CN114213332B

CN114213332B - 一种四氢吲唑类化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114213332B
Application number: CN202210158435.3A
Authority: CN
Inventors: 刘凯胜; 蒋宏香; 蓝妮; 周朋君; 马文辉
Original assignee: Shenzhen Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Peoples Hospital
Priority date: 2022-02-21
Filing date: 2022-02-21
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2042-02-21
Also published as: CN114213332A

Abstract

本发明实施例公开了一种四氢吲唑类化合物，及其制备方法和作为制备抗肿瘤药物的应用，其是具有以下化学结构式的化合物Ⅰ。所述化合物Ⅰ是通过将4‑(4‑酮‑3,6,6‑三甲基‑1‑四氢吲唑)‑2‑(4‑羟基环己氨基)苯甲酰胺与肼类化合物在碱性条件下混合反应得到。本发明在现有技术的基础上，研究制备出化合物Ⅰ，经证实，其相比现有技术的4‑(4‑酮‑3,6,6‑三甲基‑1‑四氢吲唑)‑2‑(4‑羟基环己氨基)苯甲酰胺化合物具有更强的抑制肿瘤细胞生长活性，具有普遍更低的IC50值，尤其可以在低浓度下显著引起结直肠癌细胞的发生凋亡，并通过将其阻滞在G0/G1期抑制细胞增殖，对于开发新型抗肿瘤药物具有重大的意义。

（Ⅰ）。

Description

一种四氢吲唑类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明药物合成技术领域，尤其涉及一种四氢吲唑类化合物及其作为抗肿瘤药物的应用。

背景技术

根据2020年WHO国际癌症研究机构发布的全球最新癌症负担数据，我国的新发癌症人数远超世界其他国家，位居全球第一。其中癌症新发病例数前十的癌症就包括肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肝癌等实体瘤，占新发癌症数的78%。此外，除了新发病例数外，我国的癌症死亡人数也位居全球第一，故如果不对癌症及时进行治疗干预措施，将对人类的生命健康和心理健康造成严重威胁。

四氢吲唑类化合物具有多种活性，尤其在作为抗肿瘤药物方面具有巨大的潜在应用价值，现有技术公开了多种四氢吲唑类化合物在抗肿瘤中具有活性，因此，其具有极大的应用前景及市场。

不同的四氢吲唑类衍生物对于不同的肿瘤细胞具有不同的活性，在现有四氢吲唑类化合物基础上进一步改进，以其获得针对特定肿瘤细胞具有特定高活性的药物，对于医学研究具有重要的意义。

发明内容

针对以上问题，本发明为现有技术提供一种四氢吲唑类化合物，经证实，其对于多种肿瘤细胞具有生长抑制活性，作为制备治疗肿瘤的药物具有极大应用价值。

本发明的技术目的通过以下技术方案实现：

本发明第一方面的技术目的是提供一种四氢吲唑类化合物，其是具有以下化学结构式的化合物Ⅰ：

（Ⅰ）

本发明第二方面的技术目的是提供上述四氢吲唑类化合物的制备方法，所述化合物通过将4-(4-酮-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺（具有以下化学结构式的化合物Ⅱ）与肼类化合物在碱性条件下混合反应得到。

（Ⅱ）

反应式如下：

进一步的，在本发明的其中一个实施方式中，所述肼类化合物为水合肼或盐酸肼。

进一步的，在本发明的其中一个实施方式中，反应中4-(4-酮-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺（化合物Ⅱ）与肼类化合物混合的摩尔比为1：1-3，优选为1：2-2.5。

进一步的，在本发明的其中一个实施方式中，所述碱性条件以向反应体系中加入有机碱或无机碱实现，作为更具体的实施方式，所述有机碱或无机碱选自醋酸钠、醋酸钾、氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种，最优选为醋酸钠。

进一步的，在本发明的其中一个实施方式中，反应中所述有机碱或无机碱按4-(4-酮-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺（化合物Ⅱ）与有机碱或无机碱的摩尔比为1：1.5-3.5，优选为1：2-3加入。

进一步的，在本发明的其中一个实施方式中，反应在有机溶剂中进行。作为更进一步的优选，所述有机溶剂选自乙醇、异丙醇和1,4-二氧六环中的一种，最优选为乙醇。

进一步的，在本发明的其中一个实施方式中，反应中有机溶剂按化合物II和溶剂的重量比为1:8-12加入。

进一步的，在本发明的其中一个实施方式中，反应的温度为50-100℃，优选反应温度为70-80℃，反应时间为5-15h，优选为10-12h。

进一步的，反应完成后，还包括将产物析出、抽滤和重结晶的过程。所述重结晶采用乙酸乙酯作为溶剂。

进一步的，所述4-(4-酮-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺（化合物Ⅱ）的获得属于现有技术，其具有多种制备方法，

优选采用以下方法制备：

1）用乙酰氯和5,5-二甲基-1,3-环己二酮反应合成5,5-二甲基-2-乙酰基1,3-环己二酮；2）用水合肼和2,4-二氟苯甲腈反应合成2-氟-4-肼基苯甲腈；3）将5,5-二甲基-2-乙酰基1,3-环己二酮和2-氟-4-肼基苯甲腈进行缩合反应得到2-氟-4-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-1-)苯甲腈；4）将2-氟-4-(-3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-1-)苯甲腈和反式4-羟基环己胺反应获得2-(4-羟基环己氨基)-4-(-3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-1-)苯甲腈；5）将2-(4-羟基环己氨基)-4-(-3,6,6-三甲基-41-氧-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-1-)苯甲腈和过氧化氢在碱性条件下反应得到目标产物4-(4-酮-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺（化合物II）。

本发明第三方面的技术目的是提供所述化合物Ⅰ在制备抗肿瘤细胞药物中的应用。

进一步的，所述肿瘤细胞包括HCT116、SW620、A549、HepG2和MDA-MB-231，优选为HCT116、SW620和HepG2。

进一步的，所述化合物抑制肿瘤细胞生长的浓度为0.1-100μM。

现有技术已经发现，4-(4-酮-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺（化合物Ⅱ）具有很好的抗病毒作用，对多种病毒，尤其对疱疹病毒I和II型，柯萨奇病毒III型（CVB3），乙肝病毒等具有很好的抗病毒活性。本发明通过进一步的研究发现，4-(4-酮-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺的腙衍生物（4-(4-腙-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺，即本发明的化合物Ⅰ）对多种肿瘤细胞的生长具有很强的抑制作用，其作用效果显著优于4-(4-酮-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺（化合物Ⅱ）。

实施本发明实施例，将具有如下有益效果：

本发明在现有技术的基础上，对4-(4-酮-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺（化合物Ⅱ）进行改进，研究制备出其衍生物：4-(4-腙-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺（化合物Ⅰ），经证实，本发明的化合物相比现有技术的4-(4-酮-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺化合物具有更强的抑制肿瘤细胞生长活性，具有更低的IC50值，尤其可以在低浓度下显著引起结直肠癌细胞的发生凋亡，并通过将其阻滞在G0/G1期抑制细胞增殖，这对于开发新型抗肿瘤药物具有重大的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

其中：

图1为实施例3中测定的实施例1制备的化合物Ⅰ作用于不同肿瘤细胞的存活率曲线，其中（a）为HCT116细胞，（b）为SW620细胞，（c）为A549细胞，（d）为HepG2细胞，（e）为MDA-MB-231细胞。

图2为实施例4中测定的化合物Ⅰ对应的HCT116细胞和SW620细胞凋亡实验结果。

图3为实施例4中测定的化合物Ⅰ对应的HCT116细胞和SW620细胞凋亡周期实验结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

首先，在以下实施例中，使用了化合物Ⅱ（4-(4-酮-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺）作为反应物，化合物Ⅱ通过以下步骤制备：

1）将乙酰氯（化合物1）和5,5-二甲基-1,3-环己二酮（化合物2）反应合成5,5-二甲基-2-乙酰基1,3-环己二酮（化合物3）；接着用水合肼（化合物4）和2,4-二氟苯甲腈（化合物5）反应合成2-氟-4-肼基苯甲腈（化合物6）；然后将5,5-二甲基-2-乙酰基1,3-环己二酮（化合物3）和2-氟-4-肼基苯甲腈（化合物6）进行缩合反应得到2-氟-4-(3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-1-)苯甲腈（化合物7），再将2-氟-4-(-3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-1-)苯甲腈（化合物7）和反式4-羟基环己胺（化合物8）反应获得2-(4-羟基环己氨基)-4-(-3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-1-)苯甲腈（化合物9），最后将2-(4-羟基环己氨基)-4-(-3,6,6-三甲基-4-氧-4,5,6,7-四氢-1H-吲唑-1-)苯甲腈（化合物9）和过氧化氢在碱性条件下反应得到目标产物（4-(4-酮-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺）（化合物II）。其反应式如下：

实施例1

采用上述制备的4-(4-酮-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺（化合物Ⅱ）制备本发明的化合物Ⅰ，方法如下：

取4-(4-酮-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺（2.0g，4.87mmol,1eq）溶解于20mL的乙醇中，加入盐酸肼（0.73g,10.6mmol,2.2eq）和醋酸钠（0.80g,9.7mmol,2eq）在80℃反应10h，冷却后析出固体，抽滤，得到淡黄色固体，用乙酸乙酯重结晶得到1.86g产物，产率为90%，熔点283.5-285.0℃。产物为所述化合物Ⅰ，合成反应式如下：

1H NMR (500 MHz, DMSO) δ (ppm) 8.37 (d, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.70 (d,1H), 7.15 (s, 1H), 6.62-6.72 (m, 2H), 5.96 (s, 2H), 4.59 (s, 1H), 2.74 (s,2H), 2.38 (s, 3H), 2.29 (s, 2H), 2.01 (d, 2H), 1.84 (d, 2H), 1.29 (m, 5H),0.98 (d, 7H); 13C NMR (126 MHz, DMSO) δ (ppm) 171.57, 150.12, 145.98, 142.92,142.03, 140.27, 130.85, 116.16, 111.85, 107.88, 104.86, 68.55, 37.36, 36.45,33.89, 32.86 (2C), 30.64, 28.82 (2C), 14.99 (2C)。

实施例2

取4-(4-酮-3,6,6-三甲基-1-四氢吲唑)-2-(4-羟基环己氨基)苯甲酰胺（2.0g，4.87mmol,1eq）溶解于20mL的乙醇中，加入85%的水合肼（0.46g,14.6mmol,3eq）和醋酸钠（1.19g,14.6mmol,3eq）搅拌加热在80℃反应10h，冷却后析出固体，抽滤，得到淡黄色固体，用乙酸乙酯重结晶得到1.98g产物，产率95.5%，熔点284.5-286.0℃。HPLC分析产物和实施例1的产物一致，产物为所述化合物Ⅰ。

实施例3

各化合物抑制肿瘤细胞的生长曲线及IC50值测定：

（1）选用HepG2、MDA-MB-231、Sw620、A549和Hct116为待实验肿瘤细胞，HepG2和MDA-MB-231细胞株的培养条件为添加10% FBS的DMEM培养基，Sw620和A549细胞株的培养条件为添加10% FBS的RPMI1640培养基，Hct116细胞株的培养条件为添加10% FBS的McCoy‘s5A培养基。所有细胞株均在含5% CO₂的37℃培养箱中培养。用96孔板测定细胞活力和生长。

（2）待细胞贴壁生长后，分别向各孔内加入不同浓度的实施例1制备的化合物Ⅰ、化合物Ⅱ和GA（格尔德霉素），作为实验组，不添加任何药物的作为对照组，分别培养24h和/或48h，然后每孔加10μLCCK8培养2h后，在450nm处用酶标仪检测吸光度值，按下式计算存活率：

存活率＝[(实验组吸光度-空白孔吸光度)/(对照组吸光度-空白孔吸光度)]×100%

用GraphPadPrism8绘制药物浓度对应细胞存活率的拟合曲线，化合物Ⅰ对应的细胞存活率曲线如图1所示，说明本发明的化合物Ⅰ对HCT116、SW620、A549、HepG2和MDA-MB-231细胞活力具有浓度依赖性和时间依赖性的抑制作用。

（3）48h后，化合物Ⅰ、化合物Ⅱ和GA抑制以上肿瘤细胞活性的IC50数值测定结果如表1所示。

表1

化合物	Hct116	Sw620	A549	HepG2	MDA-MB-231
						化合物Ⅰ/nM	137.9	274.7	241.0	322.7	818.7
化合物Ⅱ/nM	595.1	1064	266.8	1300	1171
						GA/nM	13.33	46.71	3.425	39.41	14.99

由表1可见，化合物Ⅰ比化合物Ⅱ的抗肿瘤活性强，尤其是对结直肠癌HCT116、SW620和HepG2胞株活性的抑制作用显著提高。

实施例4

在实施例3的基础上，为进一步验证化合物Ⅰ对结直肠癌细胞的生长和存活具有确实的影响，采用流式分析仪检测细胞凋亡和细胞周期。

（1）细胞凋亡实验

Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡实验原理：Annexin Ⅴ（膜联蛋白 V）能与PS高亲和力结合，将Annexin V 进行荧光素FITC标记，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶（Propidium, PI）为一种可与DNA结合的染料，其不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以在凋亡中晚期的细胞和死细胞透过细胞膜而使细胞核红染。

具体方法：将消化后的HCT116细胞制备成均匀的单细胞悬液，使细胞密度调整成15w个/孔；取6孔板，每孔接种2mL细胞悬液，放入含5% CO2的37℃培养箱中培养。24h后，细胞贴壁，以含10% FBS的培养基配置化合物Ⅰ作为药物工作液后给药，处理24h和48h。收集上清和细胞到离心管中，离心后用PBS重悬清洗一遍，离心后去上清，后加入500μL的BindingBuffer悬浮细胞，先后加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI染料，混匀，用流式细胞仪检测细胞凋亡。Sw620的凋亡实验同上；Q1：左上象限（Annexin V^-/PI^＋）可能是细胞碎片或其他原因导致的死亡细胞；Q2：右上象限（Annexin V^＋/PI^＋）为晚期凋亡细胞；Q3：右下象限（Annexin V^＋/PI^-）为早期凋亡细胞；Q4：左下象限（Annexin V^-/PI^-）为正常活细胞。凋亡实验结果如图2所示，图2看出，经化合物Ⅰ处理24h和48h后，Q2和Q3区域的细胞明显增加，表明化合物Ⅰ可以显著增加HCT116和SW620的细胞凋亡。

（2）细胞周期测定

PI染色检测细胞周期实验具体方法：用胰酶消化HCT116细胞后制备成均匀的单细胞悬液，接种15w个/孔接种到6孔板中，放入含5% CO2的37℃培养箱中培养。24h后，细胞贴壁，以含10% FBS的培养基配置化合物Ⅰ作为药物工作液后给药，处理24h和48h。收集上清和细胞到离心管中，离心后用PBS重悬清洗一遍，离心后去上清，加入75%预冷的乙醇重悬，4℃固定过夜，次日离心弃乙醇，PBS重悬清洗一遍，离心后去上清，后加入500μL的含10%RNaseA的PI染料重悬，避光孵育0.5-1h，用流式细胞仪检测细胞周期。细胞周期结果图如图3所示，G0/G1、G2/M、S三期在图中已经标示，化合物Ⅰ可以分别在作用48h和24h后引起HCT116细胞和SW620细胞周期阻滞在G0/G1期。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims

1.一种四氢吲唑类化合物，其特征在于，其是具有以下化学结构式的化合物Ⅰ：

Ⅰ。

2.权利要求1所述的四氢吲唑类化合物的制备方法，其特征在于，是通过将具有以下化学结构式的化合物Ⅱ与肼类化合物在碱性条件下混合反应得到；

Ⅱ。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述肼类化合物为水合肼或盐酸肼。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，反应中化合物Ⅱ与肼类化合物的摩尔比为1：1-3。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，反应在选自乙醇、异丙醇和1,4-二氧六环中的一种有机溶剂中进行。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述碱性条件以向反应体系中加入选自醋酸钠、醋酸钾、氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种实现。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，反应的温度为50-100℃，反应时间为5-15h。

8.权利要求1所述的四氢吲唑类化合物在制备抗肿瘤细胞药物中的应用；所述肿瘤细胞选自HCT116、SW620、A549、HepG2和MDA-MB-231。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述四氢吲唑类化合物抑制肿瘤细胞生长的浓度为0.1-100μM。