WO2019142844A1 - 腸内ｆｂ比低減剤およびそれを含有する食品組成物 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to prebiotics that promote bacterial growth and activation of the Bacteroidetes of the intestinal flora, in particular.
- the invention also relates to the use of mannan (yeast mannan) extracted from yeast cell walls.
- Bacteroides live in the intestines of mammals such as humans and mice to create the intestinal flora, and one of them is bacteria of the Bacteroidetes (Bacteroidetes).
- Bacteroides thetaiotaomicron Bacteroides thetaiotaomicron
- Bacteroides ovatus Bacteroides ovatus
- B. thetaiotaomicron is known as one of seven bacterial species that are characteristically abundant in the intestine of lean individuals.
- Bacteroides spp Bacteria are abundant in the intestines of lean individuals, and bacteria of Pharmucites spp.
- Non-Patent Document 1 The occupancy rate of the Firmicutes gate / occupancy rate of the Bacteoirdetes gate has come to be used as one of the indicators of fattenability.
- Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-254594 discloses isomaltoligosaccharides, galactooligosaccharides, mannan oligosaccharides, dietary fiber (for example, indigestible dextrin) and a sugar absorption inhibitor (for example, extract of a plant belonging to the genus Salacia)
- Intestinal Bacteroides growth promoter containing at least one type is described, and ingestion of the intestinal Bacteroides growth promoter increases intestinal Bacteroides and is expected to enhance immune function etc. Is also described.
- intestinal bacteroides growth promoters containing various components are used (for example, an agent containing indigestible dextrin, an agent containing mannan oligosaccharide is not used), and the intestinal bacterial flora. It is shown how the proportion of Bacteroides (total cell count as 100%) changes before and after intake.
- yeast used for the production of beer, sake, bread, etc. is rich in dietary fiber such as glucan and mannan in the cell wall.
- Mannan purified from the cell wall of yeast is known as "yeast mannan” and has been applied as a functional material with various effects such as intestinal regulation related, iron absorption promotion effect, antiulcer action, diabetes improvement effect, etc. It is in progress.
- An agent that serves as a health functional food (functional display food etc.) or its active ingredient (functional involved ingredient etc.) that can improve the FB ratio of enteric bacteria, that is, reduce it to approach lean value, is desired. Although rare, those with sufficient improvement effects have not been developed yet.
- insoluble dietary fibers are insoluble and therefore their use as food forms is limited, while glucomannan is difficult to use in beverages because of its high viscosity.
- mannan oligosaccharide is a compound (aggregation of) different in molecular weight and molecular structure depending on the origin even if it is composed of similar constituent units, and the properties are also different, but the invention of Patent Document 1 What is described in relation to is “the number of constituent monosaccharides is usually 2 to 90” (molecular weight is about 360 to 16200).
- Patent Document 1 in particular, whether enteric Bacteroides growth promoters containing mannan oligosaccharides or other components can not only increase Bacteroides but also greatly improve (decrease) the FB ratio. It is unknown from the data of the example.
- An object of the present invention is to provide an agent having an action to reduce the intestinal FB ratio, that is, an intestinal FB ratio reducing agent, which is suitable for use in food and drink.
- yeast mannan an ⁇ -mannan extracted from yeast is a bacterium belonging to the genus Pharmikutes, in the intestine. It has been found that the present invention has an excellent effect on the reduction of the FB ratio (herein referred to as “broadly defined FB ratio”) defined as “occupancy ratio / occupancy ratio of bacteria belonging to Bacteroides”. Also, although yeast mannan has a molecular weight higher than that of mannan oligosaccharides as described in Patent Document 1 (usually 50,000 to 100,000 or more), it is water soluble and the viscosity of the aqueous solution is very low.
- the FB ratio can be significantly reduced as compared with a general water-soluble dietary fiber such as indigestible dextrin.
- the present inventors further focused on bacteria belonging to the Pharmycutes and bacteria belonging to the Bacteroides, and [bacteria belonging to the Clostridium among bacteria belonging to the Pharmicutes and The yeast mannan is also excellent in the FB ratio (herein referred to as "FB ratio in a narrow sense" in the present specification) defined as the total occupancy of bacteria belonging to Have been found to have a reducing effect.
- FB ratio in a narrow sense defined as the total occupancy of bacteria belonging to Have been found to have a reducing effect.
- the present invention includes the following matters.
- [Section 3] The agent for reducing FB ratio according to Item 1 or 2, wherein the bacterium belonging to the Bacteroides or Bacteroides of the Bacteroides includes Bacteroides thetaiotaomicron.
- [Section 4] A food composition for reducing an FB ratio, comprising the agent for reducing an FB ratio according to any one of Items 1 to 3.
- FB ratio reducing agent of the present invention containing yeast mannan makes it possible to produce a food composition for reducing FB ratio which is excellent in FB ratio reducing action and easy to ingest.
- FIG. 1 is a pie chart showing the proportion (occupancy rate) of each bacterium, which corresponds to Table 1 (FB ratio in a broad sense) of Experiment 1 (normal diet) of Example 1.
- the “control” is “comparative example 1” (5% cellulose), “2% mannan” and “5% mannan” are “example 1” and “example 2”, and “5% difficult decoy” is “comparative example”.
- FIG. 2 is a bar graph showing the average value of the FB ratio of each subject corresponding to Table 5 of Example 5.
- the FB ratio reducing agent of the present invention contains yeast mannan and may contain only yeast mannan (consisting of yeast mannan) as an active ingredient for use in reducing FB ratio, or in addition to yeast mannan It may contain other active ingredients for the same application.
- the “FB ratio” includes both the “broad sense FB ratio” and the “narrow sense FB ratio” described in the present specification.
- yeast mannan refers to a substance comprising at least one of “ ⁇ -mannan” derived from yeast and “ ⁇ -mannan-protein complex” derived from yeast. Both ⁇ -mannan and ⁇ -mannan-protein complexes are the major components that make up the yeast cell wall.
- ⁇ -mannan is a polysaccharide in which D-mannose is polymerized by ⁇ 1,6-linkage, ⁇ 1,2-linkage, or ⁇ 1,3-linkage, and mannopyranose is 1 in the main chain thereof.
- ⁇ 1,2-linked or ⁇ 1,3-linked side chains may be bonded. This ⁇ -mannan is water soluble.
- ⁇ -mannan-protein complex is a water-soluble protein in which one or more ⁇ -mannan chains are linked to a protein localized in the cell wall of yeast by N-glycosidic bond or O-glycosidic bond.
- a glycoprotein of The “ ⁇ -mannan chain” linked to this glycoprotein is, like the above “ ⁇ -mannan”, D-mannose polymerized by ⁇ 1,6-linkage, ⁇ 1,2-linkage, or ⁇ 1,3-linkage
- These side chains may be linked to the main chain thereof with one or more mannopyranose, an ⁇ 1,2-linked or an ⁇ 1,3-linked mannopyranose.
- the yeast mannan may be recovered in any way as long as it is derived from yeast.
- it may be a yeast mannan which is separated and recovered (extracted) by damaging the cell wall of the yeast by an enzyme or chemical treatment or the like, or it may be a yeast mannan recovered from what was released into the medium from the yeast.
- Yeast mannan can also be readily obtained commercially. Specific examples include mannan from Saccharomyces cerevisiae M7504 (Sigma-Aldrich Japan GK) and the like. Also, yeast mannan can be prepared from yeast using any of the known methods as described below.
- yeast mannan As a method of preparing yeast mannan, any known method can be used. For example, as a step of preparing the cell wall from yeast, the step of extracting yeast extract from yeast used for the production of beer, sake, and bread, etc., and preparing yeast mannan from the cell wall of yeast which is a residue You can get mannan.
- a cell wall of yeast used as a raw material of yeast mannan for example, a cell wall of yeast marketed by Asahi Group Foods Co., Ltd. under the trade name “Yeast cell wall” or other similar commercial products may be used.
- the step of preparing yeast mannan from cell walls of yeast includes, for example, a step of obtaining a crude extract of yeast mannan from cell walls of yeast (herein referred to as “crude extraction step”), and as required, the step. And the step of purifying the crude yeast mannan extract to obtain a purified yeast mannan product (herein referred to as “purification step").
- the step of preparing the cell wall from yeast is carried out before the crude extraction step, but such step is not necessary when the cell wall of yeast produced in advance is used as a raw material.
- a hot water (containing a dilute alkali) extraction method for example, JP-B-64-3479 and JP-A-58-109423
- an autolysis method for example, JP-B-58-57153
- an enzyme digestion method using a cell wall lytic enzyme for example, JP-B-59-40126
- the purification step for example, removal treatment of protein with hydrochloric acid or the like, alcohol precipitation treatment, protease treatment, treatment with chromatography, and the like can be performed.
- yeast mannan crude extract and yeast mannan purified product are collectively referred to as "yeast mannan preparation".
- the commercially available yeast mannan as described above also corresponds to a yeast mannan preparation.
- a yeast mannan preparation it is present in the cell wall of the yeast, in addition to the yeast-derived ⁇ -mannan and / or the yeast-derived ⁇ -mannan-protein complex, or is produced by processing for preparation of the yeast mannan
- contaminants eg, glucan, proteins, mannose, etc.
- the content of the yeast mannan in the yeast mannan preparation is as long as it is a yeast mannan having the later-described yeast ⁇ -mannan in a content at which the effects of the present invention are exerted when using the yeast mannan preparation as yeast mannan
- There is no particular limitation. Which method is to be used in the crude extraction step, whether or not to carry out the purification step, and what treatment to use in the case of carrying out the purification step, etc., the preparation of yeast mannan having the desired content of yeast ⁇ -mannan It may be selected as appropriate so as to obtain a product.
- a person skilled in the art can prepare a yeast mannan having a content of yeast ⁇ -mannan in an amount not interfering with the effects of the present invention, according to general methods and conditions.
- the yeast mannan prepared by those skilled in the art according to the general methods and conditions has a content of yeast ⁇ -mannan in an amount that does not interfere with achieving the effects of the present invention.
- the yeast used as a raw material in the above method for preparing yeast mannan is not particularly limited as long as it is the above-mentioned ⁇ -mannan and the above-mentioned ⁇ -mannan-protein complex as a component of the cell wall .
- examples of such a yeast include, for example, Saccharomyces, Sizosaccharomyces, Pichia, Pichia, Candida, Kluyveromyces, Williopsis (Williopsis). ), Debaryomyces (Debaryomyces), Galactomyces, Tororaspora, Rhodotorula, Yarrowia, Zygosaccharomyces, etc. It may be a yeast, preferably a Saccharomyces genus.
- a person skilled in the art can cultivate a yeast which does not have any problem in using it as a raw material for preparing a yeast mannan exhibiting the effect of the present invention according to a general method and conditions.
- the yeast cultured by a person skilled in the art according to the general method and conditions can be used as a raw material that does not cause trouble in preparing the yeast mannan exhibiting the effects of the present invention.
- it is an edible yeast, and, as for the yeast used as a raw material of above-mentioned yeast mannan, it is more preferable that it is a yeast used as a baker's yeast or a beer yeast.
- Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
- Sizosaccharomyces pombe Schoizosaccharomyces pombe
- Saccharomyces pastorianus Saccharomyces pastorianus
- Saccharomyces paradox thalamica Saccharomyces bayanus
- Saccharomyces kudriavzevii Kluyveromyces lactis
- Candida utilis Candida albicans
- Candida There may be mentioned tropicalis (Candida tropicalis), Candida lipolytica (Candida lypolitica), and Candida salmon (Candida sake).
- the yeast used as a raw material of the above-mentioned yeast mannan is, for example, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, and Saccharomyces bayanus.
- yeast mannan preparation obtained by the above preparation method is a yeast-derived ⁇ -mannan-protein complex (that is, a protein portion in a state of being bound to ⁇ -mannan chain ) May also be included.
- yeast-derived ⁇ -mannan and the ⁇ -mannan chain portion of the yeast-derived ⁇ -mannan-protein complex are collectively referred to as “yeast ⁇ -mannan”.
- yeast alpha-mannan can also be referred to as pure yeast mannan).
- the content of yeast ⁇ -mannan in yeast mannan varies somewhat depending on the method of preparation of yeast mannan, but is generally within a certain range, usually 30 to 95%.
- the content rate of the yeast ⁇ -mannan is not particularly limited as long as the action effect of the present invention is exhibited when the yeast mannan preparation is used as the yeast mannan.
- a person skilled in the art can prepare a yeast mannan having a content of yeast ⁇ -mannan which does not disturb the effect of the present invention according to general methods and conditions.
- the yeast mannan prepared by one skilled in the art according to the general methods and conditions has a content of yeast ⁇ -mannan which does not hinder the exertion of the effects of the present invention.
- the content of yeast ⁇ -mannan in the yeast mannan preparation is calculated by the following method.
- mannose in the sample (A) of the yeast mannan preparation and mannose in the sample (B) obtained by hydrolyzing the yeast mannan preparation are quantified respectively.
- the sample (B) is a sample neutralized after hydrolysis of all sugar chains in the sample (A) to monosaccharides by treating the sample (A) with sulfuric acid.
- Mannose in each sample can be quantified, for example, by high performance liquid chromatography (HPLC), and may be quantified by a method implemented at Japan Food Research Laboratories, Inc.
- HPLC high performance liquid chromatography
- Each agent of the present invention does not need to use a yeast mannan preparation having 100% content of yeast ⁇ -mannan, and a preparation of yeast mannan having a content of yeast ⁇ -mannan in the above general range You may use a thing.
- the dosage form of the FB ratio reducing agent of the present invention is not particularly limited, and may be in the form of powder, or in the form of solution (dispersion liquid) using water or other solvent.
- the agent for reducing the FB ratio according to the present invention is typically used by blending with the food composition for reducing the FB ratio, and therefore, it is preferable to use a dosage form suitable for producing such a food composition.
- “broad-factor FB ratio” is defined as [occupancy rate of bacteria belonging to Pharmycutes / occlusion rate of bacteria belonging to Bacteroides], and “FB ratio in narrow sense” is Among the bacteria belonging to the genus Clostridium and the total occupancy of bacteria belonging to the genus Elysiperococcus, the occupancy ratio of bacteria belonging to the Bacteroides among the Bacteroides is defined.
- Bacteroides include Bacteroides (Bacteroides), Flavobacterium (Flavobacterium), Sphingobacterium (Sphingobacteria) and the like.
- Bacteroides include Bacteroides, Bacteroides, Parabacteroides, Prevotella, Paraprevotella, Alistipes, Barnesiella, Butilicimonas, It includes the genus Bodor (Odoribacter) and the like.
- Flavobacterium includes Flavobacterium and the like.
- Sphingobacterium includes Sphingobacterium (Sphingobacterium) and the like.
- Bacteroides thetaiotaomicron is included in the “bacteria belonging to Bacteroides” or “the bacteria belonging to Bacteroides among Bacteroides” in calculating the FB ratio.
- Bacteria belonging to the Bacteroides group include Bacteroides thetaiotaomicronone, Bacteroides ovatus and the like.
- Clostridia Clostridia
- Erysiperoliths Erysiperoliths
- Bacillus Clostridium species include Clostridium (Clostridium), Blautia (Blautia), SMB53, Coprococus (Coprococcus), Dorea (Dorea), Lacnospira (Lachnospira), Roseburia (Roseburia), and Ruminococcus , Veironella (Veillonella) and the like.
- the class Erysiperotrix includes Allobaculum (Allobaculum), Catenibacterium (Catenibacterium), Coprobacillus (Coprobacillus), Holdemania (Holdemania) and the like.
- Bacillus species include Bacillus, Bacillus, Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Weissella and the like.
- the total occupancy of bacteria belonging to Clostridium and bacteria belonging to the genus Elysipophilus among bacteria belonging to Pharmicutes is used. This is to exclude, from bacteria belonging to the genus Pharmikutes, Bacilli which generally include bacteria that are often recognized as good bacteria, Bacillus subtilis, and the like.
- the agent for reducing the FB ratio of the present invention By ingesting the agent for reducing the FB ratio of the present invention, or the yeast mannan contained as an active ingredient thereof, the FB ratio in the intestines of humans, mice and other mammals can be reduced.
- the FB ratio varies depending on the test condition, for example, the feeding condition (intake or normal food or high-fat diet) in the test using experimental animals, and it is possible to uniformly specify the effect by a numerical range etc. Have difficulty.
- the FB ratio after intake of the FB ratio reducing agent only needs to be lower than the FB ratio before intake under at least test conditions appropriately set to be comparable.
- the FB ratio after ingestion of the FB ratio reducing agent is preferably further compared to that of the control group (a group not receiving the FB ratio reducing agent or a group receiving cellulose), preferably “indigestible dextrin” It should be smaller compared to the group receiving the ingredients.
- the FB ratio reducing agent of the present invention preferably has a numerical value of the FB ratio, preferably 85, as compared to a control group (a group not receiving the FB ratio reducing agent or a group receiving cellulose). %, More preferably 70% or less, and still more preferably 60% or less (the reduction ranges are respectively 15% or more, 30% or more, and 40% or more).
- the reduction is preferably up to 10%, more preferably up to 15%, still more preferably up to 20% (the reduction width is up to 90% respectively) , Up to 85% and up to 80%).
- the occupancy rate of bacteria of each class or genus is calculated by a commonly used method for analysis of intestinal bacterial flora to calculate “broad-band FB ratio” and “narrow-defined FB ratio”. be able to.
- DNA is prepared from a stool sample, ribosomal RNA (typically 16S rRNA) region used for phylogenetic analysis of microorganisms is amplified, and a large amount of base sequence is obtained using a next-generation sequencer, and then the database By performing homology searches and phylogenetic analysis, the occupancy rate of the desired bacteria can be determined.
- the food composition for reducing the FB ratio according to the present invention contains the agent for reducing the FB ratio according to the present invention and other components adapted to the form of the food composition.
- the yeast mannan which is an active ingredient of FB ratio reducing agent is contained in the form of yeast which has a cell wall, the natural raw material which is not manufactured as a composition or its cooking * processed goods, for example, yeast remain. Fermented food itself does not fall under the food composition of the present invention.
- the form of the food composition is not particularly limited, and the form may be the same as various known food and drink products to which the FB ratio reducing agent of the present invention can be blended.
- the content of the FB ratio reducing agent in the food composition or the content of the yeast mannan as an active ingredient thereof is not particularly limited as long as the effect of reducing the FB ratio according to the present invention is exhibited. It can be appropriately set in consideration of the form of the food composition, the production method and the like, and in consideration of the amount of the active ingredient per serving or per day, if necessary.
- the weight of the yeast mannan preparation and the proportion of yeast ⁇ -mannan contained in the yeast mannan preparation ie, yeast ⁇ -mannan
- the content of the yeast ⁇ -mannan as an active ingredient can be adjusted by the content rate to be in the range in which the effects of the present invention can be achieved.
- the content of the FB ratio reducing agent is such that the content of the yeast ⁇ -mannan contained therein is relative to the total mass of the food composition (supplement) It is usually 5% or more, preferably 10% or more, and can usually be 75% or less.
- the content of the FB ratio reducing agent is usually 0% of the content of the yeast ⁇ -mannan contained therein relative to the total mass of the food composition (beverage). It can be not less than .04%, preferably not less than 0.1%, and usually not more than 7.5%, preferably not more than 4%.
- Raw materials or components other than the FB ratio reducing agent of the food composition of the present invention can be the same as conventional food compositions.
- the food composition of the present invention in the form of a supplement contains, in addition to the FB ratio reducing agent, various components contained in general or known supplements such as excipients, sweeteners, coloring agents, flavors and others And at least one selected from the following components.
- the food composition of the present invention in the form of a beverage is, in addition to the FB ratio reducing agent, various components contained in common or known beverages, such as water (carbonated water), coffee extract, tea leaf extract, fruit juice And other plant raw material extract, milk, soy milk, fermented milk, sweetener, at least one selected from sweeteners, acidulants, coloring agents and flavors.
- common or known beverages such as water (carbonated water), coffee extract, tea leaf extract, fruit juice And other plant raw material extract, milk, soy milk, fermented milk, sweetener, at least one selected from sweeteners, acidulants, coloring agents and flavors.
- Such a food composition of the present invention can be produced by the same method as a conventional food composition except that the method further comprises the step of adding the FB ratio reducing agent of the present invention as an ingredient.
- the food composition is used as a health food (ie, a nutritive food, a food for specified health use and a functional indication food), and a therapeutic food (ie, one that serves the purpose of treatment or a doctor gives a prescription) Therefore, it can also be manufactured as a diet, a care diet, etc. according to the menu prepared by a dietitian etc.).
- a health food ie, a nutritive food, a food for specified health use and a functional indication food
- a therapeutic food ie, one that serves the purpose of treatment or a doctor gives a prescription
- the estimated intake amount (active ingredient amount) per serving or daily of the food composition depends on the age, weight, sex, FB ratio before intake, and other index values for which the FB ratio is to be reduced. It can be set as appropriate based on non-clinical or clinical test results.
- the intake period of the food composition can also be set appropriately, and it is preferable to ingest it repeatedly over a long period of time and on a daily basis.
- the food composition of the present invention preferably has an intake of yeast ⁇ -mannan as an active ingredient contained therein, preferably 0.1 g / day or more, more preferably 0.2 g / day More preferably, it is 0.3 g / day or more, preferably 4 g / day or less, more preferably 2.5 g / day or less, and still more preferably 1.5 g / day or less.
- FB ratio reduction of the food composition of the present invention
- Examples of direct display are descriptions of the product itself, packages, containers, labels, tags and other tangibles
- examples of indirect display are websites, stores, exhibitions, billboards, billboards, newspapers, magazines , Advertising, advertising, by means of locations or means such as, television, radio, mailings, e-mail etc.
- display the functionality based on the action and effect of yeast mannan contained as a functional component can do.
- the present invention relates in one aspect to a bacterium belonging to the genus Pharmikutes, in the intestine of a human and a non-human mammal (for example, an experimental animal such as a mouse, or a pet), which comprises feeding an effective amount of yeast mannan
- the present invention provides a method for reducing the (broad) FB ratio defined as [occupancy rate / occupancy rate of bacteria belonging to Bacteroides].
- the present invention relates in one aspect to a bacterium belonging to the genus Pharmikutes, in the intestine of a human and a non-human mammal (for example, an experimental animal such as a mouse, or a pet), which comprises feeding an effective amount of yeast mannan Method of reducing FB ratio (in a narrow sense) defined as total occupancy of bacteria belonging to the genus Clostridium and bacteria belonging to the class Erysiperotrix / occupancy of bacteria belonging to the Bacteroides of the Bacteroides] provide.
- yeast mannan Method of reducing FB ratio in a narrow sense
- the occupancy rate of bacteria belonging to the genus Pharmicutes / occupancy rate of bacteria belonging to the genus Bacteroides in the intestine of humans and non-human mammals for example, experimental animals such as mice, or pets
- the use of yeast mannan in the manufacture of a food composition for reducing the (broad) FB ratio defined as The present invention relates, in one aspect, to the [bacteria belonging to the genus Clostridium among bacteria belonging to the genus Pharmicutes and to the bacteria of Escherichia coli], in the intestine of humans and non-human mammals (for example, experimental animals such as mice, or pets).
- yeast mannan in the preparation of a food composition for reducing the (narrow sense) FB ratio defined as the total occupancy of bacteria belonging to the class / occlusion of bacteria belonging to the Bacteroides of the Bacteroides] Do.
- Such “use of yeast mannan” can be converted by those skilled in the art from the invention of “FB ratio reducing agent” and “food composition for reducing FB ratio” described above, and “FB described in the present specification. The matters relating to the ratio reducing agent and the food composition for reducing the FB ratio can be similarly applied.
- the specific procedure of the determination method of mannose in a sample (SA) and a sample (SB) in Japan Food Research Laboratories is as follows. 0.6 g of each of the sample (SA) and the sample (SB) was collected, added to sulfuric acid of 72% concentration, and stirred at room temperature for 1 hour. After diluting the concentration of sulfuric acid of the sample solution to 4%, it was heated for 1 hour in an autoclave (121 ° C.). The sample solution was cooled to room temperature, neutralized, and quantified to 200 mL with water. The quantified sample solution was filtered through filter paper, the filtrate was diluted 50 times with water, and the diluted solution was further filtered through a membrane filter.
- yeast Mannan Preparation X 10 kg of commercially available yeast cell wall (trade name "Yeast cell wall", Asahi Group Foods Co., Ltd.) was suspended in distilled water, adjusted to pH 11.0 by adding sodium hydroxide, and boiled at 90 ° C. for 12 hours. The supernatant was collected by centrifugation and adjusted to pH 5.5 by addition of hydrochloric acid. The freeze-drying procedure yielded 2 kg of yeast mannan preparation X. The content of yeast ⁇ -mannan was calculated by the above-described method to be 50%.
- yeast mannan (2%) and “yeast mannan (5%)” in Examples 1 to 4 are 2% and 5%, respectively, based on the weight of the feed (“AIN93G”, manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.). Means of mixing the yeast mannan preparation X by mass.
- the “cellulose (5%)” and “nondigestible dextrin (5%)” of Comparative Examples 1 and 2 respectively contain cellulose or nondigestible dextrin based on the weight of feed (“AIN 93 G”, manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.). It means the weight ratio mixed.
- each test feed was prepared by mixing yeast mannan preparation X, cellulose and indigestible dextrin with feed (“AIN93G”, manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.).
- AIN93G manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.
- Four-week-old male ICR mice were divided into 9 groups, and each test diet was allowed to freely feed for 6 weeks.
- the library was prepared according to Illumina's protocol (Document 1 below)
- the V4 region of 16S rDNA was sequenced using MiSeq Reagent Kit version 2 (300 cycles) (Ilmina, Inc.) and MiSeq.
- the obtained sequence was analyzed using QIIME v.1.8.0 (Document 2 below), R and SPSS, and the broad FB ratio and the narrow FB ratio were calculated.
- Sequence number 1 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTGTATAAGAGAGGGCCAGCGGCCGCGGTAA-3 ' Sequence number 2: 5'-GTCTCTGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3 ' Document 1:16 S Metagenomic Sequencing Library Preparation. (Http://support.illumina.com/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15042223-b.pdf). Material 2: QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. Nat Methods (2010) 7, 335.
- Table 1 shows the broad-form FB ratio after taking each test feed for 6 weeks and the percentage of enteric bacteria (the percentage of the total number of cells as 100%) related to the calculation.
- a pie chart representing the proportion of Bacteroides, Pharmicutes, and other intestinal bacteria corresponding to this table is shown in FIG.
- Example 2 High fat diet
- Six-week-old male C57BL / 6J mice are divided into 10 groups and orally fed with yeast mannan preparation X at 300 or 1000 mg / kg / day (5 days) while rearing on a high-fat diet HFD (Oriental Yeast Co., Ltd.) Administration for 6 weeks, and analysis of 16S rDNA was performed in the same manner as in Experiment 1 to calculate a broad FB ratio and a narrowly defined FB ratio.
- the broad-form FB ratio and the ratio of intestinal bacteria (the ratio of the total number of cells to 100%) related to the calculation after the yeast mannan preparation X was ingested for 6 weeks are shown in Table 3.
- Example 5 In the test, feces of 2 healthy men and 1 woman are used as specimens, and each specimen is cultured in each culture medium to which yeast mannan preparation or mannose is added. The FB ratio in the mannose-added zone was compared with the FB ratio in the control zone. The FB ratio in the fifth embodiment corresponds to the “broad-broad FB ratio” in the present invention.
- yeast Mannan Preparation A 10 kg of commercially available yeast cell wall (trade name "Yeast cell wall", Asahi Group Foods Co., Ltd.) was suspended in distilled water, adjusted to pH 11.0 by adding sodium hydroxide, and boiled at 90 ° C. for 12 hours. The supernatant was collected by centrifugation and adjusted to pH 5.5 by addition of hydrochloric acid. The freeze-drying procedure yielded 2 kg of yeast mannan preparation A. The content of yeast ⁇ -mannan was 47.6%, as measured by the method described above.
- yeast mannan preparation B A commercially available reagent (trade name "Mannan from Saccharomyces cerevisiae", manufactured by Sigma Aldrich) was used. The content of yeast ⁇ -mannan was 78.8% as measured by the method described above.
- Mannose A commercially available reagent (trade name "D (+)-mannose", manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
- Each culture medium used for culture was prepared as follows. A solution obtained by adding distilled water to 59.0 g of GAM broth (product code "05422", Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) and measuring to 800 ml was autoclaved to obtain a GAM medium base.
- a 0.210 g / l yeast mannan preparation A solution was prepared using yeast mannan preparation A (content of yeast ⁇ -mannan: 47.6%). This solution is calculated to be a yeast% -mannan 1.00% solution.
- a 0.127 g / l yeast mannan preparation B solution was prepared using yeast mannan preparation B (content of yeast ⁇ -mannan: 78.8%). This solution is calculated to be a yeast% -mannan 1.00% solution.
- a 10.0 g / l mannose solution (1.00% solution) was prepared using mannose (content of mannose: 100%).
- yeast mannan preparation A solution yeast mannan preparation B solution and mannose solution were autoclaved respectively.
- the medium containing the yeast mannan preparation A was prepared by mixing 80.0 ml of the GAM medium base described above with 20 ml of the 0.210 g / l yeast mannan preparation A solution described above.
- the medium containing the yeast mannan preparation B was prepared by mixing 80.0 ml of the GAM medium base described above with 20 ml of the 0.127 g / l yeast mannan preparation B solution described above.
- the final content of yeast ⁇ -mannan in the medium of the yeast mannan preparation A-added zone and the yeast mannan preparation B-added zone is both calculated to be 0.20%.
- the medium containing mannose was prepared by mixing 80.0 ml of the above-mentioned GAM medium base and 20 ml of a 10.0 g / l mannose solution.
- the control medium was prepared by mixing 80.0 ml of the above-mentioned GAM medium base with 20 ml of distilled water.
- the culture medium described above was placed in each culture tank of a culture apparatus (“Bio Jr. 8”, manufactured by ABLE Inc.).
- a culture apparatus (“Bio Jr. 8”, manufactured by ABLE Inc.).
- human feces collected in culture swabs (Becton Dickinson) were suspended in 1 ml of 0.1 M phosphate buffered saline (pH 6.5) and charged into each culture tank.
- the supernatant is recovered by centrifugation, mixed with phenol, chloroform and isoamyl alcohol, and the centrifuged aqueous layer is precipitated with DNA by isopropanol precipitation, washed with 70% ethanol, dried and dissolved in 100 ⁇ l of TE.
- DNA extraction from the culture solution was performed and used as a template DNA for quantitative PCR.
- the proportion of bacteria belonging to the genus Pharmicutes in the eubacteria by detecting bacteria belonging to the genus Pharmicutes, bacteria belonging to the genus Bacteroides and eubacteria in the DNA extracted from the culture solution by the following method was calculated. Similarly, the proportion or occupancy rate of bacteria belonging to the Bacteroides in the eubacteria was also calculated.
- the bacteria belonging to the genus Pharmikutes can be prepared by the method of Gregoris et al. (Tristano Bacchetti De Gregoris et al. Improvement of phylum-and class-specific primers for real-time PCR quantification of bacterial taxa. Journal of Microbiological Methods 86 (2011) 351- 356) quantification by PCR using primers (forward; 5'-TGAAACTYAAAGGAATTGACG-3 ', reverse; 5'-ACCATGCACCACCTGTC-3') specific to bacteria belonging to the genus Pharmikutes
- primers forward; 5'-TGAAACTYAAAGGAATTGACG-3 ', reverse; 5'-ACCATGCACCACCTGTC-3'
- Bacteria belonging to Bacteroides were quantified by PCR using primers specific to bacteria belonging to Bacteroides of the method of Gregoris et al. .
- Quantitative PCR reagents using SsoAdvanced TM Universal SYBR (TM) Green Supermix (BIO RAD), the PCR reaction and detection, was used QuantStudio3 Real-Time PCR Systems (ThermoFisher SCIENTIFIC).
- the quantitative PCR of the bacteria belonging to the Pharmycutes and the bacteria belonging to the Bacteroides is repeated for 30 cycles of 95 ° C. for 15 seconds, 61.5 ° C. for 15 seconds and 72 ° C. for 20 seconds, following the reaction of 95 ° C. for 5 seconds. After the reaction, the mixture was reacted at 72.degree. C. for 5 seconds.
- the eubacteria are the eubacteria of the method of Furet et al. (Furet JP et al. Comparative assessment of human and farm animal faecal microbiota using real-time quantitative PCR. FEMS Microbiol Ecol. 2009 Jun; 68 (3): 351-62) It quantified by PCR using a specific primer (forward; 5'-CGGTGAATACGTTCCCGG-3 ', reverse; 5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3').
- Quantitative PCR reagents using SsoAdvanced TM Universal SYBR (TM) Green Supermix (BIO RAD), the PCR reaction and detection, was used QuantStudio3 Real-Time PCR Systems (ThermoFisher SCIENTIFIC).
- the PCR reaction was repeated 40 times at 95 ° C. for 20 seconds, 56 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds.
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Abstract
本発明は、飲食品における利用に適した、腸内のＦＢ比を低減させる作用を有する剤（腸内ＦＢ比低減剤）およびそれを含有するＦＢ比低減用食品組成物を提供する。本発明の腸内ＦＢ比低減剤は、酵母マンナンを含有することを特徴とする腸内ＦＢ比低減剤であり、本発明のＦＢ比低減用食品組成物は、当該腸内ＦＢ比低減剤を含有するＦＢ比低減用食品組成物である。ここでＦＢ比は、腸内の、［ファーミキューテス門に属する細菌の占有率／バクテロイデス門に属する細菌の占有率］として定義されるものであってもよいし、［ファーミキューテス門に属する細菌のうちクロストリジウム綱に属する細菌およびエリシペロトリクス綱に属する細菌の合計の占有率／バクテロイデス門のうちバクテロイデス綱に属する細菌の占有率］として定義されるものであってもよい。
Description
本発明は、腸内細菌叢のうち特にバクテロイデス門（Bacteroidetes）の細菌の増殖および活性化を促進するプレバイオティクスに関する。また、本発明は、酵母細胞壁から抽出されるマンナン（酵母マンナン）の用途に関する。
ヒト、マウス等の哺乳類の腸内には多種多様な細菌が生息して腸内細菌叢を作り出しているが、その中の一つとしてバクテロイデス門（Bacteroidetes）の細菌が挙げられる。バクテロイデス門の細菌の優勢菌種としては、例えば、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron；B. thetaiotaomicron）、バクテロイデス・オバタス（Bacteroides ovatus；B. ovatus）が挙げられる。B. thetaiotaomicronは、痩せ型の個体の腸内に特徴的に多いとされる７菌種のうちの一つとして知られている。近年、痩せ型の個体の腸内にはバクテロイデス門の細菌が多く、肥満型の個体の腸内にはファーミキューテス門（Firmicutes）の細菌が多いことが知られるようになり、ＦＢ比＝（Firmicutes門の占有率）/（Bacteoirdetes門の占有率）が、太りやすさの指標のひとつとして使用されるようになってきている（非特許文献１）。
特許文献１（特開２０１０－２５４５９４号公報）には、イソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナンオリゴ糖、食物繊維（例えば難消化性デキストリン）および糖吸収抑制物質（例えばサラシア属植物の抽出物）の少なくとも１種を含有する、腸内バクテロイデス増殖促進剤が記載されており、その腸内バクテロイデス増殖促進剤を摂取することにより、腸内バクテロイデスが増加し、免疫機能の増進などが期待されることなども記載されている。実施例では、各種の成分を含有する腸内バクテロイデス増殖促進剤を用いて（例えば難消化性デキストリンを含有する剤。マンナンオリゴ糖を含有する剤は用いられていない。）、腸内細菌叢に占めるバクテロイデスの割合（総菌体数を１００％とした率）が、摂取前と摂取後でどのように変化したかが示されている。
一方、ビール、清酒、パン等の製造に用いられる酵母は、その細胞壁にグルカン、マンナンなどの食物繊維を豊富に含んでいる。酵母の細胞壁から精製されるマンナンは「酵母マンナン」として知られ、整腸作用関連、鉄分吸収促進効果、抗潰瘍作用、糖尿病改善効果など、様々な作用効果を有する機能性素材として、応用研究が進められている。
Ley, RE., Turnbaugh, PJ.,Klein, S., Gordon, JI., Nature, 2006, 53, 65-69
腸内細菌のＦＢ比を改善する、つまり痩せ型の値に近づけるよう低減させることのできる保健機能食品（機能性表示食品等）、あるいはその有効成分（機能性関与成分等）となる剤が望まれているが、十分な改善効果を有するものはまだ開発されていない。
特許文献１で例示されている「食物繊維」のうち、不溶性食物繊維は不溶性であるがゆえに食品形態として用途が限定され、一方でグルコマンナンは粘性が高いため、飲料への使用が困難である。また「マンナンオリゴ糖」は、同様の構成ユニットから構成されるものであっても、その由来により分子量や分子構造において異なる化合物（の集合体）であり、性質も異なるが、特許文献１の発明との関係で記載されているものは「構成単糖の数が、通常２～９０のもの」（分子量でいえば３６０～１６２００程度のもの）である。マンナンオリゴ糖またはその他の成分を含有する腸内バクテロイデス増殖促進剤によって、単にバクテロイデスを増殖するだけでなく、ＦＢ比を大きく改善する（低減させる）ことができるかどうか、特許文献１の記載、特にその実施例のデータからは不明である。
本発明は、飲食品における利用に適した、腸内のＦＢ比を低減させる作用を有する剤、すなわち腸内ＦＢ比低減剤を提供することを一つの課題とする。
本発明者らは、酵母から抽出されたα－マンナン（本明細書において「酵母マンナン」、又は、「酵母α－マンナン」と称する。）が、腸内の、［ファーミキューテス門に属する細菌の占有率／バクテロイデス門に属する細菌の占有率］として定義されるＦＢ比（本明細書において「広義のＦＢ比」と呼ぶ。）の低減に、優れた作用を有することを見出した。また、酵母マンナンは、特許文献１に記載されているようなマンナンオリゴ糖よりも分子量が高いが（通常５～１０万またはそれ以上）、水溶性であり、水溶液の粘性は非常に低いため、飲食品への利用に適した腸内ＦＢ比低減剤となる。後記実施例において示すように、酵母マンナンを用い場合は、難消化性デキストリン等の一般的な水溶性食物繊維に比べて、ＦＢ比を著しく低減させることができる。
本発明者らはさらに、ファーミキューテス門に属する細菌およびバクテロイデス門に属する細菌のうち特定のものに注目し、［ファーミキューテス門に属する細菌のうちクロストリジウム綱に属する細菌およびエリシペロトリクス綱に属する細菌の合計の占有率／バクテロイデス門のうちバクテロイデス綱に属する細菌の占有率］として定義されるＦＢ比（本明細書において「狭義のＦＢ比」と呼ぶ。）についても、酵母マンナンは優れた低減作用を有することを見出した。
すなわち本発明は、下記の事項を包含する。
［項１］
酵母マンナンを含有することを特徴とする、腸内の、［ファーミキューテス門に属する細菌の占有率／バクテロイデス門に属する細菌の占有率］として定義されるＦＢ比の低減剤。
［項２］
酵母マンナンを含有することを特徴とする、腸内の、［ファーミキューテス門に属する細菌のうちクロストリジウム綱に属する細菌およびエリシペロトリクス綱に属する細菌の合計の占有率／バクテロイデス門のうちバクテロイデス綱に属する細菌の占有率］として定義されるＦＢ比の低減剤。
［項３］
前記バクテロイデス門に属する細菌またはバクテロイデス門のうちバクテロイデス綱に属する細菌に、Bacteroides thetaiotaomicronが含まれる、項１または２に記載のＦＢ比の低減剤。
［項４］
項１～３のいずれか一項に記載のＦＢ比の低減剤を含有する、ＦＢ比低減用食品組成物。
［項１］
酵母マンナンを含有することを特徴とする、腸内の、［ファーミキューテス門に属する細菌の占有率／バクテロイデス門に属する細菌の占有率］として定義されるＦＢ比の低減剤。
［項２］
酵母マンナンを含有することを特徴とする、腸内の、［ファーミキューテス門に属する細菌のうちクロストリジウム綱に属する細菌およびエリシペロトリクス綱に属する細菌の合計の占有率／バクテロイデス門のうちバクテロイデス綱に属する細菌の占有率］として定義されるＦＢ比の低減剤。
［項３］
前記バクテロイデス門に属する細菌またはバクテロイデス門のうちバクテロイデス綱に属する細菌に、Bacteroides thetaiotaomicronが含まれる、項１または２に記載のＦＢ比の低減剤。
［項４］
項１～３のいずれか一項に記載のＦＢ比の低減剤を含有する、ＦＢ比低減用食品組成物。
酵母マンナンを含有する本発明のＦＢ比低減剤を利用することにより、ＦＢ比低減作用に優れ、かつ摂取しやすい、ＦＢ比低減用食品組成物を製造することが可能となる。
［ＦＢ比低減剤］
本発明のＦＢ比低減剤は酵母マンナンを含有するものであり、ＦＢ比低減という用途における有効成分として酵母マンナンのみを含む（酵母マンナンからなる）ものであってもよいし、酵母マンナンに加えて同じ用途に対する他の有効成分を含むものであってもよい。この「ＦＢ比」には、本明細書中で説明する「広義のＦＢ比」と「狭義のＦＢ比」の両方が包含される。
本発明のＦＢ比低減剤は酵母マンナンを含有するものであり、ＦＢ比低減という用途における有効成分として酵母マンナンのみを含む（酵母マンナンからなる）ものであってもよいし、酵母マンナンに加えて同じ用途に対する他の有効成分を含むものであってもよい。この「ＦＢ比」には、本明細書中で説明する「広義のＦＢ比」と「狭義のＦＢ比」の両方が包含される。
（１）酵母マンナン
本発明において、酵母マンナンは、酵母由来の「α－マンナン」及び酵母由来の「α－マンナン―タンパク質複合体」の、少なくとも１種を含む物質を指す。α－マンナン及びα－マンナン―タンパク質複合体は、いずれも酵母の細胞壁を構成する主要な成分である。
本発明において、酵母マンナンは、酵母由来の「α－マンナン」及び酵母由来の「α－マンナン―タンパク質複合体」の、少なくとも１種を含む物質を指す。α－マンナン及びα－マンナン―タンパク質複合体は、いずれも酵母の細胞壁を構成する主要な成分である。
上述の「α－マンナン」は、Ｄ－マンノースがα１，６－結合、α１，２－結合、又はα１，３－結合により重合した多糖類であり、その主鎖には、マンノピラノースが１又は２以上、α１，２－結合又はα１，３－結合した側鎖が結合していてもよい。このα―マンナンは水溶性である。
一方、上述の「α－マンナン―タンパク質複合体」は、酵母の細胞壁に局在するタンパク質に、Ｎ－グリコシド結合又はＯ－グリコシド結合により、１又は２以上のα－マンナン鎖が結合した水溶性の糖タンパク質である。この糖タンパク質に結合している「α－マンナン鎖」は、上記「α－マンナン」と同様に、Ｄ－マンノースがα１，６－結合、α１，２－結合、又はα１，３－結合により重合した多糖鎖であり、その主鎖には、マンノピラノースが１又は２以上、α１，２－結合又はα１，３－結合した側鎖が結合していてもよい。
酵母マンナンは、酵母に由来している限り、どのように回収されたものであってもよい。例えば、酵母の細胞壁を酵素又は化学的処理等により損傷させて分離回収（抽出）した酵母マンナンであってもよく、酵母から培地中に放出されたものを回収した酵母マンナンであってもよい。
酵母マンナンは、商品としても容易に入手することもできる。具体的には、マンナン ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｍ７５０４（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社）等が挙げられる。また、酵母マンナンは、以下に記載するような公知のいずれかの方法を用いて、酵母から調製することができる。
（２）酵母マンナンの調製方法
酵母マンナンの調製方法としては、公知のいずれかの方法を用いることができる。例えば、酵母からその細胞壁を調製する工程として、ビール、清酒、及び、パン等の製造に用いられた酵母から酵母エキスを抽出し、残滓である酵母の細胞壁から酵母マンナンを調製する工程により、酵母マンナンを得ることができる。酵母マンナンの原料とする酵母の細胞壁としては、例えば「酵母細胞壁」の商品名でアサヒグループ食品株式会社から販売されている酵母の細胞壁や、その他の同様の商品を用いてもよい。
酵母マンナンの調製方法としては、公知のいずれかの方法を用いることができる。例えば、酵母からその細胞壁を調製する工程として、ビール、清酒、及び、パン等の製造に用いられた酵母から酵母エキスを抽出し、残滓である酵母の細胞壁から酵母マンナンを調製する工程により、酵母マンナンを得ることができる。酵母マンナンの原料とする酵母の細胞壁としては、例えば「酵母細胞壁」の商品名でアサヒグループ食品株式会社から販売されている酵母の細胞壁や、その他の同様の商品を用いてもよい。
酵母の細胞壁から酵母マンナンを調製する工程としては、例えば、酵母の細胞壁から酵母マンナン粗抽出物を得る工程（本明細書において「粗抽出工程」と呼ぶ。）を含み、必要に応じて当該工程の後にさらに、酵母マンナン粗抽出物を精製し、酵母マンナン精製物を得る工程（本明細書において「精製工程」と呼ぶ。）を含む工程が挙げられる。粗抽出工程の前に、酵母からその細胞壁を調製する工程を行う場合もあるが、予め製造された酵母の細胞壁を原料として用いる場合はそのような工程は不要となる。粗抽出工程においては、例えば、熱水（希アルカリを含む）抽出法（例えば、特公昭６４－３４７９号公報、及び、特開昭５８－１０９４２３号公報参照。）、自己消化法（例えば、特公昭５８－５７１５３号公報参照。）、細胞壁溶解酵素による酵素消化方法（例えば、特公昭５９－４０１２６号公報参照。）等の方法を用いることができる。精製工程においては、例えば、塩酸等によるタンパク質の除去処理、アルコール沈殿処理、プロテアーゼ処理、及び、クロマトグラフィーによる処理等を行うことができる。
本明細書では、酵母マンナン粗抽出物と酵母マンナン精製物とを総称して「酵母マンナン調製物」と呼ぶ。上述したような市販されている酵母マンナンも酵母マンナン調製物に該当する。酵母マンナン調製物中には、酵母由来のα－マンナンおよび／または酵母由来のα－マンナン－タンパク質複合体の他、酵母の細胞壁中に存在していたり、酵母マンナンの調製のための処理により生じたりした、様々な夾雑物（例えば、グルカン、タンパク質、マンノース等）も含まれていてもよい。酵母マンナン調製物中の酵母マンナンの含有量は、酵母マンナンとして酵母マンナン調製物を用いたときに本発明の作用効果が奏される含有量の後述する酵母α－マンナンを有する酵母マンナンである限り、特に限定されるものではない。粗抽出工程でどのような方法を用いるか、および精製工程を行うかどうか、精製工程を行う場合はどのような処理を用いるかなどは、所望の含有量の酵母α－マンナンを有する酵母マンナン調製物が得られるよう、適宜選択すればよい。当業者であれば、一般的な方法および条件に従って、本発明の作用効果を奏する上で支障のない含有量の酵母α－マンナンを有する酵母マンナンを調製することができる。言い換えれば、一般的な方法および条件に従って当業者によって調製された酵母マンナンは、本発明の作用効果を奏する上で支障のない含有量の酵母α－マンナンを有している。
上述の酵母マンナンの調製方法における原料として用いられる酵母は、上述のα－マンナン、及び、上述のα－マンナン―タンパク質複合体を細胞壁の構成成分とする酵母であれば特に限定されるものではない。このような酵母は、例えば、サッカロマイセス（Saccharomyces）属菌、シゾサッカロマイセス（Shizosaccharomyces）属菌、ピキア（Pichia）属菌、キャンディダ（Candida）属菌、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属菌、ウィリオプシス（Williopsis）属菌、デバリオマイセス（Debaryomyces）属菌、ガラクトマイセス（Galactomyces）属菌、トルラスポラ（Torulaspora）属菌、ロドトルラ（Rhodotorula）属菌、ヤロウィア（Yarrowia）属菌、ジゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属菌等の酵母であってもよく、サッカロマイセス属菌が好ましい。当業者であれば、一般的な方法および条件に従って、本発明の作用効果を奏する酵母マンナンを調製するための原料として用いる上で支障のない酵母を培養することができる。言い換えれば、一般的な方法および条件に従って当業者によって培養された酵母は、本発明の作用効果を奏する酵母マンナンを調製する上で支障のない原料として用いることができる。
また、上述の酵母マンナンの原料として用いられる酵母は、可食性の酵母であることが好ましく、パン酵母又はビール酵母として使用されている酵母であることがより好ましい。具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）、サッカロマイセス・パラドキサス（Saccharomyces paradoxus）、サッカロマイセス・ミカタエ（Saccharomyces mikatae）、サッカロマイセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Saccharomyces kudriavzevii）、クルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、キャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・リポリティカ（Candida lypolitica）、及び、キャンディダ・サケ（Candida sake）等が挙げられる。上述の酵母マンナンの原料として用いられる酵母は、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・パストリアヌス、及び、サッカロマイセス・バヤヌスであることが好ましい。
（３）酵母α－マンナンの含有率の算出方法
上記の調製方法により得られる酵母マンナン調製物には、酵母由来のα－マンナン－タンパク質複合体（つまりα－マンナン鎖と結合した状態のタンパク質部分）も含まれていてもよい。ここで、本明細書において、酵母由来のα－マンナンと、酵母由来のα－マンナン－タンパク質複合体のうちのα－マンナン鎖部分とをあわせて「酵母α－マンナン」と総称することとする（「酵母α－マンナン」は、純粋な酵母マンナンということもできる）。酵母マンナン中の酵母α－マンナンの含有率は、酵母マンナンの調製方法によって多少変動するが概ね一定の範囲内にあり、通常は３０～９５％である。酵母α－マンナンの含有率は、酵母マンナンとして酵母マンナン調製物を用いたときに本発明の作用効果が奏される限り特に限定されるものではない。当業者であれば、一般的な方法および条件に従って、本発明の作用効果を奏する上で支障のない酵母α－マンナンの含有率を有する酵母マンナンを調製することができる。言い換えれば、一般的な方法および条件に従って当業者によって調製された酵母マンナンは、本発明の作用効果を奏する上で支障のない、酵母α－マンナンの含有率を有している。
上記の調製方法により得られる酵母マンナン調製物には、酵母由来のα－マンナン－タンパク質複合体（つまりα－マンナン鎖と結合した状態のタンパク質部分）も含まれていてもよい。ここで、本明細書において、酵母由来のα－マンナンと、酵母由来のα－マンナン－タンパク質複合体のうちのα－マンナン鎖部分とをあわせて「酵母α－マンナン」と総称することとする（「酵母α－マンナン」は、純粋な酵母マンナンということもできる）。酵母マンナン中の酵母α－マンナンの含有率は、酵母マンナンの調製方法によって多少変動するが概ね一定の範囲内にあり、通常は３０～９５％である。酵母α－マンナンの含有率は、酵母マンナンとして酵母マンナン調製物を用いたときに本発明の作用効果が奏される限り特に限定されるものではない。当業者であれば、一般的な方法および条件に従って、本発明の作用効果を奏する上で支障のない酵母α－マンナンの含有率を有する酵母マンナンを調製することができる。言い換えれば、一般的な方法および条件に従って当業者によって調製された酵母マンナンは、本発明の作用効果を奏する上で支障のない、酵母α－マンナンの含有率を有している。
酵母マンナン調製物中の酵母α－マンナンの含有率は、次の方法により算出する。まず、酵母マンナン調製物の検体（Ａ）中のマンノース、および、酵母マンナン調製物を加水分解した検体（Ｂ）中のマンノースを各々定量する。ここで、検体（Ｂ）は、検体（Ａ）を硫酸で処理することにより、検体（Ａ）中の全ての糖鎖を単糖に加水分解した後、中和された検体である。各検体中のマンノースは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：high performance liquid chromatography）により定量することができ、一般財団法人 日本食品分析センターで実施されている方法で定量してもよい。続いて、検体（Ｂ）のマンノース量から検体（Ａ）のマンノース量を差し引いた値に対して、酵母α－マンナンの加水分解により結合した水の量を減じるため、０．９を乗じることにより酵母マンナン調製物中の酵母α－マンナンの含有量を算出する。最後に、検体（Ａ）の重量に対する、酵母α－マンナンの含有量の割合を算出することにより、酵母マンナン調製物中の酵母α－マンナンの割合、すなわち酵母α－マンナンの含有率を算出することができる。
本発明の各剤は、酵母α－マンナンの含有率が１００％である酵母マンナン調製物を用いる必要はなく、酵母α－マンナンの含有率が上記のような一般的な範囲にある酵母マンナン調製物を用いてもよい。
本発明のＦＢ比低減剤の剤型は特に限定されるものではなく、粉末状であってもよいし、水または他の溶媒を用いた溶液状（分散液状）であってもよい。本発明のＦＢ比低減剤は、典型的にはＦＢ比低減用食品組成物に配合して使用されるので、そのような食品組成物の製造に適した剤型とすることが好ましい。
本発明において、「広義のＦＢ比」は、［ファーミキューテス門に属する細菌の占有率／バクテロイデス門に属する細菌の占有率］として定義され、「狭義のＦＢ比」は、［ファーミキューテス門に属する細菌のうちクロストリジウム綱に属する細菌およびエリシペロトリクス綱に属する細菌の合計の占有率／バクテロイデス門のうちバクテロイデス綱に属する細菌の占有率］として定義される。
バクテロイデス門（Bacteroidetes）には、バクテロイデス綱（Bacteroides）、フラボバクテリウム綱（Flavobacteria）、スフィンゴバクテリウム綱（Sphingobacteria）などが含まれる。
バクテロイデス綱には、バクテロイデス属（Bacteroides）、パラバクテロイデス属（Parabacteroides）、プレボテラ属（Prevotella）、パラプレボテラ属（Paraprevotella）、アリスティピス属（Alistipes）、バルネシエラ属（Barnesiella）、ブチリシモナス属（Butyricimonas）、オドリバクター属（Odoribacter）などが含まれる。
フラボバクテリウム綱には、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）などが含まれる。スフィンゴバクテリウム綱には、スフィンゴバクテリウム属（Sphingobacterium）などが含まれる。
バクテロイデス綱には、バクテロイデス属（Bacteroides）、パラバクテロイデス属（Parabacteroides）、プレボテラ属（Prevotella）、パラプレボテラ属（Paraprevotella）、アリスティピス属（Alistipes）、バルネシエラ属（Barnesiella）、ブチリシモナス属（Butyricimonas）、オドリバクター属（Odoribacter）などが含まれる。
フラボバクテリウム綱には、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）などが含まれる。スフィンゴバクテリウム綱には、スフィンゴバクテリウム属（Sphingobacterium）などが含まれる。
腸内細菌叢において、フラボバクテリウム綱の細菌およびスフィンゴバクテリウム綱の細菌は、検出はされるものの占有率は非常に低い。そのため、ＦＢ比を産出する際には、「バクテロイデス門に属する細菌の占有率」は実質的に「バクテロイデス綱に属する細菌の占有率」とみなしてもよい。また、本発明において、ＦＢ比を算出する際の「バクテロイデス門に属する細菌」または「バクテロイデス門のうちバクテロイデス綱に属する細菌」には、Bacteroides thetaiotaomicronが含まれることが好ましい。バクテロイデス綱に属する細菌には、Bacteroides thetaiotaomicronの他、Bacteroides ovatusなども含まれる。
ファーミキューテス門（Firmicutes）には、クロストリジウム綱（Clostridia）、エリシペロトリクス綱（Erysipelotrichi）、バシラス綱などが含まれる。
クロストリジウム綱には、クロストリジウム属（Clostridium）、ブラウティア属（Blautia）、SMB53、コプロコッカス属（Coprococcus）、ドレア属（Dorea）、ラクノスピラ属（Lachnospira）、ロゼブリア属（Roseburia）、ルミノコッカス属（Ruminococcus）、ベイロネラ属（Veillonella）などが含まれる。
エリシペロトリクス綱には、アロバキュラム属（Allobaculum）、カテニバクテリウム属（Catenibacterium）、コプロバシラス属（Coprobacillus）、ホルデマニア属（Holdemania）などが含まれる。
バシラス綱には、バシラス属（Bacillus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、ペディオコッカス属(Pediococcus)、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ワイセラ属（Weissella）などが含まれる。
クロストリジウム綱には、クロストリジウム属（Clostridium）、ブラウティア属（Blautia）、SMB53、コプロコッカス属（Coprococcus）、ドレア属（Dorea）、ラクノスピラ属（Lachnospira）、ロゼブリア属（Roseburia）、ルミノコッカス属（Ruminococcus）、ベイロネラ属（Veillonella）などが含まれる。
エリシペロトリクス綱には、アロバキュラム属（Allobaculum）、カテニバクテリウム属（Catenibacterium）、コプロバシラス属（Coprobacillus）、ホルデマニア属（Holdemania）などが含まれる。
バシラス綱には、バシラス属（Bacillus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、ペディオコッカス属(Pediococcus)、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ワイセラ属（Weissella）などが含まれる。
狭義のＦＢ比の算出には、ファーミキューテス門に属する細菌のうち、クロストリジウム綱に属する細菌およびエリシペロトリクス綱に属する細菌の合計の占有率を用いる。これはファーミキューテス門に属する細菌のうち、一般的に善玉菌と認識されることの多い乳酸菌、枯草菌などを含むバシラス綱を除外するためである。
本発明のＦＢ比低減剤、またはその有効成分として含有される酵母マンナンは、それを摂取することにより、ヒト、マウス、その他の哺乳類の腸内のＦＢ比を低減させることができる。ＦＢ比は、試験条件によって、例えば実験動物を用いた試験における給餌条件（摂取量や、普通食か高脂肪食か）によって変動するものであり、効果を一律に数値範囲等で規定することは困難である。しかしながら少なくとも、比較可能なように適切に設定された試験条件下で、ＦＢ比低減剤の摂取後のＦＢ比を、摂取前のＦＢ比よりも低下させることができればよい。また、ＦＢ比低減剤の摂取後のＦＢ比は、コントロール群（ＦＢ比低減剤を摂取しない群、またはセルロースを摂取した群）と比較して、好ましくはさらに「難消化性デキストリン」など他の成分を摂取した群と比較して、小さければよい。本発明の一つの側面において、本発明のＦＢ比低減剤は、コントロール群（ＦＢ比低減剤を摂取しない群、またはセルロースを摂取した群）と比較して、ＦＢ比の数値を、好ましくは８５％以下、より好ましくは７０％以下、さらに好ましくは６０％以下に低減する（低減幅としては、それぞれ１５％以上、３０％以上および４０％以上とする）ことができる。この際、低減の限度は特にないが、必要であれば例えば、好ましくは１０％まで、より好ましくは１５％まで、さらに好ましくは２０％までの低減とする（低減幅としては、それぞれ９０％まで、８５％までおよび８０％までとする）ことができる。
「広義のＦＢ比」および「狭義のＦＢ比」を算出するための、各綱または属の細菌の占有率は、腸内細菌叢の解析のために一般的に用いられている手法により測定することができる。例えば、糞便検体からＤＮＡを調製し、微生物の系統解析で利用されるリボソームＲＮＡ（代表的には１６Ｓ ｒＲＮＡ）領域を増幅し、次世代シーケンサーを用いて大量の塩基配列を取得した後、データベースに対する相同性検索および系統分類解析を実施することにより、所望の細菌の占有率を測定することができる。
［食品組成物］
本発明のＦＢ比低減用食品組成物は、本発明のＦＢ比低減剤および食品組成物の形態に適合したその他の成分を含有するものである。なお、ＦＢ比低減剤の有効成分である酵母マンナンを、細胞壁を有する酵母の形態で含有するが、組成物として製造されていない天然の素材またはその調理・加工品、例えば酵母が残存している発酵食品自体は、本発明の食品組成物には該当しない。
本発明のＦＢ比低減用食品組成物は、本発明のＦＢ比低減剤および食品組成物の形態に適合したその他の成分を含有するものである。なお、ＦＢ比低減剤の有効成分である酵母マンナンを、細胞壁を有する酵母の形態で含有するが、組成物として製造されていない天然の素材またはその調理・加工品、例えば酵母が残存している発酵食品自体は、本発明の食品組成物には該当しない。
食品組成物の形態は特に限定されるものではなく、本発明のＦＢ比低減剤を配合することのできる、公知の各種の飲食品と同様の形態とすることができる。例えば、錠剤、カセル剤、散剤（顆粒剤）、その他の剤型のサプリメント（栄養補助食品）；清涼飲料（炭酸飲料、ノンアルコール飲料、ジュース、コーヒー飲料、茶系飲料、ミネラルウォーター、スポーツ飲料など）、乳飲料、豆乳飲料、発酵乳、乳酸菌飲料、ココア、アルコール飲料（ビール、発泡酒、その他の醸造酒、リキュール、日本酒、甘酒、ワイン、焼酎など）、インスタント粉末から調製される飲料、その他の飲料；パン、シリアル、菓子類（ビスケット、クッキー、チョコレートなど）、加工品（かつおぶし、塩辛、くさやなど）、漬物（ぬか漬け、キムチ、ピクルスなど）、発酵食品（納豆、チーズ、ヨーグルトなど）、調味料（醤油、味噌、酢など）、食品添加物、その他の食品が挙げられる。
食品組成物中のＦＢ比低減剤の含有量、またはその有効成分としての酵母マンナンの含有量は、本発明によるＦＢ比低減の効果が奏される限り特に限定されるものではない。食品組成物の形態や製造方法などを考慮して、また必要に応じて一食または一日あたりの有効成分量などを考慮して、適宜設定することができる。本発明のＦＢ比低減剤として、酵母マンナン調製物を用いる場合は、その酵母マンナン調製物の重量と、その酵母マンナン調製物中に含まれる酵母α－マンナンの割合（すなわち、酵母α－マンナンの含有率）とによって、有効成分としての酵母α－マンナンの含有量が本発明の作用効果を奏する範囲となるよう調節することができる。
例えば、本発明の食品組成物がサプリメントである場合は、ＦＢ比低減剤の含有量は、そこに含まれる酵母α－マンナンの含有量が、食品組成物（サプリメント）の全質量に対して、通常５％以上、好ましくは１０％以上となり、通常７５％以下とすることができる。本発明の食品組成物が飲料である場合は、ＦＢ比低減剤の含有量は、そこに含まれる酵母α－マンナンの含有量が、食品組成物（飲料）の全質量に対して、通常０．０４％以上、好ましくは０．１％以上となり、通常７．５％以下、好ましくは４％以下とすることができる。
本発明の食品組成物の、ＦＢ比低減剤以外の原料または成分は、従来の食品組成物と同様とすることができる。
例えば、サプリメントの形態をとる本発明の食品組成物は、ＦＢ比低減剤に加えて、一般的ないし公知のサプリメントが含有する各種の成分、例えば賦形剤、甘味料、着色料、香料およびその他の成分から選ばれる少なくとも１種を含有することができる。
飲料の形態をとる本発明の食品組成物は、ＦＢ比低減剤に加えて、一般的ないし公知の飲料が含有する各種の成分、例えば水（炭酸水）、コーヒー抽出物、茶葉抽出物、果汁、その他の植物原料抽出物、乳、豆乳、発酵乳、甘味料、酸味料、着色料および香料から選ばれる少なくとも１種を含有することができる。
このような本発明の食品組成物は、成分として本発明のＦＢ比低減剤を加える工程をさらに含むこと以外は、従来の食品組成物と同様の方法により製造することができる。
食品組成物は、保健機能食品（すなわち、栄養機能食品、特定保健用食品および機能性表示食品）として、また治療食（すなわち、治療の目的を果たすもの、又は、医師が食事箋を出し、それに従い栄養士等が作成した献立に基づいて調理されたもの。）、食事療法食、介護食などとして、製造することもできる。
食品組成物の一食分または一日あたりの摂取目安量（有効成分量）は、ＦＢ比を低減させる対象の年齢、体重、性別や、摂取前のＦＢ比その他の指標値などに応じて、また非臨床的または臨床的な試験結果等に基づいて、適宜設定することができる。食品組成物の摂取期間も適宜設定することができ、長期間に亘って繰り返し、また日常的に、摂取することが好ましい。本発明の一つの側面において、本発明の食品組成物は、そこに含まれる有効成分としての酵母α－マンナンの摂取量が、好ましくは０．１ｇ／日以上、より好ましくは０．２ｇ／日以上、さらに好ましくは０．３ｇ／日以上であり、好ましくは４ｇ／日以下、より好ましくは２．５ｇ／日以下、さらに好ましくは１．５ｇ／日以下となるよう摂取されるものである。
本発明の食品組成物の「ＦＢ比低減」という用途は、直接的にまたは間接的に表示することができる。直接的な表示の例は、製品自体、パッケージ、容器、ラベル、タグ等の有体物への記載であり、間接的な表示の例は、ウェブサイト、店頭、展示会、看板、掲示板、新聞、雑誌、テレビ、ラジオ、郵送物、電子メール等の場所または手段による、広告・宣伝活動である。本発明の食品組成物を機能性表示食品として製造する場合は、例えば「ＦＢ比を低減させる（改善する）」のように、機能性成分として含まれる酵母マンナンの作用効果に基づく機能性を表示することができる。
［本発明の他の側面］
本発明は一つの側面において、有効量の酵母マンナンを摂取させることを含む、ヒトおよびヒト以外の哺乳類（例えばマウス等の実験動物、またはペット）の腸内の、［ファーミキューテス門に属する細菌の占有率／バクテロイデス門に属する細菌の占有率］として定義される（広義の）ＦＢ比を低減させる方法を提供する。本発明は一つの側面において、有効量の酵母マンナンを摂取させることを含む、ヒトおよびヒト以外の哺乳類（例えばマウス等の実験動物、またはペット）の腸内の、［ファーミキューテス門に属する細菌のうちクロストリジウム綱に属する細菌およびエリシペロトリクス綱に属する細菌の合計の占有率／バクテロイデス門のうちバクテロイデス綱に属する細菌の占有率］として定義される（狭義の）ＦＢ比を低減させる方法を提供する。これらの「（広義または狭義の）ＦＢ比低減方法」の発明は、上述した「ＦＢ比低減剤」および「ＦＢ比低減用食品組成物」の発明から当業者であれば転換可能であり、本明細書に記載した「ＦＢ比低減剤」および「ＦＢ比低減用食品組成物」に関する事項を同様に適用することができる。
本発明は一つの側面において、有効量の酵母マンナンを摂取させることを含む、ヒトおよびヒト以外の哺乳類（例えばマウス等の実験動物、またはペット）の腸内の、［ファーミキューテス門に属する細菌の占有率／バクテロイデス門に属する細菌の占有率］として定義される（広義の）ＦＢ比を低減させる方法を提供する。本発明は一つの側面において、有効量の酵母マンナンを摂取させることを含む、ヒトおよびヒト以外の哺乳類（例えばマウス等の実験動物、またはペット）の腸内の、［ファーミキューテス門に属する細菌のうちクロストリジウム綱に属する細菌およびエリシペロトリクス綱に属する細菌の合計の占有率／バクテロイデス門のうちバクテロイデス綱に属する細菌の占有率］として定義される（狭義の）ＦＢ比を低減させる方法を提供する。これらの「（広義または狭義の）ＦＢ比低減方法」の発明は、上述した「ＦＢ比低減剤」および「ＦＢ比低減用食品組成物」の発明から当業者であれば転換可能であり、本明細書に記載した「ＦＢ比低減剤」および「ＦＢ比低減用食品組成物」に関する事項を同様に適用することができる。
本発明は一つの側面において、ヒトおよびヒト以外の哺乳類（例えばマウス等の実験動物、またはペット）の腸内の、［ファーミキューテス門に属する細菌の占有率／バクテロイデス門に属する細菌の占有率］として定義される（広義の）ＦＢ比を低減させるための食品組成物の製造における酵母マンナンの使用を提供する。本発明は一つの側面において、ヒトおよびヒト以外の哺乳類（例えばマウス等の実験動物、またはペット）の腸内の、［ファーミキューテス門に属する細菌のうちクロストリジウム綱に属する細菌およびエリシペロトリクス綱に属する細菌の合計の占有率／バクテロイデス門のうちバクテロイデス綱に属する細菌の占有率］として定義される（狭義の）ＦＢ比を低減させるための食品組成物の製造における酵母マンナンの使用を提供する。このような「酵母マンナンの使用」は、上述した「ＦＢ比低減剤」および「ＦＢ比低減用食品組成物」の発明から当業者であれば転換可能であり、本明細書に記載した「ＦＢ比低減剤」および「ＦＢ比低減用食品組成物」に関する事項を同様に適用することができる。
（酵母α－マンナンの含有率の算出方法）
本実施例では、一般財団法人 日本食品分析センターに委託し、後述するようにして得られた酵母マンナン調製物Ｘ、ＡおよびＢそれぞれの検体（ＳＡ）中のマンノース、ならびに酵母マンナン調製物Ｘ、ＡおよびＢそれぞれを加水分解した検体（ＳＢ）中のマンノースを各々定量した。その定量結果に基づいて、酵母マンナン調製物Ｘ、ＡおよびＢ中の酵母α－マンナンの含有率を上述した算出方法により算出した。
本実施例では、一般財団法人 日本食品分析センターに委託し、後述するようにして得られた酵母マンナン調製物Ｘ、ＡおよびＢそれぞれの検体（ＳＡ）中のマンノース、ならびに酵母マンナン調製物Ｘ、ＡおよびＢそれぞれを加水分解した検体（ＳＢ）中のマンノースを各々定量した。その定量結果に基づいて、酵母マンナン調製物Ｘ、ＡおよびＢ中の酵母α－マンナンの含有率を上述した算出方法により算出した。
一般財団法人 日本食品分析センターにおける、検体（ＳＡ）および検体（ＳＢ）中のマンノースの定量方法の具体的な手順は次の通りである。検体（ＳＡ）および検体（ＳＢ）それぞれ０．６ｇを採取し、濃度７２％の硫酸に添加し、室温で１時間撹拌した。検体溶液の硫酸の濃度を４％に希釈した後、オートクレーブ（１２１℃）中で１時間を加熱した。検体溶液を室温に冷却後、中和して、水で２００ｍＬに定量した。定量後の検体溶液を濾紙で濾過し、濾液を水で５０倍に希釈し、希釈液をさらにメンブランフィルターで濾過した。この濾液を下記の操作条件による高速液体クロマトグラフ法で分析し、濾液中のマンノースの濃度を測定して、検体（ＳＡ）および検体（ＳＢ）中のマンノースを定量した。
機種：ＬＣ－２０ＡＤ（株式会社島津製作所）
検出器：蛍光分光光度計ＲＦ－２０Ａxs（株式会社島津製作所）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＵＧＡＲ ＡＸＩ，φ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ（東ソー株式会社）
カラム温度：６０℃
移動相：０．５ｍｏｌ／Ｌ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．７）
流量：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：２０μＬ
蛍光励起波長：３２０ｎｍ
蛍光測定波長：４３０ｎｍ
ポストカラム：反応液；１ｗ／ｖ％ Ｌ－アルギニン溶液
反応液流量；０．７ｍＬ／ｍｉｎ
反応温度；１５０℃
機種：ＬＣ－２０ＡＤ（株式会社島津製作所）
検出器：蛍光分光光度計ＲＦ－２０Ａxs（株式会社島津製作所）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＵＧＡＲ ＡＸＩ，φ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ（東ソー株式会社）
カラム温度：６０℃
移動相：０．５ｍｏｌ／Ｌ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．７）
流量：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：２０μＬ
蛍光励起波長：３２０ｎｍ
蛍光測定波長：４３０ｎｍ
ポストカラム：反応液；１ｗ／ｖ％ Ｌ－アルギニン溶液
反応液流量；０．７ｍＬ／ｍｉｎ
反応温度；１５０℃
［実施例１～４及び比較例１～３］
（酵母マンナン調製物Ｘ）
市販の酵母の細胞壁（商品名「酵母細胞壁」、アサヒグループ食品株式会社）１０ｋｇを蒸留水に懸濁し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ１１．０に調整した後、９０℃で１２時間煮沸した。遠心分離により上清を回収し、塩酸を添加してｐＨ５．５に調整した。凍結乾燥操作により２ｋｇの酵母マンナン調製物Ｘを得た。上述した方法により、酵母α－マンナンの含有率を算出したところ、５０％であった。
（酵母マンナン調製物Ｘ）
市販の酵母の細胞壁（商品名「酵母細胞壁」、アサヒグループ食品株式会社）１０ｋｇを蒸留水に懸濁し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ１１．０に調整した後、９０℃で１２時間煮沸した。遠心分離により上清を回収し、塩酸を添加してｐＨ５．５に調整した。凍結乾燥操作により２ｋｇの酵母マンナン調製物Ｘを得た。上述した方法により、酵母α－マンナンの含有率を算出したところ、５０％であった。
実施例１～４の「酵母マンナン（２％）」および「酵母マンナン（５％）」はそれぞれ、飼料（「ＡＩＮ９３Ｇ」、オリエンタル酵母工業社製）の質量に対して、２％および５％の質量の酵母マンナン調製物Ｘを混合したことを意味する。
（セルロース及び難消化性デキストリン）
比較例１では、セルロース（「セオラスＵＦ－Ｆ７０２」、旭化成ケミカルズ社製）を使用した。また、比較例２では、難消化性デキストリン（「ファイバーソル２」、松谷化学社製）を使用した。
比較例１では、セルロース（「セオラスＵＦ－Ｆ７０２」、旭化成ケミカルズ社製）を使用した。また、比較例２では、難消化性デキストリン（「ファイバーソル２」、松谷化学社製）を使用した。
比較例１および２の「セルロース（５％）」および「難消化性デキストリン（５％）」は、飼料（「ＡＩＮ９３Ｇ」、オリエンタル酵母工業製）の質量に対してセルロースまたは難消化性デキストリンを各々混合した重量比率を意味する。
（実験１：通常食）
上述したように、酵母マンナン調製物Ｘ、セルロース、及び、難消化性デキストリンを飼料（「ＡＩＮ９３Ｇ」、オリエンタル酵母工業社製）に各々混合して各試験飼料を調製した。４週齢のオスのＩＣＲマウスを９匹ずつに分け、各試験飼料を６週間自由摂食させた。マウス糞便から抽出したＤＮＡを鋳型とし、下記の塩基配列を有するフォワードプライマー（配列番号１）およびリバースプライマー（配列番号２）を用いて、イルミナ（株）のプロトコール（下記資料１）に従ってライブラリーを調製し、MiSeq Reagent Kit version 2（300cycle）（イルミナ（株））およびMiSeqを用いて１６Ｓ ｒＤＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ）のＶ４領域のシーケンスを行なった。得られたシーケンスはQIIME v.1.8.0（下記資料２）、ＲおよびＳＰＳＳを用いて解析し、広義のＦＢ比および狭義のＦＢ比を算出した。
配列番号１：5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'
配列番号２：5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'
資料１：16S Metagenomic Sequencing Library Preparation. (http://support.illumina.com/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf).
資料２：QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. Nat Methods (2010) 7, 335.
上述したように、酵母マンナン調製物Ｘ、セルロース、及び、難消化性デキストリンを飼料（「ＡＩＮ９３Ｇ」、オリエンタル酵母工業社製）に各々混合して各試験飼料を調製した。４週齢のオスのＩＣＲマウスを９匹ずつに分け、各試験飼料を６週間自由摂食させた。マウス糞便から抽出したＤＮＡを鋳型とし、下記の塩基配列を有するフォワードプライマー（配列番号１）およびリバースプライマー（配列番号２）を用いて、イルミナ（株）のプロトコール（下記資料１）に従ってライブラリーを調製し、MiSeq Reagent Kit version 2（300cycle）（イルミナ（株））およびMiSeqを用いて１６Ｓ ｒＤＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ）のＶ４領域のシーケンスを行なった。得られたシーケンスはQIIME v.1.8.0（下記資料２）、ＲおよびＳＰＳＳを用いて解析し、広義のＦＢ比および狭義のＦＢ比を算出した。
配列番号１：5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'
配列番号２：5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'
資料１：16S Metagenomic Sequencing Library Preparation. (http://support.illumina.com/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf).
資料２：QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. Nat Methods (2010) 7, 335.
６週間にわたる試験期間中の摂餌量および体重に有意差はなかった。試験期間終了時の腸内細菌の総菌数（約1011copy数／g feces）は各群の間に有意差はなかった（図示せず）。
各試験飼料を６週間摂取させた後の広義のＦＢ比とその算出に関係する腸内細菌の割合（総菌体を１００％とした率）を表１に示す。また、この表に対応する、バクテロイデス門、ファーミキューテス門、およびその他の腸内細菌の割合を表した円グラフを図１に示す。
各試験飼料を６週間摂取させた後の狭義のＦＢ比とその算出に関係する腸内細菌の割合（総菌体を１００％とした率）を表２に示す。
（実験２：高脂肪食）
６週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１０匹ずつに分け、高脂肪食ＨＦＤ（オリエンタル酵母工業製）で飼育しながら、酵母マンナン調製物Ｘを３００または１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで経口（５日／週）にて６週間投与し、実験１と同様の手順で１６Ｓ ｒＤＮＡの解析を行い、広義のＦＢ比および狭義のＦＢ比を算出した。
６週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１０匹ずつに分け、高脂肪食ＨＦＤ（オリエンタル酵母工業製）で飼育しながら、酵母マンナン調製物Ｘを３００または１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで経口（５日／週）にて６週間投与し、実験１と同様の手順で１６Ｓ ｒＤＮＡの解析を行い、広義のＦＢ比および狭義のＦＢ比を算出した。
酵母マンナン調製物Ｘを６週間摂取させた後の広義のＦＢ比とその算出に関係する腸内細菌の割合（総菌体を１００％とした率）を表３に示す。
酵母マンナン調製物Ｘを６週間摂取させた後の狭義のＦＢ比とその算出に関係する腸内細菌の割合（総菌体を１００％とした率）を表４に示す。
［実施例５］
試験には、健康な男性２名と女性１名の糞便を検体として使用し、それぞれの検体を酵母マンナン調製物またはマンノースを添加した各培地で培養し、検体毎に酵母マンナン調製物添加区およびマンノース添加区のＦＢ比を対照区のＦＢ比と比較した。なお、実施例５におけるＦＢ比は、本発明における「広義のＦＢ比」に該当する。
試験には、健康な男性２名と女性１名の糞便を検体として使用し、それぞれの検体を酵母マンナン調製物またはマンノースを添加した各培地で培養し、検体毎に酵母マンナン調製物添加区およびマンノース添加区のＦＢ比を対照区のＦＢ比と比較した。なお、実施例５におけるＦＢ比は、本発明における「広義のＦＢ比」に該当する。
（酵母マンナン調製物Ａ）
市販の酵母の細胞壁（商品名「酵母細胞壁」、アサヒグループ食品株式会社）１０ｋｇを蒸留水に懸濁し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ１１．０に調整した後、９０℃で１２時間煮沸した。遠心分離により上清を回収し、塩酸を添加してｐＨ５．５に調整した。凍結乾燥操作により２ｋｇの酵母マンナン調製物Ａを得た。上述した方法で測定したところ、酵母α－マンナンの含有率は４７．６％であった。
市販の酵母の細胞壁（商品名「酵母細胞壁」、アサヒグループ食品株式会社）１０ｋｇを蒸留水に懸濁し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ１１．０に調整した後、９０℃で１２時間煮沸した。遠心分離により上清を回収し、塩酸を添加してｐＨ５．５に調整した。凍結乾燥操作により２ｋｇの酵母マンナン調製物Ａを得た。上述した方法で測定したところ、酵母α－マンナンの含有率は４７．６％であった。
（酵母マンナン調製物Ｂ）
市販の試薬（商品名「マンナン ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」、シグマアルドリッチ社製）を用いた。上述した方法で測定したところ、酵母α－マンナンの含有率は７８．８％であった。
市販の試薬（商品名「マンナン ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」、シグマアルドリッチ社製）を用いた。上述した方法で測定したところ、酵母α－マンナンの含有率は７８．８％であった。
（マンノース）
市販の試薬（商品名「Ｄ（＋）－マンノース」、和光純薬社製）を用いた。
市販の試薬（商品名「Ｄ（＋）－マンノース」、和光純薬社製）を用いた。
（培養方法）
各検体に対して、培養は、Ｔａｋａｇｉら（Ｔａｋａｇｉ， Ｒ ｅｔ ａｌ． Ａ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｂａｔｃｈ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ Ｓｉｍｕｌａｔｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１ （２０１６））の方法を参考に実施した。
各検体に対して、培養は、Ｔａｋａｇｉら（Ｔａｋａｇｉ， Ｒ ｅｔ ａｌ． Ａ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｂａｔｃｈ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ Ｓｉｍｕｌａｔｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１ （２０１６））の方法を参考に実施した。
培養に使用された各培地は、以下のように調製した。
ＧＡＭブイヨン（製品コード「０５４２２」、日水製薬株式会社）５９．０ｇに蒸留水を加えて８００ｍｌにメスアップした溶液をオートクレーブし、ＧＡＭ培地ベースとした。
ＧＡＭブイヨン（製品コード「０５４２２」、日水製薬株式会社）５９．０ｇに蒸留水を加えて８００ｍｌにメスアップした溶液をオートクレーブし、ＧＡＭ培地ベースとした。
酵母マンナン調製物Ａ（酵母α－マンナンの含有率：４７．６％）を用いて０．２１０ｇ／ｌ酵母マンナン調製物Ａ溶液を調製した。本溶液は、酵母α－マンナン１．００％溶液と計算される。酵母マンナン調製物Ｂ（酵母α－マンナンの含有率：７８．８％）を用いて０．１２７ｇ／ｌ酵母マンナン調製物Ｂ溶液を調製した。本溶液は、酵母α－マンナン１．００％溶液と計算される。マンノース（マンノースの含有率：１００％）を用いて１０．０ｇ／ｌマンノース溶液（１．００％溶液）を調製した。
上述した酵母マンナン調製物Ａ溶液、酵母マンナン調製物Ｂ溶液、マンノース溶液をそれぞれオートクレーブした。
酵母マンナン調製物Ａ添加区の培地は、上述したＧＡＭ培地ベース８０．０ｍｌと上述した０．２１０ｇ／ｌ酵母マンナン調製物Ａ溶液２０ｍｌとを混合して調製した。酵母マンナン調製物Ｂ添加区の培地は、上述したＧＡＭ培地ベース８０．０ｍｌと上述した０．１２７ｇ／ｌ酵母マンナン調製物Ｂ溶液２０ｍｌを混合して調製した。酵母マンナン調製物Ａ添加区と酵母マンナン調製物Ｂ添加区の培地中の酵母α－マンナンの最終含有率は、ともに０．２０％と算出される。マンノース添加区の培地は、上述したＧＡＭ培地ベース８０．０ｍｌと１０．０ｇ／ｌマンノース溶液２０ｍｌを混合して調製した。対照区の培地は、上述したＧＡＭ培地ベース８０．０ｍｌと蒸留水２０ｍｌを混合して調製した。
培養装置（「Ｂｉｏ Ｊｒ．８」、ＡＢＬＥ社製）の各培養槽に上述した培地をそれぞれ入れた。検体として、カルチャースワブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に採取したヒト糞便を、１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝整理食塩水（ｐＨ６．５）で懸濁して、各培養槽に投入した。窒素と二酸化炭素の混合ガス（窒素：二酸化炭素＝４：１）を１５ｍｌ／ｍｉｎで通気しながら、３７℃で３０時間、培養した。
（ＦＢ比の算出）
上述の培養後に採取した各培養液からＤＮＡを抽出して、各ＦＢ比を算出した。
上述の培養後に採取した各培養液からＤＮＡを抽出して、各ＦＢ比を算出した。
培養液からのＤＮＡの抽出は、Ｔａｋａｇｉら（Ｔａｋａｇｉ， Ｒ ｅｔ ａｌ． Ａ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｂａｔｃｈ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ Ｓｉｍｕｌａｔｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１ （２０１６））の方法に従って行った。培養液２００μｌに、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ）飽和フェノール５００μｌ、溶菌Ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，０．５Ｍ ＥＤＴＡ）２５０μｌ、１０％ ＳＤＳ ５０μｌ、ガラスビーズ（φ０．１ｍｍ）０．３ｇを添加し、ＦａｓｔＰｒｅｐ２４ （ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用い、パワーレベル５．０で３０秒間縦方向に激しく振とうした。遠心分離により上清を回収しフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールと混合して遠心分離した水層をイソプロパノール沈殿によりＤＮＡを析出させた後に、７０％エタノールで洗浄、乾燥して、１００μｌのＴＥに溶解することで、培養液からのＤＮＡ抽出を行い、定量ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして使用した。
培養液から抽出されたＤＮＡ中のファーミキューテス門に属する細菌、バクテロイデス門に属する細菌および真正細菌を以下の方法で検出し、真正細菌中に占めるファーミキューテス門に属する細菌の割合すなわち占有率を算出した。同様にして真正細菌中に占めるバクテロイデス門に属する細菌の割合すなわち占有率も算出した。
ファーミキューテス門に属する細菌は、Ｇｒｅｇｏｒｉｓらの方法(Ｔｒｉｓｔａｎｏ Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ Ｄｅ Ｇｒｅｇｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｈｙｌｕｍ－ａｎｄ ｃｌａｓｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔａｘａ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８６ （２０１１） ３５１－３５６）のファーミキューテス門に属する細菌に特異的なプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ；５’－ＴＧＡＡＡＣＴＹＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧ－３’， ｒｅｖｅｒｓｅ；５’－ＡＣＣＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣ－３’）を用いたＰＣＲにより定量した。
バクテロイデス門に属する細菌は、Ｇｒｅｇｏｒｉｓらの方法のバクテロイデス門に属する細菌に特異的なプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ；５’－ＣＲＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴ－３’， ｒｅｖｅｒｓｅ；５’－ＧＧＴＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＧＣＧＴＡＴ－３’） を用いたＰＣＲにより定量した。
定量ＰＣＲ用試薬には、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄTM Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ (ＢＩＯ ＲＡＤ)を使用し、ＰＣＲ反応および検出には、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を使用した。
ファーミキューテス門に属する細菌とバクテロイデス門に属する細菌の定量ＰＣＲは、どちらも９５℃５秒の反応につづいて、９５℃１５秒、６１．５℃１５秒、７２℃２０秒を３０サイクル繰り返した後に、７２℃５秒反応させた。
真正細菌は、Ｆｕｒｅｔらの方法（Ｆｕｒｅｔ ＪＰ ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ ｆａｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｅｃｏｌ． ２００９ Ｊｕｎ；６８（３）：３５１－６２）の真正細菌に特異的なプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ；５’－ＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧ－３’， ｒｅｖｅｒｓｅ；５’－ＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’）を用いたＰＣＲにより定量した。
定量ＰＣＲ用試薬には、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄTM Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ (ＢＩＯ ＲＡＤ)を使用し、ＰＣＲ反応および検出には、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を使用した。
ＰＣＲ反応は、９５℃２０秒、５６℃２０秒、７２℃３０秒を４０サイクル繰り返した。
各培養液のＦＢ比は、「ＦＢ比＝（ファーミキューテス門に属する細菌の占有率）／（バクテロイデス門に属する細菌の占有率）」として算出した。そして、被験者毎に、対照区のＦＢ比を１として、酵母マンナン調製物添加区およびマンノース添加区のＦＢ比の相対値を算出した。各被験者のＦＢ比の相対値とその平均値を表５に示す。
Claims (4)
- 酵母マンナンを含有することを特徴とする、腸内の、［ファーミキューテス門に属する細菌の占有率／バクテロイデス門に属する細菌の占有率］として定義されるＦＢ比の低減剤。
- 酵母マンナンを含有することを特徴とする、腸内の、［ファーミキューテス門に属する細菌のうちクロストリジウム綱に属する細菌およびエリシペロトリクス綱に属する細菌の合計の占有率／バクテロイデス門のうちバクテロイデス綱に属する細菌の占有率］として定義されるＦＢ比の低減剤。
- 前記バクテロイデス門に属する細菌またはバクテロイデス門のうちバクテロイデス綱に属する細菌に、Bacteroides thetaiotaomicronが含まれる、請求項１または２に記載のＦＢ比の低減剤。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のＦＢ比の低減剤を含有する、ＦＢ比低減用食品組成物。
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