CN114303786A - 一种半固体蜜环菌菌种的制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种半固体蜜环菌菌种的制作方法，本发明把蜜环菌原种培养基制作成“果冻”半固体形态，既有固体，又有液体，显著提高了蜜环菌母种在原种培养基上的萌发速度、生长速度及纯度（成品率）；同时在制作蜜环菌栽培种时配制封口覆盖料培养基，也较明显地提高了原种在栽培种培养基上的萌发速度和生长速度，让其快速封口，减少杂菌污染，将栽培种成品率提高5‑8%；在蜜环菌栽培种培养时分段调控菌丝生长温度，即前期培养温度15‑18℃，中后期培养温度22‑24℃，保存温度控制在4‑8℃。此工艺做到了蜜环菌菌种生产的科学化、独特化、精准化，为规模化、工厂化菌种生产奠定坚实基础。

Description

一种半固体蜜环菌菌种的制作方法

技术领域

本发明属于食药菌菌种制种领域，具体为一种半固体蜜环菌菌种的制作方法。

背景技术

蜜环菌(Armillariella mellea) 是真菌界、担子菌门、层菌纲、伞菌目、白磨科、小蜜环菌属的一种食药用真菌。蜜环菌在自然界中与天麻、猪苓等生物相互作用和协同进化有着密切的关系。在天麻、猪苓栽培中，首先要制作优质的或成品率高的蜜环菌菌种，制作优质的、成品率高的蜜环菌菌种，一方面它决定着菌种厂家的经济效益，另一方面还直接影响或是决定着天麻、猪苓栽培的产量和质量，关系着栽培户的经济效益。

目前制作固体蜜环菌原种的培养基主要是阔叶树木屑78%，麸皮20%，糖1%，石膏1%，含水量60-63%（图1）。用这种培养基配方装瓶、灭菌、接种，经60天左右长满瓶后，用于转接生产栽培种。这是半个多世纪以来，我国主要的，常用的，也可以说是经典的食用菌原种的配方和制作方法。这个配方和方法，用于蜜环菌原种的制作和转接生产栽培种，除培养时间较长外，还存在着两个明显的弊端或不足：

一是易感杂、早期识别杂菌困难。这种固体培养基如果在灭菌中，未彻底杀灭霉菌类的微生物时，接入蜜环菌母种，导致原种感杂而不易被发现。这是因为，蜜环菌的菌丝体，对霉菌的抗性较强。一旦有霉菌存在时，相当一部分蜜环菌菌丝体，即聚集成一体，形成菌索或菌膜。蜜环菌菌丝体一旦转化、生长、形成菌索后，便具有很强的抗杂力，或是说顽强的生命力、生长力。形成的菌索外面有一层“树皮”的被膜结构，保护着里面的菌丝体——即菌种，大大增加了外界不良因素（干旱、高温、杂菌）对它的损害。菌索可以穿过有霉菌的基质，而“向前”生长或延伸。所以，常用的固体培养基质内，如果有霉菌感染，从外表察觉较难。

二是接种不方便，易感杂。这种常用的固体基质布满菌丝体后，人们在转接栽培种时，即“切块”，不容易切断或分开，使得接种速度不快，更重要的是在“切断或分开”菌种的过程中，稍不注意即容易引起接种感杂，也非常容易造成菌种成为碎末状影响萌发效果，而影响蜜环菌菌种制作的质量和效益。

发明内容

本发明提出了一种半固体蜜环菌菌种的制作方法。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案为：

一种半固体蜜环菌培养基，所述半固体蜜环菌培养基为原种培养基，包括按照重量份计的以下组分：

水95000-115000 份，琼脂800-1000份，麸皮1500-2500份，土豆粉100-300份，磷酸氢二钾90-130份、维生素C 6-10份。

优选地，所述半固体蜜环菌培养基还包括按照重量份计的以下组分：玉米粉10000-15000份。

优选地，所述半固体蜜环菌培养基的pH值为6-7。

一种蜜环菌的栽培种固体培养基，所述栽培种固体培养基包括按照重量份计的以下组分：

阔叶树木屑60-65份，棉籽壳10-20份，麸皮15-25份，糖0.5-1.5份，石膏0.5-1.5份；

或：阔叶树木屑75-85份，麸皮15-25份，糖0.5-1.5份，石膏0.5-1.5份；

或：棉籽壳75-85份，麸皮15-25份，石膏0.5-1.5份。

优选地，所述栽培种固体培养基包括按照重量份计的以下组分：

阔叶树木屑63份，棉籽壳15份，麸皮20份，糖1份，石膏1份；

或：阔叶树木屑78份，麸皮20份，糖1份，石膏1份；

或：棉籽壳79份，麸皮20份，石膏1份。

优选地，所述栽培种固体培养基含水量60-63%。

一种蜜环菌的封口覆盖料培养基，所述封口覆盖料培养基包括按照重量份计的以下组分：

阔叶树木屑40-60份，玉米面25-35份，麸皮15-22份，糖0.5-1.5份，石膏0.5-1.5份；封口覆盖料培养基含水量63-65%。

S1制作；制作半固体培养基、栽培种固体培养基；

S2培养：将半固体培养基接种的原种瓶，培养满瓶后备用；

S3将栽培种固体培养基拌匀、装瓶至瓶肩以上，灌水至满瓶下渗至瓶内培养基含水量达到最大；

S4:将封口覆盖料培养基取适量，填装入步骤S3上述瓶口颈部，并按紧压实，装满瓶口，瓶盖封口、灭菌、冷却；

S5:接种：用接种棒按压瓶口覆盖料产生适当空间，用勺子挖取上述原种瓶中原种接入栽培瓶或袋中，瓶盖封口，分段培养菌种（菌丝体）；

S6:将接种的栽培种培养。

优选地，所述步骤S5：原种接种块（1.5-2.5）cm×（1.5-3）cm。

更进一步优选地，所述步骤S5：原种接种块2cm×3cm。

优选地，所述骤S2：半固体培养基接种的原种瓶培养基装满瓶；

S5:接种：原种接入栽培瓶或袋中，填满瓶口空隙。

优选地，所述骤S2: 原种瓶，放入15-20℃温度中，培养7-10天时，剔除感染杂菌的原种瓶，将无感杂的原种继续在23-24℃温度中培养；

所述骤S6:将接种的栽培种放入15-20℃温度中培养一周-两周，此阶段以通风透气，蒸发瓶身、瓶盖及瓶盖海绵水分为主，然后逐渐升温至23-24℃培养，20-30天左右菌丝生长至瓶肩以下时，进行全面翻选一次，或移放冷库，温度继续调控在23℃左右，在搬运移动，或翻选杂菌过程中的震动可有效加快菌丝生长，缩短10天以上培养时间，菌丝满瓶后冷库温度可调控至4-8℃保存。

优选地，所述步骤S6:将接种的栽培种放入15-20℃温度中培养一周-两周，此阶段以通风透气，蒸发瓶身、瓶盖及瓶盖海绵水分为主，然后逐渐升温至23-24℃培养，20-30天左右菌丝生长至瓶肩以下时，进行全面翻选一次，或移放冷库，温度继续调控在23℃左右，在搬运移动，或翻选杂菌过程中的震动可有效加快菌丝生长，缩短10天以上培养时间，菌丝满瓶后冷库温度可调控至4-8℃保存。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明把蜜环菌原种培养基制作成“果冻”半固体形态，既有固体，又有液体（图2），显著提高了蜜环菌母种在原种培养基上的萌发速度、生长速度及纯度（成品率高达98%及以上）；同时在制作蜜环菌栽培种时配制封口覆盖料培养基，也较明显地提高了原种在栽培种培养基上的萌发速度和生长速度，让其快速封口，减少杂菌污染，将栽培种成品率提高5-8%，相对于采用试管接种老式（装满瓶）原种的制备方法，正品率提高10%左右；在蜜环菌栽培种培养时分段调控菌丝生长温度，即前期培养温度15-18℃，中后期培养温度22-24℃，保存温度控制在4-8℃。此工艺做到了蜜环菌菌种生产的科学化、独特化、精准化，为规模化、工厂化菌种生产奠定坚实基础。

主要效果：

一是蜜环菌菌丝（菌索）生长迅速，常用500毫升或600毫升玻璃瓶灌装，23-24℃温度培养25-30天即可满瓶，菌索粗壮，有力，活力旺盛，具有复壮效果，比传统木屑培养基装瓶法（图3）缩短三分之一至一半培养时间。

二是极易识别杂菌，且霉菌类的杂菌不能在基质内生长，提高菌种纯度。这种半固体基质，经过灭菌、冷却后，形成“果冻”状，用于制作蜜环菌原种甚为独特，因为它只适于制作蜜环菌原种（母种亦可）之用。这是根据蜜环菌菌种的生理和生长习性而“量身特制”。基质呈半透明、半果冻状，把蜜环菌母种接种于此，整个培养周期很容易识杂，剔杂；如有霉菌感染，不仅“菌落”明显，且霉菌在高湿度（水溶液）的环境中，浮在基质的表面，不能生长于这个基质之内。而蜜环菌菌种接种于此，它能正常生长并扎根穿梭到基质之中。因为蜜环菌丝体、菌索具有自身输送氧气的生理特性，所以在这种培养基中可以正常生长。蜜环菌因特殊的生理和生长习性，它可以在100%的水溶液中生长。

在转接栽培种接种时，从瓶子底部敲开，取菌种至瓶肩处剩余1cm培养基而废弃不用，完全不与培养基最上部及表面接触，阻断杂菌传播途径，进一步提高了菌种的纯度。

三是接种方便，能提高成品率。这种培养基似“果冻”，用于接栽培种时，很容易对它进行切分，接种时直接用勺挖，要挖多大块，就挖多大块。相对于接常规固体原种，较大幅度降底了接种难度，同时提高了接种速度和成品率。

本发明在制作栽培种封口时，配制封口覆盖料培养基，实际上是在封口时，添加加富营养物质，并将封口培养基作为覆盖料装满瓶（图4）。就是这一技巧，又大大提高了蜜环菌栽培种制作的质量和成品率。

用前述蜜环菌栽培种的三个配方，常规制作装瓶时，装到瓶肩部离瓶口的4-5cm时，就不装了，即封口、灭菌、接种。此法对于蜜环菌菌种生产亦有二个缺点，一是瓶口料面积和空间较大，水分散失，料表面不湿润，影响接入的固体蜜环菌原种，萌发慢，封口慢。二是瓶口料面积和空间大，加之蜜环菌栽培种含水量比较高，增加了感染和滋生绿霉等杂菌的机会。三是瓶口面的营养物质不丰富，也不利于蜜环菌菌种的迅速萌发和生长。所以配制的封口培养基覆盖料，一是营养富有，可加速菌种萌发和生长速度，使之迅速封口，防治杂菌感染。二是封口培养基覆盖料装至瓶口再盖瓶盖封口，接种时通过接种棒一定程度的按压增加空间再接上半固体培养基的菌种，基本填满了整个空隙，减少瓶口面积和空间，既减少了感杂机会，也相应减少了水分的散失。如果转接生产枝条水剂蜜环菌栽培种，这种半固体培养基接种时的便利性也体现的淋漓尽致，且成团成块的原种，在枝条水剂培养基中更容易快速萌发生长。

将接种的栽培种，分段控温培养，也是本技术的一个特点。常规方法，始终将温度控制在25℃左右。本方法制作栽培种时，用封口培养基覆盖料封口、灭菌、接种后，即放入15-20℃温度中培养一周至两周左右，此阶段以通风透气，蒸发瓶身、瓶盖及瓶盖海绵水分为主，减少杂菌滋生条件，然后逐渐升温至23-24℃培养，20-30天左右菌丝生长至瓶肩以下时，进行全面翻选一次，或移放冷库，在搬运移动或翻选杂菌过程中的震动，可有效刺激菌丝快速生长，缩短10天以上培养时间，菌种长满瓶后冷库温度可调控至4-8℃保存。在冷库中进行培养，还有一个优点是环境湿度相对不易散发，有效保持培养基水分维持在一个较高的水平，提高蜜环菌菌丝内在生长环境和商品外观。

上述原种培养基的配方和制作，制作栽培种用封口培养基封口，即是依据蜜环菌丝（分解吃料）与菌索（穿越传输）有不同的功能和互相转换的特性，既满足菌丝及菌索的生长，又抵挡或阻隔其它真菌和细菌的生长。分两段来培养蜜环菌栽培种，也是人为的创造条件，最大程度的调控蜜环菌的生长速度，同时抑制和限制杂菌的生长。真正做到和实现了规模化、工厂化、工艺化、精细化生产优质的蜜环菌菌种。

本发明有益效果如下：

1、发明的原种培养基，科学地配制出适合蜜环菌菌丝和菌索生长，而不适合其它杂菌生长的培养基配方，既能提供和满足蜜环菌菌种生长所需的营养物质，又能有效的阻隔其它杂菌类的生长，即其它杂菌不能穿越“果冻”半固体培养基而生长，只能在“果冻”半固体状培养基的表层面上生长，但蜜环菌索能穿入“果冻”，并深入到“果冻”半固体状基质中生长。接种时从瓶子底部敲开，取菌种至瓶肩处剩余1cm培养基而废弃不用，所以本发明培养基与常规培养基比较，不仅能大大提高接种的成功率，阻断菌种带杂而不纯，还能最大程度地提高菌丝和菌索生长的数量和质量。

2、配制的封口培养基及封口技术，用于制作栽培种，能快速的促进蜜环菌菌种萌发和生长，使之迅速封口，减少杂菌的感染机会。同时封口时，瓶口只留少许接种的空隙，也明显的减少了杂菌浸入的空间，有效的提高了成品率。本方法的封口覆盖料，同时适用于制作木屑培养基原种。

3、用两段法培养栽培种，最大程度的调控蜜环菌的生长温度和速度，同时抑制和限制杂菌的生长。这种方法生产出来的蜜环菌菌丝和菌索均匀、整齐，粗壮，瓶中颜色上下一致，纯度高，质量优。1）有效抑制和降低上述原种、栽培种制作过程中的杂菌感染。即将原种、栽培种接种后，放入15-20℃温度中，培养7-10天时，再将温度调控23-24℃中培养，也相应提高了成品率。一般的杂菌即霉菌它们生长的活跃温度是在18-20℃以上。本发明技术把蜜环菌培养的前期温度调控到15-20℃，就是利用生物之间生长的不同的温型差异，而有效的进行抑制和促进。2）有效的提高蜜环菌原种、栽培种（菌丝体或菌索）生长的内在质量。当在较低温度15-20℃中，接种的蜜环菌菌种在原种、栽培种封口后，逐渐升温至23-24℃培养长满瓶。现在几乎所有版本的书中表达，蜜环菌生长的最适温度25-26℃，而本方法是把蜜环菌生长培养的温度调控在23-24℃。正是根据食药菌菌丝体生长的最健壮温度度略低于它们生长的最适温度，即生长的最快温度。

4、本发明培养基中没有添加其他真菌和细菌抑制剂。

附图说明

图1 传统方法制作的蜜环菌原种；

图2 本发明专利半固体培养基制作的蜜环菌原种；

图3 传统方法制作的蜜环菌栽培种（培养基装至瓶肩，离瓶口4-5cm）；

图4 本发明封口培养基制作的蜜环菌栽培种（培养基装满瓶）；

图5本发明制作的即将长满瓶的蜜环菌栽培种；

图6本发明制作的长满瓶的蜜环菌栽培种。

具体实施方式

下面通过实施案例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

实施例1

蜜环菌半固体原种的制作方法，所述方法包括以下步骤：

1、一种半固体蜜环菌培养基：清水190-230斤、琼脂：800-1000克、玉米粉：20-30斤、麸皮：3-5斤、土豆粉：0.2-0.6斤、磷酸氢二钾：90-130克、维生素C：60-100片，ph值：6.5；

2、制作方法：将清水烧开，放入琼脂（提前水泡）煮化，然后放入玉米粉、麸皮及土豆粉等，然后放入提前水溶12个小时以上的维生素片，以及磷酸氢二钾，搅匀并持续搅拌熬煮30分钟，并调节pH值至7左右，灌装装入玻璃瓶（一般使用口径2.2-2.5厘米，容量为500毫升或600毫升的玻璃瓶）中，棉花封口、灭菌、冷却、接种；

3、培养：将接种的原种瓶，放入15-20℃温度中，培养7-10天时，剔除感染杂菌的原种瓶，将无感杂的原种继续在23-24℃温度中，培养满瓶后备用（图2）；

应用该实施例方法将原种正品率提高到98%及以上。

实施例2

蜜环菌栽培种固体培养基的制作方法，所述方法包括以下步骤

1、栽培种固体培养基配方：配方1）（或配方2、3），阔叶树木屑63%，棉籽壳15%，麸皮20%，糖1%，石膏1%，含水量60-65%；

2、将上述培养基拌匀、装瓶至瓶肩以上，灌水至满瓶下渗至瓶内培养基含水量达到最大；

3、封口覆盖料培养基配方：阔叶树木屑50%，玉米面30%，麸皮18%，糖1%，石膏1%，含水量63-65%；

4、将封口覆盖料培养基取适量，填装入上述瓶口颈部，并按紧压实，装满瓶口（图4）。瓶盖封口、灭菌、冷却；

5、接种：用接种棒按压瓶口覆盖料产生适当空间，用勺子挖取上述原种（接种块2cm×3cm左右大小）接入栽培瓶或袋中，填满瓶口空隙，瓶盖封口，分段培养菌种（菌丝体）（图5）;

6、将接种的栽培种放入15-20℃温度中培养一周至两周左右，此阶段以通风透气，蒸发瓶身、瓶盖及瓶盖海绵水分为主，然后逐渐升温至23-24度培养，20-30天左右菌丝生长至瓶肩以下时，进行全面翻选一次，或移放冷库，温度继续调控在23℃左右，在搬运移动，或翻选杂菌过程中的震动可有效加快菌丝生长，缩短10天以上培养时间，菌种长满瓶后冷库温度可调控至4-8℃保存（图5-6）。

应用该实施例方法将栽培种成品率96%。

对比例1

图1是传统的蜜环菌原种制作方法。这种方法装料至瓶肩，即瓶肩与瓶口留距离4-5cm就不装了，便封口，灭菌、接种。

此法的原种成品率一般只在90%左右。

图2是本发明专利半固体培养基制作的蜜环菌原种。虽然也只装到瓶肩，就不装了，但这个专利配方制作的培养基是“果冻”状的。把母种（试管种）接种于此，其成品率高达98-100%。这是因为，配制的“果冻”半固体状培养基，蜜环菌索能穿入“果冻”，并深入到“果冻”半固体状基质中生长。而其它杂菌（霉菌）不能穿越“果冻”半固体培养基而生长。

对比例2

图3是传统方法制作的蜜环菌栽培种（培养基装至瓶肩，离瓶口4-5cm）；此法制作的栽培种成品率一般只90%左右。

图4、5、6，是本发明封口培养基制作的蜜环菌栽培种（培养基装满瓶）；成品率高达95%及以上。这是因为，一方面瓶口只留少许接种的空隙，也明显的减少了杂菌浸入的空间，有效的提高了成品率。另一方面，配制的封口培养基覆盖料，富有营养，可加速菌种萌发和生长速度，使之迅速封口，防治杂菌感染，也提高了成品率。

上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种半固体蜜环菌培养基，其特征在于，所述半固体蜜环菌培养基为原种培养基，包括按照重量份计的以下组分：

水95000-115000 份，琼脂800-1000份，麸皮1500-2500份，土豆粉100-300份，磷酸氢二钾90-130份、维生素C 6-10份。

2.根据权利要求1所述的半固体蜜环菌培养基，其特征在于，所述半固体蜜环菌培养基还包括按照重量份计的以下组分：玉米粉10000-15000份；

所述半固体蜜环菌培养基的pH值为6-7。

3.一种蜜环菌的栽培种固体培养基，其特征在于，所述栽培种固体培养基包括按照重量份计的以下组分：

阔叶树木屑60-65份，棉籽壳10-20份，麸皮15-25份，糖0.5-1.5份，石膏0.5-1.5份；

或：阔叶树木屑75-85份，麸皮15-25份，糖0.5-1.5份，石膏0.5-1.5份；

或：棉籽壳75-85份，麸皮15-25份，石膏0.5-1.5份。

4.一种蜜环菌的栽培种固体培养基，其特征在于，所述栽培种固体培养基包括按照重量份计的以下组分：

阔叶树木屑63份，棉籽壳15份，麸皮20份，糖1份，石膏1份；

或：阔叶树木屑78份，麸皮20份，糖1份，石膏1份；

或：棉籽壳79份，麸皮20份，石膏1份。

5.根据权利要求4或5所述蜜环菌的栽培种固体培养基，其特征在于，所述栽培种固体培养基含水量60-63%。

6.一种蜜环菌的封口覆盖料培养基，其特征在于，所述封口覆盖料培养基包括按照重量份计的以下组分：

阔叶树木屑40-60份，玉米面25-35份，麸皮15-22份，糖0.5-1.5份，石膏0.5-1.5份；封口覆盖料培养基含水量63-65%。

7.采用权利要求1-3任意一项所述半固体蜜环菌培养基或权利要求4-5任意一项所述的栽培种固体培养基或权利要求6任意一项所述的封口覆盖料培养基用于蜜环菌菌种的制作方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1制作；制作半固体培养基、栽培种固体培养基；

S2培养：将半固体培养基接种的原种瓶，培养满瓶后备用；

S3将栽培种固体培养基拌匀、装瓶至瓶肩以上，灌水至满瓶下渗至瓶内培养基含水量达到最大；

S4:将封口覆盖料培养基取适量，填装入步骤S3上述瓶口颈部，并按紧压实，装满瓶口，瓶盖封口、灭菌、冷却；

S5:接种：用接种棒按压瓶口覆盖料产生适当空间，用勺子挖取上述原种瓶中原种接入栽培瓶或袋中，瓶盖封口，分段培养菌种（菌丝体）；

S6:将接种的栽培种培养。

8.根据权利要求7所述蜜环菌菌种的制作方法，其特征在于，所述步骤S5：原种接种块（1.5-2.5）cm×（1.5-3）cm。

9.根据权利要求7所述蜜环菌菌种的制作方法，其特征在于，所述骤S2：半固体培养基接种的原种瓶培养基装满瓶；

S5:接种：原种接入栽培瓶或袋中，填满瓶口空隙。

10.根据权利要求7所述蜜环菌菌种的制作方法，其特征在于，所述骤S2: 原种瓶，放入15-20℃温度中，培养7-10天时，剔除感染杂菌的原种瓶，将无感杂的原种继续在23-24℃温度中培养；

所述骤S6:将接种的栽培种放入15-20℃温度中培养一周-两周，此阶段以通风透气，蒸发瓶身、瓶盖及瓶盖海绵水分为主，然后逐渐升温至23-24℃培养，20-30天左右菌丝生长至瓶肩以下时，进行全面翻选一次，或移放冷库，温度继续调控在23℃左右，在搬运移动，或翻选杂菌过程中的震动可有效加快菌丝生长，缩短10天以上培养时间，菌丝满瓶后冷库温度可调控至4-8℃保存。

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