CN114081114A - 一种具有调节肠道菌群作用的透明质酸钠饮料及其制备方法 - Google Patents
一种具有调节肠道菌群作用的透明质酸钠饮料及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有调节肠道菌群作用的透明质酸钠饮料及其制备方法，属于食品饮料技术领域。本发明以透明质酸钠为主要原料调配出具有调节肠道菌群功效的饮料，所用原辅料为药食同源原料及普通食品配料，不仅成分简单，生产成本低，而且安全有效，可长期饮用，且长期饮用具有调节肠道菌群，促进益生菌生长的功效。
Description
技术领域
本发明属于饮料技术领域，具体而言，涉及一种具有调节肠道菌群作用的透明质酸钠饮料及其制备方法。
背景技术
肠道菌群是定值在人体胃肠道的微生物的总称，研究发现肠道菌群不仅在宿主代谢活动及免疫调节中发挥着重要的作用，在疾病的发生及防御过程中也是重要参与者。透明质酸钠作为一种新资源食品原料，在食品领域掀起了一股热潮，其具有多种生理功效，如延缓衰老、美容保湿和增强免疫等多种功能。随着人们生活水平和保健意识的不断提高，兼具口感及生物活性的功能性饮料越来越受消费者的欢迎。
CN113598251A公开了一种添加透明质酸钠的果茶饮料及其制备方法，包括以下比例的组分：茶汤10％～70％、果汁1％～60％、维生素C或异抗坏血酸钠0.00％～0.3％、酸0.05％～0.3％、糖0.01％～20％、水10％～70％、透明质酸钠0.005％～0.02％、胶0.00％～0.4％。
CN112998176A公开了一种补水美白的固体饮料及其制备方法，包括鱼胶原蛋白肽40～60％、低聚果糖20～40％、蓝莓果粉15～25％、透明质酸钠0.1～0.5％、维生素C 0.05～0.2％。
CN107156551A公开了一种具有抗氧化和改善皮肤状态功效的饮料，由西红花、雪莲、黄精、枸杞、雨生红球藻混合提取物、鱼胶原蛋白、透明质酸钠、维生素E、维生素C、白藜芦醇、甜味调节剂、酸味调节剂、果汁和纯净水组成。
通过检索发现，虽然已有文献披露了含有透明质酸钠的饮料，然而现有的含透明质酸钠的饮料没有调节肠道菌群作用，同时存在原辅料种类多和生产工艺复杂的问题，从而不利于降低成本。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有调节肠道菌群作用的透明质酸钠饮料，以解决已有的饮料没有调节肠道菌群作用，同时存在原辅料种类多和生产工艺复杂的问题。
为了实现上述技术目的，本发明人结合自己多年来在食品饮料加工领域的技术经验，并通过大量试验研究筛选，最终获得了如下技术方案：
一种具有调节肠道菌群作用的透明质酸钠饮料，该饮料中原辅料的质量百分比为：透明质酸钠0.03％，白砂糖4.5％，柠檬酸1.0％，维生素C 0.05％，碳酸氢钠0.03％，调味剂0.02～0.05％，余量为纯化水。
进一步优选地，如上所述具有调节肠道菌群作用的透明质酸钠饮料，其中的透明质酸钠的分子量为100～150万Da。
再进一步优选地，如上所述具有调节肠道菌群作用的透明质酸钠饮料，其中的透明质酸钠的分子量为120万Da。
再进一步优选地，如上所述具有调节肠道菌群作用的透明质酸钠饮料，其中的调味剂为食用香精。
另外，本发明还提供了一种上述具有调节肠道菌群作用的透明质酸钠饮料的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)预处理：称取透明质酸钠粉末加入纯化水，搅拌2h，至透明质酸钠完全溶解即得透明质酸钠溶液；
(2)调配:将白砂糖、柠檬酸、维生素C、碳酸氢钠和调味剂加入透明质酸钠溶液中，用纯化水定容后混匀；
(3)过滤：用200目滤网过滤，以除去部分不溶性杂质；
(4)脱气：过滤后进行脱气处理；
(5)杀菌：采用超高压瞬时灭菌设备进行杀菌；
(6)灌装：灭菌后进行塑料瓶灌装。
实验显示，灌胃本发明配制的饮料后小鼠肠道的益生菌丰度呈现增加趋势，同时可有效增加菌群的物种多样性，可有效调节小鼠肠道菌群，促进菌群平衡。因此，本发明还提供了上述透明质酸钠饮料在制备增加肠道菌群物种多样性和益生菌丰度的食品中的应用，以及上述透明质酸钠饮料在制备清除人体自由基的食品中的应用。所述的人体自由基包括DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基。
与现有技术相比，本发明以透明质酸钠为主要原料调配出具有调节肠道菌群功效的饮料，所用原辅料为药食同源原料及普通食品配料，不仅成分简单，生产成本低，而且安全有效，可长期饮用，且长期饮用具有调节肠道菌群，促进益生菌生长的功效。
说明书附图
图1：D-葡萄糖醛酸标准曲线。
图2：pH值对透明质酸钠稳定性的影响；透明质酸钠的含量采用均值±标准差表示，不同字母符号表示差异显著(p<0.05)。
图3：不同pH值下透明质酸钠溶液对DPPH自由基的清除率。
图4：不同pH值下透明质酸钠溶液对超氧阴离子自由基的清除率，超氧阴离子自由基清除率采用均值±标准差表示，不同字母符号表示差异显著(p<0.05)。
图5：不同pH值下透明质酸钠溶液对羟基自由基的清除率，羟基自由基清除率采用均值±标准差表示，不同字母符号表示差异显著(p<0.05)。
图6：不同pH值下透明质酸钠溶液黏度随剪切速率的变化。
图7：不同浓度下透明质酸钠溶液黏度随剪切速率的变化。
图8：不同浓度透明质酸钠溶液对DPPH自由基的清除率，DPPH自由基清除率采用均值±标准差表示，不同字母符号表示差异显著(p<0.05)。
图9：不同浓度透明质酸钠溶液对超氧阴离子自由基的清除率，超氧阴离子自由基清除率采用均值±标准差表示，不同字母符号表示差异显著(p<0.05)。
图10：不同浓度透明质酸钠溶液对羟基自由基的清除率，羟基自由基清除率采用均值±标准差表示，不同字母符号表示差异显著(p<0.05)。
图11：碳酸氢钠的添加量对感官评分的影响。
图12：白砂糖的添加量对感官评分的影响。
图13：柠檬酸的添加量对感官评分的影响。
图14：维生素C的添加量对感官评分的影响。
图15：稀释性曲线分布图。
图16：Shannon曲线图。
图17：Rank-Abundance曲线图。
图18：各水平上肠道菌群组成(依次为A、B、C；其中A为门水平；B为科水平；C为属水平)。
图19：主成分分析图，注：X轴和Y轴表示两个选定的主坐标轴，百分比表示主坐标轴对样本组成差异的解释度值；X轴和Y轴的刻度是相对距离，无实际意义。
图20：Beta多样性聚类分析图。
具体实施方式
以下采用实施例进一步描述本发明方法的实施过程和有益效果，试验例仅用于例证的目的，不限制本发明的保护范围，同时本领域普通技术人员根据实施例所做的显而易见的改变也包含在本发明范围之内。
实施例1：保健饮料配方优化
1.pH值对透明质酸钠溶液的影响：
将透明质酸钠(分子量120万Da)溶液用柠檬酸以及氢氧化钠调配成pH值为2，4，6，8，10，12的溶液后进行如下实验。
1.1透明质酸钠含量的测定
参考Bitter-Muir氏法测定饮料中D-葡萄糖醛酸的含量，进一步得到透明质酸钠的含量。
(1)实验前溶液的配制
硼砂硫酸溶液：精确称取四硼酸钠4.77g溶于500ml分析纯浓硫酸中。
葡萄糖醛酸标准溶液：精确称取分析纯葡萄糖醛酸20mg，加水定容至100ml容量瓶中。
咔唑试剂：精确称取咔唑粉末0.125g溶于100ml分析纯无水乙醇中。
(2)D-葡萄糖醛酸的标准曲线的绘制
分别量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的葡萄糖醛酸标准溶液加入试管中，加水至1ml，得到浓度为0.022、0.044、0.066、0.088、0.11mg/ml的葡萄糖醛酸对照品溶液，取6个具塞试管分别加入5mL硼砂硫酸溶液置于冰浴条件下冷却至4℃左右。然后依次加入空白溶液和不同浓度的葡萄糖醛酸对照品溶液各1mL于试管中，在冰浴的条件下先轻微震荡后充分混匀。将试管沸水浴10min后置于冷水中冷却至室温，分别加入咔唑试剂0.2mL混匀，再经过沸水浴15min后，冷却至室温。530nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，作出D-葡萄糖醛酸标准曲线并求出回归方程。
由图1的线性回归方程y＝16.087x+0.0894,R2＝0.9991可知D-葡萄糖醛酸在0-0.06mg/ml浓度范围内呈现良好的线性关系。
(3)不同pH值下样品的透明质酸钠的含量
分别取1ml样品于试管中，方法同上测定样品中透明质酸钠的含量。
1.2抗氧化活性的测定
(1)DPPH自由基清除测定
吸取2.0×10-4mol/l的DPPH乙醇溶液3ml于试管中，再加入无水乙醇3ml混匀，避光反应30min后于517nm处测定其吸光值，记为A0。分别吸取不同pH值的样品溶液3ml，加入DPPH乙醇溶液3ml混匀，避光反应30min后于517nm处测定其吸光值，记为A1。分别吸取不同pH值的样品溶液3ml，加入无水乙醇溶液3ml混匀，避光反应30min后于517nm处测定其吸光值，记为A2。用下式计算DPPH自由基的清除率(％)：
清除率(％)＝(1-(A1-A2)/A0)×100％
(2)超氧阴离子自由基清除测定
吸取pH8.0的0.05mol/l的磷酸盐缓冲溶液4.5ml于试管中，将试管置于25℃水浴条件下恒温加热20min，而后在25℃水浴条件下分别加入1ml样液和0.4ml25mmol/l的邻苯三酚溶液，混匀后反应5min，加入1ml80mmol/l的HCl终止反应，摇匀反应3min后在波长420nm处测定吸光值记为A1，同样方法不添加邻苯三酚后进行测定，记录吸光值为A2，用蒸馏水做空白对照进行测定，记录吸光值为A3。用下式计算超氧阴离子自由基的清除率(％)：
清除率(％)＝(1-(A1-A2)/A3)×100％
(3)羟自由基清除测定
25ml容量瓶中依次加入6mmol/lFeSO4溶液2ml，样液2ml，6mmol/LH2O2溶液2ml静置10min后加入6mmol/l的水杨酸-乙醇溶液2ml，定容至25ml，充分摇匀反应后于37℃水浴加热60min后取出，静置10min于波长520nm处测吸光度值记为As，空白管以蒸馏水代替样液，操作方法同上，记录空白管的吸光值为Ac。用下式计算羟自由基的清除率(％)：
清除率(％)＝(Ac-As)/Ac×100％
1.3流变学特性的测定
吸取不同pH值的样品溶液于流变仪的样品板上，进行稳态粘度的测定，以剪切速率为横坐标，粘度为纵坐标绘制散点图。
2.原辅料添加量对饮料品质的影响：
以感官评分，稳态黏度及抗氧化活性为指标，设置不同梯度，绘制图表，进行单因素及正交实验，综合考虑选择最优的饮料配方。
2.1透明质酸钠的添加量对饮料品质的影响
设置透明质酸钠的添加量为0.01％(以100ml水计)、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％，白砂糖的添加量为4.5％，柠檬酸的添加量为0.1％，维生素C的添加量为0.05％，碳酸氢钠的添加量为0.03％，食用香精的添加量为0.03％。设置透明质酸钠添加量单因素试验进行抗氧化活性、流变学特性和感官评分的测定。
感官评分的测定方法为：经感官培训后，选8名食品专业的学生参与感官评分，参与感官评定的学生独立进行评价，禁止讨论交流，从而减少人为干扰，提高实验结果的准确性。实验过程中，由实验准备人员为学生提供样品，学生每品尝一个样品后，根据表1从色泽、风味、滋味和组织状态四个方面对样品进行打分。在进行下一个样品品尝之前用白开水漱口，休息，避免因连续品尝口味相近的饮料而产生的味觉迟钝。
表1感官评分表
2.2辅料的添加量对饮料品质的影响
2.2.1配方单因素试验
(1)碳酸氢钠添加量的确定
分别添加4.5％的白砂糖，0.1％的柠檬酸，0.05％的维生素C，0.03％的食用香精，探索碳酸氢钠的添加量为0％、0.015％、0.03％、0.045％和0.06％对饮料感官的影响。
(2)白砂糖添加量的确定
分别添加0.1％的柠檬酸，0.05％的维生素C，0.03％的碳酸氢钠，0.03％的食用香精，探索白砂糖的添加量为3.5％、4％、4.5％、5％和5.5％对饮料感官的影响。
(3)柠檬酸添加量的确定
分别添加4.5％的白砂糖，0.05％的维生素C，0.03％的碳酸氢钠，0.03％的食用香精，探索柠檬酸的添加量为0.6％、0.8％、1.0％、1.2％和1.4％对饮料感官的影响。
(4)维生素C添加量的确定
分别添加4.5％的白砂糖，0.1％的柠檬酸，0.03％的碳酸氢钠，0.03％的食用香精，探索维生素C的添加量为0.01％、0.03％、0.05％、0.07％和0.09％对饮料感官的影响。
2.2.2配方正交试验
在前期预实验的基础上，选择对饮料感官品质影响较大的白砂糖、柠檬酸、维生素C和碳酸氢钠四种辅料的用量进行因素水平正交试验，正交试验的因素水平表见表2。
表2正交试验因素水平表
3.实验结果与分析
3.1 pH值对饮料品质影响结果
3.1.1 pH值对透明质酸钠稳定性的影响
pH值对透明质酸钠稳定性的影响如图2所示,随pH值的增加透明质酸钠并没有明显的降解出现，其含量的变化范围在5％以内。pH值为8时，透明质酸钠的含量最高，即透明质酸钠的损失最少，但pH值为4、6、10、12时均与其没有显著性差异(p>0.05)，pH值为2时，透明质酸钠的损失量最多，但与pH值为4、6、10、12仍无显著性差异(p>0.05)。因此认为在饮料加工过程中，pH值对透明质酸钠溶液的稳定性的影响较小。
3.1.2 pH值对饮料抗氧化活性的影响
(1)DPPH自由基清除率测定
本实验所用透明质酸钠溶液的浓度为0.03mg/ml，不同pH值下透明质酸钠溶液对DPPH自由基的清除率如图3所示，可知pH值为2时，透明质酸钠溶液对DPPH自由基的清除率最高且与其余pH值有显著性差异(p<0.05)，可达到51.69％，有较好的抗氧化效果，pH值为4时清除DPPH自由基效果较弱，但仍有25％左右。
(2)超氧阴离子自由基清除率测定
不同pH值下透明质酸钠溶液对超氧阴离子自由基的清除率如图4所示，pH值为2时，透明质酸钠溶液对超氧阴离子自由基的清除率最高且与其他pH值有显著性差异(p<0.05)，可达98.07％，有很好的抗氧化效果。pH值为4、6、8和10时，对超氧阴离子自由基的清除率在25％左右，也可见抗氧化效果。
(3)羟基自由基清除率测定
不同pH值下透明质酸钠溶液对羟基自由基的清除率如图5所示，pH为2时透明质酸钠溶液对羟基自由基的清除率最高，可达75.48％且与其余pH值均有显著性差异(p<0.05)，抗氧化效果可观。
3.1.3 pH值对透明质酸钠溶液流变学特性的影响
由图6可知，随剪切速率的增大，透明质酸钠溶液的粘度呈现下降趋势而后趋于平缓。且随着pH值的增大，透明质酸钠溶液的粘度呈现增加的趋势，到pH值为12时，透明质酸钠溶液的粘度显著降低，可知，强酸强碱都会对透明质酸钠溶液的粘度产生影响。
小结：保健饮料的粘度在一定程度上影响了产品的感官性状，本款保健饮料为保证清爽口感，选取粘度较低时的pH值水平。综合考虑不同pH值下透明质酸钠溶液的抗氧化活性及其粘度所带来的感官影响，确定本款保健饮料的pH值偏酸性，以期保证口感的同时具有较好的抗氧化活性。
3.2透明质酸钠的添加量对饮料品质的影响
3.2.1透明质酸钠的添加量对饮料流变学特性的影响
不同浓度下透明质酸钠溶液粘度随剪切速率的变化如图7所示，随剪切速率的增大，透明质酸钠溶液的粘度下降后趋于平缓。且随着透明质酸钠添加量的增加，粘度逐渐升高。
3.2.2透明质酸钠的添加量对饮料抗氧化活性的影响
(1)DPPH自由基清除率测定
不同浓度下透明质酸钠溶液对DPPH自由基的清除能力如图8所示，随透明质酸钠溶液浓度的增加，对DPPH自由基的清除能力也逐渐增高，可见透明质酸钠对DPPH自由基有较好的清除能力。
(2)超氧阴离子自由基清除率测定
不同浓度下透明质酸钠溶液对超氧阴离子自由基的清除能力如图9所示，随透明质酸钠溶液浓度的增加，对超氧阴离子自由基的清除能力也逐渐增高。
(3)羟基自由基清除率测定
不同浓度下透明质酸钠溶液对羟基自由基的清除能力如图10所示，随透明质酸钠溶液浓度的增加，对羟基自由基的清除能力缓慢降低，透明质酸钠溶液对羟基自由基的清除能力较DPPH自由基和超氧阴离子自由基显著降低，且随浓度变化较小。
小结：综合上述因素的抗氧化活性及粘度特性，结合成本及适宜的人体摄入量考虑选取透明质酸钠的添加量在0.03％。
3.3辅料的添加量对饮料品质的影响
3.3.1单因素实验结果
本实验依据表1感官评价表对各单因素对饮料感官的影响进行评价，同时以pH值作为辅助选择依据。
碳酸氢钠的添加量对感官评分以及饮料pH值的影响如图11所示，随碳酸氢钠添加量的增加，感官评分呈现先增加后减小的趋势，pH值逐渐增加。故碳酸氢钠的添加量的最优水平为0.03％。
白砂糖的添加量对感官评分以及饮料pH值的影响如图12所示，随白砂糖添加量的增加，感官评分呈现先增加后减小的趋势，pH值无明显变化。故白砂糖的添加量的最优水平为4.5％。
柠檬酸的添加量对感官评分以及饮料pH值的影响如图13所示，随柠檬酸添加量的增加，感官评分呈现先增加后减小的趋势，pH值逐渐减小。故柠檬酸添加量的最优水平为1.0％。
维生素C的添加量对感官评分以及饮料pH值的影响如图14所示，随维生素C添加量的增加，感官评分呈现先增加后减小的趋势，pH值缓慢减小。故维生素C的添加量的最优水平为0.05％。
3.3.2正交实验结果
根据表1的感官评分标准对照表2正交因素水平表配制的九款饮料进行打分，结果见3。对于因素A(碳酸氢钠)，B(白砂糖)，C(柠檬酸)，D(维生素C)而言，最优水平分别为A2,B1,C2,D3，因此最优组合为A2B1C2D3，即碳酸氢钠0.03％，白砂糖4.5％，柠檬酸1.0％和维生素C0.05％。根据极差分析可知，影响感官评定的因素主次顺序依次为A>C>D>B，且差距较小。
表3正交实验结果与分析表
实施例2：透明质酸钠饮料对小鼠肠道菌群的影响实验
1.供试样品
配方：透明质酸钠0.03％，白砂糖4.5％，柠檬酸1.0％，维生素C 0.05％，碳酸氢钠0.03％，调味剂0.03％，余量为纯化水。制备方法：(1)预处理：称取透明质酸钠粉末加入纯化水，搅拌2h，至透明质酸钠完全溶解即得透明质酸钠溶液；(2)调配:将白砂糖、柠檬酸、维生素C、碳酸氢钠和调味剂加入透明质酸钠溶液中，用纯化水定容后混匀；(3)过滤：用200目滤网过滤，以除去部分不溶性杂质；(4)脱气：过滤后进行脱气处理；(5)杀菌：采用超高压瞬时灭菌设备进行杀菌；
将上述制成的饮料原液进行浓缩，灌胃高剂量组浓度为原液的8倍，中剂量组为原液的4倍，低剂量组为原液的2倍。每只小鼠的灌胃量依据其每日体重(灌胃量(ml)＝体重(g)/100)。
2.动物分组及给药方法
将小鼠随机分成5组，分别为正常对照组，保健饮料低剂量组，中剂量组和高剂量组。其中低剂量组灌胃10ml/kg.bw/d浓缩2倍的保健饮料，中剂量组灌胃10ml/kg.bw/d浓缩4倍的保健饮料，高剂量组灌胃10ml/kg.bw/d浓缩8倍的保健饮料，其余组均灌胃等量生理盐水。每天灌胃给药持续28天(4周)。每周记录一次体重。
3.肠道菌群样品的制备
分别取小鼠粪便，每组平行取六份，将每只小鼠的粪便分装于无菌管中，用液氮速冻后迅速转移至-80℃冰箱中冻存。样品编号见表4。
表4小鼠粪便编号
4.肠道微生物分析
实验共四组，每组六个样品，经16S rRNA测序获得。应用16SrRNAIllumina测序技术分析本保健饮料对粪便菌群的影响。首先提取粪便中DNA，采用NanoDrop2000检测DNA的质量和浓度，采用琼脂糖凝胶检测DNA的完整性，以获得的DNA为模板，引物序列：正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；反向引物：5’-GGACTACHVGCCTWTCTAAT-3’，对V3-V4区进行PCR扩增，经检测合格后进行建库上机测序实验，测序使用平台为Illumina Hiseq2500。
5实验结果分析：
5.1Alpha多样性分析结果
5.1.1稀释性曲线
稀释曲线(Rarefaction curve)主要利用各样本在不同测序深度时的微生物Alpha多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。它可以用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度、均一性或多样性，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理。稀释曲线采用对序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们对应的物种(如OTU)数目或多样性指数，构建Rarefaction curve。若多样性指数为sobs(表征实际观测到的物种数目)，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的物种(如OTU)，反之则表明继续测序还可能产生较多新的物种(如OTU)。若是其他多样性指数(如Shannon-Wiener曲线)，曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样本中绝大多数的微生物多样性信息。本实验稀释曲线如图15和图16所示，可见本实验数据量合理且足够大，数据具有分析意义。以下图中kong代指正常对照组，di代指饮料低剂量组，zhong代指饮料中剂量组，gao代指饮料高剂量组。
5.1.2菌落多样性及物种丰富度分析
Alpha多样性分析反映微生物群落的丰富度和多样性，包括一系列统计学分析指数估计环境群落的物种丰度和多样性。主要的衡量指标有chao、ace、shannon、simpson等。其中反映群落丰富度(Community richness)的指数有：chao和ace，反映群落多样性(Community diversity)的指数有：shannon和simpson。等级丰度(Rank-Abundance)曲线如图17所示，反映了物种丰富度和群落均匀性。物种的丰富度由曲线的宽度来反映，曲线在横轴上的范围越大，物种的丰富度就越高；曲线的形状(平缓程度)反映了样本中群落的均匀度，曲线越平缓，物种分布越均匀。
由表5和图17可知，灌胃本保健饮料后，小鼠肠道菌群的丰富度较正常组小，但菌群的多样性较正常组增多。其中保健饮料低剂量组的Ace指数和Chao指数较正常对照组小鼠有极显著性降低(p<0.01)和显著性降低(p<0.05)；中剂量组小鼠菌落的Ace指数和Chao指数较正常组小鼠均无显著性差异(p>0.05)；高剂量组小鼠菌落的Ace指数和Chao指数较正常组小鼠均有极显著性降低(p<0.01)。这反映了灌胃低剂量和高剂量饮料都会导致小鼠菌群的丰富度的降低。但与此相反的是，灌胃低剂量组的小鼠的Simpson指数较正常组有极显著性增加(p<0.01)，灌胃中剂量饮料的小鼠的Shannon指数和Simpson指数分别有极显著性下降(p<0.01)和显著性增加(p<0.05)，灌胃高剂量饮料的小鼠的Shannon指数及Simpson指数与正常对照组均有极显著性差异(p<0.01)，表现为Shannon指数的下降和Simpson指数的增加。这表明，灌胃本保健饮料后，小鼠的菌落物种多样性有增加趋势。Coverage指数表示样本中的物种OTU覆盖率，其数值越高，则样本中物种被测出的概率越高，表5中各组Coverage均高于0.999，表示样本中物种基本被检出，进一步验证测序数充分。综合考虑，灌胃中剂量的本保健饮料对小鼠的菌群丰富度无显著性影响但可有效增加菌群的物种多样性，可有效调节小鼠肠道菌群，促进菌群平衡。
表5Alpha多样性指数分析表
注：各组与Kong(正常对照组)相比，*表示有显著性差异(p<0.05),**表示有极显著性差异(p<0.01)。Di代指饮料低剂量组，Zhong代指饮料中剂量组，Gao代指饮料高剂量组。
5.2.2不同水平上的群落组成分析
为进一步研究四组样品中微生物群落及物种丰富度组成，在门、科和属水平上，统计各组样品的物种丰度，绘制成柱状图，如图18所示。由图18可知，在门分类水平上，小鼠肠道菌群的主要由Bacteroidetes(拟杆菌门)和Firmicutes(厚壁菌门)组成,占菌群总数的90％以上。饮料低剂量组的Firmicutes(厚壁菌门)较正常对照组组有所增加，Bacteroidetes(拟杆菌门)较正常对照组减少。其余菌门各组间差异较小不做讨论。在科水平上，饮料低剂量组的muribaculaceae丰度较正常对照组减少，而在饮料中剂量组和高剂量组muribaculaceae丰度较正常对照组均有增加，各剂量组中Lactobacillaceae(乳杆菌科)的丰度较正常对照组均有增加，其中饮料低剂量组增加更为明显。中剂量组的Lachnospiraceae(毛螺旋菌科)和Bacteroidaceae(拟杆菌科)的丰度较正常对照组均降低。在属水平上，饮料低剂量组与正常对照组相比，下调了f-Muribaculaceae、Bacteroides的丰度，显著上调了Lactobacillus的丰度；饮料中剂量组较正常对照组相比，明显上调了f-Muribaculaceae、Lactobacillus的丰度，下调了Bacteroides的丰度；饮料高剂量组与正常对照组相比，大幅度上调了f-Muribaculaceae、Lactobacillus的丰度，下调了Bacteroides和Staphylococcus(葡萄球菌属)的丰度。
综上所述，Muribaculaceae和Lactobacillaceae作为常见的益生菌，其丰度的增加意味着灌胃本保健饮料后小鼠肠道的益生菌丰度呈现增加趋势，有助于调节肠道菌群，其中高剂量组对益生菌丰度的上调效果最为显著。
5.3Beta多样性PCA分析结果
PCA分析即为主成分分析，是利用方差分解，将多组数据的差异反映在坐标图上，坐标轴为能最大程度反映方差的两个特征值。坐标图中样本间的距离远近反映了样本间的相似程度，距离越近越相似。本实验基于各组OUT的PCA分析如图19所示，由图19可知，各剂量组较正常对照组在坐标PC2上都有明显分离，中剂量组和高剂量组在PC1坐标上也与正常对照组由明显分离，可见各剂量组与正常对照组在肠道微生物组成上有明显差异存在，其中中剂量组与高剂量组分离度不高，没有明显的组成差异。
5.3.4Beta多样性聚类分析结果
本实验采用Bray-Curtis距离算法，对四组样品的OUT组成进行比较，计算其距离值，并绘制柱状图，其结果如图20所示。由图可知，每组组内六个样品间距离较近，代表组内样本差异小，具有很好的代表性。从图20中可知，灌胃本保健饮料后各剂量组OTU97(乳杆菌属)的丰度较正常对照组均有显著增加，其中低剂量组该菌属丰度上调幅度大于中高剂量组，可见灌胃本保健饮料有益于肠道中有益菌生长，有助于构建良好的肠道菌群环境。
Claims (8)
1.一种具有调节肠道菌群作用的透明质酸钠饮料，其特征在于，该饮料中原辅料的质量百分比为：透明质酸钠0.03％，白砂糖4.5％，柠檬酸1.0％，维生素C 0.05％，碳酸氢钠0.03％，调味剂0.02～0.05％，余量为纯化水。
2.根据权利要求1所述具有调节肠道菌群作用的透明质酸钠饮料，其特征在于，所述的透明质酸钠的分子量为100～150万Da。
3.根据权利要求2所述具有调节肠道菌群作用的透明质酸钠饮料，其特征在于，所述的透明质酸钠的分子量为120万Da。
4.根据权利要求1所述具有调节肠道菌群作用的透明质酸钠饮料，其特征在于，所述的调味剂为食用香精。
5.一种根据权利要求1或2或3所述具有调节肠道菌群作用的透明质酸钠饮料的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)预处理：称取透明质酸钠粉末加入纯化水，搅拌2h，至透明质酸钠完全溶解即得透明质酸钠溶液；
(2)调配:将白砂糖、柠檬酸、维生素C、碳酸氢钠和调味剂加入透明质酸钠溶液中，用纯化水定容后混匀；
(3)过滤：用200目滤网过滤，以除去部分不溶性杂质；
(4)脱气：过滤后进行脱气处理；
(5)杀菌：采用超高压瞬时灭菌设备进行杀菌；
(6)灌装：灭菌后进行塑料瓶灌装。
6.一种根据权利要求1或2或3所述的透明质酸钠饮料在制备增加肠道菌群物种多样性和益生菌丰度的食品中的应用。
7.一种根据权利要求1或2或3所述的透明质酸钠饮料在制备清除人体自由基的食品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的人体自由基包括DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基。
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