WO2015152360A1 - 不活化全粒子ワクチンを含有するマイクロニードルアレイ製剤およびその投与方法 - Google Patents

不活化全粒子ワクチンを含有するマイクロニードルアレイ製剤およびその投与方法 Download PDF

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WO2015152360A1
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microneedle array
needle
vaccine
inactivated whole
administration
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来馬　浩二
小山田　孝嘉
島田　俊雄
義博 迫田
宏 喜田
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富士フイルム株式会社
国立大学法人北海道大学
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Definitions

  • the present invention relates to a microneedle array containing an inactivated whole particle influenza vaccine.
  • Influenza is an acute infectious respiratory disease caused by an influenza virus that spreads through respiratory droplet infection. Influenza influenza vaccination is considered effective for preventing influenza, and recently, prepandemic vaccines that are especially compatible with new influenza are being developed.
  • Influenza vaccines are classified into three types: live attenuated vaccines, inactivated whole particle vaccines, and inactivated split vaccines. Currently, inactivated split vaccines are widely used in Japan.
  • Patent Document 1 discloses a transdermal delivery device and administration method for influenza vaccine.
  • Patent Document 2 discloses a microneedle device comprising a polylactic acid microneedle coated with an influenza vaccine comprising an antigen comprising an A type (H1N1) strain, an A type (H3N2) strain and a B type strain as an active ingredient. ing.
  • Non-Patent Document 3 a skin-dissolving microneedle loaded with a trivalent seasonal influenza HA antigen is prepared, and immunity induction characteristics in humans are evaluated.
  • Inactivated split vaccine is widely used in Japan, but its effectiveness is low. In addition, when an influenza pandemic is assumed, it is important to elicit many human immunity with a small amount of vaccine, and an efficient and simple administration method of the vaccine is required.
  • Patent Document 1 does not confirm the correlation between the dose of the influenza vaccine transdermal delivery device and the amount of antibody produced. Further, in Patent Document 2 and Non-Patent Document 3, as described above, a method for administering an influenza vaccine using a microneedle array has been studied, but split vaccine is used, and the production of antibodies against the dose of vaccine is performed. The amount was not enough. Therefore, there is a strong demand for the development of an even better microneedle array that can efficiently and easily administer influenza vaccines.
  • An object of the present invention is to provide a microneedle array that can improve antibody production ability and can be easily administered with an influenza vaccine.
  • the present inventors have administered a microneedle array in which a needle part containing an inactivated whole-particle influenza vaccine and a sheet part are administered, thereby producing an antibody-producing ability.
  • the present invention was completed.
  • a microneedle array including a needle part containing an inactivated whole-particle influenza vaccine and a sheet part.
  • the microneedle array according to [1] wherein the needle part contains a water-soluble polymer and dissolves after being inserted into the body.
  • the water-soluble polymer is at least one selected from the group consisting of hydroxyethyl starch, dextran, sodium chondroitin sulfate, sodium hyaluronate, carboxymethyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, and polyethylene glycol.
  • the influenza vaccine is at least one selected from the group consisting of A / H1N1, A / H3N2, A / H5N1, and B, [1] to [3] Microneedle array.
  • [5] The amount according to any one of [1] to [4], wherein 90% by mass or more with respect to the total mass of the inactivated whole-particle influenza vaccine is contained within 80% from the tip with respect to the height of the needle part.
  • Microneedle array Microneedle array.
  • An administration method in which the microneedle array according to any one of [1] to [6] is administered, and then the second administration is performed at intervals of 24 hours or more and less than 2 months.
  • an inactivated whole-particle influenza vaccine can be administered by a simple operation compared to administration by injection.
  • antibody production ability can be improved with a small amount of vaccine compared to administration by injection.
  • FIG. 1 is a sectional view showing an example of the microneedle array of the present invention.
  • the microneedle array of the present invention is formed of a needle part 11 and a sheet part 12 that contain an inactivated whole-particle influenza vaccine.
  • the microneedle array of the present invention contains an inactivated whole particle influenza vaccine.
  • the inactivated whole-particle influenza vaccine means virus particles that are inactivated while retaining the virus form from the virus suspension obtained by culturing influenza virus, and does not include split vaccines.
  • Influenza vaccines are not limited to that type, but include types A and B, including seasonal vaccines and pandemic vaccines.
  • There are subtypes of influenza A virus that are a combination of a type selected from H1-16 and a type selected from N1-9. In the present invention, at least one selected from the group consisting of A / H1N1, A / H3N2, A / H5N1, and B types is preferred.
  • the microneedle array of the present invention includes a needle part.
  • the needle part contains an inactivated whole-particle influenza vaccine, and the needle part is punctured into the skin or mucous membrane, whereby transdermal or transmucosal administration is possible.
  • the shape of the needle part is not particularly limited as long as it is a convex structure having a tip, and includes a needle shape having a sharp tip and a shape having a sharp tip, but a shape having a sharp tip is preferred.
  • Specific examples include a pyramidal structure such as a conical structure, a triangular pyramid structure, and a quadrangular pyramidal structure, a truncated cone structure, a triangular frustum structure, a quadrangular frustum structure, and the like.
  • a structure, a triangular pyramid structure, and a quadrangular pyramid structure are preferable, and a conical structure is more preferable.
  • the needle portions of the microneedle array of the present invention include two needle portions 21 and 22 in FIG. 2, and needle portions 31 to 34 in FIG. It can take a multilayer structure of layers or more.
  • the needle part first layer and the needle part second layer are called in order from the layer including the tip of the needle.
  • the angle ⁇ 2 formed by the side surface in one layer in the case of the second needle layer 22 in FIG. 2 and the third needle layer 33 in FIG. 3
  • the angle formed by the intersection when extending in the needle tip direction is the needle portion.
  • the needle part of the microneedle array of the present invention can also have a structure in which the angle formed by the side surfaces is continuously changed as shown by the needle part 41 in FIG.
  • the needle part of the microneedle array of the present invention preferably concentrates the inactivated whole-particle influenza vaccine efficiently on the upper end part of the needle part as shown in the upper end part 51 of the needle part in FIG. Thereby, administration efficiency can further be improved. Moreover, since manufacturing efficiency improves by selecting the same material for the lower end part of a needle part and a sheet
  • the height of the needle part is represented by the length of a perpendicular line dropped from the tip of the needle to the sheet part as indicated by H in FIG.
  • the height of the needle part is preferably 50 ⁇ m or more and 2000 ⁇ m or less, more preferably 100 ⁇ m or more and 1500 ⁇ m or less, and further preferably 200 ⁇ m or more and 1000 ⁇ m or less. If it is 50 ⁇ m or more, it becomes possible to administer inactivated whole-particle influenza vaccine transdermally, and if it is 2000 ⁇ m or less, the Langerhans cells effective for immunity induction can be efficiently recognized as an antigen vaccine.
  • the width of the basal portion of the needle portion is represented by the distance between the farthest points in the basal portion of one needle, as indicated by W in FIGS.
  • the width of the base portion of the needle portion is preferably 50 ⁇ m or more and 2000 ⁇ m or less, more preferably 100 ⁇ m or more and 1500 ⁇ m or less, and further preferably 200 ⁇ m or more and 1000 ⁇ m or less.
  • 1 to 2000 needle portions are preferably arranged per microneedle array, more preferably 3 to 1000 needle portions, and even more preferably 5 to 500 needle portions.
  • the interval between the needle portions is represented by the distance between the legs of the perpendicular line that is lowered from the tip of the needle portion to the sheet portion as indicated by D in FIG.
  • the interval between the arranged needle parts is the distance between the needles closest to each of the needle parts, and the perpendicular foot descending from the tip to the sheet part. The distance between them is obtained and expressed as an average value.
  • an embodiment like D in FIGS. 6 and 7 can be mentioned.
  • the interval between the needle portions is preferably from 0.1 mm to 10 mm, more preferably from 0.2 mm to 5 mm, and still more preferably from 0.3 mm to 3 mm.
  • the area occupied by the needle portion per microneedle array includes the basal portions of all the needles as indicated by S in FIGS. 6 and 7, and the area is minimized at the tangent to the basal portion of the outermost needle. It is expressed by the area of the figure configured as described above.
  • the area occupied by the needle portion is preferably 0.005 to 1000 mm 2 , more preferably 0.05 to 500 mm 2 , and even more preferably 0.1 to 300 mm 2 .
  • the density of the needle parts is represented by a value obtained by dividing the number of needle parts of one microneedle array by the area occupied by the needle parts.
  • the density of the needle part is preferably 0.01 to 10 needles per 1 mm 2, more preferably 0.05 to 5, and still more preferably 0.1 to 5.
  • the needle part is preferably dissolved after being inserted into the body after puncturing the skin or mucous membrane. Therefore, the material constituting the needle part is preferably a water-soluble polymer, more preferably a polysaccharide, hydroxyethyl starch, dextran, sodium chondroitin sulfate, sodium hyaluronate, carboxymethyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, polyoxyethylene. More preferred is at least one selected from the group consisting of polyoxypropylene glycol and polyethylene glycol.
  • the microneedle array of the present invention has a sheet portion that supports the needle portion.
  • the user applies a force to the sheet part, whereby the inactivated whole-particle influenza vaccine contained in the needle part can be administered from the skin.
  • a method for applying force to the needle portion is not particularly limited.
  • the thickness of the sheet portion is represented by the distance between the surface in contact with the needle and the opposite surface, as indicated by T in FIGS.
  • the thickness of the sheet portion is preferably 1 ⁇ m or more and 1200 ⁇ m, more preferably 3 ⁇ m or more and 600 ⁇ m or less, and further preferably 5 ⁇ m or more and 400 ⁇ m.
  • the material constituting the sheet part is preferably a water-soluble polymer, more preferably a polysaccharide, hydroxyethyl starch, dextran, sodium chondroitin sulfate, sodium hyaluronate, carboxymethyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, polyoxyethylene polyoxy More preferred is at least one selected from the group consisting of propylene glycol and polyethylene glycol.
  • the material constituting the seat part may be the same as or different from the material constituting the needle part.
  • the microneedle array of the present invention can include a support in a part of the sheet part.
  • the support By including the support, the strength of the sheet portion is increased, and the microneedle array can be punctured into the skin or mucous membrane more easily.
  • a support body From the simplicity of puncture, a polyethylene terephthalate, a polyethylene naphthalate, etc. are mentioned.
  • the thickness of the support is preferably from 10 ⁇ m to 1000 ⁇ m, more preferably from 30 ⁇ m to 500 ⁇ m, still more preferably from 50 ⁇ m to 300 ⁇ m.
  • 90% by mass or more based on the total mass of the inactivated whole particle influenza vaccine included in the microneedle array of the present invention is preferably contained within 80% from the tip with respect to the height of the needle part, and within 60% More preferably, it is contained within 40%. Moreover, it is preferable that 90 mass% or more with respect to the total mass of the inactivated whole particle influenza vaccine included in the microneedle array of the present invention is contained within 500 ⁇ m from the tip of the needle part, and more preferably within 350 ⁇ m. Preferably, it is contained within 200 ⁇ m.
  • the administration time of the microneedle array of the present invention is preferably within 1 hour, more preferably within 30 minutes, from the viewpoint of improving compliance.
  • the number of administration is preferably twice from the viewpoint of improving antibody production ability.
  • the administration interval is preferably about 24 hours to 2 months, more preferably about 3 days to 1.5 months, and further preferably about 1 week to 4 weeks.
  • the microneedle array of the present invention can stimulate an immune response in the skin and improve antibody production ability. Specifically, the IgG antibody titer in serum can be increased. In addition, the microneedle array of the present invention showed an increase in antibody titer against other types of influenza viruses when administered twice.
  • microneedle array of the present invention will be described more specifically with reference to examples.
  • present invention is not limited to the following examples.
  • Example 1 Preparation of whole particle influenza vaccine-containing microneedle array A / PR / 8/1934 (H1N1) strain of influenza virus was treated with formalin to obtain an inactivated whole particle vaccine.
  • the 14.4 mass% hydroxyethyl starch solution to which the inactivated whole particle vaccine was added was filled into a mold having a conical recess and dried. Thereafter, 40% by mass of sodium chondroitin sulfate was filled in the mold and dried to form the rest of the needle part and the sheet part (including polyethylene terephthalate as a support), which was removed from the mold.
  • a microneedle array having a needle layer height of about 580 ⁇ m and containing an inactivated whole particle vaccine (needle portion first layer: conical structure having a height of about 460 ⁇ m and a bottom surface diameter of about 270 ⁇ m; second needle portion)
  • Layer a truncated cone structure having a height of about 120 ⁇ m, an upper base diameter of about 270 ⁇ m, and a lower base diameter of about 460 ⁇ m; a width of a base portion of a needle portion of about 460 ⁇ m;
  • the number of the needles was 9; the interval between the needles was about 1 mm; the area occupied by the needles was about 6 mm 2 ; the needle density was about 1.5 / mm 2 .
  • the vaccine content is equivalent to hemagglutinin-containing value of 0.67 ng, 1.3 ng, 2.7 ng, respectively.
  • Microneedle arrays of 5.4 ng, 11 ng, 21 ng, 0.11 ⁇ g, and 0.54 ⁇ g were prepared.
  • the distribution of the inactivated whole particle vaccine in the needle part of the prepared microneedle array was estimated by the following method.
  • a microneedle array was made in the same manner as described above, except that a 14.4 wt% hydroxyethyl starch solution with 0.1 wt% Evans blue dye was used instead of the inactivated whole particle vaccine.
  • the distribution ratio of the dye to the part including the needle tip was measured. The ratio was 45%.
  • the distribution ratio of the dye to the portion including the needle tip when cut at 200, 260, and 330 ⁇ m from the tip of the needle was measured in the same manner. They were 90%, 100%, and 100%, respectively.
  • Example 1 and Comparative Example 1 Vaccine administration test to mice using microneedle array
  • Mice (Balb / c (Claire Japan), female, 7 weeks old) were purchased, and after habituation for 1 week, an influenza vaccine administration test was performed.
  • the microneedle array was punctured for 4 minutes with the skin stretched. Both Example 1 and Comparative Example 1 were carried out with 4 animals.
  • Vaccine administration test by mouse subcutaneous injection test (Comparative Examples 2 and 3) As Comparative Examples 2 and 3, vaccine was administered by subcutaneous injection to mice under the same conditions as in Example 1 and Comparative Example 1.
  • 100 ⁇ L of the inactivated whole-particle vaccine prepared in Example 1 diluted with water for injection was 2.7 ng, 5.4 ng, 11 ng, 21 ng, 43 ng, 0.21 ⁇ g in terms of hemagglutinin-containing equivalent values, respectively. 1.1 ⁇ g was administered.
  • Comparative Example 3 100 ng of the vaccine prepared by diluting the split vaccine prepared in Comparative Example 1 to each dose with water for injection was administered in an amount corresponding to hemagglutinin content of 43 ng, 0.21 ⁇ g, and 1.1 ⁇ g, respectively. Both Comparative Example 2 and Comparative Example 3 were carried out with 4 animals.
  • mice bred for 4 weeks were opened under anesthesia, and blood was collected from the posterior vena cava. Serum was obtained by centrifuging the blood left at room temperature and collecting the supernatant. The amount of antibody (IgG) specific to influenza contained in the obtained serum was measured by the following method. (Measurement of IgG antibody production) 50 ⁇ L / well of the virus antigen inactivated for ELISA was dispensed into NUNC immunoplate maxisorp (C bottom, 96 well) and allowed to stand overnight at 4 ° C. with a seal.
  • NUNC immunoplate maxisorp C bottom, 96 well
  • FIG. 8 shows the evaluation of the production amount of IgG antibody in the serum of mice by administration of Example 1 and Comparative Examples 1 to 3. Surprisingly, it was found that the group administered with the vaccine according to Example 1 produced more IgG antibody even at low doses compared to the group administered with the vaccine according to Comparative Examples 1-3. .
  • Example 2 Preparation of microparticle array containing whole particle influenza vaccine Inactivation of influenza virus of A / PR / 8/1934 (H1N1) strain having a vaccine content equivalent to hemagglutinin content of 0.01 ⁇ g in the same manner as in Example 1. A microneedle array containing the whole particle vaccine was prepared.
  • Comparative Example 4 Preparation of a split influenza vaccine-containing microneedle array
  • an influenza virus split vaccine of A / PR / 8/1934 (H1N1) strain having a vaccine content equivalent to a hemagglutinin-containing value of 0.01 ⁇ g was prepared.
  • a microneedle array to be included was prepared.
  • Example 2 and Comparative Example 4 Vaccine administration test to mice using microneedle array
  • Mice (Balb / c (Claire Japan), female, 7 weeks old) were purchased, and after habituation for 1 week, an influenza vaccine administration test was performed.
  • hair was removed from the back of the mouse under anesthesia, and then the microneedle array was punctured for 4 minutes with the skin stretched. Both Example 3 and Comparative Example 4 were performed with 6 animals.
  • Vaccine administration test by subcutaneous injection test in mice (Comparative Example 5 and Comparative Example 6) As Comparative Example 5 and Comparative Example 6, vaccine administration by subcutaneous injection was performed on mice under the same conditions as in Example 2 and Comparative Example 4.
  • 100 ⁇ L of the inactivated whole particle vaccine prepared in Example 2 diluted with physiological saline was administered in an amount of 0.01 ⁇ g corresponding to hemagglutinin content.
  • 100 ⁇ L of the vaccine prepared by diluting the split vaccine prepared in Comparative Example 4 to each dose with water for injection was administered in an amount of 0.01 ⁇ g corresponding to hemagglutinin.
  • Comparative Example 5 and Comparative Example 6 were both performed with 6 animals.
  • MDCK cells were seeded in a 12-well plate and incubated at 37 ° C. for 2 days so as to cover the entire bottom surface.
  • 100 ⁇ L of lung emulsion diluted 10-fold in increments of 10 to 1000000 in 1 ⁇ MEM buffer was added to each 12-well plate in which MDCK cells were cultured, and incubated at 35 ° C. for 1 hour.
  • 1 mL of a mixture of 1 ⁇ MEM buffer and 1% agarose at 42 ° C. was added to each well and allowed to cool to room temperature for gelation.
  • the 12-well plate was incubated at 35 ° C. for 2 days.
  • the virus titer is expressed as a plaque forming unit (log (pfu / g)) per 1 g of the lung emulsion. (K ⁇ 10 (n + 2) ) Calculated with
  • Example 2 The results of measuring the viral load in the lungs by administration of Example 2 and Comparative Examples 4 to 6 are shown in FIG. It was found that the group administered with the vaccine according to Example 2 had a smaller amount of virus and had a higher virus growth inhibitory effect in the lungs than the group administered with the vaccine according to Comparative Examples 4-6.
  • Needle portion 12 Sheet portion 13 Base portion 21 Needle portion first layer 22 Needle portion second layer 31 Needle portion first layer 32 Needle portion second layer 33 Needle portion third layer 34 Needle portion fourth layer 41 Needle portion 51 Needle Upper end part 52 Sheet part 53 Support 61 Conical needle part tip 71 Square pyramid needle part tip D Distance between needle part and needle part H Needle part height S Needle part occupation area T Sheet part part Thickness W Needle base width ⁇ 1 Angle formed by side of needle layer first layer ⁇ 2 Angle formed by side of needle layer second layer or third layer

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Abstract

　抗体産生能を向上させることができ、簡便にインフルエンザワクチンを投与することのできるマイクロニードルアレイを提供する。不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包する針部と、シート部と、を含むマイクロニードルアレイ。マイクロニードルアレイを投与した後、２４時間以上２ヶ月未満の間隔をあけて２回目の投与を行う投与方法。

Description

不活化全粒子ワクチンを含有するマイクロニードルアレイ製剤およびその投与方法
　本発明は、不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包するマイクロニードルアレイに関する。
　インフルエンザは、呼吸器飛沫感染を介して拡散するインフルエンザウイルスによって引き起こされる急性の伝染性呼吸器疾患である。インフルエンザの予防には、インフルエンザワクチンを接種する方法が有効と考えられ、最近では、特に新型インフルエンザに対応したプレパンデミックワクチンの開発が進んでいる。
　インフルエンザワクチンは、弱毒化生ワクチン、不活化全粒子ワクチン、不活化スプリットワクチンの３種類に分類される。現在、日本において不活化スプリットワクチンが広く使用されている。
　ワクチンの効率的な投与方法として、マイクロニードルアレイによるインフルエンザワクチンの投与方法が提案されている。特許文献１には、インフルエンザワクチンの経皮デリバリー装置および投与方法が開示されている。
　特許文献２には、Ａ型（Ｈ１Ｎ１）株、Ａ型（Ｈ３Ｎ２）株およびＢ型株を有効成分とする抗原からなるインフルエンザワクチンをコーティングしたポリ乳酸製のマイクロニードルを備えるマイクロニードルデバイスが開示されている。
　非特許文献３には、三価季節性インフルエンザＨＡ抗原を装填した皮膚内溶解型マイクロニードルを作製し、ヒトにおける免疫誘導特性が評価されている。
特表２００７－５３０６８０号公報 国際公報２０１０／００１６７１号公報
日本薬剤学会第２８年会要旨集　口頭発表Ｎｏ．２３－３－１４　「臨床研究におけるインフルエンザ経皮ワクチン製剤の免疫誘導特性に関する解析」
　不活化スプリットワクチンは、日本において広く使用されているが、有効性が低い。また、インフルエンザの大流行を想定した場合、少ないワクチン量で多くのヒトの免疫を惹起させることが重要であり、ワクチンの効率的で簡便な投与方法が必要とされる。
　特許文献１は、このインフルエンザワクチンの経皮デリバリー装置による投与量と抗体産生量の相関について確認していない。また、特許文献２および非特許文献３では　上述のようにマイクロニードルアレイによりインフルエンザワクチンを投与する方法が検討されているが、スプリットワクチンが使用されており、ワクチンの投与量に対して抗体の産生量が十分ではなかった。また、そのため、インフルエンザワクチンを効率的で簡便に投与することのできる、さらに優れたマイクロニードルアレイの開発が強く求められている。
　本発明の目的は、抗体産生能を向上させることができ、簡便にインフルエンザワクチンを投与することのできるマイクロニードルアレイを提供することにある。
　このような状況下において、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包する針部と、シート部とを組み合わせたマイクロニードルアレイを投与することで、抗体産生能に優れることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は下記を提供する。
［１］　不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包する針部と、シート部と、を含むマイクロニードルアレイ。
［２］　針部が水溶性高分子を含み、体内に挿入された後に溶解する［１］に記載のマイクロニードルアレイ。
［３］　水溶性高分子が、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも１種である［２］に記載のマイクロニードルアレイ。
［４］　インフルエンザワクチンがＡ／Ｈ１Ｎ１型、Ａ／Ｈ３Ｎ２型、Ａ／Ｈ５Ｎ１型、およびＢ型からなる群より選択される少なくとも１種である［１］～［３］のいずれか１つに記載のマイクロニードルアレイ。
［５］　不活化全粒子インフルエンザワクチンの全質量に対する９０質量％以上が、針部の高さに対して先端から８０％以内に含まれる［１］～［４］のいずれか１つに記載のマイクロニードルアレイ。
［６］　不活化全粒子インフルエンザワクチンの全質量に対する９０質量％以上が、針部の先端から５００μｍ以内に含まれる［１］～［４］のいずれか１つに記載のマイクロニードルアレイ。
［７］　［１］～［６］のいずれか１つに記載のマイクロニードルアレイを投与した後、２４時間以上２ヶ月未満の間隔をあけて２回目の投与を行う投与方法。
　本発明のマイクロニードルアレイを用いれば、注射による投与に比べて、不活化全粒子インフルエンザワクチンを簡便な操作で投与することができる。また、注射による投与に比べて、少量のワクチン量でも抗体産生能を向上させることができる。
本発明のマイクロニードルアレイの一例を示す断面図である。 本発明のマイクロニードルアレイの一例を示す断面図である。 本発明のマイクロニードルアレイの一例を示す断面図である。 本発明のマイクロニードルアレイの一例を示す断面図である。 本発明のマイクロニードルアレイの一例を示す断面図である。 本発明のマイクロニードルアレイの一例を示す上面から見た図である。 本発明のマイクロニードルアレイの一例を示す上面から見た図である。 ＩｇＧ抗体価についてＨ１Ｎ１型不活化全粒子インフルエンザワクチンのマイクロニードルアレイ投与群とスプリットインフルエンザワクチンのマイクロニードルアレイ投与群とそれぞれの注射投与群との比較を示す図である。 ウイルス力価についてＨ１Ｎ１型不活化全粒子インフルエンザワクチンのマイクロニードルアレイ投与群と、スプリットインフルエンザワクチンのマイクロニードルアレイ投与群と、それぞれの注射投与群との比較を示す図である。
　以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明する。本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。また、本発明の目的の範囲内において適宜変更を加えて実施することができる。
　図１は本発明のマイクロニードルアレイの一例を示す断面図である。図１に示すように、本発明のマイクロニードルアレイは、不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包する針部１１とシート部１２から形成される。
　本発明のマイクロニードルアレイは、不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包する。
　不活化全粒子インフルエンザワクチンとは、インフルエンザウイルスを培養して得られたウイルス浮遊液からウイルスの形態を保持したままで不活化されたウイルス粒子を意味し、スプリットワクチンは含まれない。
　インフルエンザワクチンは、その型に限定されるものではなく、Ａ型、Ｂ型を含み、シーズン性ワクチンおよびパンデミックワクチンを含む。Ａ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１～１６から選ばれる型と、Ｎ１～９から選ばれる型との組み合わせによる亜型が存在する。本発明においては、Ａ／Ｈ１Ｎ１型、Ａ／Ｈ３Ｎ２型、Ａ／Ｈ５Ｎ１型、およびＢ型からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
　本発明のマイクロニードルアレイは針部を含む。針部は、不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包し、針部が皮膚または粘膜に穿刺されることで、経皮または経粘膜からの投与が可能となる。
　針部の形状は先端を有する凸状構造であれば特に限定されず、先鋭な先端を有する針形状および先の尖っていない先端を有する形状を含むが、先鋭な先端を有する形状が好ましい。具体的には、円錐状構造、三角錘状構造、四角錘状構造などの多角錘構造、円錐台構造、三角錐台構造、四角錘台構造などの多角錘台構造などが挙げられ、円錐状構造、三角錘状構造、四角錘状構造が好ましく、円錐状構造がより好ましい。
　本発明のマイクロニードルアレイの針部は、図２の針部２１と針部２２、図３の針部３１～３４に示すように、針部の側面の傾きが非連続的に変化する、二層ないしそれ以上の多層構造をとることができる。多層構造とした場合に、針の先端を含む層から順に針部第一層、針部第二層、と呼ぶ。図２の針部第一層２１と針部第二層２２、または図３の針部第一層３１と針部第三層３３のように、針部第一層よりもシート部に近い少なくとも１つの層における側面のなす角度θ２（図２の針部第二層２２、図３の針部第三層３３の場合は、針先端部方向に延長した時の交点のなす角度）が針部第一層における側面のなす角度θ１よりも大きいことが好ましい。このような構造をとることで、針部全体の体積が大きくなり、マイクロニードルアレイ作製時により多くの薬剤を針部の上端部に集中させることができる。
　本発明のマイクロニードルアレイの針部は、側面のなす角度を、図４の針部４１に示すように、連続的に変化させた構造をとることもできる。
　本発明のマイクロニードルアレイの針部は、図５の針部上端部５１に示すように、不活化全粒子インフルエンザワクチンを針部上端部に効率的に集中させることが好ましい。これにより、投与効率をさらに向上させることができる。また、針部の下端部およびシート部に同じ材料を選択することで製造効率が向上するため、好ましい。
　針部の高さは、図１のＨのように、針先端からシート部へ下ろした垂線の長さで表す。針部の高さは５０μｍ以上２０００μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以上１５００μｍ以下であることがより好ましく、２００μｍ以上１０００μｍ以下であることがさらに好ましい。５０μｍ以上であれば、不活化全粒子インフルエンザワクチンの経皮からの投与が可能となり、２０００μｍ以下であれば、免疫誘導に有効なランゲルハンス細胞へ抗原となるワクチンを効率的に認識させることができる。
　図１～図７の面１３のように、針部とシート部の界面を針部の基底部と呼ぶ。針部の基底部における幅は、図６および図７のＷのように、１本の針の基底部で最も遠い点間の距離で表す。針部の基底部における幅は、５０μｍ以上２０００μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以上１５００μｍ以下であることがより好ましく、２００μｍ以上１０００μｍ以下であることがさらに好ましい。
　針部は、１つのマイクロニードルアレイあたり１～２０００本配置されることが好ましく、３～１０００本配置されることがより好ましく、５～５００本配置されることがさらに好ましい。１つのマイクロニードルアレイあたり２本の針部を含む場合、針部の間隔は、図１におけるＤのように針部の先端からシート部へ下した垂線の足の間の距離で表す。１つのマイクロニードルアレイあたり３本以上の針部を含む場合、配列される針部の間隔は、全ての針部においてそれぞれ最も近接した針部に対して先端からシート部へ下した垂線の足の間の距離を求め、その平均値で表す。例えば、針部が等間隔で配列している場合は、図６および図７におけるＤのような態様が挙げられる。針部の間隔は、０．１ｍｍ以上１０ｍｍ以下であることが好ましく、０．２ｍｍ以上５ｍｍ以下であることがより好ましく、０．３ｍｍ以上３ｍｍ以下であることがさらに好ましい。
　１つのマイクロニードルアレイあたりの針部の占有面積は、図６および図７におけるＳのように、全ての針の基底部を含み、かつ最外周の針の基底部の接線で面積が最小になるように構成された図形の面積で表す。針部の占有面積は０．００５～１０００ｍｍ2であることが好ましく、０．０５～５００ｍｍ2がより好ましく、０．１～３００ｍｍ2であることがさらに好ましい。
　１つのマイクロニードルアレイあたり２本以上の針部を含む場合、針部の密度は、１つのマイクロニードルアレイの針部の本数を針部の占有面積で割った値で表す。針部の密度は、１ｍｍ2当たり０．０１～１０本の針密度が好ましく、０．０５～５本であることがより好ましく、０．１～５本であることがさらに好ましい。
　針部は、皮膚または粘膜に穿刺後、体内に挿入された後に溶解すること好ましい。そのため、針部を構成する材料としては、水溶性高分子が好ましく、多糖類であることがより好ましく、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも１種がさらに好ましい。
　本発明のマイクロニードルアレイは、針部を支持するシート部を有する。
　針部を皮膚または粘膜に穿刺する際に、使用者がシート部に力を加えることで針部に内包される不活化全粒子インフルエンザワクチンの経皮からの投与が可能となる。
　針部に力を加える方法としては、特に限定されない。
　シート部の厚さは図１～図５のＴのように、針と接している面と反対側の面の間の距離で表す。シート部の厚さは、１μｍ以上１２００μｍであることが好ましく、３μｍ以上６００μｍ以下であることがより好ましく、５μｍ以上４００μｍであることがさらに好ましい。
　シート部を構成する材料としては、水溶性高分子が好ましく、多糖類であることがより好ましく、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも１種がさらに好ましい。
　シート部を構成する材料は、針部を構成する材料と同一であっても、異なっていてもよい。
　本発明のマイクロニードルアレイは、図５のシート部５２に示すように、シート部の一部に支持体を含むことができる。支持体を含むことでシート部の強度が増し、より簡便にマイクロニードルアレイを皮膚または粘膜に穿刺することができる。
　支持体の材料としては特に限定されないが、穿刺の簡便さから、ポリエチレンテレフタラート、ポリエチレンナフタレートなどが挙げられる。
　支持体の厚さは、１０μｍ以上１０００μｍ以下が好ましく、３０μｍ以上５００μｍ以下がより好ましく、５０μｍ以上３００μｍ以下がさらに好ましい。
　本発明のマイクロニードルアレイに内包される不活化全粒子インフルエンザワクチンの全質量に対する９０質量％以上が、針部の高さに対して先端から８０％以内に含まれることが好ましく、６０％以内に含まれることがより好ましく、４０％以内に含まれることがさらに好ましい。
　また、本発明のマイクロニードルアレイに内包される不活化全粒子インフルエンザワクチンの全質量に対する９０質量％以上が、針部の先端から５００μｍ以内に含まれることが好ましく、３５０μｍ以内に含まれることがより好ましく、２００μｍ以内に含まれることがさらに好ましい。
　本発明のマイクロニードルアレイの製造法としては、特に限定されないが、（１）鋳型の製造工程、（２）不活化全粒子インフルエンザワクチンおよび水溶性高分子を調製する工程、（３）（２）工程で得た液を鋳型に充填し、針部の上端部を形成する工程、（４）水溶性高分子を鋳型に充填し、針部の下端部およびシート部を形成する工程、（５）鋳型から剥離する工程、を含む製造法によって得ることが好ましい。
　本発明のマイクロニードルアレイの投与時間は、コンプライアンス向上の観点から、１時間以内が好ましく、３０分以内がより好ましい。
　投与回数は、抗体産生能向上の観点から２回投与することが好ましい。投与間隔としては、２４時間～２ヶ月程度が好ましく、３日～１．５ヶ月程度がより好ましく、１週間～４週間程度がさらに好ましい。
　本発明のマイクロニードルアレイは、皮膚内での免疫応答を刺激し、抗体産生能を向上させることができる。具体的には、血清中のＩｇＧ抗体価を上昇させることが可能となる。
　また、本発明のマイクロニードルアレイは２回投与を行うことによって、他型のインフルエンザウイルスに対しても抗体価の上昇が見られた。
　以下、本発明のマイクロニードルアレイを実施例によりさらに具体的に説明するが、以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
全粒子インフルエンザワクチン含有マイクロニードルアレイの調製
　Ａ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株のインフルエンザウイルスをホルマリンによって処理し、不活化全粒子ワクチンを得た。その不活化全粒子ワクチンを添加した１４．４質量％ヒドロキシエチルデンプン溶液を円錐形状の凹部を持つ鋳型に充填し、乾燥させた。
　その後、４０質量％コンドロイチン硫酸ナトリウムを鋳型に充填し、乾燥させることで、針部の残りとシート部（支持体としてポリエチレンテレフタラートを含む）を形成し、型から抜くことで、実施例１の不活化全粒子ワクチンを内包させた、針部の高さが約５８０μｍの二層構成のマイクロニードルアレイ（針部第一層：高さ約４６０μｍ、底面直径約２７０μｍの円錐構造；針部第二層：高さ約１２０μｍ、上底面直径約２７０μｍ、下底面直径約４６０μｍの円錐台構造；針部の基底部の幅約４６０μｍ；シート部厚さ約２０５μｍ（このうちポリエチレンテレフタラート約１７５μｍ）；針本数９本；針の間隔約１ｍｍ；針部専有面積約６ｍｍ2；針密度約１．５本／ｍｍ2）を調製した。鋳型への充填量に合わせてヒドロキシエチルデンプン溶液に添加する不活化全粒子ワクチンの量を変えることで、ワクチン含有量がヘマグルチニン含有相当値でそれぞれ、０．６７ｎｇ、１．３ｎｇ、２．７ｎｇ、５．４ｎｇ、１１ｎｇ、２１ｎｇ、０．１１μｇ、０．５４μｇのマイクロニードルアレイを作製した。
　作製したマイクロニードルアレイの針部内における不活化全粒子ワクチンの分布は、以下の手法によって推測した。
　不活化全粒子ワクチンの代わりに０．１質量%のエバンスブルー色素を有する１４．４質量％ヒドロキシエチルデンプン溶液を使用する他は、上記と同じ方法でマイクロニードルアレイを作製した。針部の先端から１４０μｍの箇所でシート部と水平にカットし、カットした針先端を含む部分、および残りの針部とシート部を併せた部分を別々に水に溶解し、吸光度測定することで色素の針先端を含む部分への分配比率を測定した。比率は４５％であった。針部の先端から２００、２６０、３３０μｍの箇所でそれぞれカットした時の色素の針先端を含む部分への分配比率を同様に測定した。それぞれ、９０％、１００％、１００％であった。
（比較例１）
スプリットインフルエンザワクチン含有マイクロニードルアレイの調製
　Ａ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株のインフルエンザウイルスをエーテルによって処理し、スプリットワクチンを得た。その後、実施例１と同様の操作で、不活化全粒子ワクチンに代えてスプリットワクチンを用いて調製し、比較例１を得た。鋳型への充填量に合わせてヒドロキシエチルデンプン溶液に添加するスプリットワクチンの量を変えることで、ワクチン含有量がヘマグルチニン含有相当値でそれぞれ、２１ｎｇ、０．１１μｇ、０．５４μｇのマイクロニードルアレイを作製した。
マウスへのマイクロニードルアレイによるワクチン投与試験（実施例１および比較例１）
　マウス（Ｂａｌｂ／ｃ（日本クレア社）、メス、７週齢）を購入し、１週間の馴化の後、インフルエンザワクチンの投与試験を行った。実施例１および比較例１では、麻酔下でマウスの背面を除毛した後、皮膚を引き伸ばした状態でマイクロニードルアレイを４分間穿刺した。実施例１および比較例１は、ともに４匹で実施した。
マウスへの皮下注射試験によるワクチン投与試験（比較例２および３）
　比較例２および３として、実施例１および比較例１と同様の条件でマウスに対して、皮下注射によるワクチン投与を実施した。比較例２では、実施例１で調製した不活化全粒子ワクチンを、注射用水で希釈したワクチン１００μＬをヘマグルチニン含有相当値でそれぞれ２．７ｎｇ、５．４ｎｇ、１１ｎｇ、２１ｎｇ、４３ｎｇ、０．２１μｇ、１．１μｇ投与した。比較例３では、比較例１で調製したスプリットワクチンを注射用水で各用量に希釈したワクチン１００μＬをヘマグルチニン含有相当値でそれぞれ４３ｎｇ、０．２１μｇ、１．１μｇ投与した。比較例２および比較例３は、ともに４匹で実施した。
実施例１、比較例１～３の投与によるマウスの血清中における抗体産生量の評価
　投与後、４週間飼育したマウスを麻酔下で開腹し、後部大静脈より採血を行った。室温で静置した血液を遠心分離にかけ、上清を採取することで血清を得た。得られた血清中に含まれるインフルエンザに特異的な抗体（ＩｇＧ）の量を、下記の手法で測定した。
（ＩｇＧ抗体産生量の測定）
　ＮＵＮＣ　ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ　ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｃ　ｂｏｔｔｏｍ，９６ｗｅｌｌ）に、ＥＬＩＳＡ用として不活化させたウイルス抗原を５０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、シールにて４℃で終夜静置した。静置後、ＰＢＳＴ（Ｇｉｂｃｏ　ＰＢＳ＋０．１％　Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。その後、ブロッキング液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１％ＢＳＡ）を２００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、室温で３０分静置した。静置後、ＰＢＳＴ（Ｇｉｂｃｏ　ＰＢＳ＋０．１％　Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。洗浄後、希釈液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１％ＢＳＡ，０．１％Ｔｗｅｅｎ）で約１０，０００倍に希釈したサンプルを１００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、室温で１時間静置した。静置後、同様にＰＢＳＴ（Ｇｉｂｃｏ　ＰＢＳ＋０．１％　Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。
　次に、希釈液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１％ＢＳＡ，０．１％Ｔｗｅｅｎ）で希釈したＨＲＰ標識抗ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ抗体（５００倍）を１００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、室温で１時間静置した。静置後、同様にＰＢＳＴ（Ｇｉｂｃｏ　ＰＢＳ＋０．１％　Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。
　さらに、基質反応として、ＴＭＢ　１００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、遮光下室温で１５分間静置した。その後、ストップ液（１ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣｌ）１００μＬ／ｗｅｌｌを滴下した。
　滴下後、λ＝４５０ｎｍの吸光度（リファレンス６２０ｎｍ）を測定することにより、吸光度の大きさでＩｇＧ抗体産生量を相対評価した。
　実施例１、比較例１～３の投与によるマウスの血清中におけるＩｇＧ抗体の産生量評価を図８に示す。
　比較例１～３によってワクチンを投与された群に比べて、実施例１によってワクチンを投与された群は、予想外なことに低投与量でもＩｇＧ抗体がより多く産生されていることが判明した。
（実施例２）
全粒子インフルエンザワクチン含有マイクロニードルアレイの調製
　実施例１と同様の方法にて、ワクチン含有量がヘマグルチニン含有相当値で０．０１μｇのＡ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株のインフルエンザウイルスの不活化全粒子ワクチンを内包するマイクロニードルアレイを作製した。
（比較例４）
スプリットインフルエンザワクチン含有マイクロニードルアレイの調製
　比較例１と同様の方法にて、ワクチン含有量がヘマグルチニン含有相当値で０．０１μｇのＡ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株のインフルエンザウイルスのスプリットワクチンを内包するマイクロニードルアレイを作製した。
マウスへのマイクロニードルアレイによるワクチン投与試験（実施例２および比較例４）
　マウス（Ｂａｌｂ／ｃ（日本クレア社）、メス、７週齢）を購入し、１週間の馴化の後、インフルエンザワクチンの投与試験を行った。実施例２および比較例４では、麻酔下でマウスの背面を除毛した後、皮膚を引き伸ばした状態でマイクロニードルアレイを４分間穿刺した。実施例３および比較例４は、ともに６匹で実施した。
マウスへの皮下注射試験によるワクチン投与試験（比較例５および比較例６）
　比較例５及び比較例６として、実施例２および比較例４と同様の条件でマウスに対して、皮下注射によるワクチン投与を実施した。比較例５では、実施例２で調製した不活化全粒子ワクチンを、生理食塩水で希釈したワクチン１００μＬをヘマグルチニン含有相当値で０．０１μｇ投与した。比較例６では、比較例４で調製したスプリットワクチンを注射用水で各用量に希釈したワクチン１００μＬをヘマグルチニン含有相当値で０．０１μｇ投与した。比較例５および比較例６は、ともに６匹で実施した。
実施例２、比較例４～６のワクチン投与したマウスに対するウイルス増殖抑制効果の評価
　投与後、４週間飼育したマウスに対し、ＰＢＳで希釈した３００μＬのＡ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株のインフルエンザウイルス（ウイルス力価　１０4ｐｆｕ）を麻酔下で経鼻投与した。投与３日後のマウスを麻酔下で肺を摘出し、肺乳剤に対して１×ＭＥＭ／ＢＳＡ／抗生物質を含む培地を１：９の割合で加えてマルチビーズショッカーにより粉砕処理し、１０％肺乳剤を得た。
（肺中のウイルス力価の測定）
　ＭＤＣＫ細胞を１２穴プレートに撒き、３７℃で２日間インキュベートすることで底面一面に覆うように培養した。肺乳剤を１×ＭＥＭバッファーにて１０倍～１００００００倍まで１０倍刻みで希釈したものの１００μＬを、ＭＤＣＫ細胞を培養した１２穴プレートへそれぞれ１ｍＬずつ添加し、３５℃で１時間インキュベートした。肺乳剤を洗浄した後、４２℃の１×ＭＥＭバッファーおよび１％アガロースの混合液１ｍＬを各穴に加え、室温まで冷まし、ゲル化させた。１２穴プレートは３５℃で２日間インキュベートした。その後、０．００５％ニュートラルレッドを含む４２℃の１×ＭＥＭバッファーおよび１％アガロースの混合液１ｍＬを各穴に加え、さらに３５℃で１日間インキュベートした。その後、ライトテーブルの上で１２穴プレートを裏返して置き、ウイルスによるプラック（感染して死滅した細胞の痕）をカウントした。１つの穴あたりプラック数が１０以上１００未満になった希釈倍率を用いて判定した。１０のｎ乗の希釈倍率で添加した穴に対してｋ個のプラックが出た場合、ウイルス力価は肺乳剤１ｇあたりのプラック形成ユニット（ｌｏｇ（ｐｆｕ／ｇ））として以下の式
Ｔ＝ｌｏｇ（ｋ×１０(n+2)）
で算出した。
　実施例２および比較例４～６の投与による肺中のウイルス量測定結果を図９に表す。
　比較例４～６によってワクチンを投与された群に比べて、実施例２によってワクチンを投与された群は、ウイルスの量が少なく、肺中でのウイルス増殖抑制効果が高いことが判明した。
１１   針部
１２   シート部
１３   基底部
２１   針部第一層
２２   針部第二層
３１   針部第一層
３２   針部第二層
３３   針部第三層
３４   針部第四層
４１   針部
５１   針部上端部
５２   シート部
５３   支持体
６１   円錐状の針部の先端
７１   四角錘状の針部の先端
Ｄ     針部と針部の間隔
Ｈ     針部の高さ
Ｓ     針部の占有面積
Ｔ     シート部の厚さ
Ｗ     針部基底部の幅
θ１   針部第一層の側面のなす角
θ２   針部第二層または第三層の側面のなす角

Claims (7)

  1. 　不活化全粒子インフルエンザワクチンを内包する針部と、シート部と、を含むマイクロニードルアレイ。
  2. 　針部が水溶性高分子を含み、体内に挿入された後に溶解する請求項１に記載のマイクロニードルアレイ。
  3. 　水溶性高分子が、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも１種である請求項２に記載のマイクロニードルアレイ。
  4. 　インフルエンザワクチンがＡ／Ｈ１Ｎ１型、Ａ／Ｈ３Ｎ２型、Ａ／Ｈ５Ｎ１型、およびＢ型からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１～３のいずれか１項に記載のマイクロニードルアレイ。
  5. 　不活化全粒子インフルエンザワクチンの全質量に対する９０質量％以上が、針部の高さに対して先端から８０％以内に含まれる請求項１～４のいずれか１項に記載のマイクロニードルアレイ。
  6. 　不活化全粒子インフルエンザワクチンの全質量に対する９０質量％以上が、針部の先端から５００μｍ以内に含まれる請求項１～４のいずれか１項に記載のマイクロニードルアレイ。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載のマイクロニードルアレイを投与した後、２４時間以上２ヶ月未満の間隔をあけて２回目の投与を行う投与方法。
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