CN114364809A - 试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

一种试剂盒，其为用于识别试样中的sdLDL‑C的试剂盒，所述试剂盒包含第1试剂组合物和第2试剂组合物，所述第1试剂组合物具有选自由胆固醇酯酶活性、胆固醇氧化酶活性和鞘磷脂酶活性组成的组中的1种或2种以上活性，所述第2试剂组合物用于对sdLDL‑C进行定量，将第1试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.90以上且3.00以下，将第2试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.90以上且8.00以下。

Description

试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及试剂盒和方法。
背景技术
作为将吸光度、浊度的测定用于小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)的定量的技术，有专利文献1～4中记载的技术。
专利文献1(日本特开2003-28882号公报)中记载了待检体中的小而密低密度脂蛋白的测定方法，其中，使特定浓度的1价的阳离子和/或2价的阳离子、以及聚阴离子存在。此外，根据该文献中记载的方法，可以提供：能够仅特异性且高灵敏度地测定小而密低密度脂蛋白的、待检体中的小而密低密度脂蛋白的测定方法。另外，该文献中记载了通过测定主波长660nm处的浊度来测定小而密低密度脂蛋白。
专利文献2(国际公开第2008/50636号)和专利文献3(国际公开第2009/48143号)中记载了：在进行sdLDL-C的定量时，测定主波长600nm、副波长700nm处的吸光度。
另外，专利文献4(国际公开第2008/105486号)中记载了：在测定sdLDL-C时，测定600nm处的吸光度。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2003-28882号公报
专利文献2：国际公开第2008/50636号
专利文献3：国际公开第2009/48143号
专利文献4：国际公开第2008/105486号
发明内容
发明要解决的问题
如前所述，专利文献1～4中，在进行sdLDL-C的定量时，利用了在波长600～700nm左右的长波长侧的吸光度测定。
本发明人等对这样的技术进行了研究，在稳定地得到高水平的测定精度方面存在改善的余地。
本发明提供以高精度稳定地对sdLDL-C进行定量的技术。
用于解决问题的方案
为了对更微量的试样也获得高测定精度，本发明人等对使用波长600～700nm左右的区域中的吸光度测定的sdLDL-C的定量进行了研究。结果发现存在作为新课题的如下情况：在保存用于定量的试剂时试剂劣化，在比定量sdLDL-C的波长区域短的短波长侧出现具有峰的吸收，上述吸收的影响有时在高波长侧也可观测到。此外，证实了：若出现这样的吸收，则对定量sdLDL-C时的吸光度产生影响，因此有时测定精度降低。另外，还发现：短波长侧的吸收峰的出现方式会根据例如测定中使用的试剂的成分、保存条件、保存天数而改变。
因此，为了尽可能地消除在短波长区域发生的吸收的影响而进行了进一步研究，结果新发现：对于用于识别sdLDL-C的试剂组合物，通过在sdLDL-C的测定波长区域外的特定的波长中将加速试验后的吸光度的比设为特定的范围，从而能够有效地抑制吸收对长波长侧的影响、以高精度进行sdLDL-C的定量，以至完成了本发明。
根据本发明，提供以下的试剂盒和方法。
[1]一种试剂盒，其为用于识别试样中的小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)的试剂盒，所述试剂盒包含第1试剂组合物和第2试剂组合物，
所述第1试剂组合物具有选自由胆固醇酯酶活性、胆固醇氧化酶活性和鞘磷脂酶活性组成的组中的1种或2种以上活性，
所述第2试剂组合物用于对前述sdLDL-C进行定量，
将前述第1试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.90以上且3.00以下，
将前述第2试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.90以上且8.00以下。
[2]根据[1]所述的试剂盒，其中，将第1试剂组合物在37℃下保存2周后的前述吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，由ABS360/ABS400表示的比R2为0.90以上且2.50以下。
[3]根据[1]或[2]所述的试剂盒，其中，前述第1试剂组合物还具有过氧化氢酶活性。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的试剂盒，其中，前述第1试剂组合物包含作用于除小而密低密度脂蛋白(sdLDL)以外的脂蛋白的表面活性剂。
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的试剂盒，其中，将第2试剂组合物在37℃下保存2周后的前述吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，由ABS360/ABS400表示的比R2为0.90以上且2.50以下。
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的试剂盒，其中，前述第2试剂组合物包含作用于小而密低密度脂蛋白(sdLDL)的表面活性剂。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的试剂盒，其中，
前述第1试剂组合物满足以下的条件1～3中的1个或2个条件、且
前述第2试剂组合物不满足前述条件1～3中的前述1个或2个条件，满足此外的所有条件。
条件1：包含耦合剂
条件2：包含铁配合物
条件3：具有过氧化物酶活性
[8]一种对试样中的小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)进行定量的方法，其包括如下工序：
使第1试剂组合物作用于前述试样的工序，所述第1试剂组合物具有选自由胆固醇酯酶活性、胆固醇氧化酶活性和鞘磷脂酶活性组成的组中的1种或2种以上活性；及
在使第1试剂组合物作用于前述试样的前述工序之后，使用于对前述sdLDL-C进行定量的第2试剂组合物进行作用，由此对残留的脂蛋白中的胆固醇进行定量的工序，
将前述第1试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.90以上且3.00以下，
将前述第2试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.90以上且8.00以下。
[9]根据[8]所述的方法，其中，将第1试剂组合物在37℃下保存2周后的前述吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，由ABS360/ABS400表示的比R2为0.90以上且2.50以下。
[10]根据[8]或[9]所述的方法，其中，前述第1试剂组合物还具有过氧化氢酶活性。
[11]根据[8]至[10]中任一项所述的方法，其中，前述第1试剂组合物包含作用于除前述sdLDL以外的脂蛋白的表面活性剂。
[12]根据[8]至[11]中任一项所述的方法，其中，将第2试剂组合物在37℃下保存2周后的前述吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，由ABS360/ABS400表示的比R2为0.90以上且2.50以下。
[13]根据[8]至[12]中任一项所述的方法，其中，前述第2试剂组合物包含作用于前述sdLDL的表面活性剂。
[14]根据[8]至[13]中任一项所述的方法，其中，
前述第1试剂组合物满足以下的条件1～3中的1个或2个条件、且
前述第2试剂组合物不满足前述条件1～3中的前述1个或2个条件，满足此外的所有条件。
条件1：包含耦合剂
条件2：包含铁配合物
条件3：具有过氧化物酶活性
发明的效果
根据本发明，可以提供以高精度稳定地对sdLDL-C进行定量的技术。
附图说明
图1是示出第1试剂组合物的吸光度测定结果的例子的图。
图2是示出第1试剂组合物的吸光度测定结果的例子的图。
图3是示出第2试剂组合物的吸光度测定结果的例子的图。
图4是示出第2试剂组合物的吸光度测定结果的例子的图。
具体实施方式
以下对实施方式进行说明。本实施方式中，测定试剂等组合物可以单独包含各成分或将各成分组合包含2种以上。另外，本说明书中，数值范围的“x～y”表示“x以上且y以下”，均包括下限值x和上限值y。
首先，对脂蛋白进行说明。
脂蛋白大致分为极低密度脂蛋白(Very Low Density Lipoprotein：VLDL)、低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein：LDL)和高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein：HDL)的级分，LDL进而分为小而密低密度脂蛋白(sdLDL)和除此以外的亚级分。也有时将sdLDL称为小粒子LDL、small LDL(SLDL)、dense LDL、small,dense LDL，另外也有时将除此以外的LDL称为大粒子LDL(LLDL)、轻LDL。
这些脂蛋白的级分和亚级分可以通过颗粒尺寸或比重来区分。
对于脂蛋白的颗粒尺寸的直径，根据报道者不同而异，例如，VLDL为30nm～80nm(或30nm～75nm)，LDL为22nm～28nm(或19nm～30nm)，HDL为7～10nm。
对于脂蛋白的比重，例如VLDL为1.006以下、LDL为1.019～1.063、HDL为1.063～1.21。
脂蛋白中，LDL颗粒直径可以利用例如梯度凝胶电泳(GGE)(JAMA,260,p.1917-21,1988)、NMR(HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2ndEdition、Nader Rifai等人著、p.609-623、AACC PRESS:TheFats of Life Summer 2002、LVDD 15YEAR ANNIVERSARY ISSUE、Volume AVI No.3、p.15-16)进行测定。另外，比重可以基于例如通过超离心分离的分析(Atherosclerosis,106,p.241-253,1994:Atherosclerosis,83,p.59,1990)而确定。
本实施方式中，待测定的sdLDL通常是指LDL级分中直径为约22.0～约25.5nm的亚级分、或者比重1.040～1.063的亚级分。
之所以按大小将LDL分为亚级分，是因为LDL中粒径越小者越容易引发动脉硬化，在LDL中恶性度越高，因此需要单独测定LDL中较小者。在LDL内直径分布、比重分布是连续的，无法明确地区分比重为何种程度以上时恶性度特别高。因此，上述的比重1.040～1.063的值也并非确立为sdLDL的特性，而是用中间值将广泛使用的可称为确定值的LDL的比重范围1.019～1.063分开后的高比重侧的值。例如，对于sdLDL的比重，在其它报告中，被分级为1.044～1.060(Atherosclerosis:106 241-253 1994)。采用何种范围的sdLDL的比重，因报告者不同而略有差异，但是以该范围进行识别时sdLDL的存在均与临床恶性度有关。
本说明书中，称为sdLDL时具体是指：LDL中的比重大、且与除此以外的LDL相比临床上更容易引发动脉硬化。另外，sdLDL优选是指属于LDL的比重范围内高于中间值的比重范围的LDL，更优选是指属于比重1.044～1.063的范围的LDL。另外，称为除LDL以外的脂蛋白的情况，是指VLDL或HDL，进而还包括乳糜微粒、中间密度脂蛋白(IDL：intermediatedensity lipoprotein)或非常高密度脂蛋白(VHDL：very high density lipoprotein)。
(试剂盒)
本实施方式中，试剂盒用于识别试样中的sdLDL-C，且包含以下的第1试剂组合物和第2试剂组合物。
(第1试剂组合物)
第1试剂组合物是具有选自由胆固醇酯酶活性、胆固醇氧化酶活性和鞘磷脂酶活性组成的组中的1种或2种以上活性的试剂组合物。将第1试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.9以上且3.0以下。
(第2试剂组合物)
第2试剂组合物是用于对sdLDL-C进行定量的试剂组合物。将第2试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.90以上且8.00以下。
本发明人等新发现：在sdLDL-C的测定波长区域外的特定的波长中，通过将第1和第2试剂组合物的加速试验后的吸光度的比设为特定的范围，从而能以高精度对sdLDL-C进行定量。具体而言，发现：作为短波长侧的吸收存在的有无、程度的指标，ABS400/ABS450的比R1是适合的。通过将R1设为上限值以下，从而能够有效地抑制在比sdLDL-C的测定波长区域、例如波长600～700nm的区域低的低波长侧具有峰的吸收对波长600～700nm的区域的干扰，因此能够以高精度进行sdLDL-C的定量。
此处，在sdLDL-C的测定波长区域本身内难以判定干扰的有无，但通过使用观测区域外的400nm和450nm的吸光度、且将第1和第2试剂组合物的加速试验后的吸光度比作为指标，从而能够把握在低波长侧具有峰的吸收的存在、干扰的影响。此外，通过使用R1处于特定的范围的试剂组合物，从而能够改善测定精度。
对于第1试剂组合物，在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，从改善sdLDL-C的测定精度的观点出发，由ABS400/ABS450表示的比R1为3.00以下，优选为2.80以下、更优选为2.70以下、进一步优选为2.60以下、进而更优选为2.50以下。
另外，从稳定地对sdLDL-C进行定量的观点出发，第1试剂组合物的R1为0.90以上，另外，也可以为例如0.95以上、或1.00以上。
另外，对于第2试剂组合物，在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，从改善sdLDL-C的测定精度的观点出发，由ABS400/ABS450表示的比R1为8.00以下，优选为7.00以下、更优选为6.00以下、进一步优选为5.00以下、进而更优选为4.00以下。
另外，从稳定地对sdLDL-C进行定量的观点出发，第2试剂组合物的R1为0.90以上，另外，也可以为例如0.95以上、或1.00以上。
本实施方式中，试剂盒中包含的第1和第2试剂组合物均满足关于R1的上述条件，因此能够精度良好地测定sdLDL-C。
另外，本实施方式的试剂盒中，对于第1和第2试剂组合物中的至少一者，在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，从更稳定地改善sdLDL-C的测定精度的观点出发，由ABS360/ABS400表示的比R2为2.50以下，优选为2.00以下、更优选为1.80以下、进一步优选为1.70以下、进而更优选为1.50以下。
另外，从进一步稳定地对sdLDL-C进行定量的观点出发，R2例如可以为0.9以上，另外，也可以为例如1.0以上或为例如1.2以上。
另外，对于第1试剂组合物，在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，从更稳定地改善sdLDL-C的测定精度的观点出发，由ABS360/ABS400表示的比R2例如为3.0以下，优选为2.50以下、更优选为2.20以下、进一步优选为2.00以下、进而更优选为1.68以下、更进一步优选为1.60以下。
另外，从进一步稳定地对sdLDL-C进行定量的观点出发，第1试剂组合物的R2可以为例如0.90以上，另外，也可以为例如0.95以上、或1.00以上。
另外，对于第2试剂组合物，在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，从更稳定地改善sdLDL-C的测定精度的观点出发，由ABS360/ABS400表示的比R2例如为3.00以下，优选为2.50以下、更优选为2.00以下、进一步优选为1.70以下、进而更优选为1.50以下。
另外，从进一步稳定地对sdLDL-C进行定量的观点出发，第2试剂组合物的R2可以为例如0.90以上，另外，也可以为例如0.95以上、或1.00以上。
从进一步改善sdLDL-C的测定精度的观点出发，更优选第1和第2试剂组合物均满足关于R2的上述条件。
本实施方式中，试剂盒用于sdLDL-C的识别或定量，优选用于sdLDL-C的识别和定量。
另外，试剂盒具体用于包括2个以上工序的sdLDL-C的定量方法。此时，第1和第2试剂组合物分别用于不同的工序，优选以第1试剂组合物和第2试剂组合物的顺序使用。
以下对各试剂组合物的构成进行进一步具体地说明。
(第1试剂组合物)
第1试剂组合物具有选自由胆固醇酯酶活性、胆固醇氧化酶活性和鞘磷脂酶活性组成的组中的1种或2种以上活性，优选具有胆固醇酯酶活性、胆固醇氧化酶活性和鞘磷脂酶活性。
第1试剂组合物是具有上述1种或2种以上活性的组合物，因此在试样中添加第1试剂组合物时，例如，能够去除试样中的除sdLDL以外的脂蛋白。另外，能够将除sdLDL以外的脂蛋白中的胆固醇导出至反应体系外。
第1试剂组合物是包含1种或2种以上的例如具有选自由胆固醇酯酶活性、胆固醇氧化酶活性和鞘磷脂酶活性组成的组中的1种或2种以上活性的酶的组合物，优选包含具有胆固醇酯酶活性的酶、具有胆固醇氧化酶活性的酶和具有鞘磷脂酶活性的酶。
此处，“表面活性剂进行作用(反应)”是指：表面活性剂分解脂蛋白、脂蛋白中的胆固醇游离。例如，称为“作用于除sdLDL以外的脂蛋白的表面活性剂(与除sdLDL以外的脂蛋白的表面活性剂进行反应)”时，不要求表面活性剂对sdLDL完全不发挥作用，只要主要对除sdLDL以外的脂蛋白进行作用即可。“去除”是指：分解被检体试样中的物质，使得在之后的工序中不会检测出其分解物。即，“去除除sdLDL以外的脂蛋白中的胆固醇”是指：分解被检体试样中的除sdLDL以外的脂蛋白，使得在之后的工序中不会检测出作为其分解产物的这些脂蛋白中的胆固醇。
“导出至反应体系外”具体是指：对于HDL、VLDL、L LDL等中包含的胆固醇，进行去除、使其凝集、或进行抑制，使得在之后的工序中不反应，以使HDL、VLDL、L LDL等中包含的胆固醇不对sdLDL-C的定量产生影响。
另外，“具有胆固醇酯酶活性”具体是指：存在胆固醇酯酶且可能发生由过氧化物酶胆固醇酯酶催化的反应。对于胆固醇氧化酶活性、鞘磷脂酶活性、过氧化氢酶活性、过氧化物酶活性等其它酶活性也是同样。
另外，从更稳定地将试样中的除sdLDL以外的脂蛋白中的胆固醇导出至反应体系外的观点出发，第1试剂组合物优选还具有过氧化氢酶活性。进而具体而言，第1试剂组合物优选为进一步包含1种或2种以上的具有过氧化氢酶活性的酶的组合物。
接着，对第1试剂组合物中包含的成分进行进一步具体地说明。
作为第1试剂组合物中包含的成分，例如可列举出酶、不具有酶作用的蛋白质、表面活性剂、缓冲液、耦合剂、电子供体、铁配合物。
作为酶，例如可列举出具有选自由胆固醇酯酶活性、胆固醇氧化酶活性和鞘磷脂酶活性组成的组中的1种或2种以上活性的酶。另外，也可以包含具有除上述活性以外的活性的酶。例如，第1试剂组合物优选还具有过氧化氢酶活性，更优选包含具有过氧化氢酶的酶。
作为酶的具体例，可列举出胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、鞘磷脂酶、过氧化氢酶、过氧化物酶。
其中，作为胆固醇酯酶，可以使用例如源自细菌、菌类的胆固醇酯酶。
作为胆固醇氧化酶，可以使用例如源自细菌、酵母的胆固醇氧化酶。
另外，作为鞘磷脂酶的具体例，可列举出SPC(旭化成公司制)、来自蜡样芽孢杆菌的鞘磷脂酶(Sphingomyelinase from bacillus cereus)、来自金黄色葡萄球菌的鞘磷脂酶(Sphingomyelinase from staphylococcus aureus)(SIGMA公司制)。
另外，对于第1试剂组合物中的酶活性，从更稳定地将除sdLDL以外的脂蛋白中的胆固醇导出至反应体系外的观点出发，例如鞘磷脂酶活性优选为0.1U/mL以上，更优选为0.2U/mL以上，另外，优选为100U/mL以下，更优选为20U/mL以下。
另外，从适宜地调节对各种脂蛋白的作用的观点出发，第1试剂组合物可以优选包含脂蛋白水解酶。
作为脂蛋白水解酶，可以使用例如脂蛋白脂肪酶。脂蛋白脂肪酶只要是具有能分解脂蛋白的能力的酶就没有限定，例如可以使用源自动物或微生物的脂蛋白脂肪酶。
作为不具有酶作用的蛋白质的具体例，可列举出白蛋白。
作为表面活性剂，可列举出例如作用于除sdLDL以外的脂蛋白的表面活性剂，更优选列举出作用于除sdLDL以外的脂蛋白且不作用于sdLDL的表面活性剂。另外，从稳定地识别sdLDL-C的观点出发，第1试剂组合物优选包含作用于除sdLDL以外的脂蛋白的表面活性剂，更优选包含作用于除sdLDL以外的脂蛋白且不作用于sdLDL的表面活性剂。
作为作用于除sdLDL以外的脂蛋白的表面活性剂，可列举出聚氧乙烯衍生物。作为衍生物的例子，可以列举出选自由聚氧乙烯烷基醚和聚氧乙烯多环苯基醚组成的组中的1种或2种以上的非离子表面活性剂。
其中，作为聚氧乙烯多环苯基醚的优选的例子，可列举出聚氧乙烯苄基苯基衍生物、聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚衍生物、特定的酚乙氧基化物。作为聚氧乙烯多环苯基醚的具体例，可列举出EMULGEN A-60、EMULGEN A-500、EMULGEN B-66、EMULGEN A-90(以上、花王公司制)、Newcol 703、Newcol 704、Newcol 706、Newcol 707、Newcol 708、Newcol 709、Newcol 710、Newcol 711、Newcol 712、Newcol 714、Newcol 719、Newcol 723、Newcol 729、Newcol 733、Newcol 740、Newcol 747、Newcol 780、Newcol 610、Newcol 2604、Newcol2607、Newcol 2609、Newcol 2614(以上、日本乳化剂公司制)、NOIGEN EA-87、NOIGEN EA-137、NOIGEN EA-157、NOIGEN EA-167、NOIGEN EA-177、NOIGEN EA-197D、NOIGEN EA-207D(以上、第一工业制药公司制)、BLAUNON DSP-9、BLAUNON DSP-12.5、BLAUNON TSP-7.5、BLAUNON TSP-16、BLAUNON TSP-50(以上、青木油脂公司制)等。
对于第1试剂组合物中的表面活性剂的浓度，相对于第1试剂组合物的全部组成，从稳定地作用于除sdLDL以外的脂蛋白的观点出发，优选为0.2％(w/v)以上，更优选为0.3％(w/v)以上、进一步优选为0.5％(w/v)以上。
另外，从同样的观点出发，第1试剂组合物中的表面活性剂的浓度优选为5％(w/v)以下，更优选为3％(w/v)以下。
需要说明的是，第1和第2试剂组合物中包含的表面活性剂可以通过组合IR、NMR、LC-MS等进行解析的方法来鉴定。作为对表面活性剂的离子型(非离子型、阴离子型、阳离子型)进行确认的方法，可列举出在酸性或碱性条件下基于有机溶剂的提取法、固相提取法。作为确定表面活性剂的结构的方法，可列举出使用LC-MSMS、NMR进行解析的方法。
第1试剂组合物优选包含酶和表面活性剂，更优选包含鞘磷脂酶和聚氧乙烯衍生物。
缓冲液的种类可以根据例如第1试剂组合物中包含的酶的种类进行适宜选择。作为缓冲液的具体例，可列举出磷酸缓冲液、Tris缓冲液、PIPES缓冲液。
耦合剂和电子供体以例如在过氧化物酶活性的存在下进行偶联反应的组合的形式使用。
作为上述偶联反应中使用的耦合剂，例如可列举出4-氨基安替比林、氨基安替比林衍生物、香兰素二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙。
另外，电子供体优选为苯胺衍生物。作为苯胺衍生物的具体例，可列举出N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-(3-磺丙基)苯胺(HALPS)、N-(3-磺丙基)-3-甲氧基-5-苯胺(HMMPS)。
另外，作为铁配合物，例如可列举出针对第2试剂组合物而在后文说明的铁配合物。作为铁配合物的浓度，优选0.001～0.05mmol/L。
第1试剂组合物可以构成为：包含例如鞘磷脂酶；且包含例如胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶等分解胆固醇的酶、电子供体或耦合剂中任一者；以及去除过氧化氢的过氧化氢酶等。
(第2试剂组合物)
第2试剂组合物是用于对sdLDL-C进行定量的试剂。第2试剂组合物的成分根据第1试剂组合物的构成而不同，但只要是能对sdLDL-C进行定量的配方组成即可，可以使用公知的物质。
作为第2试剂组合物的成分，例如可列举出酶、缓冲液、表面活性剂、耦合剂、铁配合物。
作为酶，例如可列举出过氧化物酶。
缓冲液的种类可以根据例如第2试剂组合物中包含的酶的种类进行适宜选择。作为缓冲液的具体例，可列举出对于第1试剂组合物所说明者。
作为表面活性剂，可列举出例如作用于sdLDL的表面活性剂。另外，从稳定地对sdLDL-C进行定量的观点出发，第2试剂组合物优选包含作用于sdLDL的表面活性剂。
作用于sdLDL的表面活性剂可以是仅作用于sdLDL的表面活性剂等选择性地作用于sdLDL的表面活性剂，也可以是还作用于除sdLDL以外的脂蛋白的表面活性剂或作用于所有脂蛋白的表面活性剂。
作为仅作用于sdLDL的表面活性剂，可以适宜地使用例如聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或其衍生物。作为聚氧乙烯-聚氧丙烯基共聚物或其衍生物，例如可列举出Pluronic17R-4、Pluronic L-64、Pluronic PE3100、Pluronic P-85、Pluronic F-88、Pluronic P-103、Pluronic F-127等Pluronic(注册商标)系表面活性剂(BASF公司、ADEKA公司)等。
作为作用于所有脂蛋白的表面活性剂，例如可以列举出聚氧乙烯衍生物，另外，可以使用市售的总胆固醇测定用试剂等中使用的表面活性剂。作为上述表面活性剂，例如可列举出聚氧乙烯烷基苯基醚(例如EMULGEN 909(花王公司制)、TritonX100)、聚氧乙烯烷基醚(例如EMULGEN 707、EMULGEN 709(以上、花王公司制))。
对于第2试剂组合物中的表面活性剂的浓度，相对于第2试剂组合物的全部组成，从稳定地作用于sdLDL的观点出发，优选为0.05％以上，更优选为0.1％(w/v)以上、进一步优选为0.5％(w/v)以上。
另外，从同样的观点出发，第2试剂组合物中的表面活性剂的浓度优选为8.0％(w/v)以下，更优选为5.0％(w/v)以下。
作为耦合剂，例如可列举出对于第1试剂组合物所说明者。
作为铁配合物，例如可列举出亚铁氰化钾、亚铁氰化钠、卟啉铁配合物、EDTA-铁配合物。
对于第2试剂组合物中的铁配合物的浓度，相对于第2试剂组合物的全部组成，优选为0.0015mmol/L以上，另外，优选为0.3mmol/L以下，另外，也可以为例如0.05mmol/L以下。
另外，优选：第1试剂组合物满足以下的条件1～3中的1个或2个条件、且第2试剂组合物不满足以下的条件1～3中第1试剂组合物所满足的1个或2个条件、满足此外的所有条件。
条件1：包含耦合剂
条件2：包含铁配合物
条件3：具有过氧化物酶活性
sdLDL-C的定量中，例如在过氧化物酶活性的存在下使电子供体和耦合剂发生偶联反应，通过产生的色素来测定特定波长的吸光度。此时，作为反应促进剂，可以使用铁配合物，但在同一试剂中存在耦合剂、过氧化物酶活性和铁配合物时，试剂会逐渐自然显色，有时对sdLDL-C的定量产生影响。在这点上，通过将第1和第2试剂组合物设为上述的构成，从而能够防止耦合剂、过氧化物酶活性和铁配合物在第1或第2试剂组合物中共存，因此能够抑制试剂组合物的自然显色。因此，能够进一步稳定地进行sdLDL-C的定量。
从更稳定地对sdLDL-C进行定量的观点出发，更优选：第1试剂组合物满足条件1和条件3、且第2试剂组合物满足条件2。
从同样的观点出发，还优选使耦合剂和电子供体分离而存在于不同的试剂组合物中。
另外，第1或第2试剂组合物中可以包含血清白蛋白。
各试剂组合物的pH为中性附近、例如pH6～pH8，优选为pH6.5～7.5，可以添加缓冲液调节pH。
(方法)
本实施方式中的方法是使用前述的第1和第2试剂组合物对试样中的sdLDL-C进行定量的方法。本实施方式中的定量方法包括以下的第1工序和第2工序。
(第1工序)使前述第1试剂组合物作用于试样的工序
(第2工序)在第1工序之后，使前述的第2试剂组合物进行作用，由此对残留的脂蛋白中的胆固醇进行定量的工序
第1和第2试剂组合物的构成如上所述。
上述方法中，通过使用吸光度的比R1满足前述的条件的第1和第2试剂组合物，从而能够以高精度稳定地对sdLDL-C进行定量。
另外，sdLDL-C的定量方法例如可以通过如下方式进行：在试样(被检体试样)中添加第1试剂组合物使其反应，接着添加第2试剂组合物使其反应，测定吸光度，从而进行。
被检体试样例如为血清或血浆，优选为血清。
第1和第2工序通常在自动分析装置内进行。
试样的量、各试剂组合物的量例如可以考虑各试剂组合物中的试剂浓度等进行适宜确定，在能用于自动分析装置的范围内进行。例如可以使用被检体试样1～10μL、第1试剂50～300μL、第2试剂25～200μL。
以下对各工序进行进一步具体地说明。
(第1工序)
第1工序中，使第1试剂组合物作用于试样。由此，去除除sdLDL以外的脂蛋白，使除sdLDL以外的脂蛋白中的胆固醇游离并导出至反应体系外。
进而具体而言，第1工序中，优选：在鞘磷脂酶和胆固醇酯酶的存在下使作用于除sdLDL以外的脂蛋白的表面活性剂作用于试样。然后，使从脂蛋白中游离而产生的胆固醇与例如胆固醇氧化酶等与胆固醇反应的酶发生反应并导出至反应体系外。第1工序中，例如可以使用如下技术：去除除sdLDL以外的脂蛋白中的胆固醇并导出至反应体系外，使除sdLDL以外的脂蛋白的胆固醇凝集、或进行抑制使其在之后的工序不反应等公知的技术。
例如第1试剂组合物具有鞘磷脂酶活性时，从选择性地去除除sdLDL以外的脂蛋白的观点出发，第1工序中的反应液的鞘磷脂酶活性优选为0.05U/mL以上，更优选为0.1U/mL以上，另外，优选为100U/mL以下，更优选为20U/mL以下。
另外，例如第1试剂组合物包含作用于除sdLDL以外的脂蛋白的表面活性剂时，从选择性地去除除sdLDL以外的脂蛋白的观点出发，第1工序中的反应液中的表面活性剂的浓度优选为0.15％(w/v)以上，更优选为0.25％(w/v)以上，另外，优选为5％(w/v)以下，更优选为3％(w/v)以下。
第1工序中，去除由除sdLDL以外的脂蛋白产生的胆固醇并导出至反应体系外的工序可以优选利用以下任意的方法进行。
(1)通过胆固醇酯酶活性和胆固醇氧化酶活性，在除sdLDL以外的脂蛋白中由胆固醇产生过氧化氢，在过氧化氢酶活性的存在下将过氧化氢分解为水和氧气的方法
(2)在通过胆固醇酯酶活性和胆固醇氧化酶活性而产生的过氧化氢、以及耦合剂或电子供体的存在下形成无色醌的方法
(3)在过氧化氢酶活性的存在下使过氧化氢分解、且同时在耦合剂或电子供体的存在下形成无色醌的方法
上述的方法中，第1试剂组合物具有选自由胆固醇酯酶活性、胆固醇氧化酶活性和鞘磷脂酶活性组成的组中的1种或2种以上活性、且例如成为以下的构成。
采用上述(1)的方法的情况下，第1试剂组合物还具有过氧化氢酶活性。
采用上述(2)的方法的情况下，第1试剂组合物至少包含耦合剂和电子供体中的一者、且第1试剂组合物还具有过氧化物酶活性。
采用上述(3)的方法的情况下，第1试剂组合物具有过氧化氢酶活性和过氧化物酶活性、且第1试剂组合物包含耦合剂或电子供体。
上述(1)或(2)的方法中，使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用于胆固醇而产生过氧化氢，去除所产生的过氧化氢。
反应液中的胆固醇酯酶浓度优选为0.010U/mL以上，更优选为0.3U/mL以上、进一步优选为0.6U/mL以上，另外，优选为10U/mL以下，更优选为2.5U/mL以下、进一步优选为2.0U/mL以下。
另外，反应液中的胆固醇氧化酶的浓度优选为0.1～0.7U/mL左右。
上述(3)的方法中，过氧化氢酶的反应液中的浓度优选为40～2500U/mL左右。
另外，过氧化物酶的反应液中的浓度优选为0.4～2.0U/mL左右。
上述(2)或(3)的方法中，电子供体的使用浓度以反应液中的最终浓度计优选为0.1mmol/L以上，另外，优选为8mmol/L以下。
另外，第1试剂组合物包含脂蛋白脂肪酶时，反应液中的脂蛋白脂肪酶的浓度优选为0.01U/mL以上，另外，优选为10U/mL以下，更优选为5U/mL以下、进一步优选为1U/mL以下。
第1工序中，通过将除L LDL、LDL以外的VLDL、HDL等脂蛋白中的胆固醇导出至反应体系外，从而在之后的工序中，在反应液中优选仅残留sdLDL作为脂蛋白。有时将如此去除除sdLDL以外的脂蛋白并导出至反应体系外、在之后的工序中不会检测出除sdLDL以外的脂蛋白的胆固醇的情况称为“使sdLDL区别于除此以外的脂蛋白”。
另外，第1工序中，除sdLDL以外的脂蛋白中的胆固醇也可以未被完全去除，在该情况下，优选在第2工序中使用可选择性地测定sdLDL-C的表面活性剂。
另外，第1工序中，可以在反应液中进一步添加、使用1价的阳离子和2价的阳离子中的至少1者或它们的盐作为离子强度调节剂。通过添加离子强度调节剂，从而容易使sdLDL区别于L LDL。
离子强度调节剂具体可以从由氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化锰、氯化钙、氯化锂、氯化铵等氯化物；硫酸镁、硫酸钾、硫酸锂、硫酸铵等硫酸盐；和乙酸镁等乙酸盐组成的组中选择并使用。离子强度调节剂的反应液中的浓度优选为0～100mmol/L。
另外，第1试剂组合物具有鞘磷脂酶活性时，第1工序中，为了调节磷脂酶对sdLDL和L LDL的催化活性，也可以添加聚阴离子。
作为所添加的聚阴离子，可以适宜地使用肝素、磷钨酸、硫酸葡聚糖等。对于第1试剂组合物中的聚阴离子的浓度，肝素的情况优选为10～250U/mL、磷钨酸的情况优选为0.02～1.25％(w/v)、硫酸葡聚糖的情况优选为0.02～1.25％(w/v)。反应液中的浓度分别优选为5～250U/mL、0.01～1.25％(w/v)、0.01～1.25％(w/v)。
(第2工序)
第2工序中，对经过第1工序而残留的sdLDL-C进行定量。第2工序可以使用一直以来使用的LDL的定量方法。例如有如下方法：利用比浊测定对添加LDL凝集剂而形成的LDL特异性凝集物的含量进行定量的方法、使用基于LDL特异性抗体的抗原抗体反应的方法、使用酶对分解产物进行定量的方法等。这些当中，优选使用酶对分解产物进行定量的方法。
使用酶对分解产物进行定量的方法中，在第1工序后的反应液中加入例如包含1种或2种以上的选自由胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和胆固醇脱氢酶组成的组中的胆固醇测定用酶的第2试剂组合物使sdLDL-C游离、分解，对其反应产物进行定量。
另外，第2工序中，也优选使用包含表面活性剂的第2试剂组合物。第2试剂组合物包含表面活性剂时，第2工序中的反应液中的表面活性剂的浓度优选为0.01％(w/v)以上，更优选为0.1％(w/v)以上，另外，优选为10％(w/v)以下，更优选为5％(w/v)以下。
本实施方式中，各工序中，优选在反应温度2℃～45℃下进行，更优选在25℃～40℃下进行。
关于反应时间，各工序均优选以1～10分钟进行，进一步优选以3～7分钟进行。
作为供于sdLDL-C的定量方法的试样的例子，可列举出血清、血浆等源自血液的试样。
作为用于定量sdLDL-C的自动分析装置，例如可列举出TBA-120FR、TBA-200FR(以上、东芝公司制)、JCA-BM1250、JCA-BM1650、JCA-BM2250(以上、日本电子公司制)、HITACHI7180、HITACHI7170(以上、日立公司制)、AU2700、AU5800、AU680(以上、OLYMPUS公司制)、cobas c501、cobas c701(以上、Roche公司制)等。
sdLDL-C的定量例如通过测定580～720nm的波长区域、优选600～700nm的波长区域的吸光度来进行。
接着，对第1和第2试剂组合物的酶活性的测定方法进行说明。
本实施方式中，试剂组合物的胆固醇氧化酶活性、胆固醇酯酶活性、鞘磷脂酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性例如可以利用以下的方法进行测定。
胆固醇氧化酶活性的测定中，作为底物液使用6mM胆固醇溶液(溶解于异丙醇中)。对于测定对象，以成为2～4U/mL的方式加入稀释液(0.1M磷酸缓冲液、TritonX100、pH7.0)，将稀释后的溶液3mL在37℃加热5分钟后加入底物液0.05mL。然后，将混合液在37℃下反应并测定波长240nm吸光度变化量。在37℃下反应后，测定从2分钟到7分钟为止的吸光度变化量，计算出胆固醇氧化酶活性。例如，吸光度变化量若为3U/L以上，则可以说测定对象具有胆固醇氧化酶活性，进而具体可以说包含胆固醇氧化酶。
胆固醇酯酶活性的测定中，使用底物(0.04％胆固醇亚麻酸酯、1％TritonX100、0.6％胆酸钠溶液)、300U/mL胆固醇氧化酶溶液、酶稀释液(20mM磷酸缓冲液、0.5mM EDTA·2Na、2mM MgCl2、0.2％BSA、pH7.5)、反应液(0.06％4-氨基安替比林、0.4％苯酚、7.5KU/L过氧化物酶)。将反应液1.75mL和底物液1.0mL混合后，在37℃下加热5分钟，加入0.1mL胆固醇氧化酶溶液。进行37℃、2分钟加热后加入用稀释液稀释的测定对象0.1mL，将混合液在37℃下进行反应，测定波长500nm的吸光度变化量。37℃反应后，测定从0分钟到3.5分钟为止的吸光度变化量，计算出胆固醇酯酶活性。例如，吸光度变化量若为8U/L以上，则可以说测定对象具有胆固醇酯酶活性，进而具体可以说包含胆固醇酯酶。
鞘磷脂酶活性的测定中，使用反应液(0.008％鞘磷脂、0.05％TritonX100溶液、10U/mL碱性磷酸酶、10U/mL胆固醇氧化酶、2U/mL过氧化物酶、0.02％4-氨基安替比林、0.02％TODB混合液)、反应终止液(1％十二烷基硫酸钠溶液)、稀释液(10mM Tris缓冲液、0.1％TritonX100、pH8.0)。将反应液0.08mL和用稀释液稀释的测定对象0.003mL混合并在37℃下加热5分钟后，加入反应终止液0.16mL。在反应终止后测定主波长546nm、副波长700nm的吸光度变化量，计算出鞘磷脂酶活性。例如，吸光度变化量若为2U/L以上，则可以说测定对象具有鞘磷脂酶活性，进而具体可以说包含鞘磷脂酶。
过氧化物酶活性的测定中，使用反应液1(1.5mM HDAOS、0.05％TritonX100、50mM磷酸缓冲液、pH7.0)、以及反应液2(5mM 4-氨基安替比林、0.05％TritonX100、1％过氧化氢、50mM磷酸缓冲液、pH7.0)、稀释液(50mM磷酸缓冲液、pH7.0)。将0.3mL的反应液1和用稀释液稀释的测定对象0.08mL混合，在37℃下加热5分钟。之后加入0.1mL的反应液2，在37℃下进行反应，测定主波长600nm、副波长700nm的吸光度变化量。37℃反应后，测定2分钟到5分钟为止的吸光度变化量并计算出过氧化物酶活性。例如，吸光度变化量若为10U/L以上，则可以说测定对象具有过氧化物酶活性，进而具体可以说包含过氧化物酶。
过氧化氢酶活性的测定中，使用底物(0.06％过氧化氢、50mM磷酸缓冲液、pH7.0)。将底物溶液2.9mL在25℃下预加热后，与测定对象0.1mL混合，测定240nm处的吸光度变化量。25℃反应后，测定从0分钟到3分钟为止的吸光度变化量并计算出过氧化氢酶活性。例如，吸光度变化量若为100U/L以上，则可以说测定对象具有过氧化氢酶活性，进而具体可以说包含过氧化氢酶。
另外，第1和第2试剂组合物中的酶也可以利用以下的方法鉴定。即，首先，利用混合型质谱仪检测用胰蛋白酶降解包含目标酶的试样而得到的片段肽。通过对由质谱仪得到的肽的质量、和在质谱仪内与氩气碰撞而得到的碎片离子的谱图(MS/MS数据)进行数据库检索(例如，Mascot检索)而能够鉴定蛋白质。若源自试剂组合物中的氨基酸序列的片段肽的序列与作为唯一序列登记在数据库中的氨基酸序列一致，则可认为包含对象酶。
另外，第1和第2试剂组合物中的酶也可以通过例如以下的定量进行鉴定。即，选择用胰蛋白酶将目标酶分解而得到的片段肽中的目标酶特异性的、且在质谱解析中可以得到强信号的肽作为定量对象肽。对于定量对象肽，通过化学合成制作非标记的肽和作为内部标准的用稳定同位素标记的肽。通过胰蛋白酶使包含目标酶的试样完全消化，添加已知量的稳定同位素标记肽，通过与HPLC连接的三重四极杆型质谱仪(LC-MS/MS)以MRM模式(多反应监测模式)进行测定。同样地测定定量对象肽的非标记肽和已知量的稳定同位素标记肽的混合液，并制作内部标准的浓度比与峰面积比的标准曲线，通过计算试样中的定量对象肽的绝对量而能够对目标酶进行定量。
以上对本发明的实施方式进行了说明，但这些是本发明的示例，也可以采用除上述以外的各种构成。
实施例
以下的各例中，吸收光谱的测定使用HITACHI公司制的U-3900。
首先，对试剂组合物中使用的成分进行说明。
以下的例子中，第1和第2试剂组合物均通过在PIPES缓冲液(50mmol/L、pH7.0)中以各表中记载的浓度配混表1或表2中记载的各成分而制备。
以下示出表1和表2中记载的成分。
TOOS：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺
4-AA：4-氨基安替比林
FeK：亚铁氰化钾
POD：过氧化物酶
B-Cat：过氧化氢酶
NaN3：叠氮化钠
(制备例1)
(实施例1-1～1-8、比较例1-1～1-4)
以表1中记载的配方组成，制备了各例的第1试剂组合物。
此处，各例的第1试剂组合物除了表1中记载的成分之外，共通地包含以下的成分。
(第1试剂组合物的共通成分)
胆固醇酯酶：0.6U/mL
胆固醇氧化酶：0.5U/mL
鞘磷脂酶：2.7U/mL
聚氧乙烯多环苯基醚(花王公司制)：0.3％(w/v)
将得到的第1试剂组合物在37℃下加速保存1周或2周，对于保存过程中的自然显色，测定了波长320nm～480nm的吸收光谱。表1一并示出各例中得到的试剂组合物的吸光度和吸光度比。
另外，图1的(a)～图1的(f)和图2的(a)～图2的(f)是示出各例中得到的第1试剂组合物的刚制备后以及在37℃下加速保存1周或2周后的吸收光谱的图。
[表1]
Figure BDA0003540134710000231
(制备例2)
(实施例2-1～2-9、比较例2-1～2-4)
以表2中记载的配方组成，制备了各例的第2试剂组合物。
此处，各例的第2试剂组合物除了表2中记载的成分之外，共通地包含以下的成分。
(第2试剂组合物的共通成分)
聚氧乙烯烷基醚(花王公司制)：1.0％(w/v)
将得到的第2试剂组合物在37℃下加速保存1周或2周，对于保存过程中的自然显色，测定了波长320nm～480nm的吸收光谱。表2一并示出各例中得到的试剂组合物的吸光度和吸光度比。
另外，图3的(a)～图3的(f)和图4的(a)～图4的(g)是示出各例中得到的第2试剂组合物的刚制备后以及在37℃下加速保存1周或2周后的吸收光谱的图。
[表2]
Figure BDA0003540134710000251
(实施例3-1～3-4、比较例3-1～3-7)
将各例中的第1和第2试剂组合物在37℃的条件下保存2周，进行加速试验。
以表3～表5表示的组合使用保存后的第1和第2试剂组合物，对是否能够准确地进行sdLDL的定量进行评价。将评价结果一并示于表3～表5。
(过氧化氢酶系统)
表3是为了用过氧化氢酶去除除sdLDL以外的脂蛋白胆固醇而组合了第1和第2试剂组合物的测定系统的结果。
各测定系统中，利用以下的方法测定校正吸光度。此处，校正吸光度是指：测定sdLDL-C浓度已知的标准物质时的测定波长处的吸光度。
即，对于sdLDL-C浓度为41mg/dL的标准物质和不存在sdLDL-C的作为空白物质的生理盐水，分别利用以下的方法测定3次sdLDL-C浓度，求出由主波长600nm的吸光度减去副波长700nm的吸光度而得到的吸光度差。然后由标准物质的吸光度差的平均值减去空白吸光度差的平均值，而计算出各例的校正吸光度。
具体而言，对于表3中记载的各例，按照以下的步骤进行sdLDL-C浓度的测定和评价。
(sdLDL-C浓度的测定和评价方法)
1.在上述标准物质和生理盐水的试样3.0μL中加入各例的第1试剂组合物150μL，在37℃下作用5分钟。
2.在上述1.中得到的试样中加入各例的第2试剂组合物50μL，在37℃下作用5分钟。
3.对于上述2.中得到的试样，在即将加入第2试剂组合物前及添加第2试剂组合物5分钟后测定波长600nm和700nm处的吸光度，通过(添加第2试剂组合物5分钟后的600nm吸光度-700nm吸光度)-(即将加入第2试剂组合物前的600nm吸光度-700nm吸光度)而计算出前述的校正吸光度。
4.另一方面，对于各例的测定精度，将sdLDL-C浓度的测定结果为41±2.1mg/dL的情况评价为“○”，将不在上述范围内的情况评价为“×”。
[表3]
表3过氧化氢酶系统
比较例3-1 实施例3-1 实施例3-2 比较例3-2
第1试剂组合物 实施例1-1 实施例1-2 实施例1-7 比较例1-1
第2试剂组合物 比较例2-1 实施例2-1 实施例2-4 实施例2-5
保存2周后的校正吸光度(mABS) 72.4 73.1 77.3 71.4
评价 × ○ ○ ×
根据表3所示的各例，在用过氧化氢酶去除除sdLDL以外的脂蛋白胆固醇的测定系统中，能够准确测定sdLDL-C的校正吸光度范围为73mABS以上且120mABS以下。此处，校正吸光度范围是表示对sdLDL-C进行定量时的准确度的指标。
另外，第1和第2试剂组合物的R1均在特定的范围的实施例中，能够准确地测定sdLDL-C。
(无色醌系统)
表4是第1试剂组合物为包含过氧化物酶的构成、并以形成无色醌而去除除sdLDL以外的脂蛋白胆固醇的方式组合了第1和第2试剂组合物的测定系统的结果。
对于表4记载的各例，依据表3中的前述方法进行了sdLDL-C浓度的测定和评价。
[表4]
表4
无色醌系统
比较例3-3 实施例3-3 比较例3-4
第1试剂组合物 实施例1-3 实施例1-5 比较例1-3
第2试剂组合物 比较例2-2 实施例2-2 实施例2-8
保存2周后的校正吸光度(mABS) 88 191 197
评价 × ○ ×
根据表4所示的各例，在用无色醌去除除sdLDL以外的脂蛋白胆固醇的测定系统中，能够准确地测定sdLDL-C的校正吸光度范围为150mABS以上且195mABS以下。
另外，第1和第2试剂组合物的R1均在特定的范围内的实施例中，能够准确地测定sdLDL-C。
(混合去除系统)
表5是第1试剂组合物为包含过氧化物酶的构成、并且以成为形成无色醌而去除除sdLDL以外的脂蛋白胆固醇且用过氧化氢酶去除除sdLDL以外的脂蛋白胆固醇的混合去除系统的方式组合了第1和第2试剂组合物的结果。
对于表5记载的各例，依据表3中的前述方法进行sdLDL-C浓度的测定和评价。
[表5]
表5
混合去除系统
比较例3-5 实施例3-4 比较例3-6 比较例3-7
第1试剂组合物 实施例1-4 实施例1-6 比较例1-2 比较例1-4
第2试剂组合物 比较例2-3 实施例2-3 实施例2-7 实施例2-9
保存2周后的校正吸光度(mABS) 78 158 190 164
评价 × ○ × ×
根据表5所示的各例，在用过氧化氢酶和无色醌去除除sdLDL以外的脂蛋白胆固醇的测定系统中，能够准确地测定sdLDL-C的校正吸光度范围为110mABS以上且160mABS以下。
另外，第1和第2试剂组合物的R1均在特定的范围内的实施例中，能够准确地测定sdLDL-C。
该申请主张基于2019年9月10日申请的日本申请特愿2019-164200号的优先权，将其公开的全部内容引用至此。

Claims (14)

1.一种试剂盒，其为用于识别试样中的小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)的试剂盒，所述试剂盒包含第1试剂组合物和第2试剂组合物，
所述第1试剂组合物具有选自由胆固醇酯酶活性、胆固醇氧化酶活性和鞘磷脂酶活性组成的组中的1种或2种以上活性，
所述第2试剂组合物用于对所述sdLDL-C进行定量，
将所述第1试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.90以上且3.00以下，
将所述第2试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.90以上且8.00以下。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，将第1试剂组合物在37℃下保存2周后的所述吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，由ABS360/ABS400表示的比R2为0.90以上且2.50以下。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述第1试剂组合物还具有过氧化氢酶活性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒，其中，所述第1试剂组合物包含作用于除小而密低密度脂蛋白(sdLDL)以外的脂蛋白的表面活性剂。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，其中，将第2试剂组合物在37℃下保存2周后的所述吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，由ABS360/ABS400表示的比R2为0.90以上且2.50以下。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂盒，其中，所述第2试剂组合物包含作用于小而密低密度脂蛋白(sdLDL)的表面活性剂。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的试剂盒，其中，
所述第1试剂组合物满足以下的条件1～3中的1个或2个条件、且
所述第2试剂组合物不满足所述条件1～3中的前述1个或2个条件，满足此外的所有条件，
条件1：包含耦合剂
条件2：包含铁配合物
条件3：具有过氧化物酶活性。
8.一种对试样中的小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)进行定量的方法，其包括如下工序：
使第1试剂组合物作用于所述试样的工序，所述第1试剂组合物具有选自由胆固醇酯酶活性、胆固醇氧化酶活性和鞘磷脂酶活性组成的组中的1种或2种以上活性；及
在使第1试剂组合物作用于所述试样的所述工序之后，使用于对所述sdLDL-C进行定量的第2试剂组合物进行作用，由此对残留的脂蛋白中的胆固醇进行定量的工序，
将所述第1试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.90以上且3.00以下，
将所述第2试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.90以上且8.00以下。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，将第1试剂组合物在37℃下保存2周后的所述吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，由ABS360/ABS400表示的比R2为0.90以上且2.50以下。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述第1试剂组合物还具有过氧化氢酶活性。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中，所述第1试剂组合物包含作用于除所述sdLDL以外的脂蛋白的表面活性剂。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中，将第2试剂组合物在37℃下保存2周后的所述吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，由ABS360/ABS400表示的比R2为0.90以上且2.50以下。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其中，所述第2试剂组合物包含作用于所述sdLDL的表面活性剂。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的方法，其中，
所述第1试剂组合物满足以下的条件1～3中的1个或2个条件、且
所述第2试剂组合物不满足所述条件1～3中的前述1个或2个条件，满足此外的所有条件，
条件1：包含耦合剂
条件2：包含铁配合物
条件3：具有过氧化物酶活性。
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