WO2022210763A1 - インフルエンザワクチン - Google Patents

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亮大郎 三股
誠大 奈良原
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    • C12N2760/16263—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment

Definitions

  • the present invention relates to highly effective influenza vaccines for children or the elderly.
  • Human influenza viruses are single-stranded RNA viruses belonging to the genus Orthomyxovirus, and are classified into types A, B, and C according to the antigenicity of their internal antigens. Of these, types A and B cause major epidemics every year, mainly in winter, and are known to affect an estimated 10 million or more people annually in Japan. Vaccines are the most effective means of preventing influenza viruses that cause major epidemics every year. Influenza vaccines in Japan were introduced in 1957 with the outbreak of the Asian flu, and at that time were inactivated whole-particle vaccines obtained by inactivating purified influenza viruses. However, after that, in order to reduce side effects such as fever, a split vaccine was approved in which the lipid component was removed by cleaving the virus particles with diethyl ether or surfactant treatment, and now split vaccines are widely used worldwide.
  • split vaccines are known to have low immunogenicity, especially in age groups with weak immune responses, such as children and the elderly. Therefore, about half of seasonal influenza virus infections are children, and although the frequency is low, children have a higher risk of developing influenza encephalopathy than other age groups. high risk of Therefore, highly effective influenza vaccines for children and the elderly, such as live attenuated nasal vaccines, adjuvant preparations and high titer vaccines, have already been approved in Europe and the United States.
  • TLRs Toll-like receptors
  • phagocytic cells play an important role in connecting innate immunity and adaptive immunity (Non-Patent Document 1), but the expression of TLRs is significantly reduced in elderly macrophages, so antigen-specific It is known that the acquired immune response, which is a typical response, is also reduced (Non-Patent Document 2).
  • the present invention relates to providing an influenza vaccine that has high immunogenicity in children and the elderly and is more effective than conventional split vaccines.
  • an inactivated whole-particle vaccine can be prepared that maintains higher innate immune activity than conventional formalin treatment.
  • the vaccine has higher immunogenicity than the approved split vaccine in pediatric and geriatric animal models.
  • the beta-propiolactone-treated inactivated whole particle vaccine can induce virus-specific antibodies to the nasal mucosa where the virus proliferates, and is significantly more effective than the split vaccine in pediatric and elderly model animals. High antibody induction was confirmed.
  • the present invention relates to the following 1) to 6).
  • An immunization method comprising administering to a child or an elderly person a composition containing, as a viral antigen, inactivated whole particles inactivated with beta-propiolactone.
  • a method for preventing influenza comprising administering to a child or the elderly a composition containing, as a viral antigen, inactivated whole particles inactivated with beta-propiolactone.
  • an influenza vaccine that exhibits higher efficacy than the approved split vaccine for children and/or the elderly with weak immune responses.
  • the influenza vaccine composition of the present invention promotes high antibody induction in both serum and nasal mucosa in children and the elderly. can be increased, and it can greatly contribute to the pharmaceutical industry as the creation of a high-value-added influenza preventive drug.
  • BPL beta propiolactone.
  • IgG titers against A/Singapore/GP1908/2015 strain in serum 42 days after subcutaneous administration of vaccine IgG titers against strain B/Phuket/3073/2013 in serum 42 days after subcutaneous administration of vaccine.
  • Neutralizing antibody titer against B/Phuket/3073/2013 strain in serum 42 days after subcutaneous administration of vaccine IgG titers against A/Singapore/GP1908/2015 strain in nasal washes 42 days after subcutaneous administration of vaccine. IgG titers against strain B/Phuket/3073/2013 in nasal washes 42 days after subcutaneous administration of vaccine.
  • Viral antigens in the influenza vaccine composition of the present invention are influenza virus whole particles that have been inactivated with beta( ⁇ ) propiolactone.
  • influenza virus refers to influenza A virus or influenza B virus, or both. Influenza virus also includes all currently known subtypes and subtypes isolated and identified in the future.
  • Viral antigens of the present invention include at least either influenza A virus or influenza B virus. That is, the influenza vaccine of the present invention may be a monovalent vaccine containing virus antigens of either influenza A virus or influenza B virus, or may be a polyvalent vaccine containing both of them.
  • Viral antigens preferably include A/H1N1 and/or A/H3N2 influenza virus strains, and B/Victoria and/or B/Yamagata strain B influenza virus strains. More preferably, it includes two type A strains (A/H1N1 subtype and A/H3N2 subtype) and two type B strains (B/Victoria strain and B/Yamagata strain).
  • Influenza virus whole particles can be prepared by a method using embryonated chicken eggs or cultured cells.
  • the preparation method using embryonated chicken eggs is, for example, a method in which a virus stock is inoculated into embryonated chicken eggs and cultured, and then the virus suspension is clarified, concentrated, and purified to obtain a virus fluid containing virus particles.
  • the preparation method using cultured cells is, for example, a method of inoculating a virus strain into cultured cells, culturing the cells, and then obtaining a virus fluid containing virus particles from the culture supernatant in the same manner as in the embryonated chicken egg method described above.
  • the culture is performed by inoculating the influenza virus strain at 30 to 37° C.
  • virus suspension infected allantoic fluid or infected cell culture supernatant
  • a barium salt adsorption elution reaction and ultrafiltration are performed.
  • Virus purification can be performed using means such as ultracentrifugation such as sucrose density gradient centrifugation and liquid chromatography.
  • the cultured cells are not particularly limited as long as they are cells in which influenza viruses exhibit proliferative properties.
  • MDCK Medin-Darby Canine Kidney
  • Vero Vero
  • Caco-2 Caco-2
  • PER. C6 EB66
  • those cells engineered to high express the receptors that the virus uses for entry.
  • the influenza virus whole particles thus obtained are inactivated with beta-propiolactone. That is, in the present invention, instead of conventional inactivation treatment using formaldehyde (formalin treatment), inactivation treatment with beta-propiolactone is performed.
  • Beta-propiolactone is a monoalkylating agent widely used for virus inactivation in the preparation of many vaccines.
  • the inactivation treatment with beta-propiolactone is carried out at any time during the clarification, concentration or purification of the recovered influenza virus suspension after culturing with embryonated chicken eggs or cultured cells.
  • the virus solution collected after culturing is added at a final concentration of 0.0125 to 0.1 vol%, preferably 0.025 to 0.075 vol%, more preferably 0.05 vol%. and ⁇ -propiolactone is added to and reacted at 2 to 8° C. for 18 hours or more, preferably 20 hours or more, more preferably 24 hours or more and 50 hours or less, preferably 30 hours or less.
  • a more preferred embodiment is, for example, treatment at 2 to 8° C. and 0.05% for 24 hours.
  • an influenza vaccine whose antigen is inactivated whole virus particles inactivated with beta-propiolactone stimulates innate immunity compared to an inactivated whole-particle influenza vaccine prepared by conventional formalin treatment.
  • the vaccine shows significantly higher antibody induction in serum after 1 and 2 administrations than the existing split vaccines.
  • the vaccine showed a high induction of virus-specific IgG in the nasal mucosa, and in pediatric model animals, it was significantly higher than the split vaccine for both type A and B viruses. , showing significantly higher antibody induction than existing vaccines with type B virus even in elderly model animals.
  • a composition containing, as a viral antigen, influenza virus whole particles that have been inactivated with beta-propiolactone is useful as an influenza vaccine that exhibits a high ability to stimulate innate immunity when administered to children and/or the elderly.
  • administration of a composition containing, as a viral antigen, influenza virus whole particles inactivated with beta-propiolactone to children and/or the elderly is effective in producing antibodies against the influenza virus in the children and/or the elderly. It is useful as an immunization method for induction and as a method for preventing influenza.
  • the ability to stimulate innate immunity can be evaluated by the ability to activate TLR.
  • the viral antigen of the influenza vaccine composition of the present invention preferably has an RLU value of 50 or more, and preferably 60 or more, measured using recombinant RAW264.7 cells as shown in Examples described later. is more preferred.
  • the influenza vaccine composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier as appropriate in addition to the influenza antigen described above, and be formulated in a predetermined form.
  • the carrier includes carriers commonly used in the production of vaccines, specifically buffers, emulsifiers, preservatives (e.g., thimerosal), tonicity agents, pH adjusters, thickening agents, Examples include inactivating agents (eg, formalin), adjuvants, immunostimulants, and the like.
  • An adjuvant is a substance that, when administered together with an antigen, enhances the immune response to the antigen. The addition is not necessary and the composition can be adjuvant-free.
  • influenza vaccine compositions are suitably formulated in solid, semi-solid or liquid form to be compatible with the intended route of administration.
  • Suitable routes of administration include, for example, intramuscular, transdermal, subcutaneous, intradermal, intranasal, sublingual and oral routes, preferably subcutaneous administration.
  • injectable formulations for intramuscular, transdermal, subcutaneous, intradermal administration include, for example, solutions, emulsions, aqueous or hydrophobic suspensions, and dried formulations that are dissolved or suspended by adding liquids.
  • a powder dosage form is mentioned.
  • the content of the influenza antigen in the influenza vaccine composition is 7.5 ⁇ g or more per virus strain, that is, 7.5 ⁇ g HA/strain or more, preferably 9 to 21 ⁇ g HA/strain, more preferably 9 to 21 ⁇ g HA/strain, in terms of hemagglutinin amount per dosage unit. contains 15 ⁇ g HA/strain.
  • the hemagglutinin content is a value obtained by measuring by a test method such as a single radiation immunodiffusion test method defined by WHO or national standards.
  • the amount of antigen contained in the vaccine may be appropriately changed according to the type of virus or the subject of administration.
  • the subjects for administration of the influenza vaccine composition of the present invention are children and/or the elderly.
  • the term "pediatric” refers to a human aged 0 to 15, preferably 3 to 12
  • the term “elderly” refers to a human aged 50 or older, more preferably 55 or older. and more preferably 60 years or older.
  • the frequency of administration of the influenza vaccine composition of the present invention is at least once, but preferably at least twice from the viewpoint of efficacy. Additional administration is sometimes referred to as booster immunization, which can provide more effective protection against infection. A booster interval of at least one week is recommended, with intervals of one to four weeks being preferred.
  • Example 1 Evaluation of the effect of inactivation treatment on the ability to activate innate immunity B/Phuket/3073/2013 strain virus was inoculated into the chorioallantoic cavity of a 12-day-old embryonated chicken egg, cultured for 3 days, and then excreted. Liquid was collected. After clarification of the collected urinary fluid by filter filtration, the influenza virus was recovered by adsorbing to barium sulfate and eluting with a 12% sodium citrate solution. The recovered virus was further subjected to ultrafiltration to replace with 6.7 mM phosphate-buffered saline (pH 7.2), and after buffer replacement, the fraction containing influenza virus was recovered by sucrose density gradient centrifugation to purify. The resulting virus solution was used as a purified influenza virus solution.
  • Betapropiolactone (BPL), an inactivating agent, was added to the purified influenza virus solution to a final concentration of 0.05%, and the infectivity of the influenza virus was inactivated by reacting at 4°C for 24 hours, After this inactivation reaction, the buffer was replaced with 6.7 mM phosphate buffered saline (pH 7.2) by ultrafiltration (MWCO: 100,000), and this was used as a ⁇ -propiolactone-treated inactivated whole particle vaccine. did.
  • the purified influenza virus solution was adjusted to a protein concentration of 200 ⁇ g/mL, and 10% neutral buffered formalin solution (Fuji Film Wako Pure Chemical, formaldehyde content: 3.8 to 4.1%) was added thereto. A final concentration of 0.01 or 0.02% was added, and the reaction was carried out at 4°C for 14 days. After the reaction, glycine was added to a final concentration of 10 mM to stop the formaldehyde reaction, and the mixture was centrifuged at 1,000,000 ⁇ g at 4° C. for 4 hours. After centrifugation, the supernatant was discarded, and the obtained virus pellet was suspended in 6.7 mM phosphate-buffered saline (pH 7.2) to obtain a formaldehyde-treated inactivated whole particle vaccine.
  • NBP2-26261 Novus Biologicals: Recombinant RAW264.7 cells in which a secretory alkaline phosphatase (SEAP) gene was integrated downstream of the NF ⁇ B transcription response element, except for TLR5 10 ⁇ g of the total protein amount of various inactivated vaccines were added to each strain and cultured at 37° C. and 5% CO 2 for 24 hours. After culturing, the supernatant was collected and the alkaline phosphatase activity of the supernatant was measured using SEAP Reporter Assay Kit (trade name, Cayman). Since this measured value (RLU: Relative Light Unit) serves as an index of TLR-mediated innate immune activity, the ability of vaccines prepared under each inactivation treatment condition to activate innate immunity was compared with this measured value.
  • SEAP secretory alkaline phosphatase
  • FIG. 1 A comparison of the measured values is shown in FIG. 1.
  • 0.02% formalin at 4° C. for 14 days which is a general virus inactivation treatment condition
  • a clear decrease in the ability to stimulate innate immunity was confirmed.
  • rice field in the reaction of 0.02% formalin at 4° C. for 14 days, which is a general virus inactivation treatment condition
  • the innate immunity stimulating ability was lower than in the beta-propiolactone treatment. Therefore, compared with the formalin-inactivated whole particle vaccine that was in circulation before 1971, the beta-propiolactone-treated inactivated whole particle vaccine was shown to have a higher ability to stimulate innate immunity. was done.
  • Example 2 Evaluation of immunogenicity in children and the elderly in a mouse model
  • a ⁇ -propiolactone-treated inactivated whole particle vaccine of each strain was prepared and added to 6.7 mM phosphate-buffered saline containing 1 w/w% sucrose ( pH 7.2) to prepare an inactivated whole particle vaccine.
  • the split vaccine the undiluted solution of the influenza HA vaccine was used, and similarly, 6.7 mM phosphate buffered saline (pH 7.2 ).
  • the administration solution prepared as described above was subcutaneously administered to male C57BL/6 mice (Charles River) at 1, 3, 6, 12 and 18 months of age twice at 3-week intervals. . Twenty-one days after the first administration (Day 21), partial blood was collected from the tail vein, and 21 days after the second administration (Day 42), whole blood was collected under anesthesia. Serum was prepared from the collected blood by centrifugation and subjected to various antibody titer measurements. After collecting the whole blood on Day 42, the pipetman was inserted from the pharyngeal side of the maxilla, D-PBS containing 0.175% BSA and protease inhibitor (Thermo Fisher Scientific) was poured in, and the solution collected from the external nostril was injected into the nasal cavity. used as a washing solution. This nasal wash was also subjected to virus-specific IgG titration.
  • C57BL/6 mice aged 1, 3, 6, 12 and 18 months were immature individuals (equivalent to 12 years old in humans) at 1 month old and mature individuals (equivalent to 20-30 years old in humans) at 3 and 6 months old. It is known that 12 months old is a middle-aged individual (equivalent to 42 years old in humans), and 18 months old is an old individual (equivalent to 56 years old in humans) (Charles River Technical Information, research Aged C57BL/6J mice used, https://www.crj.co.jp/cms/crj/pdf/product/rm/brochure/White_Paper_B6-Aged.pdf). Therefore, 1-month-old model animals for children and 18-month-old model animals for elderly people.
  • virus-specific IgG titers after two administrations ( Figure 3A (type A virus) and Figure 3B (type B virus)) and neutralizing antibody titers ( Figure 4A (type A virus) and Figure 4B (type B virus) )
  • Figure 3A type A virus
  • Figure 3B type B virus
  • Figure 4A type A virus
  • Figure 4B type B virus
  • Neutralizing antibody titers were also measured for the sera after the second administration, and as shown in Figure 4A (type A virus) and Figure 4B (type B virus), inactivation was observed in 1 month old and 18 month old mice.
  • the whole particle vaccine administration group (W.V.) showed significantly higher antibody induction.
  • FIG. 5A shows nasal virus-specific IgG titers against the A/Singapore/GP1908/2015 strain, showing that in 1-month-old mice, inactivated whole-particle
  • the vaccine administration group (W.V.) showed significantly higher antibody induction.
  • FIG. 5B shows nasal virus-specific IgG titers against strain B/Phuket/3073/2013, showing that both 1-month and 18-month-old mice had split vaccine (S.V. ), a significantly higher antibody titer was confirmed in the inactivated whole particle vaccine administration group (W.V.).

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Abstract

小児や高齢者において高い免疫原性を有し、従来のスプリットワクチンに比べて有効性の高いインフルエンザワクチンを提供する。　小児及び／又は高齢者に投与されるインフルエンザワクチン組成物であって、ベータプロピオラクトンで不活化処理された不活化全粒子をウイルス抗原として含有する、組成物。

Description

インフルエンザワクチン
　本発明は、小児若しくは高齢者に対する有効性の高いインフルエンザワクチンに関する。
　ヒトのインフルエンザウイルスはオルソミクソウイルス属の一本鎖ＲＮＡウイルスであり、内部抗原の抗原性によってＡ型、Ｂ型及びＣ型に分類される。このうち冬季を中心に毎年大きな流行を引き起こすのはＡ型及びＢ型であり、わが国においても年間で推定約１，０００万人以上が罹患することが知られている。このように毎年大きな流行を起こすインフルエンザウイルスの予防に最も有効な手段がワクチンである。わが国のインフルエンザワクチンは、１９５７年に流行したアジア風邪を契機に導入され、当時は精製したインフルエンザウイルスを不活化処理した不活化全粒子ワクチンであった。しかし、その後発熱等の副反応低減のため、ジエチルエーテルや界面活性剤処理でウイルス粒子を解裂し、脂質成分を除いたスプリットワクチンが承認され、現在では世界的にスプリットワクチンが広く普及している。
　しかし、スプリットワクチンは、小児や高齢者といった免疫応答の弱い年齢層では特に免疫原性が低いことが知られている。そのため、季節性インフルエンザウイルスの感染の約半数は小児であり、頻度は少ないが小児では他の年齢層に比べてインフルエンザ脳症の発症リスクが高く、高齢者では感染症状が重症化を呈し易く、死亡のリスクが高い。そのため、既に欧米では弱毒生経鼻ワクチン、アジュバント製剤及び高力価ワクチンといった、小児や高齢者用の有効性の高いインフルエンザワクチンが承認されている。
　高齢者の免疫応答が弱い理由の１つとして、高齢者における自然免疫の低下が挙げられる。特に、貪食細胞におけるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）は、自然免疫と獲得免疫を繋ぐ重要な役割を担うが（非特許文献１）、高齢者のマクロファージではＴＬＲｓの発現が著しく低下し、そのため抗原特異的な反応である獲得免疫応答も低下することがわかっている（非特許文献２）。また、既往歴がなく、ワクチン接種歴も少ない小児では、より強い基礎免疫を促す必要があり、そのためにはＴＬＲ７を介した形質細胞様樹状細胞の強い活性化が必要である（非特許文献３）。
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　本発明は、小児や高齢者において高い免疫原性を有し、従来のスプリットワクチンに比べて有効性の高いインフルエンザワクチンを提供することに関する。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、インフルエンザウイルスの不活化処理にベータプロピオラクトンを用いることにより、従来のホルマリン処理に比べて自然免疫活性を高く維持した不活化全粒子ワクチンを調製でき、当該ワクチンが小児及び高齢者のモデル動物において、既承認のスプリットワクチンよりも高い免疫原性を有していることを見出した。そして、当該ベータプロピオラクトン処理した不活化全粒子ワクチンでは、ウイルスが増殖する鼻腔粘膜へウイルス特異的な抗体を誘導することができ、小児及び高齢者のモデル動物においてスプリットワクチンに対して有意に高い抗体誘導が確認された。
　したがって、本発明は以下の１）～６）に係るものである。
　１）小児及び／又は高齢者に投与されるインフルエンザワクチン組成物であって、ベータプロピオラクトンで不活化処理された不活化全粒子をウイルス抗原として含有する、組成物。
　２）ウイルス抗原がＡ／Ｈ１Ｎ1亜型及びＡ／Ｈ３Ｎ２亜型からなるＡ型インフルエンザウイルス株、並びにＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統からなるＢ型インフルエンザウイルス株を含む、１）に記載の組成物。
　３）アジュバントを含有しない、１）又は２）に記載の組成物。
　４）皮下投与される、１）～３）のいずれかに記載の組成物。
　５）ベータプロピオラクトンで不活化処理された不活化全粒子をウイルス抗原として含有する組成物を小児又は高齢者に投与する、免疫方法。
　６）ベータプロピオラクトンで不活化処理された不活化全粒子をウイルス抗原として含有する組成物を小児又は高齢者に投与する、インフルエンザの予防方法。
　本発明によれば、免疫応答が弱い小児及び／又は高齢者に対して既承認のスプリットワクチンよりも高い有効性を示すインフルエンザワクチンが提供される。本発明のインフルエンザワクチン組成物は、小児及び高齢者において、血清及び鼻腔粘膜のいずれにおいても高い抗体誘導を促すことから、感染や重症化のリスクの高い小児及び高齢者において、ウイルス感染の防御活性を高めることが可能となり、付加価値の高いインフルエンザ予防薬の創製として医薬品産業に大きく貢献できる。
不活化処理によるインフルエンザワクチンの自然免疫活性の影響。ＢＰＬ：ベータプロピオラクトン。 ワクチンの皮下投与による２１日後の血清におけるＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株に対するＩｇＧ力価。 ワクチンの皮下投与による２１日後の血清におけるＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株に対するＩｇＧ力価。 ワクチンの皮下投与による４２日後の血清におけるＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株に対するＩｇＧ力価 ワクチンの皮下投与による４２日後の血清におけるＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株に対するＩｇＧ力価。 ワクチンの皮下投与による４２日後の血清におけるＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株に対する中和抗体価。 ワクチンの皮下投与による４２日後の血清におけるＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株に対する中和抗体価。 ワクチンの皮下投与による４２日後の鼻腔洗浄液におけるＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株に対するＩｇＧ力価。 ワクチンの皮下投与による４２日後の鼻腔洗浄液におけるＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株に対するＩｇＧ力価。
　以下に本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本発明のインフルエンザワクチン組成物におけるウイルス抗原は、ベータ（β）プロピオラクトンで不活化処理されたインフルエンザウイルス全粒子である。
　本発明において、「インフルエンザウイルス」とは、Ａ型インフルエンザウイルス若しくはＢ型インフルエンザウイルス、又はその両者を示す。また、インフルエンザウイルスは、現在知られている全ての亜型、及び将来単離及び同定される亜型も含む。
　本発明のウイルス抗原は、少なくともＡ型インフルエンザウイルス又はＢ型インフルエンザウイルスのいずれかを含む。すなわち、本発明のインフルエンザワクチンは、Ａ型インフルエンザウイルス又はＢ型インフルエンザウイルスの一方のウイルス抗原を含む単価ワクチンでも良く、それらを両方含んでいる多価ワクチンでも良い。
　ウイルス抗原としては、好ましくは、Ａ／Ｈ１Ｎ1亜型及び／又はＡ／Ｈ３Ｎ２亜型からなるＡ型インフルエンザウイルス株と、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統及び／又はＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統Ｂ型インフルエンザウイルス株とを含むものが挙げられ、より好ましくは、Ａ型を２株（Ａ／Ｈ１Ｎ1亜型及びＡ／Ｈ３Ｎ２亜型）、Ｂ型を２株（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統）を含むものが挙げられる。
　インフルエンザウイルス全粒子は、発育鶏卵若しくは培養細胞を用いた方法より調製できる。
　発育鶏卵による調製方法は、例えば、ウイルス株を孵化鶏卵に接種して培養した後、ウイルス浮遊液を清澄化、濃縮、精製して、ウイルス粒子を含むウイルス液を得る方法である。また、培養細胞による調製方法は、例えば、ウイルス株を培養細胞に接種して培養した後、上記の発育鶏卵法と同様に培養上清よりウイルス粒子を含むウイルス液を得る方法である。
　ここで、培養は、インフルエンザウイルス株を接種して、３０～３７℃で１～７日程度、好ましくは３３～３５℃で２日間程度行われる。培養終了後、ウイルス浮遊液（感染尿膜腔液若しくは感染細胞培養上清）が回収され、清澄化のため、遠心分離または濾過が行われる。次いで、濃縮のために、バリウム塩吸着溶出反応や限外濾過が行われる。ウイルス精製は、ショ糖密度勾配遠心分離等の超遠心分離や液体クロマトグラフィー等の手段を用いて行うことができる。
　培養細胞とはインフルエンザウイルスが増殖性を示す細胞であれば特に限定されず、例えば、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ）、Ｖｅｒｏ、Ｃａｃｏ－２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＥＢ６６及びウイルスが侵入に使用するレセプターを高発現するよう組換えたこれらの細胞が挙げられる。
　斯くして得られたインフルエンザウイルス全粒子は、ベータプロピオラクトンによって不活化処理される。
　すなわち、本発明においては、従来のホルムアルデヒドを用いた不活化処理（ホルマリン処理）に代えて、ベータプロピオラクトンによる不活化処理が行われる。
　ベータプロピオラクトンは、多くのワクチンの調製においてウイルス不活性化のために広く使用されるモノアルキル化剤である。
　ベータプロピオラクトンによる不活化処理は、発育鶏卵若しくは培養細胞で培養し、回収されたインフルエンザウイルス浮遊液を清澄化、濃縮又は精製するいずれかの時期に行われる。
　ベータプロピオラクトン処理としては、培養後に回収されたウイルス液に、終濃度で０．０１２５～０．１ｖｏｌ％、好ましくは０．０２５～０．０７５ｖｏｌ％、より好ましくは０．０５ｖｏｌ％となるようにβ－プロピオラクトンを加え、２～８℃で、１８時間以上、好ましくは２０時間以上、より好ましくは２４時間以上、かつ５０時間以下、好ましくは３０時間以下で反応させる方法が挙げられる。
　より好ましい態様として、例えば２～８℃、０．０５％で２４時間処理することが挙げられる。
　後述する実施例に示すとおり、ベータプロピオラクトンで不活化処理した不活化全ウイルス粒子を抗原とするインフルエンザワクチンが、従来のホルマリン処理によって調製した不活化全粒子インフルエンザワクチンに比べて自然免疫賦活化能が高く、これを小児及び高齢者のモデル動物に投与することで、１回及び２回投与後の血清において、既存のスプリットワクチンに比べて有意に高い抗体誘導を示す。また、２回投与後は、鼻腔粘膜においても当該ワクチンは高いウイルス特異的ＩｇＧの誘導を示し、小児のモデル動物ではＡ型及びＢ型のいずれのウイルスに対してもスプリットワクチンよりも有意に高く、高齢者のモデル動物でもＢ型のウイルスで既存のワクチンよりも有意に高い抗体誘導を示す。
　したがって、ベータプロピオラクトンで不活化処理されたインフルエンザウイルス全粒子をウイルス抗原として含む組成物は、小児及び／又は高齢者に投与した場合に、高い自然免疫賦活化能を発揮するインフルエンザワクチンとして有用である。また、ベータプロピオラクトンで不活化処理されたインフルエンザウイルス全粒子をウイルス抗原として含む組成物の小児及び／又は高齢者への投与は、当該小児及び／又は高齢者にインフルエンザウイルスに対して抗体を誘導するための免疫方法として、またインフルエンザの予防方法として有用である。
　なお、自然免疫賦活化能は、ＴＬＲ活性化能によって評価することができ、例えば、後述実施例で記載するとおり、ＴＬＲ７遺伝子と分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子を組み込んだＲＡＷ２６４．７細胞に、インフルエンザ抗原を曝露した際の培養上清中のＳＥＡＰ活性（ＲＬＵ値：Ｒｅｌａｔｉｖｅ　Ｌｉｇｈｔ　Ｕｎｉｔ）を測定することにより行うことができる。
　本発明のインフルエンザワクチン組成物のウイルス抗原は、例えば、後述する実施例で示すように組換えＲＡＷ２６４．７細胞を用いて測定されたＲＬＵ値が５０以上であるのが好ましく、６０以上であるのがより好ましい。
　本発明のインフルエンザワクチン組成物は、上記インフルエンザ抗原の他に、適宜、薬学的に許容され得る担体を含有し、所定の形態で製剤化され得る。
　ここで、担体としては、ワクチンの製造に通常用いられる担体が挙げられ、具体的には、緩衝剤、乳化剤、保存剤（例えば、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤、粘稠剤、不活化剤（例えば、ホルマリン）、アジュバント若しくは免疫刺激剤等が例示される。アジュバントとは、抗原と共に投与することで、当該抗原に対する免疫応答を増強させる物質であるが、本発明のワクチン組成物は、上記のとおりワクチン抗原自体が高い抗体誘導能を有することから、アジュバントの添加は必ずしも必要とせず、アジュバントを含有しない組成物とすることができる。
　斯かるインフルエンザワクチン組成物は、固形、半固形若しくは液体形態で、意図する投与経路に適合するように適当に製剤される。適当な投与経路としては、例えば、筋肉内、経皮、皮下、皮内、鼻腔内、舌下、経口等が挙げられるが、好ましくは皮下投与である。筋肉内、経皮、皮下、皮内等の注射投与製剤としては、例えば、液剤、エマルジョン剤、水溶性又は疎水性の懸濁剤や、液体を添加して溶解あるいは懸濁させて使用する乾燥粉末の剤型が挙げられる。
　上記インフルエンザワクチン組成物におけるインフルエンザ抗原の含有量は、１投与単位に、ヘムアグルチニン量としてウイルス１株当たり７．５μｇ以上、すなわち７．５μｇＨＡ／株以上であり、好ましくは９～２１μｇＨＡ／株、より好ましくは１５μｇＨＡ／株を含む。なお、ヘムアグルチニン含量は、一元放射免疫拡散試験法等の、ＷＨＯや国の基準で定められた試験法で測定することによって得られる値である。また、ワクチンに含まれる抗原量はウイルスの種類又は投与対象に応じて適宜変更しても良い。
　本発明のインフルエンザワクチン組成物の投与対象は、小児及び／又は高齢者である。本発明において、小児とは、０歳以上１５歳未満のヒト、好ましくは３歳以上１２歳未満を意味し、高齢者とは、好ましくは５０歳以上のヒトであり、より好ましくは５５歳以上であり、更に好ましくは６０歳以上である。
　本発明のインフルエンザワクチン組成物の投与回数は、少なくとも１回であるが、有効性の観点から、少なくとも２回が好ましい。更なる投与を時に追加免疫といい、これにより、より効果の高い感染防御効果を奏することができる。追加免疫の間隔は、少なくとも１週間が推奨され、１～４週間の間隔が好ましい。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
実施例１　　不活化処理による自然免疫賦活化能への影響評価
　１２日齢の発育鶏卵のしょう尿膜腔内にＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株のウイルスを接種して、３日間培養後にしょう尿液を採取した。採取したしょう尿液をフィルターろ過で清澄化した後、硫酸バリウム塩に吸着させ、１２％クエン酸ナトリウム溶液で溶出してインフルエンザウイルスを回収した。回収したウイルスは、更に限外ろ過で６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）に置換し、バッファー置換後にしょ糖密度勾配遠心でインフルエンザウイルスを含む画分を回収することによって精製した。得られたウイルス液を精製インフルエンザウイルス液とした。
　精製インフルエンザウイルス液に終濃度０．０５％となるように不活化剤であるベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）を添加して、４℃、２４時間の反応でインフルエンザウイルスの感染性を不活化させ、この不活化反応後に限外ろ過（ＭＷＣＯ：１００，０００）でバッファーを６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）に置換し、これをβ－プロピオラクトン処理不活化全粒子ワクチンとした。
　また、精製インフルエンザウイルス液をタンパク濃度が２００μｇ／ｍＬとなるよう調整し、そこへ１０％中性緩衝ホルマリン液（富士フィルム和光純薬、ホルムアルデヒド含量：３．８～４．１％）をホルマリンが終濃度で、０．０１又は０．０２％となるように添加して、４℃で１４日間の反応を行った。反応後、終濃度で１０ｍＭとなるようにグリシンを添加してホルムアルデヒドの反応を停止し、それを４℃、１，０００，０００×ｇで４時間の遠心分離した。遠心分離後に上清を廃棄し、得られたウイルスのペレットを６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）で懸濁して、これをホルムアルデヒド処理不活化全粒子ワクチンとした。
　１．５×１０６ｃｅｌｌｓのＮＢＰ２－２６２６１（Ｎｏｖｕｓ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社：ＮＦκＢの転写応答配列の下流に分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子を組み込んだ組換えＲＡＷ２６４．７細胞であり、ＴＬＲ５を除いたその他全てのＴＬＲを発現している。）に対して、各種不活化処理ワクチンを総タンパク量として１０μｇ添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。培養後、上清を回収して、上清のアルカリフォスファターゼ活性をＳＥＡＰ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（商品名、Ｃａｙｍａｎ社）で測定した。この測定値（ＲＬＵ：Ｒｅｌａｔｉｖｅ　Ｌｉｇｈｔ　Ｕｎｉｔ）がＴＬＲを介した自然免疫活性の指標となるため、各不活化処理条件で調製したワクチンの自然免疫活性化能は、本測定値で比較した。
　測定値の比較は図１に示す通りであり、ウイルスの不活化処理条件として一般的な０．０２％ホルマリンの４℃で１４日間の反応では、明確な自然免疫賦活化能の低下が確認された。また、０．０１％ホルマリン処理においても、０．０２％よりは高いもののベータプロピオラクトン処理と比べると自然免疫賦活化能は低値を示した。したがって、１９７１年以前に流通していたホルマリンで不活化した不活化全粒子ワクチンと比較して、ベータプロピオラクトン処理不活化全粒子ワクチンは高い自然免疫賦活化能を有していることが示された。
実施例２　　マウスモデルでの小児及び高齢者における免疫原性評価
　実施例１と同様にして、Ａ／Ｈ１Ｎ１亜型（Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株）及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統（Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株に）のβ－プロピオラクトン処理不活化全粒子ワクチンを調製し、各株のヘムアグルチニンが０．２ｍＬ当り１５μｇＨＡとなるよう１ｗ／ｗ％しょ糖含有６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）で調整し、不活化全粒子ワクチンとした。また、スプリットワクチンについては、インフルエンザＨＡワクチンの原液を用いて、同様に各株のヘムアグルチニンが０．２ｍＬ当り１５μｇＨＡとなるよう１ｗ／ｗ％しょ糖含有６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）で調整した。
　上記の通りに調製した投与液（表１）を、１、３、６、１２及び１８ヶ月齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（チャールズリバー社）に１匹当り３週間隔で２回皮下投与した。１回投与２１日後（Ｄａｙ２１）、尾静脈より部分採血を行い、２回目投与２１日後（Ｄａｙ４２）に麻酔下で全採血を行った。採取した血液は遠心分離により血清を調製し、各種抗体価測定に供した。
　また、Ｄａｙ４２の全採血の後、上顎の咽側よりピペットマンを挿し込み、０．１７５％ＢＳＡ及びプロテアーゼインヒビター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含有するＤ－ＰＢＳを流し込み、外鼻孔より回収した溶液を鼻腔洗浄液とした。この鼻腔洗浄液についてもウイルス特異的ＩｇＧ力価測定に供した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　１、３、６、１２及び１８ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６マウスは、１ヶ月齢が未成熟個体（ヒトで１２歳に相当）、３及び６ケ月齢が成熟個体（ヒトで２０～３０歳に相当）、１２ヶ月齢が中年個体（ヒトの４２歳に相当）、１８ヶ月齢が老年個体（ヒトの５６歳に相当）であることが知られている（チャールズリバー社技術情報、研究に使用される老齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｒｊ．ｃｏ．ｊｐ／ｃｍｓ／ｃｒｊ／ｐｄｆ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｒｍ／ｂｒｏｃｈｕｒｅ／Ｗｈｉｔｅ＿Ｐａｐｅｒ＿Ｂ６－Ａｇｅｄ．ｐｄｆ）。したがって、１ヶ月齢が小児、１８ヶ月齢が高齢者のモデル動物となる。
　これらモデル動物の設定がインフルエンザワクチンの免疫原性においても適切であることを確認するため、既承認のスプリットワクチン（Ｓ．Ｖ．）の抗体誘導を１～１８ヶ月齢のマウスで比較すると、１回投与後の血清のウイルス特異的ＩｇＧ力価は図２Ａ（Ａ型ウイルス）及び図２Ｂ（Ｂ型ウイルス）に示す通り、いずれの株に対しても成熟個体である３ヶ月齢が最も高い抗体価であり、１ヶ月齢及び１８ヶ月齢は３ヶ月齢に比べて抗体誘導が低い結果となった。また、２回投与後のウイルス特異的ＩｇＧ力価（図３Ａ（Ａ型ウイルス）及び図３Ｂ（Ｂ型ウイルス））及び中和抗体価（図４Ａ（Ａ型ウイルス）及び図４Ｂ（Ｂ型ウイルス））の結果は、どちらも１回投与後のウイルス特異的ＩｇＧ力価の結果と同様に、抗体価のピークである３ヶ月齢に比べて、１ヶ月齢及び１８ヶ月齢のマウスでは抗体誘導が低いことがわかった。したがって、ヒトと同様に小児のモデルである１ヶ月齢のマウスや高齢者のモデルである１８ヶ月齢のマウスでは、抗体誘導の低下が確認され、インフルエンザワクチンの免疫原性においてもこれらのモデルは適切であると考えられた。
　これらモデルでの免疫原性試験の結果として、１回投与後の血清のウイルス特異的ＩｇＧ力価は（図２Ａ（Ａ型ウイルス）及び図２Ｂ（Ｂ型ウイルス））、いずれのウイルス株に対しても１ヶ月齢及び１８ヶ月齢のマウスでは、スプリットワクチン投与群（Ｓ．Ｖ．）に比べて不活化全粒子ワクチン投与群（Ｗ．Ｖ．）の抗体誘導が有意に高いことがわかった。また、２回目投与後の血清のウイルス特異的ＩｇＧ力価も、１回投与後の結果と同様に不活化全粒子ワクチン投与群（Ｗ．Ｖ．）で有意に高い抗体価を示した（図３Ａ（Ａ型ウイルス）及び図３Ｂ（Ｂ型ウイルス））。２回目投与後の血清については、中和抗体価も測定しており、図４Ａ（Ａ型ウイルス）及び図４Ｂ（Ｂ型ウイルス）に示す通り、１ヶ月齢及び１８ヶ月齢のマウスにおいて不活化全粒子ワクチン投与群（Ｗ．Ｖ．）の方が有意に高い抗体誘導を示した。
　また、２回投与後のＤａｙ４２では、鼻腔洗浄液を回収して、インフルエンザウイルスの感染する鼻腔粘膜での抗体誘導を評価した。図５Ａには、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株に対する鼻腔のウイルス特異的ＩｇＧ力価を示すが、１ヶ月齢のマウスではスプリットワクチン投与群（Ｓ．Ｖ．）に比べて、不活化全粒子ワクチン投与群（Ｗ．Ｖ．）では有意に高い抗体誘導を示した。しかし、１８ヶ月齢では、いずれのワクチンの投与でも抗体価は同程度であった。図５Ｂには、Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株に対する鼻腔のウイルス特異的ＩｇＧ力価を示しており、１ヶ月齢及び１８ヶ月齢のマウスのいずれにおいても、スプリットワクチン投与群（Ｓ．Ｖ．）に比べ不活化全粒子ワクチン投与群（Ｗ．Ｖ．）では有意に高い抗体価が確認された。
　上記の結果より、小児及び高齢者のモデル動物において、血清の抗体誘導は不活化全粒子ワクチンで既承認のスプリットワクチンに比べて有意に高い抗体誘導が確認された。また、ウイルス感染の場である鼻腔粘膜の抗体誘導は、小児のモデル動物では、本実施例で評価したＡ型及びＢ型ウイルスのいずれに対しても不活化全粒子ワクチン投与群（Ｗ．Ｖ．）でスプリットワクチン投与群（Ｓ．Ｖ．）よりも有意に高く、高齢者のモデル動物では、Ａ型ウイルスは同程度だが、Ｂ型ウイルスでは不活化全粒子ワクチンで有意に高い抗体誘導を示した。すなわち、小児及び高齢者のいずれのモデル動物でも免疫原性の有意な向上が示され、ベータプロピオラクトン処理不活化全粒子ワクチンは既承認のスプリットワクチンよりも高い有効性を示すと考えられる。
 

Claims (6)

  1. 　小児及び／又は高齢者に投与されるインフルエンザワクチン組成物であって、ベータプロピオラクトンで不活化処理された不活化全粒子をウイルス抗原として含有する、組成物。
  2. 　ウイルス抗原がＡ／Ｈ１Ｎ1亜型及びＡ／Ｈ３Ｎ２亜型からなるＡ型インフルエンザウイルス株、並びにＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統からなるＢ型インフルエンザウイルス株を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 　アジュバントを含有しない、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 　皮下投与される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 　ベータプロピオラクトンで不活化処理された不活化全粒子をウイルス抗原として含有する組成物を小児又は高齢者に投与する、免疫方法。
  6. 　ベータプロピオラクトンで不活化処理された不活化全粒子をウイルス抗原として含有する組成物を小児又は高齢者に投与する、インフルエンザの予防方法。
     
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