NO313882B1

NO313882B1 - Diastereomert rene trifluormetylketonpeptidderivater som inhibitorer for human leukocyttelastase og fremstilling avderivatene

Info

Publication number: NO313882B1
Application number: NO19963329A
Authority: NO
Inventors: Stephen John Pegg; George Joseph Sependa; Elwyn Peter Davies; Chris Allan Veale
Original assignee: Zeneca Ltd
Priority date: 1994-02-11
Filing date: 1996-08-09
Publication date: 2002-12-16
Also published as: IL112613A0; AU692515B2; FI963132A0; NO963329L; EP0743953A1; US5739157A; TW414801B; ATE174034T1; DK0743953T3; IL112613A; NO963329D0; FI963132A; NZ279265A; HK1011033A1; WO1995021855A1; JPH09508902A; JP3416142B2; ES2125004T3; EP0743953B1; DE69506380D1

Description

OTASTFRFOMFRT RFNF TR TFT. UORMFT YT. KFTONPFPTTD-DFRTVATFR SOM TNHTRTTORF. R FOR HUMAN LFnKOCYTTFLASTASF

Den foreliggende oppfinnelse vedrører pyrrolidinderivat-er, og nærmere bestemt forbindelsen ( S.) -1-[ (£1) -2-(4-metoksy-benzamido)-3-metylbutyryl]-M-[(£)-2-metyl-l-(trifluoracetyl)-propyl]pyrrolidin-2-karboksamid, vist i formelen I (fremsatt nedenfor)

og som har S-konfigurasjon i de kirale sentre identifisert ved symbolene <*> og #, og solvater derav, hvilken forbindelse er en inhibitor for human leukocyttelastase (HLE), også kjent som human neutrofil elastase (HNE), som er av verdi, f.eks., som et forskningsinstrument i farmakologiske, diagnostiske og beslektede studier og ved behandling av sykdommer hos pattedyr hvor HLE er implisert. F.eks. er HLE blitt implisert årsaksmessig i patogenesen av akutt respiratorisk åndenødssyndrom

(ARDS:acute respiratory distress syndrome), rheumatoid artritis, aterosklerose, lungeemfysem, og andre inflammator-iske forstyrrelser, innbefattet bestennelsessykdommer i luft-veiene karakterisert ved øket og unormal luftveissekresjon, såsom akutt og kronisk bronkitt og cystisk fibrose. HLE er også blitt årsaksmessig implisert i visse vaskulære sykdommer og beslektede tilstander (og deres terapi) hvori neutrofil deltagelse er involvert eller implisert, f.eks. i blødning i forbindelse med akutt ikke-lymfocyttisk leukemi, så vel som i reperfusjonsskade i sammenheng med f.eks. myokardial ischemi og beslektede tilstander i forbindelse med koronar arteriesyk-

dom såsom angina og infarkt, cerebrovaskulær ischemi såsom transient ischemisk attakk og slag, perifer okklusiv vaskulær sykdom såsom intermittent klaudikasjon og kritisk lemischemi, veneutilstrekkelighet såsom venehypertensjon, åreknuter og venesårdannelse, så vel som tilstander av nedsatt reperfusjon såsom dem i forbindelse med rekonstruktiv vaskulær kirurgi, trombolyse og angioplasti. Oppfinnelsen angår også fremgangsmåter for behandling av én eller flere av disse sykdoms-tilstander, og anvendelse av forbindelsen (eller et solvat derav) til fremstilling av et medikament for anvendelse i én eller flere av nevnte tilstander. Oppfinnelsen angår videre farmasøytiske blandinger som inneholder forbindelsen, eller et solvat derav, som aktiv bestanddel, så vel som fremgangsmåter for fremstilling av forbindelsen (eller et solvat derav) , nye mellomprodukter anvendelige i nevnte fremgangsmåter og metoder for fremstilling av nevnte mellomprodukter.

På grunn av HLE's åpenbare rolle, har det vært betydelig forskningsanstrengelse i senere år for utvikling av HLE-inhibitorer. I US-patent 4.910.190 er det beskrevet en serie av strukturelt beslektede peptidoyltrifluormetan-derivater som er HLE-inhibitorer. Vi har nå oppdaget at det spesifikke pyrrolidinderivat nevnt ovenfor, er en potent inhibitor for HLE, idet det har en overraskende fordel ved at det er en enkelt diastereoisomer som har krystallinsk form. Dette utgjør basis for den foreliggende oppfinnelse. Å anvende en HLE-inhibitor som ikke kan isoleres i krystallinsk form som, eller ved formulering av, et medikament for behandling av sykdomstilstandene referert til ovenfor, innebærer betydelige problemer, f.eks. ved fremstilling av forbindelsen eller formuleringen til det renhetsnivå og den ensartethet som kreves for regulatorisk godkjenning. Det er derfor svært

ønskelig å finne en ny krystallinsk HLE-inhibitor og enda mere ønskelig å fremstille en ny krystallinsk HLE-inhibitor som er en enkelt diastereoisomer. En ytterligere fordel med forbindelsen ifølge denne oppfinnelse er at den er blitt funnet å ha HLE-inhibitorisk aktivitet når den administreres oralt. Før den foreliggende oppfinnelse, hadde det spesifikke pyrrolidin-

derivat nevnt ovenfor, ikke tidligere vært fremstilt, og intet var derfor spesifikt kjent angående dets fysiske, kjemiske eller farmakologiske egenskaper.

I Tetrahedron Letters, bd. 33, nr. 30, s. 4279-4282, 1992, beskrives en stereoselektiv syntese for fremstilling av peptidyl-trifluormetylketoner med formelen

med over 99% isomer renhet.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes forbindelsen (S)-1-[ (£.) -2-(4-metoksybenzamido)-3-metylbutyryl]-M-[(S)-2-metyl-l-(trifluoracetyl)propyl]-pyrrolidin-2-karboksamid, eller et solvat derav.

Forbindelsen ifølge denne oppfinnelse, som også kan representeres ved formelen Ia

(hvori en fortykket linje betegner en binding som stikker ut på oversiden av papirets plan) er en enkelt diastereoisomer, i det følgende referert til heri som "SSS-diastereoisomeren med formel I" eller "SSS-diastereoisomeren", for å skille den fra andre mulige diastereoisomerer med forskjellig konfigurasjon i

det kirale sentre angitt ved <*> og # i formel I, f.eks. diastereoisomeren som, i formel I, har S-konfigurasjon i de kirale sentre merket <*> og R-konfigurasjonen i de kirale sentre merket # (referert til heri i det følgende som "SSR-diastereoisomeren med formel I" eller "SSR-diastereoisomeren") .

SSS-diastereoisomeren med formel I er et krystallinsk fast stoff, som eksisterer i en form som hovedsakelig eller i alt vesentlig er fri for løsningsmiddel (i det følgende referert til heri som den "vannfrie" form), eller som en solvatisert form. Den solvatiserte form kan f.eks. være en hydratisert form, som kan eksistere som en gem-diol av tri-fluorketonfunksjonaliteten, dvs. som en forbindelse med formelen Ib

og/eller en form som inkorporerer et vannmolekyl som del av krystallgitteret. F.eks. kan gem-diolen Ib, selv være ytterligere hydratisert. Det kan fremstilles krystallinsk SSS-diastereoisomer hvori forholdet av vannfri form til solvatisert (f.eks. hydratisert) form er f.eks. ca. 1:1 eller større, såsom 4:1 eller større. Når forbindelsen ifølge denne oppfinnelse er f.eks. isolert i alt vesentlig eller hovedsakelig fri for løsningsmiddel, vil forholdet av vannfri form til solvatisert (f.eks. hydratisert) form f.eks. være ca. 19:1 eller bedre, dvs. 95 vekt.% eller mer av forbindelsen være i den vannfrie form.

Det vil bli forstått at det er ekstremt vanskelig å fremstille en forbindelse som er en enkelt diastereoisomer fullstendig fri for de andre mulige diastereomere former, spesielt en forbindelse som har tre kirale sentre. Den foreliggende oppfinnelse inkluderer derfor en krystallinsk form av SSS-diastereoisomeren med formel I, eller et solvat derav, som inneholder andre mulig diastereoisomerer med forskjellige konfigurasjoner i de kirale sentre angitt ved <*> og # i formel I. Det er blitt funnet at det kan fremstilles krystallinsk SSS-diastereoisomer med formel I, eller et solvat derav, som inneholder 25% eller mindre av SSR-diastereoisomeren med formel I, dvs. at det krystallinske materiale har et forhold av SSS:SSR-former på ca. 3:1 eller mer. Den foreliggende oppfinnelse inkluderer derfor en krystallinsk form av forbindelsen med formel I med et innhold på minst 75% av SSS-diastereoisomeren. Det kan f.eks. fremstilles krystallinsk materiale med et forhold av SSS:SSR på ca. 4:1 (eller større) og et forhold av vannfri:hydratisert form på ca. 4:1 (eller større). Fortrinnsvis vil den krystallinske SSS-diastereoisomer med formel I, eller et solvat derav, være i alt vesentlig eller hovedsakelig rent, dvs. at det inneholder mindre enn 5% av én eller flere av de andre mulige diastereoisomerer, f.eks. at det inneholder mindre enn 5% av SSR-diastereoisomeren med formel I, fortrinnsvis mindre enn 3% av SSR-diastereoisomeren med formel I, og mere fortrinnsvis mindre enn 2% av SSR-diastereoisomeren med formel I.

Fortrinnsvis vil SSS-diastereoisomeren med formel I være i vannfri form, dvs. hovedsakelig eller i alt vesentlig fri for den solvatiserte (f.eks. hydratiserte) form. I denne form, har SSS-diastereoisomeren den fordelaktige egenskap at den er ikke-hygroskopisk. Den har også den fordelaktige egenskap at den i fast tilstand har god epimer stabilitet. En spesielt foretrukket.form av SSS-diastereoisomeren med formel I er således en form som inneholder mindre enn 2% av SSR-diastereoisomeren med formel I og som er 95% eller mere i vannfri form.

Smeltepunktet av SSS-diastereoisomeren med formel I vil generelt avhenge av renhetsnivået, og kan bestemmes ved vanlige fremgangsmåter vel kjent i teknologien, f.eks. ved differensial scanning-kalorimetri (DSC). Typisk vil SSS-diastereoisomeren med formel I ha et smeltepunkt som er i området 147-151°C, f.eks. 148-150°C, spesielt 147-149°C, når den er hovedsakelig eller i alt vesentlig i vannfri form, og hovedsakelig eller i alt vesentlig fri for SSR-diastereoisomeren (oppvarmingshastighet 5°C/minutt). Når den imidlertid eksisterer som en ca. l:l-blanding av vannfri og hydratisert form, og er hovedsakelig eller i alt vesentlig fri for SSR-diastereoisomeren, kan den fremstilles i en form som typisk har en smeltepunkt på 116-117°C.

SSS-diastereoisomeren med formel I, når den er hovedsakelig eller i alt vesentlig i vannfri form og hovedsakelig eller i alt vesentlig fri for SSR-diastereoisomeren, har et røntgenstråle-pulverdiffraksjonsmønster som inkluderer spesifikke topper ved ca. 2<®> = 8,95, 11,17, 11,47, 13,86, 15,49, 17,86, 18,22, 19,24, 21,58 og 21,92°.

SSS-diastereoisomeren med formel I, når den eksisterer som hovedsakelig en l:l-blanding av vannfri og hydratisert form med smeltepunkt 116-117°C, har et røntgenstråle-pulverdiffraksjonsmønster som inkluderer spesifikke topper ved ca. 2<©> = 6,20, 9,81, 10,29, 12,33, 12,44, 14,22 og 17°.

SSS-diastereoisomeren med formel I kan dessuten fremstilles i en krystallinsk hydratisert form som er hovedsakelig eller i alt vesentlig fri for SSR-diastereoisomeren, og som ved differensial scanningkalorimetri (oppvarmingshastighet 2°C/minutt) har en endoterm hendelse som begynner ved 91-92°C (med en topp ved 99-100°C) , etterfulgt av en eksoterm hendelse som begynner ved 109-110°C (med en topp ved 111-112°C) , etterfulgt av en ytterligere endoterm hendelse som begynner ved 148-149°C (med en toppverdi ved 150-151°C) . Denne hydratiserte form har et røntgenstrålepulver-diffraksjonsmønster som inkluderer spesifikke topper ved ca. 2© = 6,62, 10,43, 13,30, 16,17, 19,51, 21,37 og 22,80°. Disse DSC-data, sammen med termogravimetriske analyse (TGA) data og <19>F NMR-spektraldata, angir at denne form i alt vesentlig er monohydratet av gem-diolen (med formel Ib). Det vil bli forstått at begynnelsen og toppverdiene gjengitt ovenfor, kan variere noe avhengig av den anvendte scanninghastighet. F.eks. viste det seg at en lignende DSC-scanning utført med en scanninghastighet på 5°C/min., viste begynnelse av den første endoterme hendelse ved ca. 95-96°C (med en topp ved 105-106°C) .

Røntgenstråle-pulverdiffraksjonsspektra ble bestemt ved anvendelse av Scintag XDS-2000 X-ray diffraktometer, med en EC&G fast-tilstandsfotondetektor, GLP Series (germanium) operert med en Microvax computer og som anvendte Diffraction Management System software levert av Scintag Inc., Sunnydale, California, USA. Det anvendte røntgenstrålerør var et Cu K-alfa med en bølelengde på 1,5406 Å ved 45 KV og 40 mA. Mot-.tagerslissene var satt på 2 og 4 mm, og de divergerende slisser satt på 0,5 og 0,2 mm med hensyn til retningen for den innfallende stråle. Spektrene ble oppnådd på den kontinuerlige scanningmåte med en kutter-stigning på 0,02. Hver prøve ble eksponert i 1 grad 2-theta pr. minutt (kjøre-tiden var 38 minutter) og oppsamlet fra 2 til 40 grader 2-theta, for å gi et spor av avstander mot intensitet for dette området.

For diffraksjonsanalyse ble prøvene pakket i runde prøve-skåler av aluminiumlegering med en diameter på 25 mm og dybde på 2 mm. Pulverprøven ble plassert i skålen slik at det var tilstede en mengde i overskudd av skålens volum, og deretter utjevnet til kanten av skålen med et mikroskop-objektglass. Silisium av typen NBS 640b ble anvendt som ytre standard.

Røntgenstrålepulver-diffraksjonsspektra av typiske prøver av SSS-diastereoisomeren med formel I, når den er hovedsakelig eller i alt vesentlig fri for løsningsmiddel, når den er en ca. l:l-blanding av vannfri og hydratisert form, og når den er i hydratisert (gem-diolmonohydrat) form, er vist i henholdsvis figurene 1, 2 og 3 i det følgende.

Infrarøde spektra ble fremstilt for typiske prøver av SSS-diastereoisomeren med formel I når den er hovedsakelig eller i alt vesentlig fri for løsningsmiddel, når den er en ca. l:l-blanding av vannfri og hydratisert form, og når den er monohydratet med formel Ib. De infrarøde spektra ble oppnådd ved løsningsmiddel-støpeteknikken vel kjent i teknologien, fra acetonitrilutstøpinger av en prøve på et salt (f.eks. ZnSe eller KBr) vindu for analyse ved direkte transmisjon. De infra-røde spektra ble bestemt over bølgetallområdet 4000 til 4 00 cm"<1>.

Det infra-røde spektrum av en prøve av SSS-diastereoisomeren med formel I når den er hovedsakelig eller i alt vesentlig fri for løsningsmiddel, er vist i fig. 4. Spektret i fig. 4 inkluderer skarpe topper ved ca. 2968, 1761, 1629, 1607, 1533, 1503, 1443, 1259, 1209, 1178, 1158, 1032, 845 og 767 cm"<1>. Det infra-røde spektrum av en prøve av SSS-diastereoisomeren med formel I når den er hovedsakelig en 1:1-blanding av vannfri og hydratisert form, og spekteret av en prøve av monohydratet av gem-diolen med formel Ib, var ikke signifikant forskjellige fra spekteret i fig. 3 på grunn av karakteren av løsningsmiddelstøpeteknikken og det anvendte løsningsmiddel.

Det vil bli forstått at 2<©->verdiene for røntgenstråle-pulverdiffraksjonsmønsterne og bølgelengdene for de infra-røde spektra, kan variere noe fra en maskin til en annen, og slik at de angitte verdier ikke skal oppfattes som absolutte.

Det vil bli forstått at hydrogenatomene i hydroksylgrupp-ene på gem-diolen med formel Ib er sure, og at slike forbindelser derfor kan danne krystallinske farmasøytisk akseptable salter, ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter, f.eks. med baser som gir fysiologisk akseptable kationer, f.eks. alkalimetall (såsom natrium eller kalium), jordalkali-metall eller organiske aminsalter. Oppfinnelsen skal derfor inkludere krystallinske farmasøytisk akseptable salter av en gem-diol med formel Ib eller et hydrat derav.

SSS-diastereoisomerene med formel I, eller solvater derav, kan fremstilles, ved følgende■fremgangsmåter, som er ytterligere separate aspekter ifølge denne oppfinnelse.

Krystallinske SSS-diastereoisomerer inneholdende mindre enn 25% SSR-diastereoisomerer, kan fremstilles fra en ikke-krystallinsk (amorf) diastereomer blanding av SSS og SSR-diastereoisomerene, inneholdende SSS og SSR-diastereoisomerene i ca. like store mengder (dvs. et forhold på ca. 1:1 til ca. 3:2 SSS:SSR), ved krystallisering fra et egnet ikke-polart løsningmiddel, såsom dietyleter, di-n-propyleter eller di-n-butyleter, eller en blanding av løsningsmidler, såsom en blanding av metyl-i-erJi-butyleter og heksan eller, fortrinnsvis, en blanding av etylacetat og heksan. For å initiere krystalliseringen, kreves det utsåing med krystallinsk SSS-diastereoisomer. En foretrukket slik krystalliseringsfrem-gangsmåte omfatter å redusere volumet av løsningen av en ikke-krystallinsk diastereomer blanding av SSS og SSR-diastereoisomerene i etylacetat ved inndamping eller destillasjon, tilsetning av heksan til den varme løsning og opprettholdelse av en klar løsning, utsåing med i alt vesentlig ren SSS-diastereoisomer og gradvis avkjøling. En modifikasjon av denne fremgangsmåte inkluderer anvendelse av en løsning av den ikke-krystallinske diastereomere blanding av SSS og SSR-diastereoisomerene i et laverekokende løsningsmiddel enn etylacetat (såsom metyl i£xt-butyleter), f.eks. som det kan fremstilles direkte fra opparbeidingen av preparatet av den ikke-krystallinske blanding (som diskutert nedenfor) og utveksling av løsningsmiddelet med etylacetat ved tilsetning av etylacetat og konsentrering av løsningen ved inndamping eller destillasjon ved atmosfærisk trykk, før tilsetningen av heksanet.

Avhengig av det anvendte løsningsmiddel og de nøyaktige betingelser som anvendes for krystalliseringen, kan produktet til å begynne med, isoleres som en blanding av vannfrie og hydratiserte diastereoisomerer, f.eks., med et forhold av vannfri:hydratisert form på ca. 1:1 eller større. Krystallinsk produkt med et forhold av vannfri:hydratisert form på ca. 4:1 kan f.eks. fremstilles.

Hovedsakelig eller i alt vesentlig ren krystallinsk SSS-diastereoisomer med formel I, hovedsakelig eller i alt vesentlig i vannfri form, f.eks. inneholdende ca. 5% eller mindre av den hydratiserte form, kan fremstilles ved gjentatt re-krystallisering av krystallinsk SSS-diastereoisomer inneholdende SSR-diastereoisomer. Et ikke-polart løsningsmiddel som danner en azeotrop med vann, blir vanligvis anvendt for dette formål. Dette letter fjerning av vann fra systemet når SSS-diastereoisomeren med formel I, inneholdende SSR-diastereoisomer, blir løst ved oppvarming eller koking i et krystallisasjonsløsningsmiddel, fortrinnsvis med konsentrering av løsningen, før tilsetningen av et andre løsningsmiddel om nødvendig, og krystalliseringen tillates å foregå. Toluen er et spesielt egnet løsningsmiddel for dette formål, eller en blanding av etylacetat og heksan, hvori heksanet blir tilsatt etter azeotropisk fjerning av vann fra etylacetatløsningen. Krystallinsk SSS-diastereoisomer som er hovedsakelig eller i alt vesentlig ren og hovedsakelig eller i alt vesentlig i vannfri form, kan deretter også rekrystalliseres fra alternative løsningsmidler, innbefattet n-butylacetat, iso-propylacetat, 1,2-dimetoksyetan, 2,2-dimetoksypropan, tert-butanol, iiext-amylmetyleter og blandinger av diklormetan og heksan, metyletylketon og heksan, N,N-dimetylformamid og metyl tert-hiityl eter, dipropyleter og acetonitril, 1,4-dioksan og heksan, metyletylketon og isoheksan, tetrahydrofuran og cyklo-heksan, etylacetat og isoheksan, tetrahydrofuran og heksan, tetrahydrofuran og isoheksan, dietyleter og etylacetat, og li£r_t-amylmetyleter og acetonitril. En enkelt krystallisering fra hvilket som helst av løsningsmidlene ovenfor, kan være tilstrekkelig til å oppnå SSS-diastereoisomer inneholdende 5% eller mindre av SSR-diastereoisomer. I alle omkrystalliser-inger blir det foretrukket initiering av krystalliseringen ved utsåing.

Alternativt kan det fremstilles en hovedsakelig eller i alt vesentlig ren hydratisert form (hvis data angir at den er et gem-diol monohydrat) ved gjentatt omkrystallisering av krystallinsk SSS-disatereoisomer inneholdende SSR-diastereoisomer ved anvendelse av en blanding av aceton og vann, eller en blanding av £_e_ri-butanol og vann som løsningsmiddel.

Når det utføres krystalliseringer eller omkrystalliser-inger som det referes til ovenfor, vil forholdet av volum av løsningsmiddel (i ml) til vekten av SSS-diastereoisomer inneholdende SSR-diastereoisomer (i gram), fortrinnsvis være f.eks. i området fra 2:1 til 15:1, og beleiligvis ca. 6:1 til 10:1.

En ikke-krystallinsk (amorf) diastereomer blanding av SSS og SSR-diastereoisomerer som referert til ovenfor, kan fremstilles som beskrevet i eksempel 20 av US patent nr. 4.910.190 eller ved den analoge fremgangsmåte illustrert i skjema 1.

Alternativt kan det anvendes den nye fremgangsmåte illustrert i skjema 2, hvori det nye mellomprodukt M-(4-metoksybenzoyl)-L-valyl-L-prolin (eller et salt derav), som er et ytterligere aspekt ifølge denne oppfinnelse, blir koblet med 3-amino-4-metyl-l,1,1-trifluor-2-pentanol, etterfulgt av konvensjonell oksydasjon av alkoholproduktet til det tilsvarende keton. Konvensjonelle fremgangsmåter for lignende koblings- og oksydasjonsreaksjoner er beskrevet heri og i USP 4.910.190. En fordel ifølge denne fremgangsmåte, er at den tillater inkorporering av aminoalkoholen i et senere trinn. Det nye mellomprodukt kan fremstilles ved anvendelse av de konvensjonelle trinn med selektiv avbeskyttelse, kobling og avbeskyttelse (skjema 2, trinnene (a)-(c)), som illustrert i fremgangsmåte 1 i det følgende. Alternativt blir N-t.ert-butyloksykarbonylvalin koblet med prolinbenzylesteren, f.eks. ved anvendelse av M-hydroksybenztriazol og dicykloheksylkarbo-diimid i diklormetan ved 0°C, etterfulgt av fjerning av den t£jit-butyloksykarbonylbeskyttende gruppe ved anvendelse av trifluoreddiksyre under dannelse av L-valyl-L-prolinbenzylesteren. Denne blir så koblet med f.eks. anisoylklorid i diklormetan ved ca. omgivende temperatur i nærvær av trietylamin, og den benzylbeskyttende gruppe blir deretter fjernet ved hydrogenolyse. Den diastereomere blanding fremstilt ved anvendelse av disse fremgangsmåter, har et SSS:SSR-forhold på ca. 1:1 til 3:2, og er bare blitt isolert i en ikke-krystallinsk form, såsom et skum eller en olje.

Alternativt blir en spesielt fordelaktig fremgangsmåte for fremstilling av det nye mellomprodukt M-(4-metoksybenzoyl)-L-valyl-L-prolin, som er et annet aspekt ifølge den foreliggende oppfinnelse, karakterisert ved følgende trinn: (i) omsetning av L-valyl-L-prolin (eller et salt derav) med et tri(1-4C)alkylhalogenosilan (f.eks. trimetylklorsilan) eller bis(tri(1-4C)alkylsilyl)acetamid (såsom bis(trimetyl-silyl)acetamid) under dannelse av L-valyl-L-prolin tri(l-4C)alkylsilylester (f.eks. L-valyl-L-prolintrimetylsilyl-ester); etterfulgt av (ii) omsetning av L-valyl-L-prolin tri(1-4C)alkylsilylesteren med et aktivert derivat av 4-metoksybenzosyre (f.eks. et syreklorid såsom 4-metoksybenzoylklorid (også kjent som anisoylklorid) eller et anhydrid), under dannelse av M-(4-metoksybenzoyl)-L-valyl-L-prolin tri(1-4C)alkylsilylester; etterfulgt av (iii) fjerning av tri(1-4C)alkylsilylbeskyttelsesgruppen.

Trinn (i) utføres beleilig i et egnet inert løsnings-middel eller fortynningsmiddel, f.eks. etylacetat, et eterisk løsningsmiddel eller fortynningsmiddel (såsom tetrahydrofuran eller dioksan) eller et hydrokarbonløsningsmiddel såsom toluen, i nærvær av en organisk base såsom f.eks. trietylamin, pyridin eller fortrinnsvis N-metylmorfolin, eller en uorganisk base såsom natrium eller kaliumkarbonat. Omsetningen utføres ved en temperatur i området f.eks. fra -10 tii 50°C, og fortrinnsvis mellom 0 og 30°C. Fortrinnsvis anvendes ca. 2 ekvivalenter base pr. ekvivalent av L-valyl-L-prolin (eller det anvendes 3 ekvivalenter base dersom det anvendes et salt, såsom L-valyl-L-prolinhydroklorid). Fortrinnsvis anvendes ca. 2 ekvivalenter eller mer av silyleringsmiddelet pr. ekvivalent av L-valyl-L-prolin.

Trinn (ii) utføres under vannfrie betingelser ved anvendelse av en konvensjonell fremgangsmåte. F.eks. anvendes 4-metoksybenzoylklorid, og det anvendes lignende betingelser som i trinn (i). I dette tilfelle anvendes ca. 1 ekvivalent syreklorid til 1 ekvivalent base (eller et svakt overskudd). Fortrinnsvis blir produktet fra trinn (i) ikke isolert, men blir omsatt in situ ved tilsetning av en ytterligere ekvivalent av den samme base som anvendt i trinn (i), etterfulgt av 1 ekvivalent av syrekloridet.

Trinn (iii) utføres ved anvendelse av en konvensjonell fremgangsmåte for avbeskyttelse av en silylbeskyttende gruppe, f.eks. ved hydrolyse ved vandige betingelser. Den silylbeskyttende gruppe blir beleilig fjernet under opparbeidings-fremgangsmåten i trinn (ii). Det vil bli forstått at andre konvensjonelle silyleringsmidler kan anvendes i trinn (i) for å danne den tilsvarende silylester av L-valyl-L-prolin, som deretter kan anvendes i trinn (ii) og den silylbeskyttende gruppe deretter fjernes som i trinn (iii).

For å oppnå en ikke-krystallinsk (amorf) diastereomer blanding av SSS og SSR-diastereoisomerer, for anvendelse som utgangsmateriale for fremstilling av forbindelsen ifølge denne oppfinnelse, kan trinnene (i)-(iii) etterfølges av: (iv) omsetning av M-(4-metoksybenzoyl)-L-valyl-L-prolin med 3-amino-4-metyl-l, 1,1-trifluor-2-pentanol under dannelse av (£.) - 1-[(£)-2-(4-metoksybenzamido)-3-metylbutyryl]-M-[2-metyl-l-(2,2,2-trifluor-l-hydroksyetyl)propyl]pyrrolidin-2-karboksamid; etterfulgt av (v) oksydasjon av (SJ-1-[ { S.) -2-(4-metoksybenzamido)-3-metyl-butyryl] -M-[2-metyl-l-(2,2,2-trifluor-l-hydroksyetyl)propyl]-pyrrolidin-2-karboksamid, tilsvarende trinnene (d) og (e) i skjema 2.

Trinn (iv) blir utført ved anvendelse av en konvensjonell metode for kobling av en karboksylsyre til et amin under dannelse av en amidbinding, såsom dem beskrevet i US patent 4.910.190. Særlig egnet er anvendelsen av et klorformiat, f.eks. et alkylklorformiat (såsom isobutylklorformiat) i nærvær av et tertiært amin (såsom trietylamin eller fortrinnsvis N-metylmorfolin), i et egnet løsningsmiddel eller fortynningsmiddel, f.eks. et klorert løsningsmiddel•eller fortynningsmiddel såsom diklormetan, et eterisk løsningsmiddel eller fortynningsmiddel såsom tetrahydrofuran eller metyl t£_ct-butyleter, eller et hydrokarbonløsningsmiddel eller fortynningsmiddel såsom toluen. En blanding av løsningsmidler eller fortynningsmidler kan anvendes, f.eks. en blanding av toluen og tetrahydrofuran. Reaksjonen utføres vanligvis ved en temperatur i området f.eks. -15°C til 30°C og fortrinnsvis mellom -10°C og 20°C. En omvendt tilsetning av det forhånds-dannede blandede anhydrid til en velling av aminoalkoholen, f.eks. ved anvendelse av metyl jLexi-butyleter som løsnings-middel, kan også anvendes.

Trinn (v) blir utført ved anvendelse av et konvensjonelt oksydasjonsmiddel for omdanningen av en hydroksygruppe til en ketongruppe. Egnede oksydasjonsmidler og betingelser inkluderer f.eks. anvendelse av oksalylklorid, dimetylsulfoksyd og et tertiært amin; anvendelse av eddiksyreanhydrid og dimetylsulfoksyd; anvendelse av kromtrioksydpyridinkompleks i diklormetan; anvendelse av høyverdig jodreagens, såsom 1,1,l-triacetoksy-2,l-benzoksidol-3(3H)-on med trifluoreddiksyre i diklormetan; anvendelse av overskudd av dimetylsulfoksyd og et vannløselig karbodiimid i nærvær av dikloreddiksyre; eller alkalisk vandig kaliumpermanganatløsning. Spesielt egnede oksydasjonsmidler er de to sistnevnte, spesielt alkalisk vandig kaliumpermanganatløsning, f.eks. en blanding av natriumhydroksyd og kaliumpermanganat.

3-Amino-4-metyl-l,1,1-trifluor-2-pentanol kan fremstilles som beskrevet i US patent nr. 4.910.190 eller som illustrert i eksemplene.

Alternativt, dersom (S)-1-[(SJ-2-(4-metoksybenzamido)-3-metylbutyryl]-M-[(£)-2-metyl-l-((R)-2,2,2-trifluor-l-hydroksyetyl ) propyl ] pyrrolidin-2-karboksamid (som kan fremstilles f.eks. ved anvendelse av fremgangsmåter analoge med dem vist i skjema 1 eller 2, men ved anvendelse av den oppløste aminoalkohol 2 (R) , 3 (S.) -3-amino-4-metyl-l, 1,1-trif luor-2-pentanol, selv fremstilt som beskrevet i US patent nr. 4.910.190 eller som beskrevet i eksempelene i det følgende) blir oksydert, da kan det isolerte amorfe materialet krystalliseres under dannelse av hovedsakelig eller i alt vesentlig ren krystallinsk SSS-diastereoisomer som en blanding av vannfrie og hydratiserte former (f.eks. dersom dietyleter anvendes som krystallisasjonsløsningsmiddel), eller i alt vesentlig den vannfrie form (f.eks. dersom materialet krystalliseres eller omkrystalliseres fra toluen).

Oksydasjonen kan utføres ved anvendelse av betingelser analoge med dem beskrevet i trinn (v) ovenfor.

En spesielt fordelaktig fremgangsmåte for fremstilling av SSS-diastereoisomeren med formel I, som er et enda ytterligere aspekt ifølge den foreliggende oppfinnelse, karakteriseres ved oppvarming av en ikke-krystallinsk (amorf) diastereomer blanding av SSS og SSR-diastereoisomerer med formel I med en egnet base, f.eks. en tertiær base såsom et M-(1-4C)alkyl-" morfolin (f.eks. N-metylmorfolin), et M-(1-4C)alkylpiperidin (f.eks. M-etylpiperidin), pyridin eller pentaisopropyl-guanidin, i et egnet ikke-polart løsningsmiddel eller fortynningsmiddel, f. eks. metyl te_nt-butyleter, heksan eller fortrinnsvis en blanding av hydrokarboner med et kokepunkt i området 110-120°C (f.eks. en petroleumfraksjon, k.p. 100-120°C såsom "ESSOCHEM 30" (et varemerke)), eller blandinger derav, eller en blanding av etylacetat og heksan. Ettersom løsningen tillates å avkjøle seg gradvis, vil SSS-diastereoisomer krystallisere fra løsningen, og epimeriseringen av den deretter SSR-anrikede diastereomere blanding som er tilbake i den varme løsning, finne sted, hvorved det fremstilles ytterligere SSS-diastereoisomer som krystalliserer. Likevekten drives således i favør av SSS-diastereoisomeren. Denne epimeriserings/krystalliseringsfremgangsmåte tillater derfor omdanning av SSR-diastereoisomer til SSS-diastereoisomer, eller resirkulering av morvæsker anriket på SSR-diastereoisomeren for fremstilling av ytterligere mengder av SSS-diastereoisomer. Fremgangsmåten har derfor den fordel at den kan utføres ved anvendelse av enten en SSS eller SSR-anriket diastereomer blanding. En foretrukket base for anvendelse i epimeriserings/krystalliseringsfremgangsmåten er M-metylmorfolin.

Avhengig av det anvendte løsningsmiddel eller fortynningsmiddel, utføres oppvarmingen vanligvis f.eks. ved en temperatur i området fra 50-130°C, og beleiligvis, f.eks. til å begynne med, ved tilbakeløpstemperaturen for løsningsmiddelet eller fortynningsmiddelet, før reaksjonsblandingen tillates å avkjøle seg gradvis og krystallisringen av SSS-diastereoisomeren finner sted. Det blir foretrukket at reaksjonsblandingen blir oppvarmet slik at det foregår destillasjon av løsningsmiddel, før avkjøling. Et blandbart ikke-polart løsningsmiddel eller fortynningsmiddel, hvori SSS-diastereoisomeren er mindre løselig, kan tilsettes til den oppvarmede løsning for å hjelpe på krystalliseringen. Denne tilsetning kan beleiligvis utføres mens destillasjonen av det første løsningsmiddel eller fortynningsmiddel finner sted, for å forebygge alt for tidlig krystallisering av produktet. Alternativt kan det første løsningsmiddel hvori den diastereomere blanding og basen blir oppvarmet, i alt vesentlig bli erstattet med et blandbart ikke-polart løsningsmiddel med høyere kokepunkt, hvori SSS-diastereoisomeren er mindre løselig, før gradvis avkjøling. Når det f.eks. anvendes metyl tprt-hnt.yl eter som løsningsmiddel, kan det tilsettes en blanding av hydrokarboner med et kokepunkt i området 100-120°C (f.eks. en petroleumfraksjon, k.p. 100-120°C, såsom ESSOCHEM 30), eventuelt med tilsetning av ett eller flere andre slike løsningsmidler, såsom toluen, med samtidig fjerning av det laverekokende løsningsmiddel ved destillasjon, før avkjøling.

Det vil bli forstått at denne modifikasjon tillater en diastereomer blanding som til å begynne med isoleres som en løsning i et i alt vesentlig ikke-polart løsningsmiddel som skal anvendes direkte til fremstilling av krystallinsk SSS-diastereoisomer .

For å initiere krystalliseringen, kreves det utsåing med krystallinsk SSS-diastereoisomer. Fortrinnsvis utføres krystalliseringen ved å tillate temperaturen av blandingen å avkjøle seg langsomt til omgivende temperatur, f.eks. ved å tillate temperaturen å falle i trinn på 10°C og holde den ved hver temperatur i ca. 1 time. Fortrinnsvis anvendes 0,5-1 ekvivalent base pr. ekvivalent amorft utgangsmateriale, spesielt ca. 1 ekvivalent.

En modifikasjon av denne epimerings/krystalliserings-fremgangsmåte som kan anvendes til fremstilling av SSS-diastereoisomeren med formel I, er krystallisering av en ikke-krystallinsk blanding av SSS og SSR-diastereoisomerene fra et egnet ikke-polart løsningsmiddel (som referert til ovenfor), såsom en blanding av etylacetat og heksan, i nærvær av en katalytisk mengde (f.eks, ca 10 mol-%) av en base (som definert ovenfor), f.eks, M-metylmorfolin.

Ved anvendelse av epimeriserings/krystalliseringsfrem-gangsmåten, blir det vanligvis oppnådd det krystallinske materiale til å begynne med isolert som krystallinsk SSS-diastereoisomer inneholdende mindre enn 25% SSR-diastereoisomer, f.eks. krystallinsk materiale med et forhold av SSS:-SSR på 4:1 eller bedre. Dette materiale isoleres generelt til å begynne med, som en blanding av vannfrie og hydratiserte former. Hovedsakelig eller i alt vesentlig ren krystallinsk SSS-diastereoisomer med formel I, hovedsakelig eller i alt vesentlig i vannfri form, f.eks. inneholdende ca. 5% eller mindre av den hydratiserte form, eller en krystallinsk hydratisert form, kan fremstilles ved omkrystallisering av dette materiale som beskrevet heri tidligere.

Det blir foretrukket å fjerne eventuell restbase fra produktet isolert fra epimeriserings/krystalliseringsfrem-gangsmåten før ytterligere rensing ved omkrystallisering, for å unngå epimerisering av produktet tilbake til en diastereomer blanding. Dette blir oppnådd f.eks. ved vasking av det isolerte produkt med fortynnet vandig syre, f.eks. fortynnet saltsyre eller fortynnet svovelsyre.

Anvendeligheten av forbindelsen ifølge denne oppfinnelse kan demonstreres ved standardtester og kliniske studier, innbefattet dem som er beskrevet nedenfor.

Tnh i heringsmå 1 i nger:

Evnen til forbindelsen ifølge denne oppfinnelse til å virke som inhibitor for human leukocyttelastase (HLE) på det lavmolekylære peptidsubstrat metoksy-sukcinyl-alanyl-alanyl-prolyl-valin-p-nitroanilid blir bestemt som beskrevet i US patent nr. 4.910.190. Forbindelsens potens evalueres ved å oppnå en kinetisk bestemmelse av dissosiasjonskonstanten Ki, av komplekset som dannes ved interaksjonen av inhibitoren med HLE. Forbindelsen ifølge denne oppfinnelse ble funnet å ha en Ki på 6,7 nM.

Akutt 1 linge. skadeTnndel 1 :

Dyremodeller av emfysem omfatter intratrakeal (i.t.) administrering av en elastolytisk protease for å forårsake en langsomt progressiv, destruktiv lesjon av lungen. Disse lesjoner evalueres normalt noen få uker til et par måneder etter den opprinnelige skade. Disse proteaser induserer imidlertid også en lesjon som er åpenbar i de første få timer.

Den tidlige lesjon er først hemoragisk, utvikler seg til en inflammatorisk lesjon ved slutten av de første 24 timer og løser seg opp igjen i den første uken etter skaden. For å høste fordelen ved denne tidlige lesjon, ble anvendt følgende modell.

Hamstere blir først lett anestetisert med Brevital. Fosfatbufret saltløsning (PBS)" pH 7,4, enten alene eller inneholdende human leukocyttelastase (HLE), blir deretter administrert direkte inn i trakea. 24 timer senere blir dyrene avlivet, og lungene fjernet og omhyggelig trimmet for utvendig vev. Etter bestemmele av fuktig lungevekt, blir lungene skyllet ut med PBS og totalt gjenvunnede utskyllbare røde og hvite celler bestemmes. Verdiene for fuktig lungevekt, totalt utvaskbare røde celler og totalt utvaskbare hvite celler blir forhøyet på doseavhengig måte etter administrering av HLE. Forbindelser som er effektive elastaseinhibitorer, kan forebygge eller nedsette alvorlighetsgraden av enzym-indusert lesjon, hvilket resulterer i lavere fuktig lungevekt og reduserte verdier for totalt utvaskbare celler, både røde og hvite, i forhold til administrering av HLE alene. Forbindelser kan evalueres ved å administrere dem intratrakealt som løsninger eller suspensjoner i PBS, enten sammen med eller på forskjellige tidspunkter før HLE-utfordringen (400 Ug), eller ved å dosere dem intravenøst eller oralt som løsninger på forskjellige tidspunkter før HLE-utfordringen (100 Ug) for å bestemme deres anvendelighet til å forebygge en HLE-lesjon.

En løsning av forbindelsen ifølge oppfinnelsen fremstilles beleilig ved anvendelse av 10% polyetylenglykol 400/PBS.

Akntt hl ødn i ngs^ na 1 y. qp :

Denne analyse beror på overvåking av bare mengden av blødning i lungen etter intratrakeal administrering av human neutrofil elastase (HNE). Blødningen kvantifiseres ved spregning av erytrocytter gjenvunnet i lungeutskyllingsvæske, og sammenligning med fortynninger av helt hamsterblod. Screening-protokollen, i likhet med den beskrevet i Fletcher et al., American Review of Respiratory Disease (1990), 141, 672-677, er som følger. Forbindelser som er demonstrert å være HNE-inhibitorer in vitro, fremstilles beleilig for dosering som beskrevet ovenfor for den akutte lungeskademodell. Syriske hann-hamstere (som har fastet i 16-18 timer før anvendelse) anestetiseres lett med Brevital natrium (30 mg/kg i.p.). Forbindelsene doseres deretter intravenøst eller oralt til hamsterne på et bestemt tidspunkt, såsom 30 eller 90 minutter, før intratrakeal administrering av 50 Pg pr. dyr av HNE i 300 Ul fosfatbufret saltløsning (PBS) pH 7,4. 4 timer etter enzymadministrering blir dyrene avlivet med en overdose av pentobarbitalnatrium, toraks åpnet og lungene og hjerte fjernet, og lungene befridd for uvedkommende materiale. De utskårne lunger skylles ut med tre utbyttinger av 2 ml PBS via en trakealkanyle. De gjenvunnede utskyllinger slås sammen, volumene (ca. 5 ml) registreres, og utskyllingene lagres ved 4°C inntil analyse. For beregning av mengden av blod i hver prøve, blir de tinte utskyllinger og en prøve av helt hamsterblod ultralydbehandlet for å sprenge erytrocytter, og behørig fortynnet over i individuelle brønner i en 96-brønners mikro-titerplate. De optiske tettheter (OD) av de sprengte utskyllinger og blodprøver blir bestemt ved 540 nm. Verdiene (Ul blodekvivalter)/(ml utskylling) blir bestemt ved sammenligning av OD for testprøvene med OD for standardkurven fremstilt fra helt hamsterblod. De totale Pl ekvivalenter av gjenvunnet blod, blir bestemt ved å multiplisere gjenvunnet utvaskings-volum med (ul blodekvivalenter)/(ml utskylling) for hver prøve. Resultatene er gjengitt som % inhibering av HNE-indusert blødning med hensyn til PBS-behandlede kontroller når testforbindelsen er gitt i en angitt dose og tidspunkt før administrering av HNE. ED50-verdien for forbindelsen ifølge oppfinnelsen ble funnet å være 5,2 mg/kg etter oral dosering og 0,59 mg/kg etter i.v. administrering.

Ingen åpenbar toksisitet ble observert når forbindelsen ifølge oppfinnelsen ble administrert i in vivo-testene ovenfor .

Det vil bli forstått at implikasjonene av en forbindelses aktivitet i den akutte lungeskademodell eller den akutte blødningsanalyse ikke er begrenset til emfysem, men at testen heller gir indikasjon på generell in vivo-inhibering av HLE.

Ifølge et ytterligere trekk av denne oppfinnelse, tilveiebringes en farmasøytisk blanding omfattende en farma-søytisk effektiv mengde av forbindelsen ifølge denne oppfinnelse, eller et solvat derav, og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer. Som bemerket ovenfor, vil et annet trekk ifølge denne oppfinnelse være en fremgangsmåte for anvendelse av forbindelsen ifølge oppfinnelsen, eller et solvat derav, til behandling av en sykdom eller tilstand hos et pattedyr, spesielt et menneske, hvori HLE er implisert, såsom dem referert til heri tidligere, og spesielt akutt og kronisk bronkitt, lungeemfysem, reperfusjonsskade, respiratorisk åndenødssyndrom hos voksne, cystisk fibrose eller perifer vaskulær sykdom (såsom kritisk ischemi i lemmene eller intermitterende halting).

Forbindelsen ifølge den foreliggende oppfinnelse kan administreres til et varmblodig dyr, spesielt et menneske, i behov derav for behandling av en sykdom hvori HLE er implisert, i form av en konvensjonell farmasøytisk blanding, f.eks. som generelt beskrevet i US patent 4.910.190. Én administrasjonsmåte kan være via en pulverisert eller flytende aerosol. I en pulverisert aerosol, kan forbindelsen ifølge oppfinnelsen administreres på samme måte som kromolynnatrium via en "Spinhaler" (et varemerke) turbo-inhalatoranordning levert fra Fisons Corp. i Bedford, Massachusets ved en rate på ca. 0,1 til 50 mg pr. kapsel, idet det administreres 1 til 8 kapsler daglig for et gjennomsnittlig menneske. Hver kapsel som skal anvendes i turbo-inhalatoren, inneholder den nød-vendige mengde av forbindelsen ifølge oppfinnelsen, mens resten av den 20 mg kapsel er en farmasøytisk akseptabel bærer såsom laktose. I en flytende aerosol, kan forbindelsen ifølge oppfinnelsen administreres ved anvendelse av en nebulisator såsom f.eks. en "Retec" (varemerke) nebulisator, hvori løsningen blir fortåket med komprimert luft. Aeroslen kan administreres f.eks. med en rate på én til ca. åtte ganger pr. dag som følger: En nebulisator fylles med en løsning av forbindelsen, f.eks. 3,5 ml løsning inneholdende 10 mg/ml; løsningen i nebulisatoren blir fortåket med komprimert luft; og pasienten puster normalt (respirasjonsvolum) i 8 minutter med nebulisatoren i munnen.

Alternativt kan administreringsmåten være parenteral, innbefattet subkutan deponering ved hjelp av en osmotisk pumpe, eller fortrinnsvis oral. Forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan formuleres beleilig i oral eller parenteral doseringsform ved å kompoundere ca. 10 til 250 mg pr. doseringsenhet méd konvensjonell bærer, eksipient, binde-middel, konserveringsmiddel, stabilisator, smaksmiddel eller lignende som nødvendig for akseptert farmasøytisk praksis, f.eks. som beskrevet i US patent 3.755.340. For parenteral administrering, ville det bli gitt en 1 til 10 ml intravenøs, intramuskulær eller subkutan injeksjon inneholdende ca. 0,02 til 10 mg/kg legemsvekt av forbindelsen ifølge oppfinnelsen tre eller fire ganger daglig. Injeksjonen ville inneholde forbindelsen ifølge oppfinnelsen i en vandig isotonisk steril løsning eller suspensjon, eventuelt med et konserveringsmiddel såsom fenol, eller et solubiliseringsmiddel såsom etylendi-amintetraeddiksyre (EDTA). For parenteral administrering eller anvendelse i en aerosol, kan det fremstilles en vandig formulering f.eks. ved å løse forbindelsen i 5-10% polyetylenglykol 400/fosfatbufret saltløsning, etterfulgt av aseptisk filtrering, og steril lagring ved anvendelse av standard fremgangsmåte.

Vanligvis vil forbindelsen ifølge oppfinnelsen bli administrert til mennesker i en daglig dose i området fra f.eks. 5 til 100 mg av forbindelsen i form av aerosol, eller 50 til 1000 mg intravenøst eller oralt, eller en kombinasjon derav. Det vil imidlertid lett bli forstått at det kan være nødvendig å variere dosen av administrert forbindelse i over-ensstemmelse med vel kjent medsinsk praksis for å ta hensyn til karakteren og alvorlighetsgraden av sykdommen under behandling, aktuell terapi og alderen, vekten og kjønnet til pasienten som får behandling. Det vil likeså bli forstått at det generelt kan anvendes ekvivalente mengder av en solvatisert (f.eks. hydratisert) form av forbindelsen. Protokoller for administrering av en HLE-inhibitor og evaluering av pasientene, er beskrevet i de europeiske patent-søknader med publikasjonsnummer 458535, 458536, 458537 og 463811 for behandling eller forebyggelse av henholdsvis cystisk fibrose, ARDS, bronkitt og blødning i forbindelse med akutt ikke-lymfocytisk leukemi eller dens terapi; og forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan anvendes på lignende måte, eller anvendes fortrinnsvis ved oral administrering, for behandling av disse sykdommer og tilstander enten alene eller i kombinasjon med et annet terapeutisk middel, vanligvis angitt for behandling av den spesielle tilstand. For terapeutisk eller profylaktisk behandling av en vaskulær sykdom eller beslektet tilstand hos et pattedyr, hvori neutrofiler er involvert eller implisert, kan en forbindelse ifølge denne oppfinnelse administreres beleilig på oral eller parenteral vei, enten alene eller samtidig eller i rekkefølge med andre terapeutisk aktive midler som vanligvis administreres for tilstanden. Anvendeligheten av forbindelsen ifølge oppfinnelsen til slik behandling av vaskulære sykdommer og beslektede tilstander, kan demonstreres ved anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet i internasjonal patentsøknad, publikasjon nr. WO 92/22309.

De forskjellige aspekter ifølge denne oppfinnelse skal nå illustreres ved følgende ikke-begrensende eksempler hvori, dersom intet annet er angitt: (i) temperaturene er gitt i grader Celsius (°C) ; operasjonene ble utført ved romtemperatur eller omgivende temperatur, dvs. ved en temperatur i området fra 18-25°C; (ii) organiske løsninger ble tørket over vannfr.itt magnesiumsulfat; fordampning av løsningsmiddel ble utført ved anvendelse av en rotasjonsfordamper under redusert trykk (600-4000 pascal; 4,5-30 mm Hg) med en badetemperatur på opp til 60°C; (iii) kromatografi betyr "flashkromatografi" (metoden til Still) utført på Merck Kieselgel (artikkel 9385 fra E. Merck, Darmstadt, Tyskland), eluering ved anvendelse av både trinn- og kontinuerlige gradienter er betegnet med uttrykket i parentes "gradient", etterfulgt av det første og det siste løsningsmiddeltorhold; tynnsjiktkromatografi (TLC:thin layer chromatography) ble utført på silikaplater, f.eks. 0,25 mm silikagel GHLF-plater (artikkel 21521 fra Analtech, Newark, DE, USA); (iv) vanligvis ble reaksjonsforløpet etterfulgt av TLC, og reaksjonstidene er gitt bare for illustrasjon; (v) smeltepunkter er ukorrigerte og (dek) angir dekomponering; de gitte smeltepunkter er de som er oppnådd for materialene fremstilt som beskrevet; polymorfisme kan føre til isolering av materialer med forskjellige smeltepunkter i noen preparater; (vi) sluttproduktene hadde tilfredsstillende kjerne-magnetisk resonans (NMR) spektra; og hvor de ble undersøkt, var de i alt vesentlig rene ved HPLC; (vii) utbyttene er gitt utelukkende for illustrasjon og er ikke nødvendigvis de som kan oppnås ved tålmodig prosessutvikling; fremstillingen ble gjentatt dersom mere materiale var nødvendig; (viii) når de er gitt, vil NMR-data være i form av deltaverdier for viktige diagnostiske protoner, gitt i deler pr. million (ppm) i forhold til tetrametylsilan (TMS) som indre standard, bestemt ved 250 MHz ved anvendelse av DSMO-d6 som løsningsmiddel; det anvendes konvensjonelle forkortelser for signalform; for AB-spektra rapporteres de direkte observerte skift;

(ix) kjemiske symboler har sin vanlige betydning;

det anvendes SI-enheter og symboler;

(x) redusert trykk er gitt som absolutte trykk i pascal (Pa); forhøyet trykk er gitt som overtrykk i bar;

(xi) løsningsmiddelforhold er gitt som volum:volum (v/v) forhold;

(xii) massespektra (MS) ble kjørt med en elektron-energi på 70 elektron volt på kjemisk ioniseringsmåte ved anvendelse av en direkte eksponeringsprobe; hvor angitt ble ioniseringen gjennomført ved elektronsammenstøt (EI) eller hurtig atombombardement (FAB:fast atom bombardment); vanligvis rapporteres utelukkende topper som angir hovedmassen; og

(xiii) HPLC ble anvendt til å etablere forholdet av SSS:SSR-diastereoisomerer med formel I i isolert materiale, ved anvendelse av en Hypersil C18, 3 Pm, 10 cm x 4,6 mm kolonne og en mobilfase med 0,02M tetrabutylammoniumfosfat/- acetonitril (75:25) ved pH 7,5. Strømningshastigheten var 1,5 ml/min., injeksjonsvolumet var 20 Pl med ventil, og på-visningsbølgelengden var 254 nm. Retensjonstiden for SSS-diastereoisomeren er typisk 12-13 minutter, og for SSR-diastereoisomeren er den typisk 20-21 minutter. Alternativt kan det anvendes en SUPELCO LC-18 reversfase, 25 cm x 4,6 mm kolonne, med vann:acetonitril (60:40) som elueringsmiddel, med en strømningshastighet på 1,0 ml/minutt.

Eksempel L

En krystallinsk diastereomer blanding av SSS-diastereoisomer og SSR-diastereoisomer (0,67 g), i et forhold på ca. 85:15 SSS:SSR, ble tilsatt til toluen (4,5 ml) og oppvarmet til 80°C, under dannelse av en klar løsning. Løsningen ble avkjølt til 55°C i løpet av 30 minutter, og isådd ren SSS-diastereoisomer. Løsningen ble deretter avkjølt til 25°C i løpet av 1 time, og deretter avkjølt i isbad i ytterligere 1 time. Det krystallinske produkt ble oppsamlet ved filtrering, vasket med kald toluen (2 ml) og tørket ved 50°C. Denne fremgangsmåte ble gjentatt for å gi krystallinsk SSS-diastereoisomer med formel I (0,43 g) inneholdende mindre enn 2%

SSR-diastereoisomer ved HPLC.analyse:

<25>[alfa]D -90°C (c=l,50 i etanol) ; smp. 147,5-148,5°C;

NMR (de-DMSO): 0,92 (m, 12H), 1,75 (m, 1H), 1,81-2,15 (m, 5H), 3,61 (m, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,91 (m, 1H), 4,44 (m, 2H), 4,62 (t, 1H), 6,96 (d, 2H), 7,91 (d, 2H), 8,34 (d, 1H), 8,60 (d, 1H) ;

NMR (d6-DSMO/D20) : 0, 75 (d, 3H) , 0,89 (m, 9H) , 1,70-2,19 (m, 6H), 3,56 (m, 1H), 3,75 (s, 3H), 3,84 (m, 1H), 3,98 (d, 1H), 4,37 (m, 2H), 6,94 (d, 2H), 7,76 (d, 2H) ;

massespektrum (kjemisk ionisering): 500 (M+H); mikroanalyse, funnet: C, 57, 72; H, 6,62; N, 8,36%; C24H32F3N3O5 krever: C, 57,70; H, 6,45; N, 8,41%.

Ved anvendelse av differensial scanningkalorimetri, viste dette materiale en initialforandring ved ca. 149,5°C, med en topp ved ca. 151°C.

[Et lignende resultat ble oppnådd ved anvendelse av en krystallinsk diastereomer blanding med et SSS:SSR-forhold på 76:24, og omkrystallisering to ganger fra toluen.

Et lignende resultat ble også oppnådd ved anvendelse av en blanding av etylacetat og heksan som løsningsmiddel. Den krystallinske diastereomere blanding av SSS og SSR-diastereoisomerer ble løst i etylacetat, volumet redusert ved destillasjon, og den varme løsning (60°C) fortynnet med heksan, hvilket ga en klar løsning. Løsningen ble avkjølt til 50°C, isådd med ren SSS-diastereoisomer og avkjølt. Forholdene mellom anvendt utgangsmateriale og løsningsmidler var lik dem anvendt i eksempel 5.]

Den krystallinske diastereomere blanding av SSS og SSR-diastereoisomerer som ble anvendt som utgangsmateriale, ble oppnådd som beskrevet i eksempel 4 eller 5 nedenfor.

F. k. qempel 2

0,6M Natriumhydroksydløsning (260 ml) ble tilsatt til en løsning av (£)-1-[(SJ -2-(4-metoksybenzamido)-3-metylbutyryl]-KL- [ (£) -2-metyl-l- ( (R) -2, 2, 2-trif luor-l-hydroksyetyl) propyl ] - pyrrolidin-2-karboksamid (25,7 g) i en blanding av t-butanol

(205 ml) og vann (255 ml) ved 0°C. En løsning av kaliumpermanganat (24,2 g) i vann (385 ml) ble tilsatt dråpevis under omrøring i løpet av 1 time, og den resulterende reaksjons-blanding ble omrørt i ytterligere 1 time ved 0°C. Metanol (100 ml) ble deretter tilsatt, og blandingen omrørt ved 0°C i ytterligere 2 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom kiselgur, og det enda avkjølte filtrat ble surgjort med IM saltsyre (200 ml), som resulterte i dannelsen av et voluminøst hvitt bunnfall. Fast natriumklorid ble tilsatt til blandingen til metningspunktet, etterfulgt av dietyleter (200 ml) og etylacetat (200 ml). Blandingen ble omrørt inntil alt det faste stoff hadde løst seg. Den organiske fase ble fraskilt, og det vandige sjikt ekstrahert med dietyleter:etylacetat (1:1). De samlede organiske faser ble vasket med saltløsning, tørket (MgS04), og løsningsmiddelet fjernet ved inndamping under vakuum. Det resulterende skum ble løst i varm toluen (150 ml) og fikk stå i 16 timer ved omgivende temperatur. Det faste stoff som krystalliserte, ble oppsamlet ved filtrering, vasket med dietyleter og tørket under vakuum ved 40°C i 3 timer, under dannelse av krystallinsk SSS-diastereoisomer med formel I (16,5 g) inneholdende <0,5% av SSR-diastereoisomeren med formel I; smp. 149-151°C. (Utgnidning av filtratet resulterte i gjenvinning av et ytterligere utbytte av SSS-diastereoisomeren (6,24 g)).

Når dietyleter ble anvendt som krystallisasjonsløsnings-middel, istedenfor toluen, ble det oppnådd krystallinsk SSS-diastereoisomer av lignende renhet som en blanding av vannfri og hydratisert form (forhold 1:1); smp. 116°C; mikroanalyse, funnet: C, 56, 48; H, 6,49; N, 8,20%; C24H32F3N3CVO, 5 H20 krever: C, 56,68; H, 6,54; N, 8,26%.

Utgangsmaterialet aminoalkohol, ble oppnådd som følger: (i) Trifluoreddiksyre (200 ml) ble tilsatt til en blanding av N-benzyloksykarbonyl-L-valyl-L-prolin tert-hntylester (80,0 g) i metylenklorid (300 ml) ved 0°C i løpet av ca. 30 minutter. Etter omrøring ved 0°C i 1 time, ble reaksjonsblandingen tillatt å stige til omgivende temperatur og omrørt i ytterligere 3 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter konsentrert under vakuum og konsentrert om igjen fire ganger fra toluen for å fjerne resterende trifluoreddiksyre. Den resulterende viskøse olje ble tørket under vakuum i 16 timer. Råproduktet ble renset ved kromatografi på silikagel, ved anvendelse av metylenklorid som elueringsmiddel, under dannelse av M-benzyloksykarbonyl-L-valyl-L-prolin (A) (63,6 g) som en blekgul viskøs olje;

NMR (d6-DMSO) : 0,92 (2 d, 6H) , 1, 65-2, 05 (2m, 4H) , 2,25 (m, 1H), 3,60 (m, 1H), 3,80 (m, 1H), 4,05 (dd, 1H), 4,25 (m, 1H), 5,02 (2d, 2H), 7,35 (m, 5H), 7,50 (d, 1H). (ii) N-metylmorfolin (16,6 ml) ble tilsatt i én porsjon til en omrørt løsning av forbindelse A i tetrahydrofuran (THF; 550 ml), og løsningen ble avkjølt til -35°C. Isobutylklorformiat (18,9 ml) ble deretter tilsatt dråpevis til den avkjølte løsning. Når tilsetningen var fullstendig, ble reaksjonsblandingen omrørt i 1 time, og deretter ble en løsning av 2 (R) , 3 (£)-3-amino-4-metyl-1,1,1-trifluor-2-pentanol (24,5 g) i THF (160 ml) tilsatt dråpevis i løpet av 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble omrørt i ytterligere 1 time ved -35°C og ble deretter tillatt å varme seg opp til•omgivende temperatur og omrørt i 16 timer. Blandingen ble filtrert, og filtratet vasket to ganger med mettet vandig natriumhydrogen-karbonatløsning. De vandige sjikt ble ekstrahert to ganger med dietyleter, og de samlede organiske sjikt vasket med saltløsning og tørket. Løsningsmiddelet ble fjernet ved fordampning, og råproduktet ble renset ved silikakromatografi ved anvendelse av metylenklorid:toluen (9:1) som elueringsmiddel, under dannelse av (£) -1-[ (S_) -2-(benzyloksykarbonyl-amino) -3-metylbutyryl] -M- [ ( 2.) -2-metyl-l- ( (R) -2, 2, 2-trif luor-l-hydroksyetyl) propyl ] pyrrolidin-2-karboksamid (55,1 g) (B) som et fargeløst skum;

NMR (300 MHz, d6-DMS0) : 0,90 (9m, 12H), 1,63-2,03 (m, 5H) , 3,55 (ra, 1H), 3,75 (m, 2H), 4,07 (m, 2H), 4,45 (m, 1H), 5,02 (2 d, 2H), 7,35 (m, 5H), 7,45 (d, 1H), 7,65 (d, 1H).

(iii) En løsning av forbindelse B (55 g) i etanol (300 ml) ble hydrogenert i 3 timer over 10% palladium på karbonkatalysator (5,5 g) under et hydrogentrykk på 55 psi (380 kPa). Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom kiselgur, og filtratet konsentrert under vakuum under dannelse av en viskøs olje. Oljen ble utgnidd med dietyleter (250 ml) i 16 timer, og det resulterende faste stoff oppsamlet ved filtrering for å gi (S)-1-[(£)-2-amino-3-metylbutyryl]-N-[(£)-2-metyl-l-((R)-2,2,2-trifluor-l-hydroksyetyl)propyl]pyrrolidin-2-karboksamid (C) (25,6 g) som et hvitt fast stoff; NMR (300 MHz, d6-DMSO): 0,75-0,97 (m, 12H), 1,42 (s, 1H), 1,65-2,0 (m, 5H), 2,78-3,20 (hver d, total 1H), 3,45-3,60 (hver m, total 1H), 3,82 (m, 1H), 4,10 (m, 1H), 4,45, 4,57 (hver m, total 1H), 6,45 (br d, 1H), 7,45, 7,60 (hver d, total 1H) . (iv) Forbindelse C ble slemmet opp i THF (350 ml), og pulverisert natriumkarbonat (18,5 g) ble tilsatt. Blandingen ble avkjølt til -5°C, og en løsning av anisoylklorid (11,9 g) i THF (50 ml) ble tilsatt under omrøring. Reaksjonsblandingen ble omrørt i ytterligere 2 timer ved 0°C og fikk deretter stige til omgivende temperatur. Reaksjonsblandingen ble filtrert, og filtratet surgjort med IM saltsyreløsning (20 ml) og vasket med vann. Det vandige sjikt ble ekstrahert to ganger med dietyleter, og de samlede organiske sjikt vasket med 50% mettet natriumhydrogenkarbonatløsning, saltløsning og tørket.

Løsningsmiddel ble fjernet ved fordampning under dannelse av et fargeløst skum. Skummet ble utgnidd med dietyleter, og det resulterende faste stoff oppsamlet ved filtrering og tørket under vakuum ved 40°C i 3 timer, under dannelse av (SJ -1-[ (S.) - 2- (4-metoksybenzamido) -3-metylbutyryl] -M- [ ( S.) -2-metyl-l- ( (R) - 2,2,2-trifluor-l-hydroksyetyl)propyl]pyrrolidin-2-karboksamid som et hvitt fast stoff, smp. 168-170°C;

NMR (300 MHz, d6-DMSO) : 0,82-1, 05 (m, 12H) , 1, 65-2,05 (3m, 5H), 2,05-2,25 (m, 1H), 3,60 (m, 1H), 3,82 (s, 3H + t, 1H), 3,93 (m, 1H), 4,12 (m, 1H), 4,45 (m, 2H), 6,45 (d, 1H), 6,98 (d, 2H), 7,65 (d, 1H), 7,90 (d, 2H), 8,35 (d, 1H).

2 (E) -3 (S) -3-Amino-4-metyl-l, 1,1-trif luor-2-pentanol ble oppnådd som følger: En løsning av D-(-)-vinsyre (50,7 g) i etanol (200 ml) ble tilsatt til en løsning av 2 (ES.)-3 (SE) -3-amino-4-metyl-1,1,1-trifluor-2-pentanol (57,8 g) i etanol (200 ml). Løsningen ble filtrert varmt og fikk stå i 16 timer ved omgivende temperatur. Det hvite faste stoff som skilte seg ut, ble oppsamlet ved filtrering og vasket med et lite volum kald etanol. Det faste stoff ble tørket under vakuum og om-krystallisert tre ganger fra varm etanol under dannelse av 2( R)-3( S)-3-amino-4-metyl-l,1,1-trifluor-2-pentanol D-(-)-vinsyresalt (8,3 g); smp. 135-137°C.

Alternativt kan det anvendes følgende fremgangsmåte:

(i) Trifosgen (23 g) ble tilsatt i én .porsjon til en godt omrørt blanding av 2 (ES.) -3 ( SR) -3-amino-4-metyl-1,1,1-trifluor-2-pentanol hemioksalatsalt (50 g) i toluen (250 ml) og 2M natriumhydroksydløsning (350 ml). Reaksjonen begynte å bli eksoterm og ble plassert i isbad. Etter 0,5 timer, ble reaksjonen oppvarmet til 25°C, og TLC indikerte en betydelig mengde av uomsatt amin tilstede. Løsningens pH ble justert om igjen til ca. 12 ved anvendelse av ca. 50% natriumhydroksyd-løsning. En ytterligere porsjon av trifosgen (8 g) ble tilsatt, og løsningen ble omrørt i 1 time. Reaksjonsblandingens pH ble nedsatt til pH 7 ved anvendelse av IM saltsyre og ekstrahert to ganger med eter. De samlede etersjikt ble vasket med vann, saltløsning og tørket (MgS04) . Løsnings-middelet ble fjernet ved inndamping under dannelse av en olje, som krystalliserte ved henstand. Det resulterende faste stoff ble oppsamlet ved filtrering og vasket med eter:heksan (1:1) under dannelse av 27 g av 4(ES)-5(SE)-4-isopropyl-5-trifluor-metyl-2-oksazolidinon som et hvitt, fast stoff, smp. 71-72°C; <*>H NMR (300 MHz, DMSO): 8,45 (s, 1H), 5,11 (m, 1H), 3,61 (m, 1H), 1,72 (m, 1H), 0,86 (d, 6H). (ii) n-Butyllitium (20 ml av en 10M løsning i heksan) ble tilsatt til en løsning av 4 (ES.)-5 (SE)-4-isopropyl-5-trifluor-metyl-2-oksazolidinon (35,8 g) i THF (600 ml) ved -78°C, etterfulgt av omrøring i 0,5 timer. (-)-Mentylklorformiat (41 ml, friskt destillert) ble tilsatt, etterfulgt av fortsatt omrøring ved -78°C i 0,5 timer. Løsningen ble oppvarmet til 25°C, og reaksjonen undertrykket ved tilsetning av mettet vandig natriumhydrogenkarbonatløsning. Produktet ble ekstrahert over i eter og vasket med vann og saltløsning. Løsningen ble tørket (MgS04), og løsningsmiddelet fjernet under vakuum. Den resulterende olje krystalliserte ved henstand under dannelse av et fast stoff som ble oppsamlet ved filtrering. Det faste stoff ble vasket med eterrheksan (1:1) og tørket under dannelse av 4(S),5(E)-4-isopropyl-3-[1(E),2(S),5(E)-mentyloksykarbonyl]-5-trifluormetyl-2-oksazolidinon (23,15 g); smp. 138-140°C;

<X>H NMR (300 MHz, DMSO): 5,51 (dd, 1H), 4,68 (m, 1H), 4,26 (m, 1H), 2,27 (m, 1H), 1,94 (d, 1H), 1,78 (m, 1H), 1,62 (d, 12H) , 1,42 (m, 2H), 1,01 (dd, 2H), 0,95-0,84 (m, 24H), 0,71 (d, 3H); <19>F NMR (376,5, MHz, DMSO): -76, 9910; 99% d.e. (Et ytterligre utbytte på 4,3 g (99% d.e.) ble oppnådd fra morvæsken).

(Bemerk: 4 (E) , 5 (S)-isomeren hadde smp. 80-82°C og <19>F NMR (376,5 MHz, DMSO): -77,0019.

(iii) En løsning av 4(S),5(E)-4-isopropyl-3-[1(E),2(S),5(E)-mentyloksykarbonyl]-5-trifluormetyl-2-oksazolidinon (27 g) i dioksan (70 ml) og 50% kaliumhydroksydløsning (80 ml) ble oppvarmet ved 100°C i 2 dager. Reaksjonen ble avkjølt, fortynnet med eter (400 ml), og det organiske sjikt fraskilt. pH av den vandige løsning ble justert til 9 (opprinnelig ca. 14) ved anvendelse av 6M saltsyre. Det vandige sjikt ble ekstrahert tre ganger med eter (300 ml). De organiske faser ble slått sammen, tørket (MgS04) og tilsatt til en godt omrørt løsning av oksalsyredihydrat (4,5 g) i acetonitril (100 ml). Det faste stoff som falt ut, ble oppsamlet ved filtrering, vasket med eter og tørket under vakuum (60°C) under dannelse av 15,9 g hvitt fast stoff. Det faste stoff ble utgnidd med eter (300 ml), oppsamlet ved filtrering og tørket under dannelse av 2 (R) -3 (£.) -3-amino-4-metyl-l, 1,1-trif luor-2-pentanol hemioksalatsalt (13,4 g, 88% utbytte) som et hvitt fast stoff, smp. 184-186°C;

<:>H NMR (300 MHz, DMSO): 5,71 (bs, 3H), 4,08 (ddd, 1H), 2,88 (m, 1H), 1,81 (m, 1H), 0,92 (m, 6H) ;

Analyse for C6H12F3NO-0,5 C2H204: C, 38,89; H, 6,06; N, 6,48: funnet: C, 38,75; H, 5,95; N, 6,47.

Eksempel 1

En ikke-krystallinsk (amorf) diastereomer blanding (skum eller olje) av SSS og SSR-diastereoisomerer med formel I (0,5 g) i et forhold på ca. 1:1, ble løst i dietyleter (2,5 ml), isådd en krystall av i alt vesentlig ren SSS-diastereoisomer, og fikk stå i 16 timer. Det faste stoff som krystalliserte, ble oppsamlet ved filtrering, vasket med dietyleter og fikk tørke under dannelse av krystallinsk SSS-diastereoisomer inneholdende SSR-diastereoisomer, i 30 til 45% utbytte (forholdet SSS:SSR 88:12; vannfri form:hydratisert form 1:1). (Et lignende resultat ble oppnådd når det ble anvendt en ikke-krystallinsk diastereomer blanding av SSS:SSR 3:2).

Eksempel i

En ikke-krystallinsk diastereomer blanding av SSS og SSR-diastereoisomerer med formel I (forhold SSS:SSR 48,5:51,5; 5,18 g) ble løst i tert-hut<y>lmet<y>l eter (23 ml) og M-metylmorfolin (1,3 ml) ble tilsatt. Blandingen ble•oppvarmet til tilbakeløp, og en blanding av hydrokarboner med et kokepunkt på 100-120°C (ESSOCHEM 30; 60 ml) ble tilsatt langsomt, mens temperaturen av reaksjonsblandingen ble holdt på 98°C. Etter at 25 ml destillat var oppsamlet, ble temperaturen nedsatt til 70°C, og noen få kimkrystaller av i alt vesentlig ren SSS-diastereoisomer ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 70°C i 1 time, ved 60°C i ytterligere 1 time> og til slutt ved omgivende temperatur i 16 timer. Det resulterende krystallinske faste stoff ble oppsamlet ved filtrering, vasket med ESSOCHEM 30 og fikk tørke under dannelse av en krystallinsk blanding av SSS og SSR-diastereoisomerer (4,8 g), med et forhold av SSS:SSR på 76:24. Dette materiale ble tilsatt til vann (17 ml) under omrøring, og 2M saltsyre (2 ml) ble tilsatt. Etter omrøring ved omgivende temperatur i 90 minutter, ble det krystallinske faste stoff oppsamlet ved filtrering, vasket med vann og tørket (3,88 g). (Dette ble vist ved HPLC å ha det samme SSS:SSR-forhold).

Ved anvendelse av en lignende fremgangsmåte, men ved avkjøling av løsningen til 65°C før tilsetning av kimkrystall-ene av i alt vesentlig ren SSS-diastereoisomer og omrøring ved 65°C, deretter avkjøling i 10 graders trinn som ble holdt i 1 time ved hver temperatur, og tilslutt omrøring ved omgivende temperatur i 16 timer, ble det oppnådd en krystallinsk blanding av SSS og SSR-diastereoisomerer med formel I (SSS:-SSR-forhold på 85:15) i et utbytte på ca. 85%.

Eksempel

En ikke-krystallinsk (amorf) diastereomer blanding av SSS og SSR-diastereoisomerer med formel I (29,4 g) i etylacetat (200 ml) ble destillert ved atmosfærisk trykk for å fjerne 100 ml destillat. Ytterligere etylacetat (166 ml) ble deretter tilsatt, og løsningen igjen destillert ved atmosfærisk trykk for å fjerne 166 ml destillat. Denne fremgangsmåte ble deretter gjentatt. Løsningen ble deretter avkjølt til 60°C, og heksan (166 ml) ble tilsatt i løpet av 30 minutter ved 60°C under dannelse av en klar løsning. Løsningen ble avkjølt til 50°C, isådd med i alt vesentlig ren krystallinsk SSS-diastereoisomer (0,1 g) og deretter avkjølt til omgivende temperatur i 18 timer. Blandingen ble omrørt i ytterligere 18 timer ved 0°C, oppvarmet til 20°C og ytterligere heksan (33 ml) tilsatt i løpet av 10 minutter. Etter omrøring i 3 timer ved omgivende temperatur, ble tilsatt ytterligere heksan (50 ml), og blandingen omrørt i ytterligere 18 timer ved omgivende temperatur. Det krystallinske produkt ble oppsamlet ved filtrering og tørket under vakuum i 4 timer under dannelse av en krystallinsk blanding av SSS og SSR-diastereoisomerer (39% utbytte) med et forhold av SSS:SSR på 85:15 ved HPLC.

[Anvendelse av en lignende fremgangsmåte, men tilsetning av M-metylmorfolin (0,8 ml) til etylacetatet før (eller etter) destillasjonen og vasking av det frafiltrerte krystallinske produkt med fortynnet saltsyre og deretter vann (før tørking under vakuum), ga en krystallinsk blanding av SSS og SSR-diastereoisomerer, med lignende SSS:SSR-forhold, i 60% utbytte.

Rks<p>mp<p>l

En krystallinsk blanding "av SSS og SSR-diastereoisomerer i et forhold på SSS:SSR på ca. 85:15 (10 g) , oppnådd ved anvendelse av fremgangsmåten i eksempel 5, ble rørt ut til en velling i aceton (15 ml) og oppvarmet til 40°C. Vann (10 ml) ble tilsatt, og blandingen ble oppvarmet til 55-60°C i 90 minutter. Den blakkede løsning ble avkjølt til 35-40°C, og ytterligre vann (5 ml) ble tilsatt. Blandingen fikk avkjøle seg til omgivende temperatur og ble omrørt i 16 timer. Det krystallinske faste stoff ble oppsamlet ved filtrering, og fremgangsmåten gjentatt. Det resulterende krystallinske faste stoff ble tørket ved 40°C under vakuum for å gi krystallinsk SSS-diastereoisomer (inneholdende mindre enn 2% SSR-diastereoisomer) i hydratisert form med et vanninnholdt på 6,69% (i 75% utbytte). Et DSC-termogram av dette krystallinske materiale (oppvarmingshastighet 2°C/min.) viser en endoterm hendelse som begynner ved ca. 91-92°C, etterfulgt av en eksoterm hendelse som begynner ved ca. 109-110°C, etterfulgt av ytterligere en endoterm hendelse ved ca. 148-149°C. Disse data, sammen med TGA-data og <19>F NMR-spektraldata, indikerer at denne krystallinske form må være i alt vesentlig monohydratet av gem-diolen (med formel Ib), som har et teoretisk (beregnet) vanninnhold på 6,73%.

En ikke-krystallinsk diastereomer blanding av SSS og SSR-diastereoisomerer, anvendt som utgangsmateriale i eksemplene 3, 4 og 5, ble fremstilt ved anvendelse av fremgangsmåte 1 eller 2 som følger:

Fremgangsmåte 1

(i) En løsning av N-benzyloksykarbonyl-L-valyl-L-prolin fert-butylester (20 g) i metanol (300 ml) ble hydrogenert ved 50 psi (345 kPa) over 10% palladium på karbonkatalysator (2 g) i 12 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert gjennom kiselgur, og filterkaken vasket med metanol. Filtratet ble inndampet under dannelse av L-valyl-L-prolin texii-butylester

(A) (12 g) som en olje; NMR (300 MHz, d6-DMSO) : 0,80 (d, 3H) , 0,92 (d, 3H) , 1,74 (s, 9H), 1,79-2,15 (m, 5H), 3,22 (d, 1H), 3,30 (bs, 2H), 3,40 (m, 1H), 3,62 (m, 1H), 4,16 (dd, 1H). (ii) Esteren (A) (12,5 g) ble løst i tetrahydrofuran (THF; 100 ml) og avkjølt til 0°C. En løsning av anisoylklorid (8,37 g) i THF (200 ml) ble tilsatt under omrøring, etterfulgt av trietylamin (18 ml). Etter 1 time, ble flyktig materiale fjernet ved inndamping. Det resulterende materiale ble fortynnet med etylacetat og vasket i rekkefølge med vann, mettet ammoniumkloridløsning, mettet natriumhydrogenkarbonatløsning og saltløsning. Den organiske løsning ble tørket (Na2S04), og løsningsmiddelet fjernet ved inndamping. Det resulterende materiale ble renset ved silikakromatografi, ved anvendelse av metanol:metylenklorid (3:97) som elueringsmiddel, under dannelse av M-(4-metoksybenzoyl)-L-valyl-L-prolin tert-hntyl - ester (B) som et skum;

NMR (300 MHz, d6-DMS0) : 0,94 (d, 3H) , 0,99 (d, 3H) , 1,30 (s, 9H), 1,76 (m, 1H), 1,80 (m, 2H), 2,13 (m, 2H), 3,61 (m, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,93 (m, 1H), 4,17 (dd, 1H) , 4,46 (t, 1H) , 6,96 (d, 2H), 7,90 (d, 2H) , 8,35 (d, 1H) .

(iii) Esteren (B) (7,13 g) ble løst i trifluoreddiksyre (85 ml), og den resulterende løsning ble omrørt i 30 minutter. Flyktig materiale ble fjernet ved inndamping, og resten løst i etylacetat og vasket med vann. Det organiske sjikt ble tørket (Na2S04) , og løsningsmddelet fjernet ved inndamping. Det resulterende materiale ble renset ved silikakromatografi, ved eluering med metanolrmetylenklorid:eddiksyre (97:2:1) under dannelse av N-(4-metoksybenzoyl)-L-valyl-L-prolin (6,5 g) (C) som ble anvendt uten ytterligere rensing;

NMR (300 MHz; d6-DMSO) : 0,87 (d, 3H) , 0,99 (d, 3H), 1,88 (m, 3H), 2,15 (m, 2H), 3,64 (m, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,97 (m, 1H), 4-, 24 (dd, 1H) , 4,44 (t, 1H) , 6,96 (d, 2H) , 7,90 (d, 2H) , 8,37 (d, 1H) . (iv) Forbindelse (C) (7,1 g) , 2 (RS.) -3 (SR) -3-amino-4-metyl-1,1,1-trifluor-2-pentanol (3,8 g, fri base) og N-hydroksy-benzotriazolhydrat (5,5 g) ble løst i dimetylformamid (DMF; 40 ml), og trietylamin (7,1 ml) ble tilsatt under omrøring. 1-(3-Dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid (5,9 g) ble deretter tilsatt, og den resulterende blanding ble omrørt i 12 timer. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med etylacetat og vasket med IM saltsyre (to ganger), vann, IM natriumhydroksydløsning og saltløsning. Den organiske løsning ble tørket, og løsnings-middelet fjernet ved inndamping. Det resulterende materiale ble renset ved silikakromatografi (gradienteluering, etylacetat : metylenklorid (30:70) til metanol:metylenklorid (5:95) under dannelse av (S.)-1-[ (S.)-2-(4-metoksybenzamido)-3-metyl-butyryl]~N-[2-metyl-l-(2,2,2-trifluor-l-hydroksyetyl)propyl]-pyrrolidin-2-karboksamid (6,6 g) (D) som et hvitt skum;

NMR (de-DMSO): 0,93 (m, 12H), 1,73-2,15 (m, 6H), 3,62 (m, 1H), 3,76 (m, 3H), 4,10 (m, 1H), 4,42 (m, 2H), 6,41 (d, 1H), 6,57 (d, 1H), 6,98 (d, 2H), 7,24 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,87 (d, 2H), 8,33 (t, 1H).

(v) 0,6M Natriumhydroksydløsning (10 ml) ble tilsatt til en løsning av aminoalkoholen (D) (1,0 g) i tert-hntylalknhol (8 ml) og vann (10 ml), og blandingen avkjølt til 5°C. En løsning av kaliumpermanganat (1,0 g) i vann (20 ml) ble deretter tilsatt, mens temperaturen ble holdt under 10°C. Etter 2 timer, ble tilsatt metanol (4 ml), og reaksjonsblandingen omrørt inntil purpurfargen hadde forsvunnet. Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert gjennom kiselgur, og fast natriumklorid (11 g) ble tilsatt til filtratet. Blandingen ble ekstrahert med tert-hntylmetyl eter, og den vandige fase vasket med en blanding av tert-hntylmetyl eter og metyletylketon. De samlede organiske ekstrakter ble vasket med mettet natrium-hydrogenkarbonatløsning, 0,5M saltsyre, vann og deretter tørket. Løsningsmiddelet ble fjernet ved inndamping under dannelse av en diastereomer blanding av SSS og SSR-diastereoisomerer med formel I som et skum (SSS:SSR-forhold på 3:2).

Alternativt ble trinn (v) utført som følger: 1-(3-Dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid (12,6 g), etterfulgt av dikloreddiksyre (2,2 ml) ble tilsatt til en kald løsning av (S)-1-[(S)-2-(4-metoksybenzamido)-3-metylbutyryl]-R-[2-metyl-l-(2,2,2-trifluor-l-hydroksyetyl)propyl]pyrrolidin-2-karboksamid (6,6 g) i DMSO (30 ml) og toluen (30 ml). Reaksjonen ble oppvarmet til omgivende temperatur og omrørt i tilsammen 2,5 timer. Reaksjonsblandingen ble helt over i etylacetat og vasket med IM saltsyreløsning, mettet natriumhydrogenkarbonat og saltløsning. Løsningen ble tørket (MgS04), og løsningsmiddelet fjernet ved inndamping under dannelse av en blanding av SSS og SSR-diastereoisomerer med formel I som en olje.

Fremgangsmåte

(i) N-metylmorfolin (46 ml) ble tilsatt til en blanding av L-valyl-L-prolinhydroklorid (34 g) i THF (850 ml), etterfulgt av trimetylklorsilan (41 ml), mens temperaturen ble holdt under 30°C. Blandingen ble omrørt i 2 timer og deretter avkjølt til 0°C. Ytterligere N-metylmorfolin (16,5 ml) ble tilsatt, etterfulgt av en løsning av 4-anisoylklorid (18 ml) i THF (25 ml), mens temperaturen ble holdt under 5°C. Etter 15 minutter, ble blandingen filtrert, og filtratet konsentrert i vakuum til en gul olje. Oljen ble løst i etylacetat (100 ml) og gjort basisk til pH 7-8 med mettet kaliumhydrogenkarbonat-løsning (100 ml). Det vandige sjikt ble fraskilt og vakset med etylacetat (50 ml). Det vandige sjikt ble deretter surgjort til pH 2-3 med 2M saltsyreløsning og ekstrahert med etylacetat (150 ml). Det organiske ekstrakt ble konsentrert under vakuum, og toluen (150 ml) ble tilsatt. Løsningen ble igjen konsentrert under vakuum, inntil ca. 50 ml toluen var oppsamlet. Løsningen ble deretter tilsatt dråpevis til heksan (400 ml) under omrøring for å gi et hvitt fast stoff som ble frafiltrert, vasket med heksan og tørket under vakuum under dannelse av M-(4-metoksybenzoyl)-L-valyl-L-prolin (40 g), med en NMR-data i likeht med dem som er gitt i fremgangsmåte 1, trinn (iii) ovnefor. (ii) N-metylmorfolin (36,8 ml) ble tilsatt til en løsning av M-(4-metoksybenzoyl)-L-valyl-L-prolin (34,8 g.) i THF (100 ml) og metyl tert-bntyleter (150 ml), og blandingen ble avkjølt til -5°C. En løsning av isobutylklorformiat (14,4 ml) i metyl tert-hntyl eter (30 ml) ble tilsatt i løpet av 30 minutter, mens temperaturen ble holdt ved -5°C under tilsetningen. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved -5°C i ytterligere 30 minutter, og deretter ble tilsatt 2(RS)-3(SR)-3-amino-4-metyl-1,1,1-trifluor-2-pentanol oksalatsalt (22,3 g), og blandingens temperatur ble tillatt å stige til 20°C i løpet av 1 time. Vann (100 ml) og natriumhydrogenkarbonat (5 g) ble tilsatt, og blandingen omrørt i 10 minutter. Den organiske fase ble fraskilt, vasket med 2M saltsyreløsning (50 ml), saltløsning, og inndampet under redusert trykk ved en temperatur under 50°C under dannelse av (S)-1-[(S)-2-(4-metoksybenzamido)-3-metyl-butyryl]-M-[2-metyl-l-(2,2,2-trifluor-l-hydroksyetyl)propyl]-pyrrolidin-2-karboksamid (42 g) som et skum, som hadde NMR-data i likhet med dem gitt i fremgangsmåte 1, trinn (iv) ovenfor. (iii) tert-Rntanol (60 ml), vann (360 ml) og 48% w/w natrium-hydroksydløsning (13,9 ml) ble tilsatt til en løsning av (S) - 1- [ (S) -2- (4-metoksybenzamido) -3-metylbutyryl] - R- [2-metyl-l-(2,2, 2-trifluor-l-hydroksyetyl)propyl]pyrrolidin-2-karboksamid (42 g) i tfixt-butanol (340 ml). Løsningen ble avkjølt til 5°C, og en løsning av kaliumpermanganat (40,1 g) i vann (750 ml) ble tilsatt i løpet av 1 time ved 5-10°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt i ytterligere 1 time ved denne temperatur, og deretter ble tilsatt metanol (100 ml), og blandingen omrørt i 2 timer ved 5-10°C. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom kiselgur, og filterkaken vasket med vann (60 ml). Natriumklorid (400 g) og metyl tert-bntyleter (200 ml) ble tilsatt til filtratet, blandingen omrørt i 10 minutter, og den organiske fase fraskilt. Den vandige fase ble ekstrahert med metyl tert-bntyleter (50 ml), og de samlede organiske faser vasket i rekkefølge med 2M saltsyre, vann, natriumhydrogen-karbonatløsning og saltløsning. Den organiske løsning ble tørket (MgS04) , og flyktig materiale.ble fjernet ved inndamping under dannelse av en diastereomer blanding av SSS og SSR-diastereoisomerer med formel I som et skum (SSS:SSR-forhold på ca. 1:1). 2 (RS.) -3 (SR) -3-amino-4-metyl-l, 1,1-trif luor-2-pentanol, anvendt i fremgangsmåte 1, trinn (iv) og i fremgangsmåte 2, trinn (ii), kan fremstilles som beskrevet i US patent 4.910.190, eller 3-amino-4-metyl-l,1,1-trifluor-2-pentanol (som en blanding av diastereoisomerer som kan anvendes isteden) ble oppnådd som følger: (i) En løsning av urea (72 g) i DMF (810 ml) ble tilsatt til natriumnitritt (90 g), omrørt i 10 minutter og deretter av-kjølt til 15°C. Isobutyljodid (97,2 ml) ble tilsatt i løpet av 30 minutter, og reaksjonsblandingen ble omrørt ved omgivende temperatur i 20 timer. Blandingen ble avkjølt om igjen til 15°C, og vann (810 ml) ble tilsatt langsomt. Blandingen ble omrørt i 15 minutter ved omgivende temperatur og deretter ekstrahert to ganger med metyl tert-bntyleter. De samlede organiske ekstrakter ble vasket to ganger med 20% vandig natriumtiosulfatløsning og konsentrert under vakuum under dannelse av 2-metyl-l-nitropropan (39 g), som ble anvendt uten ytterligere rensing. (ii) 3 Å molekylsikter (27,04 g) ble oppvarmet ved 120°C under vakuum i 20 timer, og tilsatt til en løsning av 2-metyl-l-nitropropan (13,0 g) i metyl tert-bntyleter (420 ml). Blandingen ble omrørt i 5 minutter, kaliumkarbonat (64,5 g) tilsatt, og blandingen omrørt i ytterligere 30 minutter. Blandingen ble avkjølt til 15°C, og fluoralhydrat (22,0 g) ble tilsatt i løpet av 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved omgivende temperatur i 16 timer, deretter avkjølt til 15°C, og vann (270 ml) tilsatt. Etter omrøring i 5 minutter ved omgivende temperatur, ble den organiske fase fraskilt og vasket med 10% vandig kaliumkarbonat, 2M saltsyre-løsning og vann. Løsningsmiddelet ble deretter fjernet ved inndamping under redusert trykk ved en temperatur under 40°C, og oljen destillert tørt azeotropisk med isopropylalkohol ved en temperatur under 50°C under dannelse av 4-metyl-3-nitro-1,1,1-trifluor-2-pentanol (21,3 g) som en olje, som ble anvendt uten ytterligere rensing. (iii) En løsnng av 4-metyl-3-nitro-l,1,1-trifluor-2-pentanol (17,1 g) i isopropanol (115 ml) og eddiksyre (0,43 ml) ble hydrogenert over 10% palladium på karbon (2,4 g) ved et overtrykk på 3,5 bar, inntil opptaket av hydrogen var fullstendig. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering gjennom kiselgur, og filterkaken vasket med isopropanol. Filtratet ble inndampet under vakuum, inntil ingen ytterligere isopropanol destillerte av, og resten løst i acetonitril (40 ml). En løsning av oksalsyre (3,94 g) i acetonitri (80 ml) ble tilsatt under omrøring, og blandingen avkjølt til 5°C. Produktet som krystalliserte ut ble oppsamlet ved filtrering, vasket med kald acetonitril og tørket ved 50°C, under dannelse av 3-amino-4-metyl-l, 1,1-trifluor-2-pentanol. som dens oksalatsalt (9,08 g) •

Claims

1. Krystallinsk form av forbindelsen med formel I som har et innhold på 75% eller mer av diastereoisomeren som har S-konfigurasjon i de kirale sentre merket <*> og #, eller en krystallinsk solvatisert form derav.;

2. Krystallinsk form ifølge krav 1, eller et krystallinsk solvat derav, som har et innhold på 95% eller mer av diastereoisomeren med S-konfigurasjon i de kirale sentre merket <* >og #, eller en krystallinsk solvatisert form derav.

3. Krystallinsk form ifølge krav 1 eller 2, som er i alt vesentlig eller hovedsakelig fri for løsningsmiddel eller en krystallinsk solvatisert form som er en krystallinsk hydratisert form.

4. Krystallinsk solvatisert form ifølge krav 1, 2 eller 3, som er en forbindelse med formel Ib eller en hydratisert form derav, eller et krystallinsk farma-søytisk akseptabelt salt derav.

5. Krystallinsk form ifølge krav 1, 2 eller 3, som er i alt vesentlig eller hovedsakelig fri for løsningsmiddel og som har et røntgenstrålepulver-diffraksjonsmønster med spesifikke topper ved 2-theta = 8,95, 11,17, 11,47, 13,86, 15,49, 17,86, 18,22, 19, 24, 21, 58 og 21,92°.

6. Krystallinsk solvatisert form ifølge krav 1, 2, 3 eller 4, som er en hydratisert form med et røntgenstrålepulver-dif fraksjonsmønster med spesifikke topper ved 2-theta = 6,62, 10,43, 13,30, 16,17, 19,51, 21,37 og 22,80°.

7. Krystallinsk solvatisert" form ifølge krav 1, 2 eller 3, som er en hydratisert form med et røntgenstrålepulver-dif f raks jonsmønster med spesifikke topper ved 2-theta = 6,20, 9,81, 10,29, 12,33, 12,44, 14,22 og 17,92°.

8. Krystallinsk form ifølge hvilket som helst av de foregående krav, som har et infrarødt spektrum, oppnådd ved løsningsmiddelstøpeteknikken fra acetonitrilutstøpinger på et saltvindu, og som har skarpe topper ved 2968, 1761, 1629, 1607, 1533, 1503, 1443, 1259, 1209, 1178, 1158, 1032, 845 og 7 67 cm <1.>

9. Krystallinsk form ifølge krav 1, 2, 3 eller 5 som har et smeltepunkt i området 147-151°C.

10. Krystallinsk form ifølge krav 1, 2, 3, 4 eller 6, som har en endoterm hendelse bestemt ved differensialscanning-kalorimetri (oppvarmingshastighet 2°C/min.) ved 91-92°C, etterfulgt av en eksoterm situasjon som begynner ved 109-110°C, etterfulgt av en endoterm situasjon som begynner ved 148-149°C.

11. Krystallinsk form ifølge krav 1, 2, 3 eller 7 som har et smeltepunkt ved 116-117°C.

12. Farmasøytisk blanding omfattende en krystallinsk form ifølge hvilket som helst av de foregående krav, sammen med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av en krystallinsk form eller solvatisert form ifølge krav 1, som omfatter å danne krystaller fra en løsing av en ikke-krystallinsk blanding av i alt vesentlig SSS og SSR-diastereoisomerer med formel I, eller solvat derav, i et løsningsmiddel valgt fra dietyleter, di-n-propyleter og di-n-butyleter, eller i et løsningsmiddel som er en blanding av metyl tert-hntyleter og heksan, eller en blanding av etylacetat og heksan, eventuelt i nærvær av en katalytisk mengde av en tertiær base.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, modifisert ved å starte med en løsning av en ikke-krystallinsk blanding av SSS og SSR-diastereoisomerene, eller solvat derav, i et løsningsmiddel som har et lavere kokepunkt enn etylacetat, å tilsette etylacetat til løsningen og konsentrere løsningen ved inndamping eller destillasjon, før tilsetning av heksan.

15. Fremgangsmåte for fremstilling av en krystallinsk form eller solvatisert form av forbindelsen med formel I ifølge krav 1, som omfatter å varme opp en ikke-krystallinsk blanding av i alt vesentlig SSS og SSR-diastereoisomerer med formel I, eller solvat derav, med en base valgt fra et M-(1-4C)alkyl-morfolin, et N-(1-4C)alkylpiperidin, pyridin og pentaiso-propylguanidin, i et løsningsmiddel valgt fra metyl t ert - butyleter, heksan eller en blanding av hydrokarboner som har et kokepunkt i området 100-120°C, eller en blanding derav, eller en blanding av etylaceat og heksan, og pode løsningen med kim og la løsningen avkjøle seg.

16. Fremgangsmåte for fremstilling av en krystallinsk form eller solvatisert form ifølge krav 2, omfattende å om-krystallisere én eller flere ganger produktet oppnådd ved fremgangsmåten ifølge krav 13, 14 eller 15, ved anvendelse av et løsningsmiddel valgt fra toluen, en blanding av etylacetat og heksan, en blanding av aceton og vann, og en blanding av tert-hntannl og vann.

17. Fremgangsmåte for fremstilling av en ikke-krystallinsk diastereomer blanding av SSS og SSR-diastereoisomerer med formel I, eller et solvat derav, som omfatter: (a) kobling av N_- (4-metoksybenzoyl) -L-valyl-L-prolin, eller et salt derav, med 3-amino-4-metyl-l,1,1-trifluor-2-pentanol under dannelse av (£)-1-[ (S.)-2-(4-metoksybenzamido)-3-metyl-butyryl]-H-[2-metyl-l-(2,2,2-trifluor-l-hydroksyetyl)propyl]-pyrrolidin-2-karboksamid; etterfulgt av (b) oksidering av ( 2.)-1-[ ( S.) -2-(4-metoksybenzamido) -3-metyl-butyryl]-N-[2-metyl-l-(2,2,2-trifluor-l-hydroksyetyl)propyl]-pyrrolidin-2-karboksamid.

18. Forbindelsen M-(4-metoksybenzoyl)-L-valyl-L-prolin eller et salt derav.

19. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsen ifølge krav 18, som omfatter trinnene for: (i) omsetning av L-valyl-L-prolin eller et salt derav med et tri(1-4C)alkylhalogenosilan eller bis(tri(1-4C)alkylsilyl)-acetamid under dannelse av L-valyl-L-prolin tri(1-4C)alkyl-silylester; (ii) omsetning av L-valyl-L-prolin tri(1-4C)alkylsilylesteren med et aktivert derivat av 4-metoksybenzosyre under dannelse av M-(4-metoksybenzoyl)-L-valyl-L-prolin tri(1-4C)alkylsilyl-ester; og (iii) fjerning av tri(1-4C)alkylsilyl-beskyttelsesgruppen.