CN1140455A - 用作人白细胞弹性蛋白酶抑制剂的非对映体纯三氟甲基酮肽衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及结晶形式的化合物(S)-1-[(S)-2-(4-甲氧苯甲酰氨基)-3-甲基丁酰]-N-[(S)-2-甲基-1-(三氟乙酰基)丙基]吡咯烷-2-甲酰胺(I)及其结晶溶剂化物，它们均被用作人白细胞弹性蛋白酶(HLE)(也称为人嗜中性白细胞弹性蛋白酶(HNE))抑制剂，当需要这种抑制作用时，这些抑制剂是有用的，如用于药理学、诊断学及相关研究的研究工具以及用于治疗哺乳动物与HLE有关的疾病。本发明还包括含有结晶形式化合物及其溶剂化物的药物组合物，制备结晶形式化合物及溶剂化物的方法以及用于合成结晶及溶剂化物的中间体。

Description

用作人白细胞弹性蛋白酶抑制剂 的非对映体纯三氟甲 基酮肽衍生物

本发明涉及吡咯烷衍生物，更特别涉及化合物(S)-1-[(S)-2-4-(甲氧苯甲酰氨基)-3-甲基丁酰]-N-[(S)-2-甲基-1-(三氟乙酰基)丙基]-吡咯烷-2-甲酰胺及其溶剂化物，该化合物由式I(此后均称为式I)表示：

并在以符号*和#标明的手性中心呈S构型，该化合物为人白细胞弹性蛋白酶(HLE)也就是已知的人嗜中性白细胞弹性蛋白酶(HNE)的抑制剂，其价值在于例如用作药理学、诊断学及相关研究中的研究工具，并用于治疗哺乳动物与HLE有关的疾病，例如，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、类风湿关节炎、动脉粥样硬化、肺气肿及其它炎症包括以增加和异常导气管分泌为特征的导气管炎症，如急性和慢性支气管炎和胆囊纤维变性这些病症的发病机理的原因说明与HLE有关。而且，某些血管疾病和相关疾病(及其治疗)也与HLE相关，其中这些疾病涉及嗜中性白细胞或受嗜中性白细胞影响，例如，与急性非淋巴细胞性白血病有关的出血，以及如与心肌缺血有关的再灌注(reperfusion)损伤和与冠状动脉疾病如绞痛和梗塞形成有关的相关疾病，脑血管缺血如瞬间局部缺血发作和中风，外周闭塞血管疾病如间歇性跛行及危急的肢缺血，静脉机能不全如静脉高血压，静脉曲张和静脉溃疡，以及受损伤的再灌注状态如与再造血管手术，血栓溶解和血管成形术有关的那些疾病状态。本发明还涉及治疗一种或多种这些疾病状态的方法和化合物(或其溶剂化物)在药物生产中的应用，所说药物用于一种或多种所述疾病状态中。本发明还涉及含有这种作为活性成分的化合物或其溶剂化物的药物组合物，和生产该化合物(或其溶剂化物)的方法，用于所说方法中新的中间体以及制备所说中间体的方法。

由于HLE的明显作用，近年来已进行了大量的研究工作努力开发HLE抑制剂。美国专利4,910,190中公开了一系列结构相关的肽酰(peptidoyl)三氟甲烷衍生物，其为HLE的抑制剂。我们现在发现了上述命名的特定的吡咯烷衍生物是一种有效的HLE抑制剂，由于其是一种呈结晶状的单一非对映异构体，因此具有出人意料的优点。这构成了本发明的基础。使用不能以结晶形式分离的HLE抑制剂作为治疗上述疾病的药物或制剂都会带来严重问题，如在生产满足调节作用所需的纯度水平和单一形式的组合物或抑制剂中产生严重问题。因此，非常需要寻找一种新型结晶HLE抑制剂且更需得到一中呈单一非对映异构体的新型结晶HLE抑制剂。已径发现本发明化合物的另一个优点是口服时具有HLE抑制活性。在本发明之前，并没有制备出上述命名的具体的吡咯烷衍生物，因此也并不知道其具体物理、化学或药理学性质。

根据本发明，提供了化合物(S)-1-[(S)-2-[4-甲氧苯甲酰氨基)-3-甲基丁酰]-N-[(S)-2-甲基-1-(三氟乙酰基)丙基]吡咯烷2-甲酰胺或其溶剂化物。

本发明化合物，也可由式Ia表示(其中粗线表示突出于纸平面外的键)，是一单一的非对映异构体，文后称为“式I的SSS非对映异构体”或“SSS非对映异构体”以区别于在式I的标有*和#的手性中心有不同构型的其它可能的非对映异构体。例如，式I的非对映异构体在标有*的手性中心呈S构型，在标有#的手性中心呈R构型(文后称为“式I的SSR非对映异构体”或“SSR非对映异构体”)。

式I的SSS非对映异构体是结晶固体，其以实际上不含或基本上不含溶剂的形式(此后指“无水”形式)存在，或呈溶剂化物形式。例如溶剂化形式可以是水合形式，可以以三氟代酮官能度的偕二醇形式存在，也就是式Ib化合物

和/或结合一水分子作为晶格结构一部分的化合物形式。例如，偕二醇Ib本身也可以进一步水合。可获得无水形式与溶剂化(例如水合物)形式的比例如为约1∶1或更高，如4∶1或更高的结晶SSS非对映异构体。当分离本发明化合物实际上或基本上不含溶剂时，无水形式与溶剂化(如水合物)形式的比例如约19∶1或更高，也就是化合物在无水形式中的重量百分比为95％或更高。

人们应理解，要获得完全不含其它可能的非对映异构体形式的呈单一非对映异构体的化合物是非常困难的，特别是有三个手性中心的化合物。因此，本发明包括结晶形式的式ISSS非对映异构体或其溶剂化物，它们包含其它可能的非对映异构体，这些非对映异构体在式I中以*和#表示的手性中心呈不同的构型。业已发现，其中含有或低于25％的式I的SSR非对映异构体的式I的结晶SSS非对映异构体或其溶剂化物是可以得到的；也就是说，结晶物质中SSS∶SSR形式的比例为约3∶1或更高。因此本发明包括含至少75％SSS非对映异构体的式I化合物的结晶形式。例如，可得到SSS∶SSR比例为约4∶1(或更高)和无水∶水合形式比率为约4∶1(或更高)的结晶物质。优选的式I的结晶SSS非对映异构体或其溶剂化物实际上或基本上是纯的，即含有少于5％的一种或多种其它可能的非对映异构体，如含有少于5％的式I的SSR非对映异构体，优选少于3％的式I的SSR非对映异构体，更为优选少于2％的式I的SSR非对映异构体。

优选式ISSS非对映异构体呈无水形式，即实际上或基本上不含溶剂化(如水合)形式。在这种形式中SSS非对映异构体的优点是非收湿性。它还具有的优点为固态时其有良好的差向异构稳定性。因此，式ISSS非对映异构体的特别优选形式为含少于2％的式I的SSR非对映异构体和95％或更多的无水形式。

式I的SSS非对映异构体的熔点通常取决于纯度，可由本领域熟知的常规手段如通过差式扫描量热法(DSC)来测定。典型地，当式I的SSS非对映异构体实际上或基本上呈无水形式并且实际上或基本上不含SSR非对映异构体时，其熔点范围为147-151℃，例如约148-150℃，特别是约147-149℃(加热速率5℃/min)。然而，当以无水形式和水合形式约为1∶1的混合物存在而且实际上或基本上不含SSR非对映异构体时，可得到熔点一般约为116-117℃的形式。

当式I的SSS非对映异构体实际上或基本上呈无水形式且实际上或基本上不含SSR非对映异构体时，其X射线粉末衍射图谱包括约2θ特定峰为8.95，11.17，11.47，13.86，15.49，17.86，18.22，19.24，21.58和21.92°。

当式I的SSS非对映异构体以实际上无水形式与水合形式之比为1∶1的混合物存在，熔点约为116-117℃时，其X射线粉末衍射图谱包括约在2θ的特定峰为6.20，9.81，10.29，12.33，12.44，14.22和17°。

此外，可获得结晶水合形式的式I的SSS非对映异构体，其实际上或基本上不含SSR非对映异构体，使用差式扫描量热法(加热速率2℃/min)，其吸热过程开始于约91-92℃(峰值在约99-100℃)，随后放热过程发生于约109-110℃(峰值在约111-112℃)，随后进一步吸热开始于约148-149℃(峰值在约150-151℃)。该水合形式X-射线粉末衍射图谱包括约2θ的特定峰为6.62，10.43，13.30，16.17，19.51，21.37和22.80°。DSC数据与热解重量分析(TGA)数据和¹⁹F NMR谱数据一起表明该形式实际上是一水合偕二醇(式Ib的)一水合物。人们将会意识到起始值和上述括号中的峰值根据所采用的扫描速度会有微小变化。例如，以扫描速度5℃/min进行相似的DSC扫描，第一吸热过程起始于约95-96℃(峰值为105-106℃)。

使用带有EC&G固态光子检测器的Scintag XDS-2000X-射线衍射仪，由Microvax计算机操作的GLP Series(锗)及使用Scintag Inc.，(Sunnydale，California，USA)提供的衍射管理系统(DiffractionManagement System)软件测定X-射线粉末衍射光谱。使用的X-射线管是Cu K-α，在45KV和40mA时其波长为1.5406A。入射光路上的接收狭缝设定在2和4mm，发射狭缝设定在0.5和0.2mm。以连续扫描方式且切光器增量为0.02mm获得光谱。每个样品每分钟扫描1°2θ(测量时间38分钟)并测得从2°至40°2θ数据，从而得到该范围内距离与光强的关系曲线。

将样品装入直径25mm深2mm圆铝合金盘中进行衍射分析。粉末状样品放于盘中使之有多于盘体积的量出现，随后用一片显微镜载玻片将粉末弄成与盘边缘齐平。使用NBS 640b型硅作为外部标准。

式ISSS非对映异构体的典型样品，当其实际或基本上不含溶剂时，当其为无水形式和水合形式比例为1∶1的混合物时，当其为水合(偕二醇一水合物)形式时，所做的X-射线粉末衍射光谱分别示于后面的图1、2和3。

式ISSS非对映异构体的典型样品，当其实际上或基本上不含溶剂时，当其为无水形式和水合形式之比为1∶1的混合物时，及当其为式Ib的一水合物时，红外光谱用本领域熟知的溶剂流延技术，从样品在盐(例如ZnSe或KBr)窗上的乙腈流延膜直接透射分析取得。测定红外光谱使用的波数范围为4000至400cm^-1。

式I的SSS非对映异构体样品，当其实际上或基本上不含溶剂时，其红外光谱示于图4。图4光谱包括在约2968，1761，1629，1607，1533，1503，1443，1259，1209，1178，1158，1032，845和767cm^-1处的尖峰。由于溶剂流延技术的特点及采用的溶剂，当式ISSS非对映异构体的样品是无水形式与水合形式的比例为1∶1的混合物时，以及当样品为式Ib偕二醇的一水合物时，其红外光谱与图3所示的红外光谱没有明显差别。

应该理解X-射线粉末衍射图谱的2θ值及红外光谱的波长因仪器不同而有微小变化，所以引用的值不能被认为是绝对数值。

应意识到，式Ib偕二醇羟基的氢原子呈酸性，因此使用常规技术该化合物可形成结晶的药物上可接受的盐，例如与能提供生理上可接受阳离子的碱反应，如碱金属(象钠或钾)，碱土金属或有机胺盐。因此本发明包括结晶的式Ib偕二醇或其水合物的药物上可接受的盐。

通过下述方法可得到式I的SSS非对映异构体或其溶剂化物，这些方法进一步构成本发明的独立的各方面。

通过从合适的非极性溶剂中结晶，如乙醚、正丙醚或正丁醚、或溶剂混合物象甲基叔丁醚和己烷的混合物，优选乙酸乙酯和己烷的混合物，从含大约等量的(即比例约为1∶1至约3∶2 SSS∶SSR)SSS和SSR非对映异构体的SSS和SSR非对映异构体的非结晶(无定形)非对映混合物中可得到结晶的含少于25％SSR的SSS非对映异物体。为了引发结晶，需要结晶的SSS非对映异构体晶种。一种优选的结晶方法包括，通过蒸发或蒸馏减少SSS和SSR非对映异构体的非结晶非对映混合物在乙酸乙酯中的溶液体积，向热溶液中加入己烷并保持清澈溶液，加入基本上纯的SSS非对映异构体晶种并使溶液逐渐冷却。改进的方法包括使用沸点比乙酸乙酯低的溶剂(如甲基叔丁基醚)中的SSS和SSR非对映异构体的非结晶非对映混合物，例如，从制备非结晶混合物(如下所述)过程中直接得到结晶产物，并且通过加入乙酸乙酯以替换乙酸乙酯溶剂并，在加入己烷之前在常压下用蒸发或蒸馏浓缩溶液。

根据所采用的溶剂及用于结晶的精确条件，最初分离的产品可以是无水和水合非对映异构体的混合物，如无水形式∶水合形式的比例约为1∶1或更大，例如可得到无水形式∶水合形式约为4∶1的结晶产品。

通过多次重结晶含SSR非对映异构体的结晶SSS非对映异构体，可以得到实际上或基本上纯的式I结晶SSS非对映异构体，实际上或基本上呈无水形式，例如，含约5％或更少量的水合形式。为此目的通常使用与水形成共沸物的非极性溶剂。当式ISSS非对映异构体(含SSR非对映异构体)通过加热或煮沸时溶解在结晶溶剂时，优选用浓溶液，如果需要，在加入第二种溶剂之前，使其结晶，这样有利于从该体系中除去水。甲苯是能实现此目的的特别合适的溶剂，或者乙酸乙酯和己烷的混合物，其中己烷是在从乙酸乙酯溶液中除去水的共沸物后加入的。从下面可选溶剂中对实际上或基本上纯的及实际上或基本上呈无水形式的结晶SSS非对映异构体进行连续重结晶，这些溶剂包括乙酸正丁酯，乙酸异丙酯，1，2-二甲氧基乙烷，2，2-二甲氧基丙烷，叔丁醇，叔戊基甲基醚和二氯甲烷和己烷的混合物，甲乙酮和己烷的混合物，N，N-二甲基甲酰胺和甲基叔丁基醚的混合物，丙醚和乙腈，1，4-二噁烷和己烷，甲乙酮和异己烷，四氢呋喃和环己烷，乙酸乙酯和异己烷，四氢呋喃和己烷，四氢呋喃和异己烷，乙醚和乙酸乙酯，叔戊基甲醚和乙腈。从上述任何一种溶剂中进行单一结晶均可足以得到含5％或更少量的SSR非对映异构体的SSS非对映异构体。在所有重结晶中优选使用晶种引发结晶过程。

此外，使用丙酮和水的混合物或叔丁醇和水的混合物作为溶剂，使含SSR非对映异构体的结晶SSS非对映异构体进行多次重结晶，可得到实际上或基本上纯的水合形式(其数据表明是偕二醇的一水合物)。

当进行上述的结晶或重结晶时，溶剂体积(以ml表示)与含SSR非对映异构体的SSS非对映异构体重量(以g表示)之比例如优选为2∶1至15∶1，方便地，约为6∶1至10∶1。

用美国专利No.4,910,190中的实施例20所述方法或通过方案1所示的类似方法可得到上述SSS和SSR非对映异构体的非结晶(无定形的)非对映混合物。

或者，可使用方案2所示的新方法，其中作为本发明另一方面的新中间体N-(4-甲氧基苯甲酰基)-L-缬氨酰-L-脯氨酸(或其盐)与3-氨基-4-甲基-1，1，1-三氟-2-戊醇偶合，随后通过常规的醇产物氧化作用形成相应的酮。相似偶合和氧化反应的常规方法描述于此和USP4,910,190中。该方法的一个优点是它允许在后一步加入氨基醇。使用常规选择性脱保持步骤，偶合和脱保护(方案2，步骤(a)-(c))，正如在后面方法1所描述的，可得到新的中间体。另外，例如使用二氯甲烷中的N-羟基苯并三唑和二环己基碳化二亚胺在0℃时将N-叔丁氧羰基缬氨酸与脯氨酸苄基酯偶合，随后用三氟乙酸除去叔丁氧羰基保护基，得到L-缬氨酰-L-脯氨酸苄基酯。然后在约室温时三乙胺存在下二氯甲烷中将该酯与例如对甲氧苯甲酰氯偶合，水解除去苄基保护基。用此方法得到的非对映混合物SSS∶SSR比例约为1∶1至3∶2，且仅以非结晶形式被分离出来，如泡沫或油状物。

此外，生产新的中间体N-(4-甲氧苯甲酰)-L-缬氨酰-L-脯氨酸的特别好的方法(作为本发明的另一方面)包括下述步骤：(i)L-缬氨酰-L-脯氨酸(或其盐)与三(1-4C)烷基卤代硅烷(例如三甲基氯硅烷)或双(三(1-4C)烷基甲硅烷基)乙酰胺(如双(三甲基硅烷基)-乙酰胺)反应得到L-缬氨酰-L-脯氨酸三(1-4C)烷基甲硅烷基酯(如L-缬氨酰-L-脯氨酸三甲基甲硅烷基酯；然后(ii)L-缬氨酰-L-脯氨酸三(1-4C)烷基甲硅烷基酯与活性的4-甲氧基苯甲酸衍生物(例如酰氯象4-甲氧基苯甲酰氯(即对甲氧苯甲酰氯)或酐)反应得到N-(4-甲氧基苯甲酰基)-L-缬氨酰-L-脯氨酸三(1-4C)烷基甲硅烷基酯；然后(iii)除去三(1-4C)烷基甲硅烷基保护基。

在合适的惰性溶剂或稀释剂中如乙酸乙酯，醚溶剂或稀释剂(如四氢呋喃或二噁烷)或烃溶剂如甲苯，在有机碱象三乙胺，吡啶或优选N-甲基吗啉或无机碱象碳酸钠或碳酸钾存在条件下方便地进行步骤(i)。进行反应的温度范围例如从-10℃至50℃，优选0℃至30℃。每当量L-缬氨酰-L-脯氨酸优选使用约2当量的碱(或如果使用的是L-缬氨酰-L-脯氨酸盐酸盐，则采用3当量碱)。每当量L-缬氨酰-L-脯氨酸优选使用约2当量的或更多的甲硅烷基化试剂。

使用常规方法在无水条件下进行步骤(ii)。例如，使用4-甲氧基苯甲酰氯及与步骤(i)相似的条件。在这种情况下，约1当量酰氯对1当量碱(或碱稍微过量)。最好不分离步骤(i)的产物，而是再加入1当量步骤(i)所用的同样的碱就地反应，随后加入1当量酰氯。

使用常规的甲硅烷保护基脱保护技术进行步骤(iii)，例如在水溶液条件下水解。在进行步骤(ii)的过程中方便地脱去甲硅烷保护基。我们知道也可在步骤(i)中使用其它常规的甲硅烷基化试剂形成L-缬氨酰-L-脯氨酸相应的甲硅烷基酯，它可被用于步骤(ii)中并随后如步骤(iii)除去甲硅烷基保护基。

为得到SSS和SSR非对映异构体的非结晶(无定形)非对映体混合物，用作制备本发明化合物的起始原料，步骤(i)-(iii)之后可以是：(iv)与N-(4-甲氧基苯甲酰)-L-缬氨酰-L-脯氨酸与3-氨基-4-甲基-1，1，1-三氟-2-戊醇反应，得到(S)-1-[(S)-2-(4-甲氧苯甲酰氨基)-3-甲基丁酰]-N-[2-甲基-1-(2，2，2-三氟-1-羟乙基)丙基]吡咯烷-2-甲酰胺；随后进行(v)(S)-1-[(S)-2-(4-甲氧苯甲酰氨基)-3-甲基丁酰]-N-[2-甲基-1-(2，2，2-三氟-1-羟乙基)丙基]吡咯烷-2-甲酰胺的氧化，相应于方案2中所示的步骤(d)和(e)。

使用常规的用于偶合羧酸与胺形成酰胺键的方法进行步骤(iv)，正如美国专利4,910,190中所述的方法。特别合适的是在叔胺(象三乙胺或优选N-甲基吗啉)存在时，在合适的溶剂或稀释剂如二氯甲烷这种氯代溶剂或稀释剂，象四氢呋喃或甲基叔丁基醚这样的醚溶剂或稀释剂，或象甲苯这样的烃溶剂或稀释剂中使用氯甲酸酯，例如氯甲酸烷基酯(如氯甲酸异丁酯)。可使用溶剂或稀释剂的混合物，例如甲苯和四氢呋喃的混合物。该反应通常进行的温度范围是例如为-15℃至30℃，优选-10℃至20℃。也可使用向氨基醇的浆液中可逆加入预先混合的酐，例如使用甲基叔丁基醚作溶剂。

使用常规氧化试剂用于羟基转化为酮基来完成步骤(v)。合适的氧化试剂和条件包括，例如使用草酰氯，二甲亚砜和叔胺；使用乙酐和二甲亚砜，使用二氯甲烷中的三氧化铬-吡啶复合物；高价碘试剂的使用，如在二氯甲烷中的1，1，1-三乙酰氧基-2，1-benzoxidol-3(3H)-酮和三氟乙酸；在二氯乙酸存在时过量二甲亚砜和水溶性碳化二亚胺的使用；或碱性高锰酸钾水溶液。特别适合的氧化剂为。后二者，尤其是碱性高锰酸钾水溶液，例如氢氧化钠和高锰酸钾的混合物。

根据美国专利No.4,910,190所述或实施例中所述方法可得到3-氨基-4-甲基-1，1，1-三氟-2-戊醇。

另外，如果将(S)-1-[(S)-2-(4-甲氧苯甲酰氨基)-3-甲基丁酰]-N-[(S)-2-甲基-1-((R)-2，2，2-三氟-1-羟乙基)-丙基]吡咯烷-2-甲酰胺(例如使用方案1或2所示的类似方法可获得该物质，但使用拆分的氨基醇2(R)，3(S)-3-氨基-4-甲基-1，1，1-三氟-2-戊醇，用USP4,910,190中描述的方法或此后实施例中描述的方法得到该氨基醇)氧化，那么可将分离的无定形产物进行结晶以得到实际上或基本上纯的结晶SSS非对映异构体，呈无水和水合形式的混合物(例如，若使用乙醚作为结晶溶剂)，或实际上为无水形式(例如，若从甲苯中结晶或重结晶该异构体)。

用相似于上述步骤(v)中所述的条件可进行氧化作用。

用于生产式ISSS非对映异构体的一个特别好的方法(作为本发明的一方面)，特征在于在合适的非极性溶剂或稀释剂中如甲基叔丁基醚，己烷或优选沸点在100-120℃范围内烃混合物(例如石油馏分，沸点100-120℃象1ESSOCHEM 30′(商标))或其混合物或乙酸乙酯和己烷的混合物，与合适的碱一起加热式ISSS和SSR非对映异构体的非结晶(无定形的)非对映混合物，其中碱的例子有三级碱如N-(1-4C)烷基吗啉(如N-甲基吗啉)，N-(1-4C)烷基哌啶(如N-乙基哌啶)，吡啶或五异丙基胍。当使溶液逐渐冷却时，SSS非对映异构体从溶液中结晶，并且在保持热或温溶液中发生SSR-富集的非对映体混合物的差向异构表异构化，其中进一步产生结晶的SSS非对映异构体。这样有利于SSS-非对映异构体的平衡。因此这种差向异构化作用/结晶作用过程允许SSR非对映异构体向SSS非对映异构体的转化，或循环富含SSR非对映异构体的母液以产生更多量的SSS非对映异构体。所以此过程的优点是可使用SSS-或SSR-富集的非对映混合物进行。用于差向异构表异构化/结晶过程的优选碱是N-甲基吗啉。

根据所使用的溶剂或稀释剂，通常要进行加热，例如在50-130℃的温度范围内进行加热，并且方便地在使反应混合物逐渐冷却和SSS非对映异构体结晶发生之前在溶剂或稀释剂的回流温度开始。优选对反应混合物进行加热，以便在冷却之前发生溶剂的蒸馏。可向加热溶液中加入SSS非对映异构体较不易溶解的可混非极性溶剂或稀释剂以帮助结晶。当发生初始溶剂或稀释剂的蒸馏发生时，可方便地进行这种添加以防止产物的提早结晶，或者在逐渐冷却之前，非对映混合物和碱被加热的初始溶剂可用基本上以高沸点的其中SSS非对映异构体溶解性较差的可混非极性溶剂代替。例如，当使用甲基叔丁基醚为溶剂时，在冷却之前，可加入沸点为100-120℃范围内的烃混合物(例如石油馏分，沸点100-120，如ESSOCHEM30)，可任意加入一种或多种其它的此类溶剂，如甲苯，通过蒸馏同时除去低沸点溶剂。应该理解，这种改进允许此非对映体混合物(最初是在基本上是非极性溶剂中作为溶液分离的)直接用于制取结晶SSS非对映异构体。

为引发结晶，需要使用晶种SSS非对映异构体。优选的结晶过程是在使混合物温度逐渐冷却至室温的情况下进行的，例如使温度每步降低10℃并在每一温度时保持约1小时。每当量无定形原料优选使用0.5-1当量的碱，尤其优选使用约1当量。

可用于制备式ISSS非对映异构体的这种差向异构化/结晶过程的改进是从合适的非极性溶剂(如上所述)中结晶SSS和SSR非对映异构体的非结晶混合物，非极性溶剂如乙酸乙酯和己烷的混合物，结晶是在催化量(例如约10mol％)的碱(如上所定义)如N-甲基吗啉存在条件下进行的。

使用差向异构化/结晶过程，初始分离的结晶物质是含少于25％SSR非对映异构体的结晶SSS非对映异构体，例如通常获得的结晶物质SSS∶SSR比例为4∶1或更好。通常该物质以无水和水合形式被初始分离。如前所述将此物质重结晶可得到实际上或基本上纯的式I结晶SSS非对映异构体，实际上或基本上呈无水形式，例如含约5％或更少量的水合形式或结晶水合形式。

在通过重结晶进一步纯化之前，最好是从分离自差向异构化/结晶过程的产物中除去任何残余碱，以避免差向异构化产物返回非对映体混合物。例如通过使用稀酸水溶液例如稀盐酸或稀硫酸洗涤被分离产物来完成此步。

用标准试验和临床研究(包括下述方法和试验)可证明本发明化合物的实用性。抑制性测定：

如美国专利4,910,190所述方法测定本发明化合物用作人白细胞弹性蛋白酶(HLE)抑制剂的效力，酶作用于低分子量底物甲氧基-琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-缬氨酰-对-硝基酰苯胺。通过抑制剂与HLE相互作用形成的复合物的解离常数Ki的动力学测定来评估化合物的效力。已经发现本发明化合物Ki为6.7nM。急性肺损伤模型：

肺气肿的动物模型包括气管内(i.t.)给药一种促弹性组织离解的蛋白酶，以引起缓慢形成破坏性肺损害。通常在这些损害开始发作后几周至几月被评价。然而这些蛋白酶还会诱发最初几小时之内便很明显的损害。早期损害首先是出血，在24小时之后发展为炎症，发作后第一周损伤症状消除。为利用这种早期损害，可使用下述模型。

首先以Brevital使仓鼠轻微麻醉。然后将pH7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)单独地或与含人白细胞弹性蛋白酶(HLE)一起直接气管给药。24小时后杀死动物并取下肺，仔细清理肺外部组织。称量肺的湿重后，以PBS灌洗肺，测定全部洗出的回收的红细胞和白细胞。在HLE给药之后肺的湿重、全部洗出红细胞和全部洗出白细胞的值随着剂量增加而提高。作为有效的弹性蛋白酶抑制剂化合物能防止或减少这种酶诱发损害的严重性，导致肺湿重的降低和相对于单独给药HLE而言总洗出细胞即红细胞和白细胞的减少。在HLE竞争(400μg)前，使用各种浓度或在不同时间，通过PBS中溶液或悬浮液形式气管给药可评估化合物，或者在HLE竞争(100μg)前在不同时间以溶液形式静脉给药或口服，以测定化合物防止HLE损害的效用。使用10％聚乙二醇400/PBS方便地制备本发明化合物溶液。急性出血鉴定：

此鉴定实验依赖于气管内给药人嗜中性白细胞弹性蛋白酶(HNE)后仅对肺出血量的监测。通过肺灌洗液中回收的破裂红细胞及与仓鼠全部血液稀释液相对比，来定量出血。类似于Fletcher等，American Review ofRespiratory Disease(1990)，141，672-667中所描述的筛选方法如下：根据上述服药急性肺损伤模型方便地制备外试验证明为HNE抑制剂的化合物。用Brevital钠盐(30mg/kgi.p.)轻微麻醉雄性叙利亚仓鼠(在使用前禁食16-8小时)。然后在气管给药50μg/动物的HNE于300μL磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH7.4)前在固定时间如30分钟或90分钟以静脉内或口服方式给仓鼠服用该化合物。服用酶之后4小时，以过量戊巴比妥钠杀死动物，打开胸腔取下肺和心，将肺的外部物质清除掉。切除的肺以三次不同的2mL PBS通过气管插管灌洗。收集回收的灌洗液，记录其体积(约5mL)并将其存放于4℃环境直至鉴定时用。为计算每一样品中的血量，超声处理融化的灌洗液和一个仓鼠全血样品以破裂红细胞并将其适当稀释放入95孔微滴板中的各个孔。在540nm处测定破裂的灌洗液和血样的光密度(OD)。通过将试验样品的OD值与由仓鼠全血制备的标准曲线中的OD值相对比较，测定(μL血当量)/(mL灌洗液)。将每样品回收的灌洗液体积乘以(μL血当量)/(mL灌汽液)得到回收的血的总μL当量。就PBS处理的对照组而言，在给药HNE之前以具体剂量和时间使用试验化合物时，其结果用HNE诱发出血的％抑制率表示，本发明化合物的ED₅₀值在口服后为5.2mg/kg，静脉给药后0.59mg/kg。

在上述体内试验中给药本发明化合物时，没有发现明显毒性。

我们知道，在急性肺损伤模型或急性出血鉴定中化合物活性的影响不限于肺气肿，而且更重要的，这些试验提供了体内抑制HLE的一般性证据。

本发明进一步的特点在于提供了含有药物有效量的本发明化合物或其溶剂化物及药物上可接受稀剂或载体的药物组合物。如上所述，本发明的另一方面是用本发明化合物或其溶剂化物治疗哺乳动物特别是人的某些疾病或疾病状态的方法，这些疾病与HLE有关，如前所述，特别是急性和慢性支气管炎，肺气肿，再灌注损伤，成人呼吸窘迫综合征，胆囊纤维变性或外周血管疾病(如危急性肢缺血或间歇性跛行)。

在需要治疗与HLE有关的疾病时，本发明化合物可以以常规药物组合物形式如美国专利4,910,190中所公开的形式给药予温血动物，特别是人。一种给药方式可以通过粉末或液体气溶胶。在用粉末气溶胶时，以相同于用Bedford，Massachusets的Fisons Corp生产的‘Spinhaler’(商标)气轮式吸入器吸入Cromolyn钠的方式，以每胶囊0.1至50mg的速率，给药本发明化合物，每天每一个普通人给药1至8胶囊。用于气轮-吸入器的每粒胶囊包含所需量的本发明化合物及其余的20mg胶囊是药物上可接受载体如乳糖。在用液体气溶胶时，使用喷雾器例如‘Retec’(商标)喷雾器可给药本发明化合物，其中溶液以压缩空气喷雾。例如根据下述方法可以每天1至约8次的速率给药该气溶胶：将喷雾器中充满化合物溶液，例如10mg/mL的3.5mL溶液；用压缩空气喷雾此喷雾器中的溶液；将喷雾剂放于病人口中病人正常呼吸(一次呼吸的体积)8分钟。

或者，给药方式可以非肠道，包括以渗透泵皮下沉积的方式，或优选口服方式。通过将约每单位剂量10至250mg的化合物与常规载体，赋形剂，粘合剂，防腐剂，稳定剂，调味剂等混合。药物实践要求的如美国专利3,755,340所述那些添加剂，可将本发明化合物配制成口服或非肠道剂量形式。非肠道给药时，以每公斤体重0.02mg至10mg本发明化合物的量静脉、肌内或皮下注射1-10mL，每天3或4次。注射液中含有本发明化合物的等渗无菌溶液或悬浮液及任意含有苯酚这样的防腐剂或乙二胺四乙酸(EDTA)这样的稳定剂。非肠道给药或使用气溶胶形式时，例如可将化合物溶于5-10％，聚乙二醇400/磷酸盐缓冲的盐水中制备溶液制剂，随后无菌过滤，并使用标准方法无菌保存。

通常，将本发明化合物给药予人时，日剂量范围为，例如气溶胶5至100mg化合物，或静脉内或口服50-1000mg，或将其结合使用。然而，很易理解，必须根据熟知的医疗经验考虑所治疗疾病的特点和严重性，当前疗法以及受治疗病人的年龄、体重和性别来改变化合物的给药剂量。类似地容易理解，通常也可使用等量的该化合物的溶剂化物(如水合)形式。HLE抑制剂的给药方式及对病人的评价描述于欧洲专利申请，公开号458535，458536，458537和463811中，这些抑制剂分别用于治疗或预防胆囊纤维变性，ARDS，支气管炎、和急性非淋巴性白血病或其疗法相关的出血；并且，本发明化合物可以相似方式或优选口服用于治疗这些病疾和疾病状态，这种化合物可单独使用或与另一种治疗具体疾病常用的治疗剂结合使用。当用于治疗或预防治疗哺乳动物血管疾病或涉及嗜中性白细胞或受其影响的相关疾病时，可以常规口服或非肠道途径给药本发明化合物，或单独给药或者同时与其它通常用于治病的活性治疗剂一起使用或顺序使用。使用国际专利申请公开WO92/22309中所述方法可证明本发明化合物在治疗血管疾病和相关疾病中的效用。

通过下述非限制性实施例来解释本发明的各个方面，其中(除非另有说明)

(i)所给温度均为摄氏度(℃)；在室温或常温进行操作，即温度范围为18-25℃；

(ii)有机溶液以无水硫酸镁干燥；溶剂的蒸发是在减压条件下(600-4000pa；4.5-30mmHg)浴温可达60℃时以旋转蒸发器进行；

(iii)色谱法意指“快速色谱”(Still法)在Merk Kieselgel上进行(来自E.Merck的Art 9385，Darmstadt，德国)，用多级和斜面梯度洗脱以引号内术语“梯度”表示，其后是初始和最终溶剂比率；薄层层析(TLC)是在二氧化硅板上进行的，例如0.25mm硅胶GHLF板(来自Analtech的Art21521，Newark，DE，USA)；

(iv)通常，反应之后进行TLC，所给反应时间仅用于说明；

(v)熔点是未修正的，(dec)表明分解；给出的熔点是按所述方法制备出的物质的熔点，在某些制备情况中多晶可导致不同熔点物质的分离；

(vi)终产物具有令人满意的核磁共振(NMR)谱；并且，如果用HPLC检测，该产物基本上是纯的；

(vii)所给收率仅用于说明，不必是那些通过严格的方程所得的值，若需要更多的物质时则需重复制备；

(viii)NMR数据(如给出)是主要诊断质子的δ值形式，相对于内标物质四甲硅烷(TMS)以ppm表示，测定频率250MHz，溶剂用DMSO-d₆，使用常用的缩写记录信号形状，用直接观察的位移记录AB谱；

(ix)化学符号具有通常含义；使用SI单位和符号；

(x)给出的减压值是绝对压力，单位为帕斯卡(Pa)；加压以表压巴(bar)形式给出；

(xi)溶剂比率为体积∶体积(v/v)；

(xii)使用直接辐照探针进行质谱测定，电子能量为70电子伏，呈化学电离形式；所指的电离作用受电子冲击(EI)或快速原子轰击(FAB)的影响；通常仅报道母体质量峰；

(xiii)HPLC用来确定分离物质中式I SSS∶SSR非对映异构体的比例，使用Hypersil C18，3μm，10cm×4.6mm柱，移动相为0.2M四丁基磷酸铵/乙腈(75∶25)，pH7.5。流速为1.5ml/min，通过阀门注射体积为20μl，检测波长是254nm。SSS非对映异构体的保留时间一般为12-13分钟，SSR非对映异构体为20-21分钟。另外，可使用SUPELCO LC-18反相，25cm×4.6mm柱，用水∶乙腈(60∶40)为洗脱剂，流速为1.0ml/min。实施例1

将比例约为85∶15 SSS∶SSR的SSS非对映异构体和SSR非对映异构体(0.67g)的结晶非对映体混合物加到甲苯中并加热至80℃，得到一清澈溶液。在30分钟内将溶液冷却至55℃，并加入纯的SSS非对映异构体晶种。然后再使溶液在1个小时内冷却至25℃，然后在冰浴中再冷却1个小时。过滤收集结晶产物，用冷甲苯(2ml)洗涤，并于50℃干燥。重复此过程得到式I结晶SSS非对映异构体(0.43g)用HPLC分析，其含有少于2％SSR非对映异构体；²⁵[α]_D-90°(C＝1.50乙醇中)；m.p.147.5-148.5℃；NMR(D₆-DMSO)：0.92(m，12H)，1.75(m，1H)，1.81-2.15(m，5H)，3.61(m，1H)，3.80(s，3H)，3.91(m，1H)，4.44(m，2H)，4.62(t，1H)，6.96(d，2H)，7.91(d，2H)，8.34(d，1H)，8.60(d，1H)；NMR(d₆-DMSO/D₂O)：0.75(d，3H)，0.89(m，9H)，1.70-2.19(m，6H)，3.56(m，1H)，3.75(s，3H)，3.84(m，1H)，3.98(d，1H)，4.37(m，2H)，6.94(d，2H)，7.76(d，2H)；质谱(化学电离)：500(M+H)；微量分析，实测值：C，57.72；H，6.62；N，8.36％；C₂₄H₃₂F₃N₃O₅理论值：C，57.70；H，6.45；N，8.41％。

使用差式扫描量热法，该物质在约149.5℃显示有初始变化，峰值约151℃。

[使用SSS∶SSR比为76∶24的结晶非对映体混合物，及从甲苯中两次重结晶，所得结果相似。

使用乙酸乙酯和己烷混合物作为溶剂也得到相似结果。将SSS和SSR非对映异构体的结晶非对映体混合物溶于乙酸乙酯，蒸馏减少体积，用己烷稀释热溶液(60℃)，保持清澈溶液。将溶液冷却至50℃，加入纯SSS非对映异构体晶种并使之冷却。所用起始原料与溶剂之比相似于实施例5中所用值。]

用作起始原料的SSS和SSR非对映异构体结晶非对映体混合物按实施例4或5方法得到。实施例2

将0.6M氢氯化钠溶液(260ml)加入0℃叔-丁醇(205ml)和水(255ml)混合物中的(S)-1-[(S)-2-(4-甲氧苯甲酰氨基)-3-甲基丁酰]-N-[(S)-2-甲基-1-((R)-2，2，2-三氟-1-羟乙基)丙基]-吡咯烷-2-甲酰胺(25.7g)的溶液中。搅拌下在1小时内滴加入高锰酸钾(24.2g)的水(358ml)溶液，再于0℃搅拌所得反应混合物1小时。然后加入甲醇(100ml)，混合物于0℃再搅拌2小时。反应混合物以-硅藻土过滤，仍冷却的滤液以1M盐酸(200ml)酸化，结果形成大体积白色沉淀。向混合物中加入固体氯化钠至饱和点，随后加入乙醚(200ml)和乙酸乙酯(200ml)。搅拌混合物至所有固体溶解。分离有机相，水相以乙醚∶乙酸乙酯(1∶1)萃取。用盐水洗涤合并的有机相，干燥(MgSO₄)，真空蒸发除去溶剂。将所得泡沫溶于热甲苯(150ml)，使其于室温下放置16小时。过滤收集结晶的固体，以乙醚洗涤，40℃真空干燥3小时，得到式I结晶的SSS非对映异构体(16.5g)，含＜0.5％的式ISSR非对映异构体；m.p.149-151℃。(研制滤液导致另一批SSS非对映异构体(6.24g)的回收)。

当使用乙醚代替甲苯作为结晶溶剂时，得到相似纯度的结晶SSS非对映异构体呈无水和水合形式的混合物(比1∶1)；m.p.116℃，微量分析，实测值：C，56.48；H，6.49，N，8.20％；C₂₄H₃₂F₃N₃O₅.0.5H₂O理论值，C，56.68；H，654；N，8.26％。

按下述方法获得起始氨基醇：(i)0℃在约30分钟内，向N-苄氧羰基-L-缬氨酰-L-脯氨酸叔丁酯(80.0g)的二氯甲烷(300ml)混合物中加入三氟乙酸(200ml)。0℃搅拌1小时后，使反应混合物升至室温并再搅拌3小时。然后将反应混合物在真空浓缩，并从甲苯中再浓缩4次，以除去残余三氟乙酸。真空干燥所得粘性油16小时。用硅胶色谱法纯化该粗产物，用二氯甲烷作洗脱剂，得到N-苄氧羰基-L-缬氨酰-L-脯氨酸(A)(63.6g)为淡色粘性油；NMR(d₆-DMSO)：0.92(2d，6H)，1.65-2.05(2m，4H)，2.25(m，1H)，3.60(m，1H)，3.80(m，1H)，4.05(dd，1H)，4.25(m，1H)，5.02(2d，2H)，7.35(m，5H)，7.50(d，1H)。(ii)将N-甲基吗啉(16.6ml)一次性加到搅拌着的化合物的四氢呋喃(THF；550ml)溶液中，溶液被冷却至-35℃。然后向冷却溶液中滴加氯甲酸异丁酯(18.9ml)。加完后，将反应混合物搅拌1小时，然后在30分钟内滴加2(R)，3(S)-3-氨基-4-甲基-1，1，1-三氟-2-戊醇(24.5g)的THF(160ml)溶液。再于-35℃搅拌反应混合物1小时，使其热至室温，搅拌16小时。过滤混合物，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤滤液2次。用乙醚萃取水相两次，用盐水洗涤合并的有机相并干燥。蒸发除去溶剂，并通过硅胶色谱法纯化粗产物，使用二氯乙烷∶甲苯(9∶1)作洗脱剂，得到(S)-1-[(S)-2-(苄氧羰基氨基)-3-甲基丁酰]-N-(S)-2-甲基-1-[(R)-2，2，2-三氟-1-羟乙基)丙基]吡咯烷-2-甲酰胺(55.1g)(B)，为无色泡沫；NMR(300MHz，d₆-DMSO)：0.90(9m，12H)，1.63-2.03(m，5H)，3.55(m，1H)，3.75(m，2H)，4.07(m，2H)，4.45(m，1H)，5.02(2d，2H)，7.35(m，5H)，7.45(d，1H)，7.65(d，1H)。(iii)将化合物B(55g)的乙醇(300ml)溶液用10％钯-炭催化剂(5.5g)，氢压力为55psi时氢化2小时。反应混合物用硅藻土过滤，真空浓缩滤液，得到粘性油。该油以乙醚(250ml)研制16小时，过滤收集所得固体得到(S)-1-[(S)-2-氨基-3-甲基丁酰]-N-[(S)-2-甲基-1-(R)-2，2，2-三氟-1-羟乙基)丙基]-吡咯烷-2-甲酰胺(C)(25.6g)，为白色固体；NMR(300MHz，d₆-DMSO)：0.75-0.97(m，12H)，1.42(s，1H)，1.65-2.0(m，5H)，2.78，3.20(每个d，总数1H)，3.45，3.60(每个m，总数1H)，3.82(m，1H)，4.10(m，1H)，4.45，4.57(每个m，总数1H)，6.45(br，d，1H)，7.45，7.60(每个d，总数1H)。(iv)将化合物C悬浮于7HF(350ml)并加入碳酸钠粉末(18.5g)。将混合物冷至-5℃，搅拌加入对甲氧苯甲酰氯(11.9g)的THF(50ml)溶液。0℃再搅拌反应混合物2小时，然后使升至室温。过滤反应混合物并以1M盐酸溶液(20ml)酸化滤液，以水洗涤。用乙醚两次萃取水相，用50％饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤合并的有机相，并干燥。蒸发除掉溶剂得到无色泡沫。用乙醚研制泡沫，过滤收集所得固体，40℃真空干燥3小时得到(S)-1-[(S)-2-(4-甲氧苯甲酰氨基)-3-甲基丁酰]-N-[(S)-2-甲基-1-((R)-2，2，2-三氟-1-羟乙基)丙基]-吡咯烷-2-甲酰胺，为白色固体，m.p.168-170℃；NMR(300MHz，d₆-DMSO)：0.82-1.05(m，12H)，1.65-2.05(3m，5H)，2.05-2.25(m，1H)，3.60(m，1H)，3.82(s，3H+t，1H)，3.93(m，1H)，4.12(m，1H)，4.45(m，2H)，6.45(d，1H)，6.98(d，2H)，7.65(d，1H)，7.90(d，2H)，8.35(d，1H)。

根据下述方法制得2(R)，3(S)-3-氨基-4-甲基-1，1，1-三氟-2-戊醇：

向2(RS)，3(SR)-3-氨基-4-甲基-1，1，1-三氟-2-戊醇(57.8g)的乙醇(200ml)溶液中加入D-(-)-酒石酸(50.7g)的乙醇(200ml)溶液。趁热过滤溶液，使其于室温下存放16小时。过滤收集分离的白色固体并用少量冷乙醇洗涤。真空干燥固体并从热乙醇中重结晶3次，得到2(R)，3(S)-3-氨基-4-甲基-1，1，1-三氟-2-戊醇D-(-)-酒石酸盐(8.3g)；m.p.135-137℃。

或者使用下述方法：(i)向充分搅拌着的2(RS)，3(SR)-3-氨基-4-甲基-1，1，1-三氟-2-戊醇半草酸盐(50g)的甲苯(250ml)溶液和2M氢氧化钠溶液(350ml)的混合物中一次加入三光气(23g)。反应开始放热并置于水浴环境中。0.5小时后将反应加热至25℃，TLC表明有大量未反应的胺存在。用50％氢氧化钠溶液将溶液pH重新调整至约12。再加入一份三光气(8g)并将溶液搅拌1小时。用1M盐酸将反应混合物pH调低至pH7，并用乙醚两次萃取。用水，盐水洗涤合并的醚层并干燥(MgSO₄)。蒸发除去溶剂得到油状物，放置后结晶。过滤收集所得固体，用乙醚∶己烷(1∶1)洗涤，得到27g 4(RS)，5(SR)-4-异丙基-5-三氟甲基-2-噁唑烷酮，为白色固体，m.p.71-72℃；¹H NMR(300MHz，DMSO)：8.45(s，1H)，5.11(m，1H)，3.61(m，1H)，1.72(m，1H)，0.86(d，6H)。(ii)于-78℃向4(RS)，5(SR)-4-异丙基-5-三氟甲基-2-噁唑烷酮(35.8g)的THF(600ml)溶液中加入正丁基锂(20ml的10M己烷溶液)，随后搅拌0.5小时。加入氯甲酸(-)-基酯(41ml，新蒸馏的)，随后继续在-78℃搅拌0.5小时。将溶液热至25℃，加入饱和碳酸氢钠水溶液终止反应。将产物用乙醚萃取并以水和盐水洗涤。干燥(MgSO₄)溶液，真空除去溶剂。所得油状物静置后结晶，得到固体，过滤收集。用乙醚∶己烷(1∶1)洗涤固体并干燥，得到4(S)，5(R)-4-异丙基-3-[1(R)，2(S)，5(R)-氧羰基]-5-三氟甲基-2-噁唑烷酮(23.15g)；m.p.138-140℃；¹H NMR(300MHz，DMSO)：5.51(dd，1H)，4.68(m，1H)，4.26(m，1H)，2.27(m，1H)，1.94(d，1H)，1.78(m，1H)，1.62(dm 2H)，1.42(m，2H)，1.01(dd，2H)，0.95-0.84(m，24H)，0.71(d，3H)；¹⁹FNMR(376.5MHz，DMSO)：-76.9910；99％d.e.(从母液中进一步回收4.3g(99％d.e.)产物)。[注：4(R)，5(S)异构体熔点m.p.80-82℃，¹⁹FNMR(376.5MHz，DMSO)：-77.0019。(iii)在100℃将4(S)，5(R)-4-异丙基-3-[1(R)，2(S)，5(R)-氧羰基]-5-三氟甲基-2-噁唑烷酮(27g)的二噁烷(70ml)溶液和50％氢氧化钾溶液(80ml)加热2天。将反应冷却，用乙醚(400ml)稀释，并分离有机层。用6M盐酸将水溶液pH调至9(起始值约为14)。用乙醚(300ml)三次萃取水相。将有机相合并，干燥(MgSO₄)并加入搅拌均匀的二水合草酸(4.5g)的乙腈(100ml)溶液。过滤收集沉淀固体，用乙醚洗涤，并真空(60℃)干燥，得到15.9g白色固体。用乙醚研制该固体，过滤收集，干燥，得到2(R)，3(S)-3-氨基-4-甲基-1，1，1-三氟-2-戊醇半草酸盐(13.4g，88％产率)，为白色固体，m.p.184-186℃；¹H NMR(300MHz，DMSO)：5.71(bs，3H)，4.08(ddd，1H)，2.88(m，1H)，1.81(m，1H)，0.92(m，6H)；元素分析C₆H₁₂F₃NO.0.5C₂H₂O₄：理论值：C，38.89；H，6.06；N，6.48；实测值：C，38.75，H，5.95；N，6.47。实施例3

将比例为1∶1式ISSS和SSR非对映异构体的非结晶(无定形的)非对映混合物(泡沫或油)(0.5g)溶于乙醚(2.5ml)，加基本纯的SSS非对映异构体结晶晶种，存放16小时。过滤收集结晶固体，用乙醚洗涤，使其干燥得到含SSR非对映异构体的结晶SSS非对映异构体，产率30-45％(SSS∶SSR为88∶12；无水形式∶水合形式为1∶1)(当使用SSS∶SSR 3∶2非结晶非对映混合物时得到类似结果。)实施例4

将式I的SSS和SSR非对映异构体的非结晶非对映混合物(SSS∶SSR比值为48.5∶51.5；5.18g)溶于叔丁基甲基醚(23ml)中，并加入N-甲基吗啉(1.3ml)。混合物被加热至回流，沸点为100-120℃(ESSOCHEM 30；60ml)的烃混合物被缓慢加入，同时保持反应混合物温度为98℃。收集25ml馏出液后，温度降至70℃，加入少量基本纯的SSS-非对映异构体晶种。70℃搅拌反应混合物1小时，60℃再搅拌1小时，最后室温下搅拌16小时。过滤收集所得结晶固体，以ESSOCHEM 30洗涤，干燥，得到SSS和SSR非对映异构体的结晶混合物(4.8g)，SSS∶SSR比值为76∶24。搅拌条件将该物质加入水(17ml)中，并加入2M盐酸(2ml)。室温搅拌90分钟后，过滤收集结晶固体，用水洗涤并干燥(3.88g)。(HPLC显示具有相同的SSS∶SSR比值)。

用同样的方法但在加入基本纯的SSS一非对映异构体晶种之前将溶液冷却至65℃，并于65℃搅拌，然后每步降10℃，在每一温度保持1小时，最后室温搅拌16小时，得到式ISSS和SSR非对映异构体的结晶混合物(SSS∶SSR值为85∶15)产率约85％。实施例5

大气压下蒸馏式ISSS和SSR非对映异构体的非结晶(无定形)非对映混合物(29.4g)于乙酸乙酯(200ml)中的溶液，以除100mL蒸馏液。然后再加入乙酸乙酯(166ml)，于大气压下又一次蒸馏溶液以除去166ml蒸馏液。重复此过程。将溶液冷却至60℃，并在60℃30分钟内加入己烷(166ml)，得到清澈溶液。将溶液冷却至50℃，加入基本纯的结晶SSS非对映异构体(0.1g)晶种并使其冷却至室温18小时。在0℃进一步搅拌溶液18小时，热至20℃，在10分钟内再加入己烷(33ml)。室温下搅拌3小时后，再加入己烷(50ml)且于室温下搅拌混合物18小时。过滤收集结晶产物，真空干燥4小时，得到SSS和SSR非对映异构体的结晶混合物(39％产率)，HPLC测其SSS∶SSR比为85∶15。

[用相似的方法，但在蒸馏之前(或之后)向乙酸乙酯中加入N-甲基吗啉(0.8ml)，并用稀盐酸和水洗涤过滤结晶产物(直空干燥之前)，得到SSS和SSR非对映异构体的结晶混合物，SSS∶SSR比率相似，产率为60％。)实施例6

用实施例5的方法得到的SSS∶SSR约85∶15的SSS和SSR非对映异构体结晶混合物(10g)在丙酮(15ml)中制浆，并热至40℃。加入水(10ml)，混合物加热至55-66℃ 90分钟。将该混浊溶液冷却至35-40℃，再加入水(5ml)。混合物冷却至室温并搅拌16小时。过滤收集结晶固体并重复此程序。在40℃真空干燥所得结晶固体得到水合形式的结晶SSS非对映异构体(含少于2％SSR非对映异构体)，水含量为6.69％(收率为75％)。该结晶物质的DSC差式热分析图表明有一个开始于约91-92℃的吸热过程，随后是开始于约109-110℃的放热过程，随后是又一个约148-149℃的吸热过程。这些数据与TGA数据及¹⁹F NMR光谱数据一起，表明了该结晶形式是基本为偕二醇(式Ib)的一水合物，其理论(计算)水含量为6.73％。

                     * * * * *

使用下述方法1或2，用实施例3、4、5的原料得到SSS和SSR非对映异构体的非结晶非对映混合物，用作实施例3，4和5的起始原料。方法1(i)在50psi用10％钯-炭催化剂(2g)使N-苄氧羰基-L-缬氨酰-L-脯氨酸叔丁酯(20g)的甲醇(30ml)溶液氢化12小时。用硅藻土过滤反应混合物，用甲醇洗涤滤饼。蒸发滤液得到L-缬氨酸-L-脯氨酸叔丁酯(A)(12g)，呈油状；NMR(300MHz，d₆-DMSO)：0.80(d，3H)，0.92(d，3H)，1.74(s，9H)，1.79-2.15(m，5H)，3.22(d，1H)，3.30(bs，2H)，3.40(m，1H)，3.62(m，1H)，4.16(dd，1H)。(ii)将该酸(A)(12.5g)溶于四氢呋喃(THF；100ml)并冷却至0℃。搅拌加入对甲氧苯甲酰氯(8.37g)的THF(200ml)溶液，随后加入三乙胺(18ml)。1小时后，蒸发除去易挥发物质。用乙酸乙酯稀释所得物质，随后依次用水、饱和氯化铵溶液、饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤。干燥(Na₂SO₄)有机溶液，蒸发除去溶剂。用硅胶色谱法纯化所得物质，用甲醇∶二氯甲烷(3.97)作洗脱剂，得到N-(4-甲氧苯甲酰基)-L-缬氨酰-L-脯氨酸叔丁酯(B)，呈泡沫状；NMR(300MHz，d₆-DMSO)：0.94(d，3H)，0.99(d，3H)，1.30(s，9H)，1.76(m，1H)，1.80(m，2H)，2.13(m，2H)，3.61(m，1H)，3.80(s，3H)，3.93(m，1H)，4.17(dd，1H)，4.46(t，1H)，6.96(d，2H)，7.90(d，2H)，8.35(d，1H)。(iii)将酯(B)(7.13g)溶于三氟乙酸(85ml)中，将所得溶液搅拌30分钟。蒸发除去挥发性物质，残余物溶解于乙酸乙酯中并以水洗涤。干燥(Na₂SO₄)有机层，蒸发除去溶剂。用硅胶色谱法纯化所得物质，用甲醇∶二氯甲烷∶乙酸97∶2∶1洗脱，得到N-(4-甲氧苯甲酰基)-L-缬氨酰-L-脯氨酸(6.5g)(C)，使用该物质时不用再纯化；NMR(300MHz；d₆-DMSO)：0.87(d，3H)，0.99(d，3H)，1.88(m，3H)，2.15(m，2H)，3.64(m，1H)，3.80(s，3H)，3.97(m，1H)，4.24(dd，1H)，4.44(t，1H)，6.96(d，2H)，7.90(d，2H)，8.37(d，1H)。(iv)将化合物(C)(7.1g)，2(RS)，3(SR)-3-氨基-4-甲基-1，1，1-三氟-2-戊醇(3.8g，游离碱)和N-羟基苯并三唑水合物(5.5g)溶于二甲基甲酰胺(DMF，40ml)中，搅拌加入三乙胺(7.1ml)。然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(5.9g)，将所得混合物搅拌12小时。用乙酸乙酯稀释反应混合物并用1M盐酸(2次)、水、1M氢氧化钠溶液和盐水洗涤。干燥有机溶液，蒸发除去溶剂。用硅胶色谱法纯化所得物质(梯度洗脱，乙酸乙酯∶二氯甲烷(30∶70)至甲醇∶二氯甲烷(5∶95)，得到(S)-1-[(S)-2-(4-甲氧苯甲酰氨基)-3-甲基丁酰]-N-[2-甲基-1-(2，2，2-三氟-1-羟乙基)丙基]吡咯烷-2-甲酰胺(6.6g)(D)，呈白色泡沫；NMR(d₆-DMSO)：0.93(m，12H)，1.73-2.15(m，6H)，3.62(m，1H)，3.76(m，3H)，4.10(m，1H)，4.42(m，2H)，6.41(d，1H)，6.57(d，1H)，6.98(d，2H)，7.24(d，1H)，7.61(d，1H)，7.87(d，2H)，8.33(t，1H)。(v)将0.6M氢氧化钠溶液(10ml)加入氨基醇(D)(1.0g)的叔丁醇(8ml)和水(10ml)溶液中，将混合物冷却至5℃。然后加入高锰酸钾(1.0)的水(20ml)溶液，同时保持温度低于10℃。2小时后加入甲醇(4ml)，搅拌反应混合物直至紫色消失。用硅藻土过滤反应混合物并向滤液中加入固体氯化钠(11g)。用叔丁基甲基醚萃取该混合物，用叔丁基甲基醚和甲乙酮的混合物洗涤水相。用饱和碳酸氢钠溶液、0.5M盐酸、水洗涤合并的有机萃取液。蒸发除去溶剂，得到式ISSS和SSR非对映异构体的非对映混合物，呈泡沫状(SSS∶SSS比为3∶2)。

另外，步骤(v)可用如下进行：

向(S)-1-[(S)-2-(4-甲氧基苯甲酰氨基)-3-甲基丁酰]-N-[2-甲基-1-(2，2，2-三氟-1-羟乙基)丙基]吡咯烷-2-甲酰胺(6.6g)的DMSO(30ml)和甲苯(30ml)的冷溶液中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺(12.6g)，随后加入二氯乙酸(2.2ml)。使反应热至室温，并搅拌2.5小时。将反应混合物倒入乙酸乙酯，用1M盐酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤。干燥(MgSO₄)溶液，蒸发除去溶剂，得到式ISSS和SSR非对映异构体的混合物，呈油状。方法2(i)向L-缬氨酰-L-脯氨酸盐酸盐(34g)的THF(850ml)混合物中加入N-甲基吗啉(40ml)，随后加入三甲基氯硅烷(41ml)，保持温度低于30℃。将搅拌混合物2小时，然后冷却至0℃。再加入N-甲基吗啉(16.5ml)和4-对甲氧苯甲酰氯(18ml)的THF(25ml)溶液，保持温度低于5℃。15分钟后，过滤混合物，真空浓缩滤液成黄色油。将油溶于乙酸乙酯(100ml)并用饱和碳酸氢钾溶液(100ml)碱化至pH7-8。分离水相并以乙酸乙酯(50ml)洗涤。用2M盐酸溶液酸化水溶液至pH2-3，并以乙酸乙酯(150ml)萃取。真空浓缩有机萃取液并加入甲苯(150ml)。再次于真空浓缩溶液直至收集约50ml甲苯。然后搅拌状态将溶液滴加至己烷(400ml)中。得到白色固体，过滤并以己烷洗涤，真空干燥，得N-(4-甲氧苯甲酰)-L-缬氨酰-L-脯氨酸(40g)，NMR相似于上述方法1步骤(iii)所述。(ii)向N-(4-甲氧基苯甲酰)-L-缬氨酰-L-脯氨酸(34.8g)的THF(100ml)和甲基叔丁基醚(150ml)的溶液中加入N-甲基吗啉(36.8ml)，混合物被冷却至-5℃。在30分钟内加入氯甲酸异丁酯(14.4ml)的甲基叔丁基醚(30ml)溶液，在加入过程中保持温度为-5℃。-5℃时再搅拌反应混合物30分钟，然后加入2(RS)，3(SR)-3-氨基-4-甲基-1，1，1-三氟-2-戊醇草酸盐(22.3g)，使混合物温度1小时内上升至20℃。加入水(100ml)和碳酸氢钠(5g)，将混合物搅拌10分钟。分离有机相，以2M盐酸溶液(50ml)、盐水洗涤，低于50℃时减压蒸发，得到(S)-1-[(S)-2-(4-甲氧苯甲酰氨基)-3-甲基丁酰]-N-[2-甲基-1-(2，2，2-三氟-1-羟乙基)-丙基]吡咯烷-2-甲酰胺(42g)，呈泡沫状，与上述方法1步骤(iv)所得物质具有相似的NMR(iii)向(S)-1-[(S)-2-(4-甲氧苯甲酰氨基)-3-甲基丁酰]-N-[2-甲基-1-(2，2，2-三氟-1-羟乙基)丙基]-吡咯烷-2-甲酰胺(42g)的叔丁醇(340ml)溶液中加入叔丁醇(60ml)，水(360ml)和48％w/w氢氧化钠溶液(13.9ml)。将溶液冷却至5℃，在5-10℃ 1小时内加入高锰酸钾(40.1g)的水(750ml)溶液，在此温度下再搅拌反应混合物1小时，加入甲醇(100ml)于5-10℃搅拌混合物2小时。用硅藻土过滤反应混合物，用水(60ml)洗涤滤饼。向滤液中加入氯化钠(400g)和甲基叔丁基醚(200ml)，搅拌混合物10分钟，分离有机相。用甲基叔丁基醚(50ml)萃取水相，合并的有机相相继以2M盐酸、水、碳酸氢钠溶液和盐水洗涤。干燥(MgSO₄)有机溶液，蒸发除去挥发性物质，得到式I SSS和SSR非对映异构体的非对映混合物，呈泡沫状(SSS∶SSR比值约1∶1)。

根据美国专利4,910,190所述的方法，用方法1步骤(iv)和方法2步骤(ii)得到2(RS)，3(SR)-3-氨基-4-甲基-1，1，1-三氟-2-戊醇，或按下述方法得到3-氨基-4-甲基-1，1，1-三氟-2-戊醇(可作为非对映异构体的混合物使用)；(i)向亚硝酸钠(90g)中加入脲(72g)的DMF(810ml)溶液，搅拌10分钟，然后冷却至15℃。在30分钟内加入异丁基碘(97.2ml)，将反应混合物室温下搅拌20小时。将混合物重新冷却至15℃，缓慢加入水(810ml)。在室温下搅拌混合物5分钟。然后用甲基叔丁基醚萃取2次。合并的有机萃取液用20％硫代硫酸钠水溶液洗涤两次，真空浓缩得到2-甲基-1-硝基丙烷(39g)，使用时不必再纯化。(ii)真空下将3A分子筛(27.04g)于120℃加热20小时，并加入2-甲基-1-硝基丙烷(13.0mg)的甲基叔丁基醚(420ml)溶液。搅拌混合物5分钟，加入碳酸钾(64.5g)，再将混合物搅拌30分钟。将混合物冷却至15℃，在30分钟内加入氟的水合物(22.0g)。室温下搅拌反应混合物16小时，然后冷却至15℃并加入水(270ml)。室温搅拌5分钟后，分离有机相，用10％碳酸钾水溶液，2M盐酸溶液和水洗涤。低于40℃时减压蒸发除去溶剂，低于50℃时油与异丙醇共沸干燥，得到4-甲基-3-硝基-1，1，1-三氟-2-戊醇(21.3g)，呈油状，不用进一步纯化即可使用。(iii)用10％钯-炭催化剂(2.4g)在3.5ba压力氢化4-甲基-3-硝基-1，1，1-三氟-2-戊醇(17.1g)的异内醇(115ml)和乙酸(0.43ml)的溶液，直至将氢完全吸收。用硅藻土过滤除去催化剂，用异丙醇洗涤滤饼。真空蒸发滤液，直至没有异丙醇蒸馏出。残留物溶于乙腈(40ml)。搅拌加入草酸(3.94g)的乙腈(80ml)溶液，混合物冷却至5℃。过滤收集结晶产物，用冷乙腈洗涤，50℃干燥得3-氨基-4-甲基-1，1，1-三氟-2-戊醇，为其草酸盐形式(9.08g)。

                           方案1

无定形SSS和SSR非对映异构体混合物Cbz＝苄氧羰基合适的试剂包括：(a)三氟乙酸(b)氯甲酸异丁酯，N-甲基吗啉，THF(c)氢，10％钯-炭，乙醇(d)对甲氧苯甲酰氯，碳酸钠，THF(e)KMnO₄，NaOH，叔丁醇，水或1-(3-三甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，Cl₂CH.CO₂H，DMSO，甲苯

                    方案2无定形SSS和SSR非对映异构体混合物Cbz＝苄氧羰基

Claims (19)

1、一种式I化合物的结晶形式或其结晶的溶剂化物形式，该结晶形式含75％或更多的非对映异构体，在标注*和#的手性中心呈S构型。

2、根据权利要求1的结晶形式或其结晶溶剂化物，该形式含有95％或更多在*和#手性中心呈S构型的非对映异构体，或其结晶溶剂化物形式。

3、根据权利要求1或2的结晶形式，实际上或基本上不含溶剂，或其结晶溶剂化物形式为结晶水合形式。

4、根据权利要求1，2或3的结晶溶剂化物形式，该形式是式Ib的化合物，

或其水合形式，或其结晶的药物上可接受盐。

5、根据权利要求1，2或3的结晶形式，其实际上或基本上不含溶剂，X-射线粉末衍射图谱的2θ特定峰为8.95，11.17，11.47，13.86，15.49，17.86，18.22，19.24，21.58和21.92°。

6、根据权利要求1，2，3或4的结晶溶剂化物形式，其为水合形式，X-射线粉末衍射图谱的2θ特定峰为6.20，10.43，13.30，16.17，19.51，21.37和22.80°。

7、根据权利要求1，2或3的结晶溶剂化物形式，其为水合形式，具有X-射线衍射图谱的2θ特定峰为6.20，9.81，10.29，12.33，12.44，14.44和17.92°。

8、根据前述任一权利要求的结晶形式，通过液膜法技术从乙腈在盐窗上的流延膜得到的红外光谱在2968，1761，1629，1607，1533，1503，1443，1259，1209，1178，1158，1032，845和767cm^-1处有尖峰。

9、根据权利要求1，2，3或5的结晶形式，熔点在147-151℃范围。

10、根据权利要求1，2，3，4或6的结晶形式，通过差式扫描量热法(加热速率2℃/min)在约91-92℃测定出有一吸热过程，随后是开始于约109-110℃的放热过程，随后是开始于约148-149℃的吸热过程。

11、根据权利要求1，2，3或7的结晶形式，具有熔点为116-117℃。

12、一种药物组合物，该组合物包括前述任一权利要求的结晶形式和药物上可接受稀释剂或载体。

13、一种制备权利要求1的结晶形式或溶剂化物形式的方法，该方法包括在溶剂中从式I或其溶剂化物的基本上为SSS和SSR非对映异构体的非结晶混合物溶液形成晶体还可以选择性地有三级胺存在；溶剂选自乙醚，正丙醚和正丁醚或溶剂是甲基叔丁醚和己烷的混合物或乙酸乙酯和己烷的混合物。

14、根据权利要求13的方法，其改进在于以SSS和SSR非对映异构体或其溶剂化物的非结晶混合物溶液开始，在沸点低于乙酸乙酯的溶剂中，在加入己烷之前向溶液中加入乙酸乙酯并通过蒸发或蒸馏浓缩溶液。

15、一种生产如权利要求1的式I化合物的结晶形式或溶剂化形式的方法，该方法包括在溶剂中加热式I的基本上是SSS和SSR非对映异构体非结晶混合物和选自N-(1-4C)烷基吗啉，N-(1-4C)烷基哌啶，吡啶和五异丙基胍的碱；所用溶剂选自甲基叔丁基醚，己烷或沸点处于100-120℃范围内的烃混合物，或其混合物，或乙酸乙酯和己烷的混合物，加入晶种至溶液并使溶液冷却。

16、一种生产如权利要求2的结晶形式或溶剂化形式的方法，该方法包括使权利要求12，13，14或15得到的产物在溶剂中重结晶一次或多次，溶剂选自甲苯，乙酸乙酯和己烷的混合物，丙酮和水的混合物，叔丁醇和水的混合物。

17、一种生产式I的SSS和SSR非结晶非对映体混合物的方法，该方法包括：

(a)将N-(4-甲氧苯甲酰)-L-缬氨酰-L-脯氨酸或其盐与3-氨基-4-甲基-1，1，1-三氟-2-戊醇偶合，得到(S)-1-[(S)-2-(4-甲氧苯甲酰氨基)-3-甲基丁酰]-N-[2-甲基-1-(2，2，2-三氟-1-羟乙基)丙基]吡咯烷-2-甲酰胺；随后，

(b)氧化(S)-1-[(S)-2-(4-甲氧苯甲酰氨基)-3-甲基丁酰]-N-[2-甲基-1-(2，2，2-三氟-1-羟乙基)丙基]吡咯烷-2-甲酰胺。

18、化合物N-(4-甲氧苯甲酰基)-L-缬氨酰-L-脯氨酸或其盐。

19、一种生产权利要求18化合物的方法，该方法包括以下步骤：

(i)将L-缬氨酰-L-脯氨酸或其盐与三(1-4C)烷基卤代硅烷或双(三(1-4C)烷基甲硅烷基)乙酰胺反应，得到L-缬氨酰-L-脯氨酸三(1-4C)烷基甲硅烷酯；

(ii)将L-缬氨酰-L-脯氨酸三(1-4C)烷基甲硅烷基酯与4-甲氧苯甲酸的活性衍生物反应，得到N-(4-甲氧苯甲酰基)-L-缬氨酰-L-脯氨酸三(1-4C)烷基甲硅烷基酯；

(iii)除去三(1-4C)烷基甲硅烷保护基。

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