニードルアレイを用いれば、注射による投与に比べて、不活化全粒子インフルエンザワクチンを簡便な操作で投与することができる。また、注射による投与に比べて、少量のワクチン量でも抗体産生能を向上させることができる。
以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明する。本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。また、本発明の目的の範囲内において適宜変更を加えて実施することができる。
図１は本発明のマイクロニードルアレイの一例を示す断面図である。図１に示すように、本発明のマイクロニードルアレイは、不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包する針部１１とシート部１２から形成される。
本発明のマイクロニードルアレイは、不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包する。
不活化全粒子インフルエンザワクチンとは、インフルエンザウイルスを培養して得られたウイルス浮遊液からウイルスの形態を保持したままで不活化されたウイルス粒子を意味し、スプリットワクチンは含まれない。
インフルエンザワクチンは、その型に限定されるものではなく、Ａ型、Ｂ型を含み、シーズン性ワクチンおよびパンデミックワクチンを含む。Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１〜１６から選ばれる型と、Ｎ１〜９から選ばれる型との組み合わせによる亜型が存在する。本発明においては、Ａ／Ｈ１Ｎ１型、Ａ／Ｈ３Ｎ２型、Ａ／Ｈ５Ｎ１型、およびＢ型からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
不活化全粒子インフルエンザワクチンとは、インフルエンザウイルスを培養して得られたウイルス浮遊液からウイルスの形態を保持したままで不活化されたウイルス粒子を意味し、スプリットワクチンは含まれない。
インフルエンザワクチンは、その型に限定されるものではなく、Ａ型、Ｂ型を含み、シーズン性ワクチンおよびパンデミックワクチンを含む。Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１〜１６から選ばれる型と、Ｎ１〜９から選ばれる型との組み合わせによる亜型が存在する。本発明においては、Ａ／Ｈ１Ｎ１型、Ａ／Ｈ３Ｎ２型、Ａ／Ｈ５Ｎ１型、およびＢ型からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
本発明のマイクロニードルアレイは針部を含む。針部は、不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包し、針部が皮膚または粘膜に穿刺されることで、経皮または経粘膜からの投与が可能となる。
針部の形状は先端を有する凸状構造であれば特に限定されず、先鋭な先端を有する針形状および先の尖っていない先端を有する形状を含むが、先鋭な先端を有する形状が好ましい。具体的には、円錐状構造、三角錘状構造、四角錘状構造などの多角錘構造、円錐台構造、三角錐台構造、四角錘台構造などの多角錘台構造などが挙げられ、円錐状構造、三角錘状構造、四角錘状構造が好ましく、円錐状構造がより好ましい。
本発明のマイクロニードルアレイの針部は、図２の針部２１と針部２２、図３の針部３１〜３４に示すように、針部の側面の傾きが非連続的に変化する、二層ないしそれ以上の多層構造をとることができる。多層構造とした場合に、針の先端を含む層から順に針部第一層、針部第二層、と呼ぶ。図２の針部第一層２１と針部第二層２２、または図３の針部第一層３１と針部第三層３３のように、針部第一層よりもシート部に近い少なくとも１つの層における側面のなす角度θ２（図２の針部第二層２２、図３の針部第三層３３の場合は、針先端部方向に延長した時の交点のなす角度）が針部第一層における側面のなす角度θ１よりも大きいことが好ましい。このような構造をとることで、針部全体の体積が大きくなり、マイクロニードルアレイ作製時により多くの薬剤を針部の上端部に集中させることができる。
本発明のマイクロニードルアレイの針部は、側面のなす角度を、図４の針部４１に示すように、連続的に変化させた構造をとることもできる。
本発明のマイクロニードルアレイの針部は、側面のなす角度を、図４の針部４１に示すように、連続的に変化させた構造をとることもできる。
本発明のマイクロニードルアレイの針部は、図５の針部上端部５１に示すように、不活化全粒子インフルエンザワクチンを針部上端部に効率的に集中させることが好ましい。これにより、投与効率をさらに向上させることができる。また、針部の下端部およびシート部に同じ材料を選択することで製造効率が向上するため、好ましい。
針部の高さは、図１のＨのように、針先端からシート部へ下ろした垂線の長さで表す。針部の高さは５０μｍ以上２０００μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以上１５００μｍ以下であることがより好ましく、２００μｍ以上１０００μｍ以下であることがさらに好ましい。５０μｍ以上であれば、不活化全粒子インフルエンザワクチンの経皮からの投与が可能となり、２０００μｍ以下であれば、免疫誘導に有効なランゲルハンス細胞へ抗原となるワクチンを効率的に認識させることができる。
図１〜図７の面１３のように、針部とシート部の界面を針部の基底部と呼ぶ。針部の基底部における幅は、図６および図７のＷのように、１本の針の基底部で最も遠い点間の距離で表す。針部の基底部における幅は、５０μｍ以上２０００μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以上１５００μｍ以下であることがより好ましく、２００μｍ以上１０００μｍ以下であることがさらに好ましい。
針部は、１つのマイクロニードルアレイあたり１〜２０００本配置されることが好ましく、３〜１０００本配置されることがより好ましく、５〜５００本配置されることがさらに好ましい。１つのマイクロニードルアレイあたり２本の針部を含む場合、針部の間隔は、図１におけるＤのように針部の先端からシート部へ下した垂線の足の間の距離で表す。１つのマイクロニードルアレイあたり３本以上の針部を含む場合、配列される針部の間隔は、全ての針部においてそれぞれ最も近接した針部に対して先端からシート部へ下した垂線の足の間の距離を求め、その平均値で表す。例えば、針部が等間隔で配列している場合は、図６および図７におけるＤのような態様が挙げられる。針部の間隔は、０．１ｍｍ以上１０ｍｍ以下であることが好ましく、０．２ｍｍ以上５ｍｍ以下であることがより好ましく、０．３ｍｍ以上３ｍｍ以下であることがさらに好ましい。
１つのマイクロニードルアレイあたりの針部の占有面積は、図６および図７におけるＳのように、全ての針の基底部を含み、かつ最外周の針の基底部の接線で面積が最小になるように構成された図形の面積で表す。針部の占有面積は０．００５〜１０００ｍｍ2であることが好ましく、０．０５〜５００ｍｍ2がより好ましく、０．１〜３００ｍｍ2であることがさらに好ましい。
１つのマイクロニードルアレイあたり２本以上の針部を含む場合、針部の密度は、１つのマイクロニードルアレイの針部の本数を針部の占有面積で割った値で表す。針部の密度は、１ｍｍ2当たり０．０１〜１０本の針密度が好ましく、０．０５〜５本であることがより好ましく、０．１〜５本であることがさらに好ましい。
針部は、１つのマイクロニードルアレイあたり１〜２０００本配置されることが好ましく、３〜１０００本配置されることがより好ましく、５〜５００本配置されることがさらに好ましい。１つのマイクロニードルアレイあたり２本の針部を含む場合、針部の間隔は、図１におけるＤのように針部の先端からシート部へ下した垂線の足の間の距離で表す。１つのマイクロニードルアレイあたり３本以上の針部を含む場合、配列される針部の間隔は、全ての針部においてそれぞれ最も近接した針部に対して先端からシート部へ下した垂線の足の間の距離を求め、その平均値で表す。例えば、針部が等間隔で配列している場合は、図６および図７におけるＤのような態様が挙げられる。針部の間隔は、０．１ｍｍ以上１０ｍｍ以下であることが好ましく、０．２ｍｍ以上５ｍｍ以下であることがより好ましく、０．３ｍｍ以上３ｍｍ以下であることがさらに好ましい。
１つのマイクロニードルアレイあたりの針部の占有面積は、図６および図７におけるＳのように、全ての針の基底部を含み、かつ最外周の針の基底部の接線で面積が最小になるように構成された図形の面積で表す。針部の占有面積は０．００５〜１０００ｍｍ2であることが好ましく、０．０５〜５００ｍｍ2がより好ましく、０．１〜３００ｍｍ2であることがさらに好ましい。
１つのマイクロニードルアレイあたり２本以上の針部を含む場合、針部の密度は、１つのマイクロニードルアレイの針部の本数を針部の占有面積で割った値で表す。針部の密度は、１ｍｍ2当たり０．０１〜１０本の針密度が好ましく、０．０５〜５本であることがより好ましく、０．１〜５本であることがさらに好ましい。
針部は、皮膚または粘膜に穿刺後、体内に挿入された後に溶解すること好ましい。そのため、針部を構成する材料としては、水溶性高分子が好ましく、多糖類であることがより好ましく、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも１種がさらに好ましい。
本発明のマイクロニードルアレイは、針部を支持するシート部を有する。
針部を皮膚または粘膜に穿刺する際に、使用者がシート部に力を加えることで針部に内包される不活化全粒子インフルエンザワクチンの経皮からの投与が可能となる。
針部に力を加える方法としては、特に限定されない。
針部を皮膚または粘膜に穿刺する際に、使用者がシート部に力を加えることで針部に内包される不活化全粒子インフルエンザワクチンの経皮からの投与が可能となる。
針部に力を加える方法としては、特に限定されない。
シート部の厚さは図１〜図５のＴのように、針と接している面と反対側の面の間の距離で表す。シート部の厚さは、１μｍ以上１２００μｍであることが好ましく、３μｍ以上６００μｍ以下であることがより好ましく、５μｍ以上４００μｍであることがさらに好ましい。
シート部を構成する材料としては、水溶性高分子が好ましく、多糖類であることがより好ましく、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも１種がさらに好ましい。
シート部を構成する材料は、針部を構成する材料と同一であっても、異なっていてもよい。
シート部を構成する材料としては、水溶性高分子が好ましく、多糖類であることがより好ましく、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも１種がさらに好ましい。
シート部を構成する材料は、針部を構成する材料と同一であっても、異なっていてもよい。
本発明のマイクロニードルアレイは、図５のシート部５２に示すように、シート部の一部に支持体を含むことができる。支持体を含むことでシート部の強度が増し、より簡便にマイクロニードルアレイを皮膚または粘膜に穿刺することができる。
支持体の材料としては特に限定されないが、穿刺の簡便さから、ポリエチレンテレフタラート、ポリエチレンナフタレートなどが挙げられる。
支持体の厚さは、１０μｍ以上１０００μｍ以下が好ましく、３０μｍ以上５００μｍ以下がより好ましく、５０μｍ以上３００μｍ以下がさらに好ましい。
支持体の材料としては特に限定されないが、穿刺の簡便さから、ポリエチレンテレフタラート、ポリエチレンナフタレートなどが挙げられる。
支持体の厚さは、１０μｍ以上１０００μｍ以下が好ましく、３０μｍ以上５００μｍ以下がより好ましく、５０μｍ以上３００μｍ以下がさらに好ましい。
本発明のマイクロニードルアレイに内包される不活化全粒子インフルエンザワクチンの全質量に対する９０質量％以上が、針部の高さに対して先端から８０％以内に含まれることが好ましく、６０％以内に含まれることがより好ましく、４０％以内に含まれることがさらに好ましい。
また、本発明のマイクロニードルアレイに内包される不活化全粒子インフルエンザワクチンの全質量に対する９０質量％以上が、針部の先端から５００μｍ以内に含まれることが好ましく、３５０μｍ以内に含まれることがより好ましく、２００μｍ以内に含まれることがさらに好ましい。
また、本発明のマイクロニードルアレイに内包される不活化全粒子インフルエンザワクチンの全質量に対する９０質量％以上が、針部の先端から５００μｍ以内に含まれることが好ましく、３５０μｍ以内に含まれることがより好ましく、２００μｍ以内に含まれることがさらに好ましい。
本発明のマイクロニードルアレイの製造法としては、特に限定されないが、（１）鋳型の製造工程、（２）不活化全粒子インフルエンザワクチンおよび水溶性高分子を調製する工程、（３）（２）工程で得た液を鋳型に充填し、針部の上端部を形成する工程、（４）水溶性高分子を鋳型に充填し、針部の下端部およびシート部を形成する工程、（５）鋳型から剥離する工程、を含む製造法によって得ることが好ましい。
本発明のマイクロニードルアレイの投与時間は、コンプライアンス向上の観点から、１時間以内が好ましく、３０分以内がより好ましい。
投与回数は、抗体産生能向上の観点から２回投与することが好ましい。投与間隔としては、２４時間〜２ヶ月程度が好ましく、３日〜１．５ヶ月程度がより好ましく、１週間〜４週間程度がさらに好ましい。
投与回数は、抗体産生能向上の観点から２回投与することが好ましい。投与間隔としては、２４時間〜２ヶ月程度が好ましく、３日〜１．５ヶ月程度がより好ましく、１週間〜４週間程度がさらに好ましい。
本発明のマイクロニードルアレイは、皮膚内での免疫応答を刺激し、抗体産生能を向上させることができる。具体的には、血清中のＩｇＧ抗体価を上昇させることが可能となる。
また、本発明のマイクロニードルアレイは２回投与を行うことによって、他型のインフルエンザウイルスに対しても抗体価の上昇が見られた。
また、本発明のマイクロニードルアレイは２回投与を行うことによって、他型のインフルエンザウイルスに対しても抗体価の上昇が見られた。
以下、本発明のマイクロニードルアレイを実施例によりさらに具体的に説明するが、以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
全粒子インフルエンザワクチン含有マイクロニードルアレイの調製
Ａ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株のインフルエンザウイルスをホルマリンによって処理し、不活化全粒子ワクチンを得た。その不活化全粒子ワクチンを添加した１４．４質量％ヒドロキシエチルデンプン溶液を円錐形状の凹部を持つ鋳型に充填し、乾燥させた。
その後、４０質量％コンドロイチン硫酸ナトリウムを鋳型に充填し、乾燥させることで、針部の残りとシート部（支持体としてポリエチレンテレフタラートを含む）を形成し、型から抜くことで、実施例１の不活化全粒子ワクチンを内包させた、針部の高さが約５８０μｍの二層構成のマイクロニードルアレイ（針部第一層：高さ約４６０μｍ、底面直径約２７０μｍの円錐構造；針部第二層：高さ約１２０μｍ、上底面直径約２７０μｍ、下底面直径約４６０μｍの円錐台構造；針部の基底部の幅約４６０μｍ；シート部厚さ約２０５μｍ（このうちポリエチレンテレフタラート約１７５μｍ）；針本数９本；針の間隔約１ｍｍ；針部専有面積約６ｍｍ2；針密度約１．５本／ｍｍ2）を調製した。鋳型への充填量に合わせてヒドロキシエチルデンプン溶液に添加する不活化全粒子ワクチンの量を変えることで、ワクチン含有量がヘマグルチニン含有相当値でそれぞれ、０．６７ｎｇ、１．３ｎｇ、２．７ｎｇ、５．４ｎｇ、１１ｎｇ、２１ｎｇ、０．１１μｇ、０．５４μｇのマイクロニードルアレイを作製した。
全粒子インフルエンザワクチン含有マイクロニードルアレイの調製
Ａ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株のインフルエンザウイルスをホルマリンによって処理し、不活化全粒子ワクチンを得た。その不活化全粒子ワクチンを添加した１４．４質量％ヒドロキシエチルデンプン溶液を円錐形状の凹部を持つ鋳型に充填し、乾燥させた。
その後、４０質量％コンドロイチン硫酸ナトリウムを鋳型に充填し、乾燥させることで、針部の残りとシート部（支持体としてポリエチレンテレフタラートを含む）を形成し、型から抜くことで、実施例１の不活化全粒子ワクチンを内包させた、針部の高さが約５８０μｍの二層構成のマイクロニードルアレイ（針部第一層：高さ約４６０μｍ、底面直径約２７０μｍの円錐構造；針部第二層：高さ約１２０μｍ、上底面直径約２７０μｍ、下底面直径約４６０μｍの円錐台構造；針部の基底部の幅約４６０μｍ；シート部厚さ約２０５μｍ（このうちポリエチレンテレフタラート約１７５μｍ）；針本数９本；針の間隔約１ｍｍ；針部専有面積約６ｍｍ2；針密度約１．５本／ｍｍ2）を調製した。鋳型への充填量に合わせてヒドロキシエチルデンプン溶液に添加する不活化全粒子ワクチンの量を変えることで、ワクチン含有量がヘマグルチニン含有相当値でそれぞれ、０．６７ｎｇ、１．３ｎｇ、２．７ｎｇ、５．４ｎｇ、１１ｎｇ、２１ｎｇ、０．１１μｇ、０．５４μｇのマイクロニードルアレイを作製した。
作製したマイクロニードルアレイの針部内における不活化全粒子ワクチンの分布は、以下の手法によって推測した。
不活化全粒子ワクチンの代わりに０．１質量%のエバンスブルー色素を有する１４．４質量％ヒドロキシエチルデンプン溶液を使用する他は、上記と同じ方法でマイクロニードルアレイを作製した。針部の先端から１４０μｍの箇所でシート部と水平にカットし、カットした針先端を含む部分、および残りの針部とシート部を併せた部分を別々に水に溶解し、吸光度測定することで色素の針先端を含む部分への分配比率を測定した。比率は４５％であった。針部の先端から２００、２６０、３３０μｍの箇所でそれぞれカットした時の色素の針先端を含む部分への分配比率を同様に測定した。それぞれ、９０％、１００％、１００％であった。
不活化全粒子ワクチンの代わりに０．１質量%のエバンスブルー色素を有する１４．４質量％ヒドロキシエチルデンプン溶液を使用する他は、上記と同じ方法でマイクロニードルアレイを作製した。針部の先端から１４０μｍの箇所でシート部と水平にカットし、カットした針先端を含む部分、および残りの針部とシート部を併せた部分を別々に水に溶解し、吸光度測定することで色素の針先端を含む部分への分配比率を測定した。比率は４５％であった。針部の先端から２００、２６０、３３０μｍの箇所でそれぞれカットした時の色素の針先端を含む部分への分配比率を同様に測定した。それぞれ、９０％、１００％、１００％であった。
（比較例１）
スプリットインフルエンザワクチン含有マイクロニードルアレイの調製
Ａ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株のインフルエンザウイルスをエーテルによって処理し、スプリットワクチンを得た。その後、実施例１と同様の操作で、不活化全粒子ワクチンに代えてスプリットワクチンを用いて調製し、比較例１を得た。鋳型への充填量に合わせてヒドロキシエチルデンプン溶液に添加するスプリットワクチンの量を変えることで、ワクチン含有量がヘマグルチニン含有相当値でそれぞれ、２１ｎｇ、０．１１μｇ、０．５４μｇのマイクロニードルアレイを作製した。
スプリットインフルエンザワクチン含有マイクロニードルアレイの調製
Ａ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株のインフルエンザウイルスをエーテルによって処理し、スプリットワクチンを得た。その後、実施例１と同様の操作で、不活化全粒子ワクチンに代えてスプリットワクチンを用いて調製し、比較例１を得た。鋳型への充填量に合わせてヒドロキシエチルデンプン溶液に添加するスプリットワクチンの量を変えることで、ワクチン含有量がヘマグルチニン含有相当値でそれぞれ、２１ｎｇ、０．１１μｇ、０．５４μｇのマイクロニードルアレイを作製した。
マウスへのマイクロニードルアレイによるワクチン投与試験（実施例１および比較例１）
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ（日本クレア社）、メス、７週齢）を購入し、１週間の馴化の後、インフルエンザワクチンの投与試験を行った。実施例１および比較例１では、麻酔下でマウスの背面を除毛した後、皮膚を引き伸ばした状態でマイクロニードルアレイを４分間穿刺した。実施例１および比較例１は、ともに４匹で実施した。
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ（日本クレア社）、メス、７週齢）を購入し、１週間の馴化の後、インフルエンザワクチンの投与試験を行った。実施例１および比較例１では、麻酔下でマウスの背面を除毛した後、皮膚を引き伸ばした状態でマイクロニードルアレイを４分間穿刺した。実施例１および比較例１は、ともに４匹で実施した。
マウスへの皮下注射試験によるワクチン投与試験（比較例２および３）
比較例２および３として、実施例１および比較例１と同様の条件でマウスに対して、皮下注射によるワクチン投与を実施した。比較例２では、実施例１で調製した不活化全粒子ワクチンを、注射用水で希釈したワクチン１００μＬをヘマグルチニン含有相当値でそれぞれ２．７ｎｇ、５．４ｎｇ、１１ｎｇ、２１ｎｇ、４３ｎｇ、０．２１μｇ、１．１μｇ投与した。比較例３では、比較例１で調製したスプリットワクチンを注射用水で各用量に希釈したワクチン１００μＬをヘマグルチニン含有相当値でそれぞれ４３ｎｇ、０．２１μｇ、１．１μｇ投与した。比較例２および比較例３は、ともに４匹で実施した。
比較例２および３として、実施例１および比較例１と同様の条件でマウスに対して、皮下注射によるワクチン投与を実施した。比較例２では、実施例１で調製した不活化全粒子ワクチンを、注射用水で希釈したワクチン１００μＬをヘマグルチニン含有相当値でそれぞれ２．７ｎｇ、５．４ｎｇ、１１ｎｇ、２１ｎｇ、４３ｎｇ、０．２１μｇ、１．１μｇ投与した。比較例３では、比較例１で調製したスプリットワクチンを注射用水で各用量に希釈したワクチン１００μＬをヘマグルチニン含有相当値でそれぞれ４３ｎｇ、０．２１μｇ、１．１μｇ投与した。比較例２および比較例３は、ともに４匹で実施した。
実施例１、比較例１〜３の投与によるマウスの血清中における抗体産生量の評価
投与後、４週間飼育したマウスを麻酔下で開腹し、後部大静脈より採血を行った。室温で静置した血液を遠心分離にかけ、上清を採取することで血清を得た。得られた血清中に含まれるインフルエンザに特異的な抗体（ＩｇＧ）の量を、下記の手法で測定した。
（ＩｇＧ抗体産生量の測定）
ＮＵＮＣ ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｃ ｂｏｔｔｏｍ，９６ｗｅｌｌ）に、ＥＬＩＳＡ用として不活化させたウイルス抗原を５０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、シールにて４℃で終夜静置した。静置後、ＰＢＳＴ（Ｇｉｂｃｏ ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。その後、ブロッキング液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１％ＢＳＡ）を２００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、室温で３０分静置した。静置後、ＰＢＳＴ（Ｇｉｂｃｏ ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。洗浄後、希釈液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１％ＢＳＡ，０．１％Ｔｗｅｅｎ）で約１０，０００倍に希釈したサンプルを１００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、室温で１時間静置した。静置後、同様にＰＢＳＴ（Ｇｉｂｃｏ ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。
次に、希釈液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１％ＢＳＡ，０．１％Ｔｗｅｅｎ）で希釈したＨＲＰ標識抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ抗体（５００倍）を１００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、室温で１時間静置した。静置後、同様にＰＢＳＴ（Ｇｉｂｃｏ ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。
さらに、基質反応として、ＴＭＢ １００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、遮光下室温で１５分間静置した。その後、ストップ液（１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ）１００μＬ／ｗｅｌｌを滴下した。
滴下後、λ＝４５０ｎｍの吸光度（リファレンス６２０ｎｍ）を測定することにより、吸光度の大きさでＩｇＧ抗体産生量を相対評価した。
投与後、４週間飼育したマウスを麻酔下で開腹し、後部大静脈より採血を行った。室温で静置した血液を遠心分離にかけ、上清を採取することで血清を得た。得られた血清中に含まれるインフルエンザに特異的な抗体（ＩｇＧ）の量を、下記の手法で測定した。
（ＩｇＧ抗体産生量の測定）
ＮＵＮＣ ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｃ ｂｏｔｔｏｍ，９６ｗｅｌｌ）に、ＥＬＩＳＡ用として不活化させたウイルス抗原を５０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、シールにて４℃で終夜静置した。静置後、ＰＢＳＴ（Ｇｉｂｃｏ ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。その後、ブロッキング液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１％ＢＳＡ）を２００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、室温で３０分静置した。静置後、ＰＢＳＴ（Ｇｉｂｃｏ ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。洗浄後、希釈液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１％ＢＳＡ，０．１％Ｔｗｅｅｎ）で約１０，０００倍に希釈したサンプルを１００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、室温で１時間静置した。静置後、同様にＰＢＳＴ（Ｇｉｂｃｏ ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。
次に、希釈液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１％ＢＳＡ，０．１％Ｔｗｅｅｎ）で希釈したＨＲＰ標識抗ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ抗体（５００倍）を１００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、室温で１時間静置した。静置後、同様にＰＢＳＴ（Ｇｉｂｃｏ ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。
さらに、基質反応として、ＴＭＢ １００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、遮光下室温で１５分間静置した。その後、ストップ液（１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ）１００μＬ／ｗｅｌｌを滴下した。
滴下後、λ＝４５０ｎｍの吸光度（リファレンス６２０ｎｍ）を測定することにより、吸光度の大きさでＩｇＧ抗体産生量を相対評価した。
実施例１、比較例１〜３の投与によるマウスの血清中におけるＩｇＧ抗体の産生量評価を図８に示す。
比較例１〜３によってワクチンを投与された群に比べて、実施例１によってワクチンを投与された群は、予想外なことに低投与量でもＩｇＧ抗体がより多く産生されていることが判明した。
比較例１〜３によってワクチンを投与された群に比べて、実施例１によってワクチンを投与された群は、予想外なことに低投与量でもＩｇＧ抗体がより多く産生されていることが判明した。
（実施例２）
全粒子インフルエンザワクチン含有マイクロニードルアレイの調製
実施例１と同様の方法にて、ワクチン含有量がヘマグルチニン含有相当値で０．０１μｇのＡ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株のインフルエンザウイルスの不活化全粒子ワクチンを内包するマイクロニードルアレイを作製した。
全粒子インフルエンザワクチン含有マイクロニードルアレイの調製
実施例１と同様の方法にて、ワクチン含有量がヘマグルチニン含有相当値で０．０１μｇのＡ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株のインフルエンザウイルスの不活化全粒子ワクチンを内包するマイクロニードルアレイを作製した。
（比較例４）
スプリットインフルエンザワクチン含有マイクロニードルアレイの調製
比較例１と同様の方法にて、ワクチン含有量がヘマグルチニン含有相当値で０．０１μｇのＡ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株のインフルエンザウイルスのスプリットワクチンを内包するマイクロニードルアレイを作製した。
スプリットインフルエンザワクチン含有マイクロニードルアレイの調製
比較例１と同様の方法にて、ワクチン含有量がヘマグルチニン含有相当値で０．０１μｇのＡ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株のインフルエンザウイルスのスプリットワクチンを内包するマイクロニードルアレイを作製した。
マウスへのマイクロニードルアレイによるワクチン投与試験（実施例２および比較例４）
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ（日本クレア社）、メス、７週齢）を購入し、１週間の馴化の後、インフルエンザワクチンの投与試験を行った。実施例２および比較例４では、麻酔下でマウスの背面を除毛した後、皮膚を引き伸ばした状態でマイクロニードルアレイを４分間穿刺した。実施例３および比較例４は、ともに６匹で実施した。
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ（日本クレア社）、メス、７週齢）を購入し、１週間の馴化の後、インフルエンザワクチンの投与試験を行った。実施例２および比較例４では、麻酔下でマウスの背面を除毛した後、皮膚を引き伸ばした状態でマイクロニードルアレイを４分間穿刺した。実施例３および比較例４は、ともに６匹で実施した。
マウスへの皮下注射試験によるワクチン投与試験（比較例５および比較例６）
比較例５及び比較例６として、実施例２および比較例４と同様の条件でマウスに対して、皮下注射によるワクチン投与を実施した。比較例５では、実施例２で調製した不活化全粒子ワクチンを、生理食塩水で希釈したワクチン１００μＬをヘマグルチニン含有相当値で０．０１μｇ投与した。比較例６では、比較例４で調製したスプリットワクチンを注射用水で各用量に希釈したワクチン１００μＬをヘマグルチニン含有相当値で０．０１μｇ投与した。比較例５および比較例６は、ともに６匹で実施した。
比較例５及び比較例６として、実施例２および比較例４と同様の条件でマウスに対して、皮下注射によるワクチン投与を実施した。比較例５では、実施例２で調製した不活化全粒子ワクチンを、生理食塩水で希釈したワクチン１００μＬをヘマグルチニン含有相当値で０．０１μｇ投与した。比較例６では、比較例４で調製したスプリットワクチンを注射用水で各用量に希釈したワクチン１００μＬをヘマグルチニン含有相当値で０．０１μｇ投与した。比較例５および比較例６は、ともに６匹で実施した。
実施例２、比較例４〜６のワクチン投与したマウスに対するウイルス増殖抑制効果の評価
投与後、４週間飼育したマウスに対し、ＰＢＳで希釈した３００μＬのＡ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株のインフルエンザウイルス（ウイルス力価 １０4ｐｆｕ）を麻酔下で経鼻投与した。投与３日後のマウスを麻酔下で肺を摘出し、肺乳剤に対して１×ＭＥＭ／ＢＳＡ／抗生物質を含む培地を１：９の割合で加えてマルチビーズショッカーにより粉砕処理し、１０％肺乳剤を得た。
投与後、４週間飼育したマウスに対し、ＰＢＳで希釈した３００μＬのＡ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株のインフルエンザウイルス（ウイルス力価 １０4ｐｆｕ）を麻酔下で経鼻投与した。投与３日後のマウスを麻酔下で肺を摘出し、肺乳剤に対して１×ＭＥＭ／ＢＳＡ／抗生物質を含む培地を１：９の割合で加えてマルチビーズショッカーにより粉砕処理し、１０％肺乳剤を得た。
（肺中のウイルス力価の測定）
ＭＤＣＫ細胞を１２穴プレートに撒き、３７℃で２日間インキュベートすることで底面一面に覆うように培養した。肺乳剤を１×ＭＥＭバッファーにて１０倍〜１００００００倍まで１０倍刻みで希釈したものの１００μＬを、ＭＤＣＫ細胞を培養した１２穴プレートへそれぞれ１ｍＬずつ添加し、３５℃で１時間インキュベートした。肺乳剤を洗浄した後、４２℃の１×ＭＥＭバッファーおよび１％アガロースの混合液１ｍＬを各穴に加え、室温まで冷まし、ゲル化させた。１２穴プレートは３５℃で２日間インキュベートした。その後、０．００５％ニュートラルレッドを含む４２℃の１×ＭＥＭバッファーおよび１％アガロースの混合液１ｍＬを各穴に加え、さらに３５℃で１日間インキュベートした。その後、ライトテーブルの上で１２穴プレートを裏返して置き、ウイルスによるプラック（感染して死滅した細胞の痕）をカウントした。１つの穴あたりプラック数が１０以上１００未満になった希釈倍率を用いて判定した。１０のｎ乗の希釈倍率で添加した穴に対してｋ個のプラックが出た場合、ウイルス力価は肺乳剤１ｇあたりのプラック形成ユニット（ｌｏｇ（ｐｆｕ／ｇ））として以下の式
Ｔ＝ｌｏｇ（ｋ×１０(n+2)）
で算出した。
ＭＤＣＫ細胞を１２穴プレートに撒き、３７℃で２日間インキュベートすることで底面一面に覆うように培養した。肺乳剤を１×ＭＥＭバッファーにて１０倍〜１００００００倍まで１０倍刻みで希釈したものの１００μＬを、ＭＤＣＫ細胞を培養した１２穴プレートへそれぞれ１ｍＬずつ添加し、３５℃で１時間インキュベートした。肺乳剤を洗浄した後、４２℃の１×ＭＥＭバッファーおよび１％アガロースの混合液１ｍＬを各穴に加え、室温まで冷まし、ゲル化させた。１２穴プレートは３５℃で２日間インキュベートした。その後、０．００５％ニュートラルレッドを含む４２℃の１×ＭＥＭバッファーおよび１％アガロースの混合液１ｍＬを各穴に加え、さらに３５℃で１日間インキュベートした。その後、ライトテーブルの上で１２穴プレートを裏返して置き、ウイルスによるプラック（感染して死滅した細胞の痕）をカウントした。１つの穴あたりプラック数が１０以上１００未満になった希釈倍率を用いて判定した。１０のｎ乗の希釈倍率で添加した穴に対してｋ個のプラックが出た場合、ウイルス力価は肺乳剤１ｇあたりのプラック形成ユニット（ｌｏｇ（ｐｆｕ／ｇ））として以下の式
Ｔ＝ｌｏｇ（ｋ×１０(n+2)）
で算出した。
実施例２および比較例４〜６の投与による肺中のウイルス量測定結果を図９に表す。
比較例４〜６によってワクチンを投与された群に比べて、実施例２によってワクチンを投与された群は、ウイルスの量が少なく、肺中でのウイルス増殖抑制効果が高いことが判明した。
比較例４〜６によってワクチンを投与された群に比べて、実施例２によってワクチンを投与された群は、ウイルスの量が少なく、肺中でのウイルス増殖抑制効果が高いことが判明した。
１１ 針部
１２ シート部
１３ 基底部
２１ 針部第一層
２２ 針部第二層
３１ 針部第一層
３２ 針部第二層
３３ 針部第三層
３４ 針部第四層
４１ 針部
５１ 針部上端部
５２ シート部
５３ 支持体
６１ 円錐状の針部の先端
７１ 四角錘状の針部の先端
Ｄ 針部と針部の間隔
Ｈ 針部の高さ
Ｓ 針部の占有面積
Ｔ シート部の厚さ
Ｗ 針部基底部の幅
θ１ 針部第一層の側面のなす角
θ２ 針部第二層または第三層の側面のなす角
１２ シート部
１３ 基底部
２１ 針部第一層
２２ 針部第二層
３１ 針部第一層
３２ 針部第二層
３３ 針部第三層
３４ 針部第四層
４１ 針部
５１ 針部上端部
５２ シート部
５３ 支持体
６１ 円錐状の針部の先端
７１ 四角錘状の針部の先端
Ｄ 針部と針部の間隔
Ｈ 針部の高さ
Ｓ 針部の占有面積
Ｔ シート部の厚さ
Ｗ 針部基底部の幅
θ１ 針部第一層の側面のなす角
θ２ 針部第二層または第三層の側面のなす角
Claims (7)
- 不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包する針部と、シート部と、を含むマイクロニードルアレイ。
- 針部が水溶性高分子を含み、体内に挿入された後に溶解する請求項１に記載のマイクロニードルアレイ。
- 水溶性高分子が、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも１種である請求項２に記載のマイクロニードルアレイ。
- インフルエンザワクチンがＡ／Ｈ１Ｎ１型、Ａ／Ｈ３Ｎ２型、Ａ／Ｈ５Ｎ１型、およびＢ型からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロニードルアレイ。
- 不活化全粒子インフルエンザワクチンの全質量に対する９０質量％以上が、針部の高さに対して先端から８０％以内に含まれる請求項１〜４のいずれか１項に記載のマイクロニードルアレイ。
- 不活化全粒子インフルエンザワクチンの全質量に対する９０質量％以上が、針部の先端から５００μｍ以内に含まれる請求項１〜４のいずれか１項に記載のマイクロニードルアレイ。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載のマイクロニードルアレイを投与した後、２４時間以上２ヶ月未満の間隔をあけて２回目の投与を行う投与方法。
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