CN113769023A - 一种治疗高血压的中药复方组合物及其质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗高血压的中药复方组合物及其质量检测方法，其由天麻、钩藤、沙苑子、蒺藜、川芎、川牛膝、杜仲、槲寄生和焦山栀组成。本发明根据自发性高血压的发病特点，根据中医药辨证论治的原则，通过大量实验筛选出最佳的原料组成和用量份数比，组配得到的中药复方可明显降低收缩压，具有有很好的治疗自发性高血压的作用。本发明通过大量实验筛选检测方法，通过采用薄层色谱定性鉴别和高效液相色谱法进行定量检测，可全面客观的对方中钩藤、天麻、川芎和川牛膝的含量进行检测和分析，且方法学检测表明，本发明提供的高效液相色谱法，精密度高、重复性和稳定性好。

Description

一种治疗高血压的中药复方组合物及其质量检测方法
技术领域
本发明涉及中药技术领域，具体为一种治疗高血压的中药复方组合物及其质量检测方法。
背景技术
自发性高血压是由遗传和环境因素综合造成的。是一个由许多病因引起的处于不断进展状态的心血管综合征，可导致心脏和血管功能与结构的改变。因此，原发性高血压治疗的主要目的是最大限度地降低心血管的死亡和病残的总危险。我院心内科门诊日门诊量近1000人中，高血压患者占百分之30％左右。尽管临床采用了多种治疗措施如改善生活方式、降压、调脂以及外科手术等系统和综合治疗，仍然仍无法有效缓解一部分高血压患者头晕头痛等症状以及延缓心、脑、肾等靶器官损害进程。高血压病是中医药优势病种之一，但临床研究质量不高，机制尚不清楚。这一现状使我们将研究的方向锁定在中医药治疗的进一步探索上，希望能找到突破性的治疗方法。
平肝益肾颗粒是江苏省中医院开发的中药制剂，其由天麻、钩藤、川芎、川牛膝、潼白蒺藜、杜仲、桑寄生和焦山栀九味中药组成，临床实验显示具有很好的治疗自发性高血压的功效。
目前关于平肝益肾颗粒的质量检测方法不多，本发明筛选出其薄层鉴别和高效液相鉴别方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗高血压的中药复方组合物及其质量检测方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种治疗高血压的中药复方组合物，它由天麻、钩藤、沙苑子、蒺藜、川芎、川牛膝、杜仲、槲寄生和焦山栀组成。
作为优选方案，以上所述的一种治疗高血压的中药复方组合物，它由天麻15～45份、钩藤15～45份、沙苑子15～45份、蒺藜15～45份、川芎10～30份、川牛膝10～30份、杜仲12～36份、槲寄生12～36份、焦山栀10～36份组成。
作为优选方案，以上所述的一种治疗高血压的中药复方组合物，它由天麻15份、钩藤15份、沙苑子15份、蒺藜15份、川芎10份、川牛膝10份、杜仲12份、槲寄生12份、焦山栀10份组成。
本发明所述的治疗高血压的中药复方组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)按重量份数取天麻、钩藤、沙苑子、蒺藜、川芎、川牛膝、杜仲、槲寄生和焦山栀，加水煎煮提取，合并煎煮提取液，滤过，得滤液，取滤液减压浓缩，然后采用直管式高速离心机离心，得离心后溶液；
(2)取糊精适量，置流化床中，当物料温度上升，开始进离心后溶液，进液速度控制在80～150r/min，喷雾干燥既得颗粒剂。
作为优选方案，本发明所述的治疗高血压的中药复方组合物的制备方法，包括以下步骤：以上八味饮片加水煎煮两次，第一次加6倍量水，浸泡0.5h，煎煮0.5h，滤过；第二次加6倍量水，煎煮0.5h，滤过。滤液减压浓缩至相对密度约1.20(60℃)，直管式高速离心机离心(转速：16000r/min，流量：4～6L/min)，得滤液。取糊精适量，置流化床中，设置进风温度为100℃，当物料温度升至70℃时，开始进液，进液速度控制在80～150r/min，雾化压力外0.2MPa，内0.15MPa。喷雾结束，70℃继续干燥1小时，制得颗粒剂。
本发明所述的治疗高血压的中药复方组合物的质量检测方法，包括薄层色谱定性检测和高效液相定量检测。
作为优选，所述的薄层色谱定性检测包括以下步骤：
(1)钩藤薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取中药复方组合物的颗粒剂，加水溶解，用浓氨水将PH调节，用三氯甲烷进行萃取，合并三氯甲烷萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，作为中药复方组合物供试品溶液，取缺钩藤的中药复方组合物，同法制备缺钩藤的阴性供试品；
2)另取钩藤对照药材粉末，加入浓氨水浸泡，加入三氯甲烷，加热回流提取，过滤，取滤液，挥干，残渣加甲醇使溶解，作为钩藤对照药材溶液；
3)吸取上述三种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-丙酮-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性未见干扰；
(2)天麻薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取中药复方组合物的颗粒剂，加水溶解后，用乙酸乙酯振摇提取，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液，取缺天麻的中药复方组合物，同法制得天麻阴性供试品溶液；
2)另取天麻对照药材粉末，加甲醇，超声提取，滤过，滤液浓缩至干，残渣加甲醇溶解，即得天麻对照药材溶液；
3)吸取上述3种溶液各，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，阴性未见干扰；
(3)川芎薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取中药复方组合物的颗粒剂，加水溶解后，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；取缺川芎的中药复方组合物，同法制得川芎阴性供试品溶液；
2)另取川芎对照药材，加水加热回流，滤过，滤液备用，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，作为川芎对照药材供试品溶液；
3)吸取上述3种溶液，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上，荧光下显相同颜色的斑点，阴性未见干扰；
(4)川牛膝薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取中药复方组合物的颗粒剂，加水溶解后，用乙酸乙酯振摇提取，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；取缺川牛膝的中药复方组合物，同法制得川牛膝阴性供试品溶液；
2)另取川牛膝对照药材，加水煎煮，滤过，滤液备用，用乙酸乙酯振摇提取，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为牛膝对照药材溶液；
3)吸取上述3种溶液各，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上，荧光下显相同颜色的斑点，阴性未见干扰。
作为优选方案，以上所述的治疗高血压的中药复方组合物的质量检测方法，步骤(1)钩藤薄层色谱鉴别，以体积比为6:4:2的石油醚-丙酮-乙酸乙酯为展开剂；
步骤(2)天麻薄层色谱鉴别，以体积比为9:0.5:0.2的乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂；
步骤(3)川芎薄层色谱鉴别，以体积比为2:1正己烷-乙酸乙酯为展开剂；
步骤(4)川牛膝薄层色谱鉴别，以体积比为10:5:8的环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯为展开剂。
作为优选方案，以上所述的治疗高血压的中药复方组合物的质量检测方法，所述的高效液相定量检测包括以下步骤：
1)对照品溶液的制备：精密称定天麻素、栀子苷、阿魏酸和沙苑子苷对照品，加70％甲醇溶解，超声处理10min，定容，摇匀，制成质量浓度分别为0.96、1.097、0.444、1.058mg·mL-1的对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：精密称定中药复方组合物，精密加入稀乙醇，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液至蒸发皿中，蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至量瓶中，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；
3)标准曲线的绘制：取上述步骤1)对照品溶液，用甲醇逐级稀释得到5个浓度，精密吸取并分别进样10μL，注入高效液相色谱仪中测定；以对照品的浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，得天麻素的回归方程为Y＝15.583X-11.895,r2＝0.9987；栀子苷Y＝17.125X-13.048,r2＝0.9988；阿魏酸Y＝16.583X-3.9589,r2＝0.9993；沙苑子苷Y＝20.216X-22.541,r2＝0.9987；
4)含量测定：分别精密吸取步骤1)对照品溶液和步骤2)供试品溶液，注入液相色谱仪，依据步骤3)的标准曲线方程，计算出供试品溶液中天麻素、栀子苷、阿魏酸和沙苑子苷的含量。
作为优选方案，以上所述的治疗高血压的中药复方组合物的质量检测方法，步骤4)的色谱条件为：色谱柱：HederaC18ODS-2色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相：体积比为1：1的甲醇：乙腈为A相，0.1％磷酸为B项，梯度洗脱；柱温：35℃；流速：1.0mL·min-1，检测波长：280nm；进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下：
梯度洗脱表
时间/min 流动相A/％ 流动相B/％
0～5 7→13 93→87
5～15 13→20 87→80
15～23 20→30 80→70
23～28 30→37 70→63
28～35 37→65 63→35
。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明中根据自发性高血压的发病特点，根据中医药辨证论治的原则，本方平肝息风，补益肝肾，主治肝肾阴虚、肝阳上亢者证。方中天麻、钩藤平肝息风，为君药。沙苑子(潼蒺藜)、白蒺藜补益肝肾，平肝祛风，共为臣药；川芎，活血行气，祛风止痛；川牛膝，引血下行，兼益肝肾；杜仲、桑寄生补益肝肾以治本；栀子清肝泻火，以平肝阳，共为佐药。诸药合用，共奏平肝息风、清热活血，补益肝肾之功。通过大量实验筛选出最佳的原料组成和用量份数比，组配得到的中药复方可明显降低收缩压，具有有很好的治疗自发性高血压的作用。
2、本发明通过大量实验筛选检测方法，通过采用薄层色谱定性鉴别和高效液相色谱法进行定量检测，可全面客观的对方中钩藤、天麻、川芎和川牛膝的含量进行检测和分析，并且方法学检测表明，本发明提供的高效液相色谱法，精密度高、重复性和稳定性好。
附图说明
图1为本发明钩藤的薄层鉴别示意图；
图2为本发明温度为8℃时平肝益肾颗粒钩藤薄层鉴别示意图；
图3为本发明温度为25℃时平肝益肾颗粒钩藤薄层鉴别示意图；
图4为本发明湿度为35％时平肝益肾颗粒钩藤薄层鉴别示意图；
图5为本发明湿度为56％时平肝益肾颗粒钩藤薄层鉴别示意图；
图6为本发明青岛海洋的平肝益肾颗粒钩藤薄层鉴别示意图；
图7为本发明烟台江友的平肝益肾颗粒钩藤薄层鉴别示意图；
图8为本发明10μL下平肝益肾颗粒钩藤薄层鉴别示意图；
图9为本发明15μL下平肝益肾颗粒钩藤薄层鉴别示意图；
图10为本发明氯仿-乙酸乙酯-甲醇(10:4:2)下平肝益肾颗粒钩藤薄层鉴别示意图；
图11为本发明天麻的薄层鉴别示意图；
图12为本发明8℃平肝益肾颗粒天麻薄层鉴别示意图；
图13为本发明25℃时平肝益肾颗粒天麻薄层鉴别示意图；
图14为本发明湿度为35％时平肝益肾颗粒天麻薄层鉴别示意图；
图15为本发明湿度为56％时平肝益肾颗粒天麻薄层鉴别示意图；
图16为本发明青岛海洋的平肝益肾颗粒天麻薄层鉴别示意图；
图17为本发明烟台江友的平肝益肾颗粒天麻薄层鉴别示意图；
图18为本发明10μL下平肝益肾颗粒天麻薄层鉴别示意图；
图19为本发明15μL下平肝益肾颗粒天麻薄层鉴别示意图；
图20为本发明乙酸乙酯-甲醇-水(9:1.5:0.2)下平肝益肾颗粒天麻薄层鉴别示意图；
图21为本发明乙酸乙酯-甲醇-水(9:0.15:0.2)下平肝益肾颗粒天麻薄层鉴别示意图；
图22为本发明川芎的薄层鉴别示意图；
图23为本发明8℃平肝益肾颗粒川芎薄层鉴别示意图；
图24为本发明25℃时平肝益肾颗粒川芎薄层鉴别示意图；
图25为本发明湿度为35％时平肝益肾颗粒川芎薄层鉴别示意图；
图26为本发明湿度为56％时平肝益肾颗粒川芎薄层鉴别示意图；
图27为本发明青岛海洋的平肝益肾颗粒川芎薄层鉴别示意图；
图28为本发明烟台江友的平肝益肾颗粒川芎薄层鉴别示意图；
图29为本发明10μL下平肝益肾颗粒川芎薄层鉴别示意图；
图30为本发明15μL下平肝益肾颗粒川芎薄层鉴别示意图；
图31为本发明正己烷-乙酸乙酯(4:1)下平肝益肾颗粒川芎薄层鉴别示意图；
图32为本发明正己烷-乙酸乙酯(4:1)下平肝益肾颗粒川芎薄层鉴别示意图；
图33为本发明川牛膝的薄层鉴别示意图；
图34为本发明8℃平肝益肾颗粒川牛膝薄层鉴别示意图；
图35为本发明25℃时平肝益肾颗粒川牛膝薄层鉴别示意图；
图36为本发明湿度为35％时平肝益肾颗粒川牛膝薄层鉴别示意图；
图37为本发明湿度为56％时平肝益肾颗粒川牛膝薄层鉴别示意图；
图38为本发明青岛海洋的平肝益肾颗粒川牛膝薄层鉴别示意图；
图39为本发明烟台江友的平肝益肾颗粒川牛膝薄层鉴别示意图；
图40为本发明10μL下平肝益肾颗粒川牛膝薄层鉴别示意图；
图41为本发明15μL下平肝益肾颗粒川牛膝薄层鉴别示意图；
图42为本发明平肝益肾颗粒供试品溶液色谱示意图；
图43为平肝益肾全方及药对配伍对SHR大鼠血压的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例,基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
平肝益肾颗粒剂的制备方法具体包括以下步骤：
(1)取天麻15g、钩藤15g、沙苑子15g、蒺藜15g、川芎10g、川牛膝10g、杜仲12g、槲寄生12g、焦山栀10g，加水煎煮提取两次，第一次加总药材重量6倍量的水，先浸泡0.5h，再煎煮提取0.5h，滤过；第二次加6倍量水，煎煮提取0.5h，滤过。滤液减压浓缩至相对密度约1.20(60℃)，直管式高速离心机离心(转速：16000r/min，流量：4～6L/min)，取离心后的上清液。
(2)取糊精适量，置流化床中，设置进风温度为100℃，当物料温度升至70℃时，开始进步骤(1)离心后的上清液，进液速度控制在80～150r/min，雾化压力外0.2MPa，内0.15MPa。喷雾结束，70℃继续干燥1小时，制得颗粒剂。
实施例2平肝益肾颗粒的薄层色谱鉴别，平肝益肾颗粒由实施例1制备得到，具体步骤如下：
步骤1：对钩藤薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取平肝益肾颗粒的供试品15g，溶解至40mL，用浓氨水将PH调节至10，用三氯甲烷进行萃取，共两次，每次30mL，合并三氯甲烷萃取液，蒸干，残渣加甲醇1mL，使其溶解，作为平肝益肾供试品溶液。取缺钩藤制剂，同法制备缺钩藤的阴性供试品溶液；
2)另取钩藤对照药材粉末2g，加入浓氨水2mL，浸泡30min，加入三氯甲烷50mL，加热回流2小时，放冷，过滤，取10mL滤液，挥干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为钩藤对照药材溶液；
3)照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》四部通则0502)试验，吸取上述三种溶液各15μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-丙酮-乙酸乙酯(6:4:2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性未见干扰。
4)钩藤薄层方法耐用性检测：
不同温度：分别检测8℃和25℃下，采用上述方法进行钩藤薄层鉴别的展开情况。结果如下图，两温度下色谱图无明显差异，故该方法适用于不同温度下平肝益肾颗粒中钩藤的薄层鉴别，见图2、图3，其中图2中的1为钩藤对照药材。2、3、4为不同批次供试品，图3中的1为钩藤对照药材。2、3、4为不同批次供试品；
不同湿度：分别检测湿度35％和56％下，平肝益肾颗粒中钩藤的薄层鉴别方法的可行性。结果如下图，两湿度下色谱图无明显差异，均有明显清晰的薄层鉴别点，故该方法适用于不同湿度下钩藤的薄层鉴别，见图4、图5，其图4中的1为钩藤对照药材，2、3、4为不同批次供试品；图5中的1为钩藤对照药材，2、3、4为不同批次供试品；
不同厂家薄层板：分别采用青岛海洋硅胶G板(批号：20200809)和烟台江友薄层层析硅胶G板(批号：20210109)进行展开，结果无明显差异，故该方法适应性良好，对薄层板厂家和品牌无要求，见图6、图7，其中图中图6、图7中的1为钩藤对照药材，2、3、4为不同批次供试品；
不同点样量：分别检测对照药材和供试品点样10μL和15μL下，平肝益肾颗粒中钩藤的薄层鉴别方法的可行性，结果，点样15μL，鉴别点更加清晰；见图8、图9，其中图8、图9中的1为钩藤对照药材，2、3、4为不同批次供试品；
不同展开剂展开效果比较：钩藤的薄层方法以石油醚(60～90℃)-丙酮-乙酸乙酯(6:4:2)为展开剂源自于2020版中国药典，但存在鉴别点在荧光下拍照不清晰的问题，故在试验中尝试更换展开剂为氯仿-乙酸乙酯-甲醇(10:4:2)，结果见图9。由图可见，展开效果差，并且考虑到三氯甲烷存在毒性，所以还是以石油醚(60～90℃)-丙酮-乙酸乙酯(6:4:2)为展开剂。图10中的1为钩藤对照药材；2、3、4为不同批次供试品；
步骤2：对天麻薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取平肝益肾颗粒18g，以30mL水溶解后，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。取缺天麻制剂，同法制得天麻阴性供试品溶液；
2)另取天麻对照药材粉末1g，加甲醇10mL，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至干，残渣加甲醇1mL使溶解，即得天麻对照药材溶液；
3)照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》四部通则0502)试验，吸取上述3种溶液各15μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(9:0.5:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，阴性未见干扰。
4)天麻薄层方法耐用性检测
不同温度：分别检测8℃和25℃下，采用上述方法进行天麻薄层鉴别的展开情况。结果如下图，两温度下色谱图无明显差异，故该方法适用于不同温度下平肝益肾颗粒中天麻的薄层鉴别，见图12、图13，其图12、图13中的1为天麻对照药材，2、3、4为不同批次供试品；
不同湿度：分别检测湿度35％和56％下，平肝益肾颗粒中天麻的薄层鉴别方法的可行性。结果如下图，两湿度下色谱图无明显差异，均有明显清晰的薄层鉴别点，故该方法适用于不同湿度下天麻的薄层鉴别，见图14、图15，其图14、图15中的1为天麻对照药材，2、3、4为不同批次供试品；
不同厂家薄层板：分别采用青岛海洋硅胶G板(批号：20200809)和烟台江友薄层层析硅胶G板(批号：20210109)进行展开，结果无明显差异，故该方法适应性良好，对薄层板厂家和品牌无要求，见图16、图17，其中图16、图17中的1为天麻对照药材，2、3、4为不同批次供试品；
不同点样量：分别检测对照药材和供试品点样10μL和15μL下，平肝益肾颗粒中天麻的薄层鉴别方法的可行性。结果，点样15μL，鉴别点更加清晰，见图18、图19，其中图18、图19中的1为天麻对照药材，2、3、4为不同批次供试品；
不同展开剂比例展开效果比较：参照2015版中国药典选用了乙酸乙酯-甲醇-水(9:1:0.2)为展开剂，但展开情况不佳，通过考察不同乙酸乙酯-甲醇-水比例的展开剂，结果发现变化情况不大，见图20-21。最终选择比移值情况较好的乙酸乙酯-甲醇-水(9:0.5:0.2)为展开剂。其图20、图21中的1为天麻对照药材，2、3、4为不同批次供试品；
步骤3：对川芎薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取平肝益肾颗粒18g，以30mL水溶解后，用乙酸乙酯萃取2次，每次40mL，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇2mL溶解，作为供试品溶液。取缺川芎制剂，同法制得川芎阴性供试品溶液；
2)另取川芎对照药材2g，加水100mL，加热回流0.5h，放冷，滤过，滤液备用。照供试品制备方法，自“用乙酸乙酯萃取2次”起，依法制备对照药材溶液；
3)照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》四部通则0502)试验，吸取上述3种溶液各15μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(366nm)下检视，供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上，荧光下显相同颜色的斑点，阴性未见干扰。
4)川芎薄层方法耐用性检测
不同温度：分别检测8℃和25℃下，采用上述方法进行川芎薄层鉴别的展开情况。结果如下图，两温度下色谱图无明显差异，故该方法适用于不同温度下平肝益肾颗粒中川芎的薄层鉴别，见图23、图24，图23、图24中的1为川芎对照药材，2、3、4为不同批次供试品；
不同湿度：分别检测湿度35％和56％下，平肝益肾颗粒中川芎的薄层鉴别方法的可行性。结果如下图，两湿度下色谱图无明显差异，均有明显清晰的薄层鉴别点，故该方法适用于不同湿度下川芎的薄层鉴别，见图25、图26，其图25、图26中的1为川芎对照药材，2、3、4为不同批次供试品；
不同厂家薄层板：分别采用青岛海洋硅胶GF254板(批号：20201008)和烟台江友薄层层析硅胶GF254板(批号：20201230)进行展开，结果无明显差异，故该方法适应性良好，对薄层板厂家和品牌无要求，见图27、图28，其中图27、图28中的1为川芎对照药材，2、3、4为不同批次供试品；
不同点样量：分别检测对照药材和供试品点样10μL和15μL下，平肝益肾颗粒中川芎的薄层鉴别方法的可行性。结果，点样15μL，鉴别点更加清晰，见图29、图30，其中图29、图30中的1为川芎对照药材，2、3、4为不同批次供试品；
不同展开剂比例展开效果比较：参考2020版中国药典，川芎的展开剂为正己烷-乙酸乙酯(3:1)，为了优化鉴别点的比移值，在试验中尝试考察展示剂正己烷-乙酸乙酯(2:1)和(4:1)，结果如图31-32。由图可见，正己烷-乙酸乙酯比例为2:1时展开效果最好。其中图31、图32中的1为川芎对照药材，2、3、4为不同批次供试品；
步骤4：对川牛膝薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取平肝益肾颗粒18g，以30mL水溶解后，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。取缺川牛膝制剂，同法制得川牛膝阴性溶液；
2)另取川牛膝对照药材1g，加水50mL，煎煮1h，滤过，滤液备用。照供试品制备方法，自“用乙酸乙酯萃取2次”起，依法制备对照药材溶液；
3)照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》四部通则0502)试验，吸取上述3种溶液各15μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(10:5:8)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上，荧光下显相同颜色的斑点，阴性未见干扰。
4)川牛膝薄层方法耐用性检测
不同温度：分别检测8℃和25℃下，采用上述方法进行川牛膝薄层鉴别的展开情况。结果如下图，两温度下色谱图无明显差异，故该方法适用于不同温度下平肝益肾颗粒中川牛膝的薄层鉴别，见图34、图35，图34、图35中的1为川牛膝对照药材，2、3、4为不同批次供试品；
不同湿度：分别检测湿度35％和56％下，平肝益肾颗粒中川牛膝的薄层鉴别方法的可行性。结果如下图，两湿度下色谱图无明显差异，均有明显清晰的薄层鉴别点，故该方法适用于不同湿度下川牛膝的薄层鉴别，见图36、图37，其图36、图37中的1为川牛膝对照药材，2、3、4为不同批次供试品；
不同厂家薄层板：分别采用青岛海洋硅胶G板(批号：20200809)和烟台江友薄层层析硅胶G板(批号：20210109)进行展开，结果无明显差异，故该方法适应性良好，对薄层板厂家和品牌无要求，见图38、图39，其中图38、图39中的1为川牛膝对照药材，2、3、4为不同批次供试品；
不同点样量：分别检测对照药材和供试品点样5μL和10μL下，平肝益肾颗粒中川牛膝的薄层鉴别方法的可行性。结果，点样10μL，鉴别点更加清晰，见图40、图41，其中图40、图41中的1为川牛膝对照药材，2、3、4为不同批次供试品。
实施例3平肝益肾颗粒的含量测定方法
(1)色谱条件：色谱柱：HederaC18ODS-2色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇：乙腈(1：1)为A相，0.1％磷酸为B项，按照表1进行梯度洗脱；柱温：35℃；流速：1.0mL·min-1。检测波长：280nm；进样体积：10μL。理论板数按天麻素峰计算不低于3000；
表1梯度洗脱表
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 7→13 93→87
5～15 13→20 87→80
15～23 20→30 80→70
23～28 30→37 70→63
28～35 37→65 63→35
(2)对照品溶液的制备：精密称定天麻素、栀子苷、阿魏酸和沙苑子苷对照品，加70％甲醇溶解，超声处理10min，定容，摇匀，制成质量浓度分别为0.96、1.097、0.444、1.058mg·mL-1的对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：精密称定实施例1制备得到的平肝益肾颗粒约3g，精密加入稀乙醇80mL，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，滤过，取10mL续滤液至蒸发皿中，蒸干，残渣加70％甲醇溶解，定容至25mL量瓶中，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；
(4)系统适应性试验：
1)分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，供试品色谱与对照品色谱在相同的位置有较大吸收。理论板数按天麻素峰计算不低于3000，见图42。
2)取上述对照品溶液，用70％甲醇逐级稀释，精密吸取并分别进样10μL，注入高效液相色谱仪中测定。以对照品的浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，得天麻素的回归方程为Y＝15.583X-11.895,r2＝0.9987；栀子苷Y＝17.125X-13.048,r2＝0.9988；阿魏酸Y＝16.583X-3.9589,r2＝0.9993；沙苑子苷Y＝20.216X-22.541,r2＝0.9987。良好的线性关系；
(5)精密度试验：
取同一对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，重复测定6次，以峰面积积分值计算，结果天麻素、栀子苷、阿魏酸和沙苑子苷峰面积RSD值分别为0.67％、0.59％、0.52％、0.83％,仪器精密度良好。
(6)重复性试验：
精密称取三批批次平肝益肾颗粒(批号：202102001、202102002、202102003)约2g，各2份，共6份，按上述要求制备平肝益肾供试品溶液，并依法测定，结果天麻素、栀子苷、阿魏酸和沙苑子苷峰面积的RSD分别为2.6％、3.5％、2.5％、2.0％，显示该方法重复性良好。
(7)稳定性试验：
取同一份平肝益肾溶液，分别于平肝益肾溶液制备完成后的0、2、4、8、12、24h进样，测定，结果天麻素、栀子苷、阿魏酸和沙苑子苷峰面积的RSD分别为1.64％、1.59％、2.52％、0.88％，显示供试品溶液在室温放置24h内基本稳定。
(8)加样回收试验：
精密称取同一批次平肝益肾颗粒(批号：202102001)约1.5g，共6份，加入天麻素、栀子苷、阿魏酸和沙苑子苷对照品对照溶液适量，按照上述要求制备供试品溶液，以上述色谱条件，测定，记录峰面积，计算加样回收率。
表2加样回收率试验结果(n＝6)
Figure BDA0003274767590000151
Figure BDA0003274767590000161
(9)样品含量测定：
精密量取3个批次按实施例1方法制备得到的平肝益肾颗粒3g，各两份，按上述要求制备平肝益肾溶液，按上述色谱条件，进样10μL，测定，计算。三个批次平肝益肾颗粒中天麻素的含量测定结果见表3。
表3不同批次平肝益肾颗粒中4种成分含量(μg/g,n＝3)
Figure BDA0003274767590000171
实施例4平肝益肾全方及药对配伍对SHR大鼠血压的影响
(1)目的：考察平肝益肾颗粒(本发明实施例1制得)及药对天麻-杜仲、天麻-牛膝、杜仲-牛膝的降血压作用。
(2)实验方法：采用无创血压仪监测10周龄SHR大鼠血压及给予平肝益肾全方和药对对SHR大鼠血压的影响。----将10周龄SHR大鼠分为随机分为六组，分别为空白组、模型组、天麻-杜仲组、天麻-牛膝组、杜仲-牛膝组和平肝益肾全方组，剂量为天麻杜仲10.53g/kg,天麻牛膝9.75g/kg,杜仲牛膝8.58g/kg,全方44.46g/kg。
(3)实验结果：由图43结果表明。与对照组比较，9周龄SHR大鼠收缩压(SBP)、平均动脉压(MBP)和舒张压(DBP)均显著增高；灌胃给予实施例1制备得到的平肝益肾全方一周，显著性降低SHR大鼠收缩压(SBP)(p<0.05)；平均动脉压MBP(p＝0.06)和舒张压DBP(p＝0.07)呈现降低趋势。灌胃给予天麻-杜仲一周，SBP(p＝0.09)，MBP(p＝0.07)和DBP(p＝0.06)呈现降低趋势，尚未有显著性差异。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (11)

1.一种治疗高血压的中药复方组合物，其特征在于，它由天麻、钩藤、沙苑子、蒺藜、川芎、川牛膝、杜仲、槲寄生和焦山栀组成。
2.根据权利要求1所述的一种治疗高血压的中药复方组合物，其特征在于，它由天麻15～45份、钩藤15～45份、沙苑子15～45份、蒺藜15～45份、川芎10～30份、川牛膝10～30份、杜仲12～36份、槲寄生12～36份、焦山栀10～36份组成。
3.根据权利要求2所述的一种治疗高血压的中药复方组合物，其特征在于，它由天麻15份、钩藤15份、沙苑子15份、蒺藜15份、川芎10份、川牛膝10份、杜仲12份、槲寄生12份、焦山栀10份组成。
4.权利要求1～3任一项所述的治疗高血压的中药复方组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按重量份数取天麻、钩藤、沙苑子、蒺藜、川芎、川牛膝、杜仲、槲寄生和焦山栀，加水煎煮提取，合并煎煮提取液，滤过，得滤液，取滤液减压浓缩，然后采用直管式高速离心机离心，得离心后溶液；
(2)取糊精适量，置流化床中，当物料温度上升，开始进离心后溶液，进液速度控制在80～150r/min，喷雾干燥既得。
5.权利要求1～3任一项所述的治疗高血压的中药复方组合物的质量检测方法，其特征在于，包括薄层色谱定性检测和高效液相定量检测。
6.根据权利要求5所述的治疗高血压的中药复方组合物的质量检测方法，其特征在于，所述的薄层色谱定性检测包括以下步骤：
(1)钩藤薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取权利要求4制备得到的颗粒剂，加水溶解，用浓氨水将PH调节，用三氯甲烷进行萃取，合并三氯甲烷萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，作为中药复方组合物供试品溶液，取缺钩藤的中药复方组合物，同法制备缺钩藤的阴性供试品；
2)另取钩藤对照药材粉末，加入浓氨水浸泡，加入三氯甲烷，加热回流提取，过滤，取滤液，挥干，残渣加甲醇使溶解，作为钩藤对照药材溶液；
3)吸取上述三种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-丙酮-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性未见干扰；
(2)天麻薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取取权利要求4制备得到的颗粒剂，加水溶解后，用乙酸乙酯振摇提取，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液，取缺天麻的中药复方组合物，同法制得天麻阴性供试品溶液；
2)另取天麻对照药材粉末，加甲醇，超声提取，滤过，滤液浓缩至干，残渣加甲醇溶解，即得天麻对照药材溶液；
3)吸取上述3种溶液各，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，阴性未见干扰；
(3)川芎薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取权利要求4制备得到的颗粒剂，加水溶解后，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；取缺川芎的中药复方组合物，同法制得川芎阴性供试品溶液；
2)另取川芎对照药材，加水加热回流，滤过，滤液备用，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，作为川芎对照药材供试品溶液；
3)吸取上述3种溶液，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上，荧光下显相同颜色的斑点，阴性未见干扰；
(4)川牛膝薄层色谱鉴别，具体步骤如下：
1)取权利要求4制备得到的颗粒剂，加水溶解后，用乙酸乙酯振摇提取，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；取缺川牛膝的中药复方组合物，同法制得川牛膝阴性供试品溶液；
2)另取川牛膝对照药材，加水煎煮，滤过，滤液备用，用乙酸乙酯振摇提取，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为牛膝对照药材溶液；
3)吸取上述3种溶液各，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上，荧光下显相同颜色的斑点，阴性未见干扰。
7.根据权利要求6所述的治疗高血压的中药复方组合物的质量检测方法，其特征在于，步骤(1)钩藤薄层色谱鉴别，以体积比为6:4:2的石油醚-丙酮-乙酸乙酯为展开剂；
步骤(2)天麻薄层色谱鉴别，以体积比为9:0.5:0.2的乙酸乙酯-甲醇-水为展开剂；
步骤(3)川芎薄层色谱鉴别，以体积比为2:1正己烷-乙酸乙酯为展开剂；
步骤(4)川牛膝薄层色谱鉴别，以体积比为10:5:8的环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯为展开剂。
8.根据权利要求5所述的治疗高血压的中药复方组合物的质量检测方法，其特征在于，所述的高效液相定量检测包括以下步骤：
1)对照品溶液的制备：精密称定天麻素、栀子苷、阿魏酸和沙苑子苷对照品，加70％甲醇溶解，超声处理10min，定容，摇匀，制成质量浓度分别为0.96、1.097、0.444、1.058mg·mL-1的对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：精密称定中药复方组合物，精密加入稀乙醇，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液至蒸发皿中，蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至量瓶中，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得；
3)标准曲线的绘制：取上述步骤1)对照品溶液，用甲醇逐级稀释得到5个浓度，精密吸取并分别进样10μL，注入高效液相色谱仪中测定；以对照品的浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，得天麻素的回归方程为Y＝15.583X-11.895,r2＝0.9987；栀子苷Y＝17.125X-13.048,r2＝0.9988；阿魏酸Y＝16.583X-3.9589,r2＝0.9993；沙苑子苷Y＝20.216X-22.541,r2＝0.9987；
4)含量测定：分别精密吸取步骤1)对照品溶液和步骤2)供试品溶液，注入液相色谱仪，依据步骤3)的标准曲线方程，计算出供试品溶液中天麻素、栀子苷、阿魏酸和沙苑子苷的含量。
9.根据权利要求8所述的治疗高血压的中药复方组合物的质量检测方法，其特征在于，步骤4)的色谱条件为：色谱柱：HederaC18 ODS-2色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相：体积比为1：1的甲醇：乙腈为A相，0.1％磷酸为B项，梯度洗脱；柱温：35℃；流速：1.0mL·min-1，检测波长：280nm；进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下：
梯度洗脱表
时间/min 流动相A/％ 流动相B/％ 0～5 7→13 93→87 5～15 13→20 87→80 15～23 20→30 80→70 23～28 30→37 70→63 28～35 37→65 63→35
。
10.权利要求1～3任一项所述的治疗高血压的中药复方组合物在制备治疗高血压的药物中的应用。
11.权利要求1～3任一项所述的治疗高血压的中药复方组合物在制备治疗自发性高血压的药物中的应用。
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