CN107456457B - 2-(3, 4-二羟苯基)-5, 7-二羟苯基-8-(1, 4氧氮己烷-4-亚甲基)-4h-色烯-4-酮化合物在制备治疗癌症药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种化合物名称为：2‑(3,4‑二羟苯基)‑5,7‑二羟苯基‑8‑(1,4氧氮己烷‑4‑亚甲基)‑4H‑色烯‑4‑酮治疗癌症的新用途，属于医药领域。本发明提供的化合物经过体外以代表肿瘤发生发展的14类肿瘤细胞系为载体，以顺铂为阳性对照药，分别对化合物进行了肿瘤细胞生长抑制的实验、相应肿瘤的IC50测定实验、对正常细胞的毒性实验。显示出该化合物对人原位胰腺腺癌细胞BxPC‑3，人急性髓细胞白血病细胞MV‑4‑11和人胃癌细胞AGS的增殖活性有显著抑制作用，作用与阳性药顺铂相当，且对检测的正常细胞毒性远小于肿瘤细胞，初步明确该化合物的抗肿瘤活性。
Description
技术领域
本发明属于木犀草素衍生物的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用，属于有机合成领域。
背景技术
癌症是严重危害人类健康的主要疾病之一，攻克癌症一直是世界瞩目的研究课题。世界卫生组织调查表明癌症患者正在逐年增加，我国癌症每年发病人数在120 万左右，每年死于癌症的人数高达90 万人以上，现已成为仅次于心脑血管病的第二大杀手。癌症虽极具杀伤力且治愈率很低，但是商机巨大。目前癌症治疗药物不足，市场需求很大。2010年美国癌症治疗费用高达1250亿美元，据美国国立卫生研究院统计，2020年将增至2070亿美元。目前市场上主要有的或者正在开发的品种有：金属抗癌药物，天然产物中提取抗癌活性成分，抗癌药物靶向制剂，基因工程药物，纳米技术的应用等，但还是未摆脱癌症难治的困境。
木犀草素属于黄酮（flavones）类植物化学物，主要存在于金银花、菊花、荆芥、白毛夏枯草等药物中，以及百里香、芽甘蓝、洋白菜、菜花、甜菜、椰菜和胡萝卜等蔬菜中，而且以糖甙的形式分布于多种植物中，如芹菜、青辣椒、紫苏叶等。木犀草素纯品为黄色结晶状粉末，微溶于水、溶于碱溶液，正常条件下稳定。其化学名为3’, 4’, 5, 7-四羟基黄酮，分子式为C15H10O6， CAS号：491-70-3。木犀草素的抗肿瘤机制既可直接作用于肿瘤细胞，干扰其细胞代谢，抑制其细胞生长，诱导细胞凋亡；还可通过增强机体的免疫功能抑制血管内皮细胞的生长，减少肿瘤组织血管的生成，抑制肿瘤的转移，提高放、化疗的疗效和化学预防作用，是一种很有前途的潜在抗肿瘤药物。
发明内容
为了对木犀草素进一步更好的开发利用，本发明以木犀草素为先导化合物，进行结构改造和药理活性筛选，发现2-(3, 4-二羟苯基)-5, 7-二羟苯基-8-(1, 4氧氮己烷-4-亚甲基)-4H-色烯-4-酮具有较强抗癌细胞作用，该化合物有抗流感H1N1的文献报道，但无合成路线及抗癌研究报道，我们合成该化合物后用盐酸成盐测试，其溶解度有较大提高，在水，葡萄糖水中可达4mg/ml，且对正常细胞毒性低于肿瘤细胞。
本发明保护的技术内容是化合物：2-(3, 4-二羟苯基)-5, 7-二羟苯基-8-(1, 4氧氮己烷-4-亚甲基)-4H-色烯-4-酮在制备治疗癌症药物中的应用。该化合物的化学式为：C20H19NO7；分子量为：385；结构式如下：
该化合物的合成方法为：称取木犀草素14.25g加入反应瓶中，加入1-2L甲醇或乙醇搅匀；加入木犀草素1-2倍摩尔量甲醛溶液搅拌，滴加0.8-1.5倍量吗啡啉，保持温度0-63℃反应1-24h；过滤，收集滤饼，用甲醇或乙醇等溶剂洗涤或重结晶，过滤，干燥，既得；
为了增加溶解度和活性，该化合物可以制成盐，反应如下：
盐酸反应：
硫酸反应：
磷酸反应：
本化合物制成盐所用酸除了盐酸、硫酸、磷酸外，还可以是甲酸、乙酸，氨基酸等；所得样品也可以包括各种水合物、晶型的制备；如将5g样品加到50mL水中，用盐酸调PH2溶解后滤过，在滤液中加50-200mL乙醇，结晶析出黄色粉末；再用适量甲醇回流制备过饱和液滤过，滤液冷却析晶则得黄色针状晶体。
本化合物的制剂剂型为片剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、混悬剂或注射剂；
本发明所述癌症包括乳腺癌、食管癌、宫颈癌、骨肉瘤、肺癌、前列腺癌、结肠癌、肝癌、胶质瘤、卵巢癌、宫颈癌、黑色素瘤、喉癌、甲状腺癌中的一种或多种；
本发明化合物治疗癌症优选为胰腺腺癌；
本发明化合物治疗癌症还优选为胃癌；
本发明化合物治疗癌症还优选为白血病；
本发明化合物的合成路线如下：
为了证实2-(3, 4-二羟苯基)-5, 7-二羟苯基-8-(1, 4氧氮己烷-4-亚甲基)-4H-色烯-4-酮(该化合物以下简称“31b”)治疗癌症的效果，用实施例1得到的31b化合物进行如下试验研究
一、研究目的
以顺铂为阳性对照药，采用MTS方法检测黄酮类化合物31b对体外培养的肿瘤细胞（14株）及正常细胞（大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC-12、大鼠心肌细胞H9c2、人肾上皮细胞293T、人肝细胞LO2和人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞）的增殖抑制活性，初步明确该化合物的抗肿瘤活性。
二、实验材料
1.供试品
1.1 名称：2-(3, 4-二羟苯基)-5, 7-二羟苯基-8-(1, 4氧氮己烷-4-亚甲基)-4H-色烯-4-酮(该化合物以下简称“31b”)。
对照药
2.1 名称：顺铂。
2.2临床适应证：顺铂临床用于卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、头颈部鳞癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤治疗，均能显示疗效。
2.3 来源和批号：顺铂（Cisplatin）：购于中国药品生物制品检定所，产品批号：100401-200501，分子量为300.65D
3.细胞种类
3.1 名称：
人宫颈癌细胞Hela 人非小细胞肺癌细胞A549
人胃腺癌细胞AGS 人乳腺癌细胞MCF7
人肝癌细胞SMMC-7721 人转移胰腺癌细胞AsPC-1
人前列腺癌细胞DU145 人食管癌细胞TE-1
人结肠癌细胞HCT116 人骨肉瘤细胞U-2 OS
人卵巢癌细胞SK-OV-3 人神经胶质瘤细胞U-251
人原位胰腺腺癌细胞BxPC-3 人急性髓细胞白血病细胞MV-4-11
大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC-12 大鼠心肌细胞H9c2
人肾上皮细胞293T 人肝细胞LO2
人胚肺成纤维细胞MRC-5
3.2 来源：细胞均购自上海细胞生物学研究所。
主要仪器设备
5.主要试剂
三、实验方法
1.主要溶液配制：
1.1 黄酮类化合物31b
化合物溶于DMSO中，配制成30 mM的母液，-80℃保存备用。用前无血清培养基稀释。
1.2 阳性对照药：
顺铂溶于无菌水中，配制成30 mM的母液，过滤除菌，-80℃保存备用。用前无血清培养基稀释。
细胞培养：
从液氮中迅速取出装有细胞的冻存管，立即放入37℃水浴快速解冻约1min，700rpm离心3min，75%酒精擦试冻存管后，移入超净工作台，去除冻存液，加入含10%胎牛血清的完全培养液，吹打均匀后转入培养皿，置于37℃、5% CO2恒温细胞培养箱内培养。倒置显微镜下观察细胞生长融合至80%左右时，按1:2～1:3比例传代。取传代后生长状态良好的细胞用于实验。
实验分组及干预方法：
取对数生长期细胞，接种于细胞培养板中（贴壁细胞密度6×104个/mL，悬浮细胞密度2×105个/mL），待细胞融合至60%时弃去旧培养基，将细胞分为以下几组（每组平行设置4个复孔）：
（1）正常对照组：用含10%胎牛血清的培养基继续培养。
（2）溶剂对照组：加入含1%溶剂及10%胎牛血清的培养基孵育。
（3）药物组：加入含相应药物浓度及10%胎牛血清的培养基孵育。
实验结束（孵育72 h）后，弃去旧培养基，各孔加入100 µL含有MTS检测试剂的培养基（悬浮细胞不用弃去旧培养基，直接向96孔板中加入20 µL MTS检测试剂），37℃孵育1-4h后检测OD490，以OD650值作为参考。实验操作严格按照MTS试剂检测说明书进行。
四、数据处理
细胞增殖抑制率按下式计算：抑制率(%)=(1- 实验组OD值/正常对照组值/溶剂对照组OD值)×100％。结果以（±s）表示，采用GraphPad Prism软件进行绘图并计算出IC50值。
五、实验结果
1. 黄酮类化合物31b抗肿瘤增殖活性初步筛选（抑制率）
1.1 黄酮类化合物31b对肿瘤细胞生存活性的抑制作用
实验结果如图1，表1所示：黄酮类化合物31b 10μM处理组对人原位胰腺腺癌细胞BxPC-3、人急性髓细胞白血病细胞MV-4-11和人胃癌细胞AGS的抑制率大于50%。
2．黄酮类化合物31b及阳性药抗肿瘤细胞增殖的IC50值测定
2.1 黄酮类化合物31b抗人原位胰腺腺癌细胞BxPC-3增殖的IC50值测定
实验结果如表2所示：黄酮类化合物31b、顺铂对BxPC-3细胞的IC50值分别为4.72 µM、4.02 µM。
2.2 黄酮类化合物31b抗人急性髓细胞白血病细胞MV-4-11增殖的IC50测定
实验结果如表3所示：黄酮类化合物31b、顺铂对MV-4-11细胞的IC50值分别为3.23µM、3.07 µM。
2.3 黄酮类化合物31b抗人胃癌细胞AGS增殖的IC50测定
实验结果如表4所示：黄酮类化合物31b、顺铂对AGS细胞的IC50值分别为4.97 µM、5.73 µM。
3. 黄酮类化合物31b对正常细胞增殖抑制活性的IC50测定
实验结果如表5所示：黄酮类化合物31b对大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC-12、大鼠心肌细胞H9c2、人肾上皮细胞293T、人胚肺成纤维细胞MRC-5和人肝细胞LO2细胞增殖抑制活性的IC50分别为20.92 µM、23.99 µM、29.00 µM、36.46 µM、21.94 µM。
六、结论与讨论
实验结果表明，黄酮类化合物31b对肿瘤细胞的增殖抑制活性具有一定的选择性，对肿瘤细胞BxPC-3、 MV-4-11和AGS的增殖活性抑制作用最为显著，且31b对检测的正常细胞毒性较小。
附图说明
图1： 31b对Hela肿瘤细胞的增殖抑制作用
图2： 31b对A549肿瘤细胞的增殖抑制作用
图3： 31b对AGS肿瘤细胞的增殖抑制作用
图4： 31b对MCF7肿瘤细胞的增殖抑制作用
图5： 31b对SMMC-7721肿瘤细胞的增殖抑制作用
图6： 31b对AsPC-1肿瘤细胞的增殖抑制作用
图7： 31b对DU145肿瘤细胞的增殖抑制作用
图8： 31b对TE-1肿瘤细胞的增殖抑制作用
图9： 31b对HCT116肿瘤细胞的增殖抑制作用
图10： 31b对U-2 OS肿瘤细胞的增殖抑制作用
图11： 31b对SK-OV-3肿瘤细胞的增殖抑制作用
图12： 31b对U-251肿瘤细胞的增殖抑制作用
图13： 31b对BxPC-3肿瘤细胞的增殖抑制作用
图14： 31b对MV-4-11肿瘤细胞的增殖抑制作用
图15：31b对人原位胰腺腺癌细胞BxPC-3的增殖抑制作用
图16：31b对人急性髓细胞白血病细胞MV-4-11的增殖抑制作用
图17：31b对人胃癌细胞AGS的增殖抑制作用
图18：31b对正常细胞的增殖抑制作用
图19：实施例1合成的化合物MS图
图20：实施例1合成的化合物MS2图谱
实施例1
称木犀草素14.25g加入反应瓶中，加入1.5L甲醇搅匀；加入木犀草素1.5倍mol量甲醛溶液搅拌，滴加0.98倍mol量吗啡啉，保持温度25℃反应8h；过滤，收集滤饼，用甲醇1L，0.5L分别洗涤1次，过滤，干燥得31b化合物， 纯度99%，收率86%。按照片剂的常规方法，加入适量辅料制备成片剂剂型。
化合物的合成路线：
化合物的结构鉴定：
负离子模式MS/MS2鉴定：质谱图给出m/z 769的离子峰，推测m/z 769为[2M-H]-离子峰， m/z 384为其准分子离子峰[M-H]-；对m/z进行MS2分析， MS2谱中有m/z 298[M-H-C4H8NO]-，m/z 256[M-H-C6H5O2-H2O]-，161[M-H-C4H8ON-C6H5O2-H2O]-，133[M-H-C4H8ON-C6H5O2-H2O-CO]-的碎片离子，推测化学组成为C20H19NO7。
核磁鉴定：
1HNMR(600MHz, DMSO—d 6)δ: 2.56(4H, s, H-2″, H-6″) ，3.60(4H, s, H-3″,H-5″)，3.84(2H, s, H-11)，6.23 (1H, s, H-6)，6.70(1H, s, H-3′)，6.90(1H, d, H-5′)，7.5(2H, m, H-2′H-6′)；13CNMR(600MHz, DMSO—d6)δ: 181.9 (C-4)，163.8 (C-5)，163.6 (C-7)，160.4(C-4′)，155．1 (C-5)，149.7(C-3′)，140.8(C-4′)，155.1(C-5)，121.7(C-6′)，119.0(C-1′)，116.0 (C-2′)，113.4 (C-5′)，103.5 (C-3)，102.6 (C-10)，100.7(C-8)，98.6 (C-6)，66.1 (C-3″,C-5″)，52.7(C-2″,C-6″)，40 (C-11)。
结合化学反应理论推测，鉴定该化合物为2-(3, 4-二羟苯基)-5, 7-二羟苯基-8-(1, 4氧氮己烷-4-亚甲基)-4H-色烯-4-酮。
成盐反应：称量以上得到的31b样品1g ，加入10mL水搅匀，在25℃以下较快速滴加1-2倍mol量盐酸使其溶解，虑过，滤液在搅拌下加入10～30mL乙醇，然后放置析出晶体，虑过收集晶体即得。
实施例2
称木犀草素14.25g加入反应瓶中，加入2L乙醇搅匀；加入木犀草素1.5倍mol量甲醛溶液搅拌，滴加0.9倍mol量吗啡啉，保持温度25℃反应8h；过滤，收集滤饼，用乙醇1L，0.5L分别洗涤1次，过滤，干燥得31b样品，99%，收率73%。按照胶囊剂的常规方法，加入适量辅料制备成胶囊剂剂型。
实施例3
称木犀草素14.25g加入反应瓶中，加入2L甲醇搅匀；加入木犀草素1.2倍mol量甲醛溶液搅拌，滴加1倍mol量吗啡啉，保持温度63℃反应1h；过滤，收集滤饼，用甲醇重结晶过滤，干燥得31b样品，收率60%。按照颗粒剂的常规方法，加入适量辅料制备成颗粒剂剂型。
Claims (5)
1.化合物：2-(3, 4-二羟苯基)-5, 7-二羟苯基-8-(1, 4氧氮己烷-4-亚甲基)-4H-色烯-4-酮在制备治疗胰腺腺癌、急性髓细胞白血病药物中的应用，所述化合物结构式如下：
。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述化合物的合成方法为：称取木犀草素14.25g加入反应瓶中，加入1-2L甲醇或乙醇搅匀；加入木犀草素1-2倍摩尔量的甲醛溶液搅拌，滴加0.8-1.5倍量的吗啡啉，保持温度0-63℃反应1-24h；过滤，收集滤饼，用甲醇或乙醇溶剂洗涤或重结晶，过滤，干燥，既得。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述化合物与酸反应制成盐类化合物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述酸包括盐酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸，或氨基酸中的一种或多种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述化合物的制剂剂型为片剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、混悬剂或注射剂。
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