CN114317767A - 一种区别c57bl/6亚系小鼠的引物、试剂盒和方法 - Google Patents
一种区别c57bl/6亚系小鼠的引物、试剂盒和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种区别C57BL/6亚系小鼠的引物、试剂盒和方法，区别C57BL/6亚系小鼠的引物包括9个SNP位点的内部正向引物、内部反向引物、外部正向引物和外部反向引物。区别C57BL/6亚系小鼠的试剂盒包括9个SNP位点的PCR反应体系。区别C57BL/6亚系小鼠的方法，包括步骤选择SNP位点，设计引物序列，制备模板DNA，ARMS‑PCR扩增，凝胶电泳，结果分析。对样品进行检测可直接区分出C57BL/6N亚系、C57BL/6J亚系及C57BL/6By亚系，同时也可鉴定到C57BL/6N亚系中的C57BL/6NJ，区别C57BL/6亚系小鼠的方法更加精确。
Description
技术领域
本发明属于在生物检测的领域，具体涉及一种区别C57BL/6亚系小鼠的引物、试剂盒和方法。
背景技术
目前，随着近些年国内外对生命科学的重视，实验动物供应及对实验动物质量的把控也成为了科学研究中关键的一环。C57BL/6小鼠在科学研究中被广泛使用，然而，最常见的两大亚系C57BL/6N与C57BL/6J在诸多方面都存在着差异，而这些差异则会导致实验数据的偏差。除此之外还存在一个C57BL/6By亚系，大约1961年该亚系从C57BL/6N中分离出来。因此在进行动物实验时，一定要根据需求选择合适的亚系。但C57BL/6小鼠在外观上几乎一致，这就导致在购买或同时饲养过程中无法快速分辨。
C57BL/6各个亚系之间存在许多特异性的单核苷酸多态性(SNP)，这对小鼠的遗传监测和亚系鉴定帮助很大。目前，已有许多能将其区分的SNP位点被报道，同时对于SNP的检测方法也层出不穷，如TaqMan探针法、SNaPshot法、高分辨率熔解曲线分析(HRM)法、PCR-RFLP法等。然而，这些方法耗时且价格昂贵。公开号CN102586457A的专利申请文件公开了45个SNP，通过多重PCR-LDR反应、琼脂糖电泳及ABI377测序等方法对近交系小鼠进行分型和鉴定，该方法不仅成本高同时也不能对C57BL/6小鼠的亚型进行区分。而公开号CN110423826A的专利申请文件公开了12个SNPs位点及1个基因突变位点用于C57BL/6亚系小鼠的遗传检测，这些SNPs位点只能区分出C57BL/6J，并不能将C57BL/6By亚系从C57BL/6N中分离鉴定出来，而且采用的KASP方法在合成荧光引物及仪器使用上都需要投入更大的成本。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种区别C57BL/6亚系小鼠的引物、试剂盒和方法，解决了不能准确区分C57BL/6亚系和投入成本高的问题。
为了实现上述目的，本发明提供的一种快速区别C57BL/6亚系小鼠的引物，包括三组SNP位点的引物序列：
第一组，SNP位点：rs244794780，引物序列为
rs244794780-FI：SEQ ID NO.1，
rs244794780-RI：SEQ ID NO.2，
rs244794780-FO：SEQ ID NO.3，
rs244794780-RO：SEQ ID NO.4；
SNP位点：rs228546410，引物序列为
rs228546410-FI：SEQ ID NO.5，
rs228546410-RI：SEQ ID NO.6，
rs228546410-FO：SEQ ID NO.7，
rs228546410-RO：SEQ ID NO.8；
SNP位点：rs226310424，引物序列为
rs226310424-FI：SEQ ID NO.9，
rs226310424-RI：SEQ ID NO.10，
rs226310424-FO：SEQ ID NO.11，
rs226310424-RO：SEQ ID NO.12；
SNP位点：rs246037535，引物序列为
rs246037535-FI：SEQ ID NO.13，
rs246037535-RI：SEQ ID NO.14，
rs246037535-FO：SEQ ID NO.15，
rs246037535-RO：SEQ ID NO.16；
第二组，SNP位点：rs260260338，引物序列为
rs260260338-FI：SEQ ID NO.17，
rs260260338-RI：SEQ ID NO.18，
rs260260338-FO：SEQ ID NO.19，
rs260260338-RO：SEQ ID NO.20；
第三组，SNP位点：rs224344563，引物序列为
rs224344563-FI：SEQ ID NO.21，
rs224344563-RI：SEQ ID NO.22，
rs224344563-FO：SEQ ID NO.23，
rs224344563-RO：SEQ ID NO.24；
SNP位点：rs222821429，引物序列为
rs222821429-FI：SEQ ID NO.25，
rs222821429-RI：SEQ ID NO.26，
rs222821429-FO：SEQ ID NO.27，
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SNP位点：rs239219835，引物序列为
rs239219835-FI：SEQ ID NO.29，
rs239219835-RI：SEQ ID NO.30，
rs239219835-FO：SEQ ID NO.31，
rs239219835-RO：SEQ ID NO.32；
SNP位点：rs243500146，引物序列为
rs243500146-FI：SEQ ID NO.33，
rs243500146-RI：SEQ ID NO.34，
rs243500146-FO：SEQ ID NO.35，
rs243500146-RO：SEQ ID NO.36。
本发明还公开一种快速区别C57BL/6亚系小鼠的试剂盒，包括9个PCR反应体系，每个反应体系包括上述的快速区别C57BL/6亚系小鼠的引物中的其中一个SNP位点的引物序列，每一个SNP位点的引物序列包括内部正向引物、内部反向引物、外部正向引物和外部反向引物。
本发明还公开一种区别C57BL/6亚系小鼠的方法，包括以下步骤：
(1)选择SNP位点，针对所述SNP位点设计引物序列；
(2)制备模板DNA，取鼠尾用NaOH溶液裂解并在温度80-100℃进行加热以释放基因组DNA，冷却后加入Tris-HCl溶液后混匀并且离心，离心后取上清液，得到模版DNA；
(3)ARMS-PCR扩增，为每个SNP位点对应一个PCR反应体系，PCR反应体系中包含PCRTaq MIX、水、引物序列和模版DNA；
(4)凝胶电泳，使用体积分数为2％的琼脂糖凝胶，电泳，之后使用紫外凝胶成像仪显示结果；
(5)将步骤(4)的显示结果与C57BL/6亚系小鼠的SNP位点对应的碱基进行比对，进行结果分析。
优选地，所述SNP位点包括：第一组的rs244794780、rs228546410、rs226310424、rs246037535，第二组的rs260260338，和第三组的rs224344563、rs222821429、rs239219835、rs243500146。
优选地，所述引物序列由上述的快速区别C57BL/6亚系小鼠的引物组成。
优选地，PCR反应体系中，引物序列rs244794780-FO和rs244794780-RO的浓度和与rs244794780-FI和rs244794780-RI的浓度和的比例为1：2；引物序列rs228546410-FO和rs228546410-RO的浓度和与rs228546410-FI和rs228546410-RI的浓度和的比例为1：4；引物序列rs226310424-FO和rs226310424-RO的浓度和与rs226310424-FI和rs226310424-RI的浓度和的比例为1：2；引物序列rs246037535-FO和rs246037535-RO的浓度和与rs246037535-FI和rs246037535-RI的浓度和的比例为1：1；引物序列rs260260338-FO和rs260260338-RO的浓度和与rs260260338-FI和rs260260338-RI的浓度和的比例为1：1；引物序列rs224344563-FO和rs224344563-RO的浓度和与rs224344563-FI和rs224344563-RI的浓度和的比例为1：2；引物序列rs222821429-FO和rs222821429-RO的浓度和与rs222821429-FI和rs222821429-RI的浓度和的比例为1：2；引物序列rs239219835-FO和rs239219835-RO的浓度和与rs239219835-FI和rs239219835-RI的浓度和的比例为1：1；引物序列rs243500146-FO和rs243500146-RO的浓度和与rs243500146-FI和rs243500146-RI的浓度和的比例为1：1。
优选地，步骤(5)中C57BL/6亚系小鼠的SNP位点对应的碱基为：
排除C57BL/6NJ亚系的其他C57BL/6N亚系小鼠的SNP位点rs244794780对应碱基为T，SNP位点rs228546410对应碱基为T，SNP位点rs226310424对应碱基为G，SNP位点rs246037535对应碱基为C，SNP位点rs260260338对应碱基为A，SNP位点rs224344563对应碱基为T，SNP位点rs222821429对应碱基为T，SNP位点rs239219835对应碱基为A，SNP位点rs243500146对应碱基为T；
其中，C57BL/6NJ小鼠的SNP位点rs244794780对应碱基为A，SNP位点rs228546410对应碱基为A，SNP位点rs226310424对应碱基为C，SNP位点rs246037535对应碱基为T，SNP位点rs260260338对应碱基为A，SNP位点rs224344563对应碱基为T，SNP位点rs222821429对应碱基为T，SNP位点rs239219835对应碱基为A，SNP位点rs243500146对应碱基为T；
C57BL/6J亚系小鼠的SNP位点rs244794780对应碱基为T，SNP位点rs228546410对应碱基为T，SNP位点rs226310424对应碱基为G，SNP位点rs246037535对应碱基为C，SNP位点rs260260338对应碱基为G，SNP位点rs224344563对应碱基为A，SNP位点rs222821429对应碱基为C，SNP位点rs239219835对应碱基为G，SNP位点rs243500146对应碱基为C；
C57BL/6By亚系小鼠的SNP位点rs244794780对应碱基为T，SNP位点rs228546410对应碱基为T，SNP位点rs226310424对应碱基为G，SNP位点rs246037535对应碱基为C，SNP位点rs260260338对应碱基为G，SNP位点rs224344563对应碱基为T，SNP位点rs222821429对应碱基为T，SNP位点rs239219835对应碱基为A，SNP位点rs243500146对应碱基为T。
本发明提供的一种区别C57BL/6亚系小鼠的引物、试剂盒和方法，具有如下有益效果：
1、对样品进行检测可直接区分出C57BL/6N亚系、C57BL/6J亚系及C57BL/6By亚系，同时也可鉴定到C57BL/6N亚系中的C57BL/6NJ，区别C57BL/6亚系小鼠的方法更加精确；
2、使用碱性裂解液裂解并加热以释放基因组DNA，冷却后加入中和缓冲液，离心后上清液即为模版DNA，快速从鼠尾中提取全基因组DNA，20分钟内即可完成，大大缩短检测所需时间；整个步骤仅需不到4个小时即可获得9个SNP位点分型信息，能够快速完成区分C57BL/6亚系的鉴定；
3、只需要应用实验室最常规的分子实验仪器——梯度PCR仪、电泳仪及紫外凝胶成像仪即可完成鉴定，不需要额外设计探针或荧光引物，也不需要配置价格高昂的仪器设备且操作简单，降低成本；
4、PCR反应中使用两个引物对来扩增两个等位基因，两个等位基因特异性内部引物以相反的方向设计，与外部引物结合，因为两个等位基因特异性扩增子的长度明显不同，琼脂糖凝胶电泳可轻松分离不同的PCR产物，从而实现亚型的快速鉴定。
附图说明
图1为本实施例1中的SNP位点的紫外凝胶成像仪显示的电泳图。
图2为本实施例1中的小鼠A样品检测的紫外凝胶成像仪显示的电泳图。
图3为本实施例2中的小鼠B样品检测的紫外凝胶成像仪显示的电泳图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
一种区别C57BL/6亚系小鼠的方法，共选取了9个SNPs位点，分成三组，第一组引物包括4个SNPs位点，rs244794780、rs228546410、rs226310424和rs246037535，用来区别出C57BL/6N亚系中的C57BL/6NJ，如果结果表明待测样本不是C57BL/6NJ则需检查第二组引物；第二组引物包括1个SNPs位点，rs260260338，用来鉴定出待测样本属于C57BL/6N亚系，如果结果表明不是C57BL/6N亚系则需检查第三组引物；第三组引物包括4个SNPs位点，rs224344563、rs222821429、rs239219835和rs243500146，能够区别出C57BL/6By亚系和C57BL/6J亚系。C57BL/6N和C57BL/6J两大亚系中又分出很多亚系，其中C57BL/6NJ是目前国内市场上使用最多的C57BL/6N亚系小鼠，通过使用该方法对样品进行检测可直接区分出C57BL/6NJ；同时也可鉴定到C57BL/6小鼠中的第三大亚系C57BL/6By，该亚系早期从C57BL/6N中被分离出来，此前的检测会将C57BL/6By也鉴定为C57BL/6N，本区别C57BL/6亚系小鼠的方法更加精确。
设计SNP引物，将以每个SNP位点为中心的1001bp序列复制到网站中(http://primer1.soton.ac.uk/primer1.html.)，并按需要修改相应的参数。在该网站所输出的结果中选择产物长度两两相差50bp左右的引物组合进行合成，若两产物长度小于50bp则不容易在凝胶电泳中区分。
以往获得待测样品DNA模版大多选用DNA提取试剂盒，需1小时后才可得到待测样品DNA，如果待测样品为鼠尾则需要更长的时间进行消化。本区别C57BL/6亚系小鼠的方法采取一种快速的方法从鼠尾中提取全基因组DNA，20分钟内即可完成，将大大缩短检测所需时间。因为进行PCR检测对DNA模版要求比较低，不需要高纯度和高浓度模版即可完成扩增，因此本发明使用碱性裂解液裂解并加热以释放基因组DNA，冷却后加入中和缓冲液，离心后上清液即为模版DNA。
本发明采用四引物突变特异性扩增系统PCR(ARMS-PCR)技术，突变扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)又称等位基因特异性扩增法(allele specific amplification,ASA)，是Newton等首先建立用来检测已知突变的方法。该技术只需要应用实验室最常规的分子实验仪器——梯度PCR仪、电泳仪及紫外凝胶成像仪即可完成鉴定，不需要额外设计探针或荧光引物，也不需要配置价格高昂的仪器设备且操作简单，降低成本。
引物3’末端核苷酸与模版之间存在错配，扩增效率大大降低。Taq聚合酶缺少3’核酸外切校正活性，因此无法纠正3’末端错配。ARMS-PCR技术应用该原理在单个PCR反应中使用两个引物对来扩增两个等位基因，两个等位基因特异性内部引物以相反的方向设计，与外部引物结合，因为两个等位基因特异性扩增子的长度明显不同，琼脂糖凝胶电泳可轻松分离不同的PCR产物，从而实现亚型的快速鉴定。
本发明区别C57BL/6亚系小鼠的方法在较短的时间内进行DNA提取和ARMS-PCR，该方法能够快速准确的区别C57BL/6亚系小鼠，能够进一步鉴定出C57BL/6NJ和C57BL/6By亚系，不仅提高了效率还大大降低了成本，为科研人员节省了更多时间。
不同亚系小鼠的三组SNP位点在电泳条带对应碱基信息如表1所示，其中第一组，SNP位点：rs244794780，胶图中出现414bp和183bp两条带，检测样品该位点是T，或者，胶图中出现414bp和286bp两条带，检测样品该位点是A；SNP位点：rs228546410，胶图中出现351bp和159bp两条带，检测样品该位点是T，或者，胶图中出现351bp和248bp，检测样品该位点是A；SNP位点：rs226310424，胶图中出现583bp和386bp两条带，检测样品该位点是G，或者，胶图中出现583bp和252bp，检测样品该位点是C；SNP位点：rs246037535，胶图中出现512bp和227bp两条带，检测样品该位点是C，或者，胶图中出现512bp和340bp两条带，检测样品该位点是T；第二组，SNP位点：rs260260338，胶图中出现313bp和147bp两条带，检测样品该位点是G，或者，胶图中出现313bp和220bp，检测样品该位点是A；第三组，SNP位点：rs224344563，胶图中出现301bp和213bp两条带，检测样品该位点是A，或者，胶图中出现301bp和142bp两条带，检测样品该位点是T；SNP位点：rs222821429，胶图中出现472bp和318bp两条带，检测样品该位点是C，或者，胶图中出现472bp和212bp两条带，检测样品该位点是T；SNP位点：rs239219835，胶图中出现339bp和239bp两条带，检测样品该位点是G，或者，胶图中出现339bp和157bp两条带，检测样品该位点是A；SNP位点：rs243500146；胶图中出现366bp和253bp两条带，检测样品该位点是C，或者，胶图中出现366bp和168bp两条带，检测样品该位点是T。
表1不同亚系小鼠的SNP位点对应碱基信息
实施例1
区别C57BL/6亚系小鼠的方法，包括以下步骤：
1、获取SNP引物序列
第一组，SNP位点：rs244794780；引物序列：
内部正向引物FI：TTTCTTTTAGTGTTTCTGTTCCTGCGA(SEQ ID NO.1)，
内部反向引物RI：GCTTTGAAATAATCTGTGATTCCCTCAA(SEQ ID NO.2)，
外部正向引物FO：TCTTCTAATTAGCTGTACGACTTGGGGA(SEQ ID NO.3)，
外部反向引物RO：TAAGAACATGATGCCAACAACTTTACCC(SEQ ID NO.4)；
SNP位点：rs228546410；引物序列：
内部正向引物FI：TGGTTGGTGGTCTTTCTCCTCCGATA(SEQ ID NO.5)，
内部反向引物RI：CTAAAACTCAGTACCAAATGTTAACCCGAA(SEQ ID NO.6)，
外部正向引物FO：TTCTTCACCTCCAATGCTGTTTCTTGTAA(SEQ ID NO.7)，
外部反向引物RO：CCCTCTGACTGTCCACTCAACAGTTTTT(SEQ ID NO.8)；
SNP位点：rs226310424；引物序列：
内部正向引物FI：TATGGCCTTCAACATCCCATGTCGCC(SEQ ID NO.9)，
内部反向引物RI：ACCGAGATGGAGGAAAAAGATAATTCATC(SEQ ID NO.10)，
外部正向引物FO：CTAAGCTATGGGTGCAGCTTGACAGGAC(SEQ ID NO.11)，
外部反向引物RO：CCCATGCAAACAGATTTAGCAATTCCAC(SEQ ID NO.12)；
SNP位点：rs246037535；引物序列：
内部正向引物FI：AGCTGTCCCCATCTTCAAATGAATATC(SEQ ID NO.13)，
内部反向引物RI：TAGATTCAGGCCTATTATGTTTCCACGA(SEQ ID NO.14)，
外部正向引物FO：CTTCAAGATGTCCCATATACAGAATGCC(SEQ ID NO.15)，
外部反向引物RO：AACAAACAAACAAACAAACAAAAAACCAA(SEQ ID NO.16)；
第二组，SNP位点：rs260260338；引物序列：
内部正向引物FI：AAACCATATGAGGTCAGCATGTACTCAG(SEQ ID NO.17)，
内部反向引物RI：TATCCACAGGCTTTCAGCTCCTTACT(SEQ ID NO.18)，
外部正向引物FO：GTTAAAGAGGTTTCACAGGGGAGCTATAT(SEQ ID NO.19)，
外部反向引物RO：ATTGCCAATCACATTTCCATTTTAGTTT(SEQ ID NO.20)；
第三组，SNP位点：rs224344563；引物序列：
内部正向引物FI：GCACACTTAACATACTCCCGAAGACT(SEQ ID NO.21)，
内部反向引物RI：AATATTTAGTGAATTTACAAGATAAGGT(SEQ ID NO.22)，
外部正向引物FO：GTTTCAGAAGTGTTAAGTGTTAAACAAG(SEQ ID NO.23)，
外部反向引物RO：ATAACAATATAAACTTGTGTTCTCCCA(SEQ ID NO.24)；
SNP位点：rs222821429；引物序列：
内部正向引物FI：CTGGTAAAGCCCATTAAACACTGCACAT(SEQ ID NO.25)，
内部反向引物RI：ATGGCTTAAGGTCTTTGTCCTCATACTTCG(SEQ ID NO.26)，
外部正向引物FO：ACAGAGTACATATGCATTCATCAGCACATG(SEQ ID NO.27)，
外部反向引物RO：CCAGATCTGCTTGCCTTTTAGACATTTG(SEQ ID NO.28)；
SNP位点：rs239219835；引物序列：
内部正向引物FI：GCATGCATGTTGGACCTTCTAGAAACCATG(SEQ ID NO.29)，
内部反向引物RI：AGCCCAACCCCCAGCTGCTATTCCATT(SEQ ID NO.30)，
外部正向引物FO：GCCCGAATTCACATCTGGATGAACCATC(SEQ ID NO.31)，
外部反向引物RO：CTCTCTCCCTCTCTCTCTCTCTGGCGCC(SEQ ID NO.32)；
SNP位点：rs243500146；引物序列：
内部正向引物FI：GAAGTGTATGCAGCCAACTCAACTGTAAC(SEQ ID NO.33)，
内部反向引物RI：CATTTTGATAAGCAGGGCCACACTTA(SEQ ID NO.34)，
外部正向引物FO：GAAGTGGGAAGTTGTTATTGCACATCAG(SEQ ID NO.35)，
外部反向引物RO：AATGGAAGGACTAGGATGTCTCTAGGGC(SEQ ID NO.36)。
2、对小鼠A全基因组DNA进行快速提取
将2mm鼠尾用180μL的NaOH溶液(浓度为50mmol/L)裂解并在温度80-100℃进行加热5-15分钟，具体可以选择在95℃进行加热10分钟以释放基因组DNA，冷却后加入20μLTris-HCl(浓度为1mol/L,pH 8.0)混匀，离心，离心后取上清液，即为模版DNA。
3、ARMS-PCR扩增
为每个SNP位点对应一个20μL的PCR反应体系，其中包含10μL Green Taq MIX(诺唯赞，P131)、7μL纯水(ddH2O)、总体积为2μL且浓度均为10μmol/L的引物(FI、RI、FO和RO)、模版DNA 1μL；PCR反应条件为：95℃预变性，3分钟；95℃变性、15秒，50～66℃退火、15秒，72℃延伸、40秒，循环30次；72℃继续延伸，5分钟。所有SNP位点对应的PCR反应体系进行整合，可以制备区别C57BL/6亚系小鼠的试剂盒。
其中SNP位点rs244794780对应的PCR反应退火温度选择52℃，引物混合物中加入外部引物与内部引物的体积比例为1:2，使引物混合物中外部引物与内部引物的浓度比例为1:2，使最终电泳图中多个条带亮度尽可能一致，避免两条带中的下部条带过暗，使电泳图的结果更清晰；
其中SNP位点rs228546410对应的PCR反应退火温度选择56℃，引物混合物中加入外部引物与内部引物的体积比为1：4，使引物混合物中外部引物与内部引物的浓度比例为1:4；
其中SNP位点rs226310424对应的PCR反应退火温度选择64℃，引物混合物中加入外部引物与内部引物的体积比为1：2，使引物混合物中外部引物与内部引物的浓度比例为1:2；
其中SNP位点rs246037535对应的PCR反应退火温度选择59℃，引物混合物中加入外部引物与内部引物的体积比为1：1，使引物混合物中外部引物与内部引物的浓度比例为1:1；
其中SNP位点rs260260338对应的PCR反应退火温度选择63℃，引物混合物中加入外部引物与内部引物的体积比为1：1，使引物混合物中外部引物与内部引物的浓度比例为1:1；
其中SNP位点rs224344563对应的PCR反应退火温度选择50℃，引物混合物中加入外部引物与内部引物的体积比为1：2，使引物混合物中外部引物与内部引物的浓度比例为1:2；
其中SNP位点rs222821429对应的PCR反应退火温度选择66℃，引物混合物中加入外部引物与内部引物的体积比为1：2，使引物混合物中外部引物与内部引物的浓度比例为1:2；
其中SNP位点rs239219835对应的PCR反应退火温度选择59℃，引物混合物中加入外部引物与内部引物的体积比为1：1，使引物混合物中外部引物与内部引物的浓度比例为1:1；
其中SNP位点rs243500146对应的PCR反应退火温度选择62℃，引物混合物中加入外部引物与内部引物的体积比为1：1，使引物混合物中外部引物与内部引物的浓度比例为1:1。
4、凝胶电泳
使用体积分数为2％的琼脂糖凝胶，电泳时间为45分钟。使用紫外凝胶成像仪显示结果。
5、结果分析
如图1所示，第一组：
SNP位点：rs244794780；胶图中出现414bp和183bp两条带，对应SNP位点为T，继续进行第二组结果分析；
或SNP位点：rs228546410；胶图中出现351bp和159bp两条带，对应SNP位点为T，继续进行第二组结果分析；
或SNP位点：rs226310424；胶图中出现583bp和386bp两条带，对应SNP位点为G，继续进行第二组结果分析；
或SNP位点：rs246037535；胶图中出现512bp和227bp两条带，对应SNP位点为C，继续进行第二组结果分析；
第二组：
或SNP位点：rs260260338；胶图中出现313bp和147bp两条带，对应SNP位点为G，继续进行第三组结果分析；
第三组
或SNP位点：rs224344563；胶图中出现301bp和213bp两条带，对应SNP位点为A，表明样品亚型为6J；
或SNP位点：rs222821429；胶图中出现472bp和318bp两条带，对应SNP位点为C，表明样品亚型为6J；
或SNP位点：rs239219835；胶图中出现339bp和239bp两条带，对应SNP位点为G，表明样品亚型为6J；
或SNP位点：rs243500146；胶图中出现366bp和253bp两条带，对应SNP位点为C，表明样品亚型为6J。
如图2所示，从左到右条带依次对应SNP位点为：第一组rs244794780、rs228546410、rs226310424、rs246037535；第二组rs260260338；第三组rs224344563、rs222821429、rs239219835、rs243500146。第一组引物对应的4个SNP位点扩增出的条带均与C57BL/6NJ小鼠SNP位点不同；第二组引物对应的1个SNP位点扩增出的条带均与C57BL/6N小鼠SNP位点不同；第三组引物对应的4个SNP位点扩增出的条带均与C57BL/6J小鼠SNP位点相同，分析说明小鼠A为C57BL/6J亚系。
整个步骤仅需不到4个小时即可获得9个SNP位点分型信息，可用于快速完成区分C57BL/6亚系的鉴定。
实施例2
按照实施例1中的区别C57BL/6亚系小鼠的方法步骤，对小鼠B全基因组DNA进行快速提取，ARMS-PCR扩增，凝胶电泳，得到第一组SNP位点结果，如图3所示，从左到右条带依次对应SNP位点为：第一组rs244794780、rs228546410、rs226310424、rs246037535；第二组rs260260338；第三组rs224344563、rs222821429、rs239219835、rs243500146。第一组引物对应的4个SNP位点扩增出的条带均与C57BL/6NJ小鼠SNP位点相对应，其余C57BL/6亚系小鼠在这4个位点上的碱基均与C57BL/6NJ小鼠不相同，因此说明小鼠B为C57BL/6NJ。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种快速区别C57BL/6亚系小鼠的引物，其特征在于，包括三组SNP位点的引物序列：
第一组，SNP位点：rs244794780，引物序列为
rs244794780-FI：SEQ ID NO.1，
rs244794780-RI：SEQ ID NO.2，
rs244794780-FO：SEQ ID NO.3，
rs244794780-RO：SEQ ID NO.4；
SNP位点：rs228546410，引物序列为
rs228546410-FI：SEQ ID NO.5，
rs228546410-RI：SEQ ID NO.6，
rs228546410-FO：SEQ ID NO.7，
rs228546410-RO：SEQ ID NO.8；
SNP位点：rs226310424，引物序列为
rs226310424-FI：SEQ ID NO.9，
rs226310424-RI：SEQ ID NO.10，
rs226310424-FO：SEQ ID NO.11，
rs226310424-RO：SEQ ID NO.12；
SNP位点：rs246037535，引物序列为
rs246037535-FI：SEQ ID NO.13，
rs246037535-RI：SEQ ID NO.14，
rs246037535-FO：SEQ ID NO.15，
rs246037535-RO：SEQ ID NO.16；
第二组，SNP位点：rs260260338，引物序列为
rs260260338-FI：SEQ ID NO.17，
rs260260338-RI：SEQ ID NO.18，
rs260260338-FO：SEQ ID NO.19，
rs260260338-RO：SEQ ID NO.20；
第三组，SNP位点：rs224344563，引物序列为
rs224344563-FI：SEQ ID NO.21，
rs224344563-RI：SEQ ID NO.22，
rs224344563-FO：SEQ ID NO.23，
rs224344563-RO：SEQ ID NO.24；
SNP位点：rs222821429，引物序列为
rs222821429-FI：SEQ ID NO.25，
rs222821429-RI：SEQ ID NO.26，
rs222821429-FO：SEQ ID NO.27，
rs222821429-RO：SEQ ID NO.28；
SNP位点：rs239219835，引物序列为
rs239219835-FI：SEQ ID NO.29，
rs239219835-RI：SEQ ID NO.30，
rs239219835-FO：SEQ ID NO.31，
rs239219835-RO：SEQ ID NO.32；
SNP位点：rs243500146，引物序列为
rs243500146-FI：SEQ ID NO.33，
rs243500146-RI：SEQ ID NO.34，
rs243500146-FO：SEQ ID NO.35，
rs243500146-RO：SEQ ID NO.36。
2.一种快速区别C57BL/6亚系小鼠的试剂盒，其特征在于，包括9个PCR反应体系，每个反应体系包括权利要求1所述的快速区别C57BL/6亚系小鼠的引物中的其中一个SNP位点的引物序列，每一个SNP位点的引物序列包括内部正向引物、内部反向引物、外部正向引物和外部反向引物。
3.一种区别C57BL/6亚系小鼠的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选择SNP位点，针对所述SNP位点设计引物序列；
(2)制备模板DNA，取鼠尾用NaOH溶液裂解并在温度80-100℃进行加热以释放基因组DNA，冷却后加入Tris-HCl溶液后混匀并且离心，离心后取上清液，得到模版DNA；
(3)ARMS-PCR扩增，为每个SNP位点对应一个PCR反应体系，PCR反应体系中包含PCR TaqMIX、水、引物序列和模版DNA；
(4)凝胶电泳，使用体积分数为2％的琼脂糖凝胶，电泳，之后使用紫外凝胶成像仪显示结果；
(5)将步骤(4)的显示结果与C57BL/6亚系小鼠的SNP位点对应的碱基进行比对，进行结果分析。
4.根据权利要求3所述的区别C57BL/6亚系小鼠的方法，其特征在于，所述SNP位点包括：第一组的rs244794780、rs228546410、rs226310424、rs246037535，第二组的rs260260338，和第三组的rs224344563、rs222821429、rs239219835、rs243500146。
5.根据权利要求3所述的区别C57BL/6亚系小鼠的方法，其特征在于，所述引物序列由权利要求1所述的快速区别C57BL/6亚系小鼠的引物组成。
6.根据权利要求5所述的区别C57BL/6亚系小鼠的方法，其特征在于，PCR反应体系中，引物序列rs244794780-FO和rs244794780-RO的浓度和与rs244794780-FI和rs244794780-RI的浓度和的比例为1：2；引物序列rs228546410-FO和rs228546410-RO的浓度和与rs228546410-FI和rs228546410-RI的浓度和的比例为1：4；引物序列rs226310424-FO和rs226310424-RO的浓度和与rs226310424-FI和rs226310424-RI的浓度和的比例为1：2；引物序列rs246037535-FO和rs246037535-RO的浓度和与rs246037535-FI和rs246037535-RI的浓度和的比例为1：1；引物序列rs260260338-FO和rs260260338-RO的浓度和与rs260260338-FI和rs260260338-RI的浓度和的比例为1：1；引物序列rs224344563-FO和rs224344563-RO的浓度和与rs224344563-FI和rs224344563-RI的浓度和的比例为1：2；引物序列rs222821429-FO和rs222821429-RO的浓度和与rs222821429-FI和rs222821429-RI的浓度和的比例为1：2；引物序列rs239219835-FO和rs239219835-RO的浓度和与rs239219835-FI和rs239219835-RI的浓度和的比例为1：1；引物序列rs243500146-FO和rs243500146-RO的浓度和与rs243500146-FI和rs243500146-RI的浓度和的比例为1：1。
7.根据权利要求3所述的区别C57BL/6亚系小鼠的方法，其特征在于，步骤(5)中C57BL/6亚系小鼠的SNP位点对应的碱基为：
排除C57BL/6NJ亚系的其他C57BL/6N亚系小鼠的SNP位点rs244794780对应碱基为T，SNP位点rs228546410对应碱基为T，SNP位点rs226310424对应碱基为G，SNP位点rs246037535对应碱基为C，SNP位点rs260260338对应碱基为A，SNP位点rs224344563对应碱基为T，SNP位点rs222821429对应碱基为T，SNP位点rs239219835对应碱基为A，SNP位点rs243500146对应碱基为T；
其中，C57BL/6NJ小鼠的SNP位点rs244794780对应碱基为A，SNP位点rs228546410对应碱基为A，SNP位点rs226310424对应碱基为C，SNP位点rs246037535对应碱基为T，SNP位点rs260260338对应碱基为A，SNP位点rs224344563对应碱基为T，SNP位点rs222821429对应碱基为T，SNP位点rs239219835对应碱基为A，SNP位点rs243500146对应碱基为T；
C57BL/6J亚系小鼠的SNP位点rs244794780对应碱基为T，SNP位点rs228546410对应碱基为T，SNP位点rs226310424对应碱基为G，SNP位点rs246037535对应碱基为C，SNP位点rs260260338对应碱基为G，SNP位点rs224344563对应碱基为A，SNP位点rs222821429对应碱基为C，SNP位点rs239219835对应碱基为G，SNP位点rs243500146对应碱基为C；
C57BL/6By亚系小鼠的SNP位点rs244794780对应碱基为T，SNP位点rs228546410对应碱基为T，SNP位点rs226310424对应碱基为G，SNP位点rs246037535对应碱基为C，SNP位点rs260260338对应碱基为G，SNP位点rs224344563对应碱基为T，SNP位点rs222821429对应碱基为T，SNP位点rs239219835对应碱基为A，SNP位点rs243500146对应碱基为T。
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