CN113546453A - 里氏木霉制备纤维素酶中使用的消泡剂及泡沫处理方法 - Google Patents

里氏木霉制备纤维素酶中使用的消泡剂及泡沫处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种里氏木霉制备纤维素酶中使用的消泡剂，所述消泡剂包括如下组分：35～45wt％的硅氧烷改性的烯丙基聚醚、3～4wt％的乳化剂、18～22wt％硅膏和余量的水。本发明还涉及一种里氏木霉制备纤维素酶过程的泡沫处理方法，包括，按照如下时间顺序加入消泡剂：从产生泡沫开始计时，在2～6h内，加入发酵体系重量0.05wt％～0.07wt％第一消泡剂；在20h至产酶高峰期内，每2.5～3.5h加入一次发酵体系重量0.08wt％～0.10wt％第二消泡剂。本申请针对泡沫产生初期，加入抑泡性能明显的消泡剂，对发酵体系的泡沫生成进行抑制，随着持续发酵，消泡剂不断被消耗，抑泡效果变差，泡沫增多，补充消泡效果明显的消泡剂，对生成的泡沫进行消除。

Description

里氏木霉制备纤维素酶中使用的消泡剂及泡沫处理方法
技术领域
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种里氏木霉制备纤维素酶中使用的消泡剂及利用所述消泡剂的泡沫处理方法。
背景技术
资源丰富的生物质目前还存在很大的利用不足问题，作为农业大国，废弃的秸秆，稻草等废弃的生物质迫切需要由传统的生产沼气、生物堆肥利用方式转化成具有更高附加值的生物制氢、生物柴油和燃料乙醇、生物材料等。
废弃生物质主要由纤维素、半纤维素、木质素组成。纤维素是葡萄糖通过β-葡萄糖苷键聚合而成，半纤维素则由木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖聚合而成。微生物无法直接利用纤维素和半纤维素，必须由纤维素酶将纤维素和半纤维素酶解为单糖和二糖，单糖和二糖可被微生物利用转化为其它有机物再进行深加工。
现有技术公开了利用秸秆制备高酶活纤维素酶的方法，打破了纤维素酶的国际垄断和价格瓶颈。但在利用秸秆生物发酵产纤维素酶的过程中，产生的液体泡沫会提高染菌风险，同时也限制生产效率。液体泡沫生成是由于气体进入含有表面活化剂的溶液在液体表面形成被液膜包裹的气泡聚集物，气-液共存的稳定气泡形成发酵液面上方的泡沫层。生物发酵产纤维素酶过程中，由于蛋白含量高，加上机械搅拌、菌株代谢产气和通气调节等因素容易形成绵密的泡沫。
消除泡沫的方式主要分为物理消泡和化学消泡。物理消泡受环境因素的制约消泡速率不高，如今应用最广泛的消泡方式是加入消泡剂，这种方式最大的优点在于破泡效率高、使用方便等优点。目前通常使用的消泡剂类型有：小分子有机消泡剂、聚醚型消泡剂、有机硅消泡剂。不同消泡剂使用效果与料液成分、菌株特性和生产方式均具有一定相关性，根据具体发酵过程的特性，寻找合适高效的消泡剂是关键。
对于里氏木霉制备纤维素酶过程，由于蛋白质降解形成的泡沫与纤维质底物结合，泡沫变的稳定且不易消灭，因此，本领域需要开发一种里氏木霉制备纤维素酶过程中使用的消泡剂，以及里氏木霉制备纤维素酶的泡沫处理方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本申请目的之一是提供一种里氏木霉制备纤维素酶过程中使用的消泡剂，该消泡剂对于里氏木霉制备纤维素酶对于尤其优异的抑泡和消泡效果，所述消泡剂包括如下组分：
35～45wt％(例如36wt％、38wt％、40wt％、42wt％、44wt％等)的硅氧烷改性的烯丙基聚醚、3～4wt％(例如3.3wt％、3.5wt％、3.7wt％等)的乳化剂、18～22wt％(例如19wt％、20wt％、21wt％等)硅膏和余量的水；
其中，所述硅氧烷改性的烯丙基聚醚使用含氢硅油和烯丙基聚醚进行硅氢加成获得，且所述含氢硅油和烯丙基聚醚按照碳碳双键和硅氢键数量比为1.2:1～1.3:1(例如1.21:1、1.22:1、1.24:1、1.26:1、1.27:1、1.28:1、1.29:1等)混合；所述烯丙基聚醚的 PO段和EO段的摩尔比为2:1～3:1(例如2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1 等)；
所述乳化剂包括至少一种亲油表面活性剂和至少一种亲水表面活性剂；所述亲油表面活性剂中必须含有一种含量在70wt％以上(例如75wt％、78wt％、83wt％、88wt％、93wt％、96wt％、99wt％、100wt％等)的HLB为4～7(例如4.2、4.7、4.8、5.3、5.6、 5.8等)的亲油表面活性剂；所述亲水表面活性剂中必须含有一种含量在70wt％以上(例如75wt％、78wt％、83wt％、88wt％、93wt％、96wt％、99wt％、100wt％等)的 HLB为13～16(例如13.3、13.6、13.8、14.2、14.7、14.8、15.3、15.6、15.8等)的亲水表面活性剂；所述乳化剂的综合HLB值为9～10(例如9.2、9.5、9.7等)；
所述硅膏为气相法白炭黑的二甲基硅油分散液，且所述气相法白炭黑和二甲基硅油的比例为1:10～1:8(例如1:8.3、1:8.5、1:8.8、1:9.2、1:9.4、1:9.8等)。
在本申请提供的里氏木霉制备纤维素酶过程的消泡剂，综合考量了消泡剂的组分种类和含量、包括硅氧烷改性的烯丙基聚醚内的含氢硅油和烯丙基聚醚硅氢加成的碳碳双键和硅氢键的比例、所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的比例、乳化剂中表面活性剂的选择和HLB值、以及硅膏的气相法白炭黑和二甲基硅油的比例等因素，以使所述消泡剂在抑制泡沫生成方面有好的表现。
对于里氏木霉制备纤维素酶的过程，培养基具有多孔结构，泡沫生成后不容易消灭，本申请针对这一技术问题，开发一种里氏木霉制备纤维素酶过程中使用的消泡剂，其具有合适的亲水亲油性，将表面活性剂、白炭黑和硅氧烷改性的烯丙基聚醚等组分乳化成小液滴，在发酵体系起始就加入，使得其能够有效抑制后续因为通气或高温反应带来的气泡生成。所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的摩尔比为2:1～3:1使得所述消泡剂具有良好的抑泡性能，而9～10的HLB值的乳化剂能够有效将硅氧烷改性的烯丙基聚醚和白炭黑进行乳化，同时选用HLB值4～7和HLB值13～16的两种表面活性剂进行混合乳化能够在里氏木霉制备纤维素酶发酵体系的气液界面形成更严密的电层，抑制泡沫生成。
优选地，所述HLB为4～7的亲油表面活性剂包括Span80、Arlacel80、Span60、Arlacel60中的任意一种或至少两种的组合，优选Span80。
优选地，所述HLB为13～16的亲水表面活性剂包括Tween21、Atlas、Tween60、Tween80、Tween40中的任意一种或至少两种的组合，优选Tween80。
优选地，所述含氢硅油的数均分子量为0.8w～1.5w(例如0.9w、1.0w、1.1w、1.2w、1.3w、1.4w等)，优选0.9w～1.1w。
含氢硅油分子量过高，乳化困难，在抑泡过程中容易分层，影响抑泡效果；含氢硅油分子量过低，硅氢加成接枝的烯丙基聚醚基团数量有限，导致硅氧烷改性的烯丙基聚醚的分散性不理想，劣化抑泡效果。
优选地，所述烯丙基聚醚的数均分子量为0.08w～0.12w(例如0.09w、0.10w、0.11w等)，优选0.09w～0.11w。
烯丙基聚醚分子量过高，硅氧烷改性的烯丙基聚醚的亲水性过高，导致消泡效果变差；烯丙基聚醚分子量过低，乳化困难，在抑泡过程中容易分层，影响抑泡效果。
优选地，所述硅膏通过如下方法制备得到，将气相法白炭黑均匀分散在300～500cp 的二甲基硅油中，然后加入混合分散相，所述混合分散相包括1000～1200cp的二甲基硅油、羧甲基纤维素、800～1100cp的羟基硅油；
优选地，所述硅膏按照重量份数包括如下组分：
气相法白炭黑1
300～500cp的二甲基硅油 2.8～3.5
1000～1200cp的二甲基硅油 5.2～6.5
羧甲基纤维素 0.04～0.06
800～1100cp的羟基硅油 0.5～0.8。
首先选用低粘度的二甲基硅油对气相法白炭黑进行分散，使气相法白炭黑获得表面改性，提高了其分散性，然后分散在其他的分散相中，有效提高了气相法白炭黑的分散性能。
本发明目的之二是提供一种里氏木霉制备纤维素酶的泡沫处理方法，所述泡沫处理方法包括，按照如下顺序加入消泡剂：
在里氏木霉生产纤维素酶的过程中，与种子液一起加入发酵液0.25～0.35v％(例如0.27v％、0.30v％、0.33v％等)的第一消泡剂，然后进行发酵，并通过加入第二消泡剂对发酵体系的泡沫进行控制，具体为：
当发酵体系的泡沫体积大于等于发酵液起始体积的0.4～0.6倍(例如0.5倍)时，加入发酵液原始体积0.020v‰～0.030v‰(例如0.023v‰、0.025v‰、0.027v‰、0.028v‰等)的第二消泡剂；
同时，在里氏木霉生产纤维素酶的过程中，第一消泡剂和第二消泡剂的加入和占发酵液起始体积的0.8～1v％(例如0.85v％、0.90v％、0.95v％等)；
所述第一消泡剂为目的之一所述的消泡剂。
需要说明的是，对于发酵体系的第二消泡剂的添加时机以发酵体系的泡沫高低有关，泡沫体积超过预定值，则可以自动或人工加入发酵液原始体积0.020v‰～0.030v‰的第二消泡剂，所述预定值为发酵液起始体积的0.4～0.6倍。而所述泡沫体积的监测可以通过人工观察实现，也可以通过监测电极实现，优选通过在发酵罐顶部相应位置设置电极，当所述泡沫升高至电极处时，则启动第二消泡剂的添加程序。
在里氏木霉制备纤维素酶的发酵过程中，由于有蛋白质的存在，以及发酵过程中不断通入的气体等因素，导致发酵过程会产生大量的气泡，而过多的气泡阻碍了发酵体系的传质，影响了制备纤维素酶的酶活。
本申请在发酵体系混合初期加入抑泡性能优异的第一消泡剂，抑制发酵体系初期高温气体导致的气泡的生成，随着发酵的进行，尤其是在发酵进行24h以后，发酵速率逐步提升，泡沫也逐渐增多，本申请根据气泡的气泡量加入消泡性能优异的第二消泡剂，对发酵体系进行消泡。同时，发明人发现，第二消泡剂中存在的乳化剂含量相对较高，对于发酵体系的产酶更有利。
本申请通过分两个过程加入两种不同的消泡剂，能够在初期有效地抑制泡沫的生成，在后期加快泡沫的消除，提高酶活。第一消泡剂和第二消泡剂中的硅氧烷改性的烯丙基聚醚、乳化剂和硅膏，相互协同，在两个发酵的不同过程中起到抑泡和消泡的作用。
优选地，所述第二消泡剂包括如下组分：
35～45wt％(例如36wt％、38wt％、40wt％、42wt％、44wt％等)的硅氧烷改性的烯丙基聚醚、7～9wt％(例如7.3wt％、7.5wt％、7.7wt％、8.3wt％、8.5wt％、8.7wt％等) 的乳化剂、18～22wt％(例如19wt％、20wt％、21wt％等)硅膏和余量的水；
其中，所述硅氧烷改性的烯丙基聚醚使用含氢硅油和烯丙基聚醚进行硅氢加成获得，且所述含氢硅油和烯丙基聚醚按照碳碳双键和硅氢键数量比为1.2:1～1.3:1(例如1.21:1、1.22:1、1.24:1、1.26:1、1.27:1、1.28:1、1.29:1等)混合；所述烯丙基聚醚的 PO段和EO段的摩尔比为1:1～1.5:1(例如1.2:1、1.3:1、1.4:1等)；
所述乳化剂包括至少一种亲油表面活性剂和至少一种亲水表面活性剂；所述亲油表面活性剂中必须含有一种含量在70wt％以上(例如75wt％、78wt％、83wt％、88wt％、93wt％、96wt％、99wt％、100wt％等)的HLB为4～7(例如4.2、4.7、4.8、5.3、5.6、 5.8等)的亲油表面活性剂；所述亲水表面活性剂中必须含有含量在70wt％以上(例如75wt％、78wt％、83wt％、88wt％、93wt％、96wt％、99wt％、100wt％等)的Tween80；所述乳化剂的综合HLB值为10.5～12(例如10.8、11.5、11.7等)；
所述硅膏为气相法白炭黑的二甲基硅油分散液，且所述气相法白炭黑和二甲基硅油的比例为1:9～1:4(例如1:4.3、1:5.5、1:6.8、1:7.2、1:8.4、1:8.8等)。
在本发明提供的里氏木霉制备纤维素酶过程的泡沫处理方法中，考虑到里氏木霉制备纤维素酶过程中，前期发酵进行缓慢，泡沫生成大都是由蛋白质基底和通气行为导致的，加入抑泡效果明显的第一消泡剂能够降低发酵体系的泡沫基础，为后续发酵时泡沫生成提供一个较大的发泡空间；而后随着发酵的进行，泡沫也生成的越来越多，针对性的加入第二消泡剂，不但可以起到消泡的效果，同时可以补充发酵体系的乳化剂，提高发酵效率。
本申请提供的第二消泡剂，综合考量了消泡剂的组分种类和含量、包括硅氧烷改性的烯丙基聚醚内的含氢硅油和烯丙基聚醚硅氢加成的碳碳双键和硅氢键的比例、所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的比例、乳化剂中表面活性剂的选择和HLB值、以及硅膏的气相法白炭黑和二甲基硅油的比例等因素，以使所述消泡剂在消除已生成的泡沫方面有好的表现。
同样地，对于里氏木霉制备纤维素酶的过程，培养基具有多孔结构，泡沫生成后不容易消灭，本申请的第二消泡剂，在发酵体系发酵速率上升，泡沫生成量较高时加入，使得其能够对生成的泡沫表面的液层的液面出现张力差，破坏液层完整性，实现消泡。所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的摩尔比为1:1～1.5:1使得所述消泡剂具有良好的消泡性能，而10.5～12的HLB值的乳化剂更能有效将白炭黑和烷基改性烯丙基聚醚进行分散，将其分散在泡沫表层，使白炭黑或硅氧烷改性的烯丙基聚醚能够更多的刺破泡沫的气泡液面，消除已生成的泡沫。
优选地，所述HLB为4～7的亲油表面活性剂包括Span80、Arlacel80、Span60、Arlacel60中的任意一种或至少两种的组合，优选Span80。
优选地，所述含氢硅油的数均分子量为1.0w～1.5w(例如1.1w、1.2w、1.3w、1.4w等)，优选1.0w～1.2w。
优选地，所述烯丙基聚醚的数均分子量为0.08w～0.12w(例如0.09w、0.10w、0.11w等)，优选0.09w～0.11w。
优选地，所述硅膏通过如下方法制备得到，将气相法白炭黑均匀分散在300～500cp 的二甲基硅油中，然后加入混合分散相，所述混合分散相包括1000～1200cp的二甲基硅油、羧甲基纤维素、800～1100cp的羟基硅油；
优选地，所述硅膏按照重量份数包括如下组分：
气相法白炭黑1
300～500cp的二甲基硅油 1.8～2.5
1000～1200cp的二甲基硅油 2.2～6.5
羧甲基纤维素 0.01～0.02
800～1100cp的羟基硅油 0.3～0.6。
本申请目的之三还提供了一种促进里氏木霉产纤维素酶的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)制备非可溶性碳源：利用烯酸浸泡玉米秸秆后烘干粉碎，利用乙醇熏蒸后，加水高温高压进行反应，然后压榨、烘干、粉碎，得到非可溶性碳源；
(2)培养里氏木霉生产纤维素酶：S1在培养皿中接种孢子得到菌丝和孢子；S2 然后将得到的菌丝和孢子加入至种子罐中，向所述种子罐通气，常温培养并调整pH 在4.8～5.0，取样测吸光度达到7～7.2，得种子液；S3发酵罐灭菌后，维持通气，将S2中的种子液按照接种量5-15％加入发酵罐中，同时按照0.2-0.4v％的比例将权利要求1～4之一所述的消泡剂加入至种子罐中，发酵过程中通气量保持不变，根据发酵罐内溶氧变化来调控搅拌转速；
在步骤S3中，监测发酵罐中的气泡体积，当气泡体积超过发酵液起始体积的 0.4～0.6倍时，加入发酵体系原始体积0.020v‰～0.030v‰的第二消泡剂；
同时，在步骤S3中，第一消泡剂和第二消泡剂的加入和占发酵液起始体积的 0.8～1v％。
与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：
本申请针对性地对里氏木霉制备纤维素酶过程提出了一种分步进行的泡沫处理方法，针对泡沫产生初期，加入抑泡性能明显的消泡剂，对发酵体系的泡沫生成进行抑制，随着持续发酵，消泡剂不断被消耗，抑泡效果变差，泡沫增多，补充消泡效果明显的消泡剂，对生成的泡沫进行消除。
在本申请提供的消泡剂，综合考量了消泡剂的组分种类和含量、包括硅氧烷改性的烯丙基聚醚内的含氢硅油和烯丙基聚醚硅氢加成的碳碳双键和硅氢键的比例、所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的比例、乳化剂中表面活性剂的选择和HLB值、以及硅膏的气相法白炭黑和二甲基硅油的比例等因素，分别提供了具有抑泡性能优异或消泡性能优异的消泡剂，以在不同的时间点加入发酵体系，有效消除泡沫。
在本申请中，第二消泡剂的乳化剂添加量适当增加，可以替换部分补液中加入的吐温80，降低吐温80在投料中的量。
本申请提供的消泡剂，组分均对发酵体系的里氏木霉等组分友好，不会影响发酵效率。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
实施例1
一种里氏木霉制备纤维素酶过程的泡沫处理方法，发酵罐中的发酵液占发酵罐体积的 60v％，并在发酵罐顶部体积90％处设置电极，包括如下步骤：
(1)非可溶性碳源的制备：
A1：分别配制质量浓度为2％的H2SO4溶液和质量浓度为2％的富马酸溶液，将两种溶液等体积混合，得到质量浓度均为1％的含H2SO4和富马酸的稀酸溶液；
A2：将玉米秸秆放入步骤A1所得稀酸溶液中浸泡24h，拿出后烘干，将烘干后的秸秆粉碎至1-2cm的粗粒，在通风环境下将粗粒用75％的乙醇进行熏蒸4h；
A3：将步骤A2所得熏蒸后秸秆粗粒加入等体积水混合，投入汽爆罐中，加热至190℃，维持10min后瞬间释放压力，降温后取出压榨、烘干、粉碎，得到非可溶性碳源。
(2)培养里氏木霉生产纤维素酶
S1：用移液枪吸取里氏木霉种子液加到培养基平板(培养基组分为2％无水葡萄糖，4％产酶大量元素营养液，0.04％产酶微量元素浓缩液，0.2％玉米浆，2％吐温80，2％琼脂其余为水，其中，产酶大量元素浓缩液组分为7％磷酸二氢钾，9.8％硫酸铵，2.1％硫酸镁，其余为水，微量元素浓缩液组分为3.5％七水硫酸亚铁，1.09％一水硫酸锰，0.98％七水硫酸锌， 1.4％六水氯化钴)上。每个培养皿中接种孢子总数约为1×105个，培养皿置于霉菌培养箱中，培养温度30℃、湿度60％，培养时长5天，观察到绿色绒状孢子布满整个平板，向培养皿中加超纯水用玻璃棒刮下生长好的菌丝和孢子，得孢子液，用移液枪吸取到离心管或EP管中，4℃冰箱保存；
S2：种子培养基为1％的无水葡萄糖，1.4％种子大量元素浓缩液(14％磷酸二氢钾，9.8％硫酸铵，2.1％硫酸酶余量为水)，0.14％微量元素浓缩液(3.5％七水硫酸亚铁，1.09％一水硫酸锰，0.98％七水硫酸锌，1.4％六水氯化钴)，0.07％玉米浆粉，其余为水。种子罐投入培养基后121℃灭菌20min，灭菌后放入超净工作台，用移液枪吸取4℃保存的孢子液(由 S1中制备)，接种罐内，接种孢子浓度约1×109个/L，种子罐转速180rpm，通气量1vvm，常温培养24h，培养期间通过流加2M NaOH溶液控制种子培养pH在4.8～5.0，取样测吸光度达到7～7.2，得种子液，即可接入发酵罐进行后续发酵；
S3：产纤维素酶发酵基础料为3.5-4.5％非可溶性碳源(由步骤(1)制备)，1％葡萄糖，4％产酶大量元素营养盐浓缩液(7％磷酸二氢钾，9.8％硫酸铵，2.1％硫酸镁，其余为水)，0.04％产酶微量元素浓缩液(3.5％七水硫酸亚铁，1.09％一水硫酸锰，0.98％七水硫酸锌， 1.4％六水氯化钴)，0.2％玉米浆粉；发酵罐投料完毕后高温蒸汽121℃灭菌20min，灭菌完成后设置通气量1.0vvm，将步骤S2中的种子液接入发酵罐中，接种量为10％，同时加入，发酵液0.30v％的第一消泡剂，发酵过程中通气量保持不变，根据发酵罐内溶氧变化来调控搅拌转速，搅拌转速调节范围在180～200rpm/min，控制发酵液溶氧在1.2～2.5mg/L，期间通过流加10％的氨水控制发酵液的pH值不低于4.0，发酵第30h检测发现发酵液溶氧低于1.5mg/mL且还有继续降低趋势，开始流加复合型诱导碳源，30～36h匀速流加12％诱导碳源，36～48h匀速流加16％诱导碳源，48～60h匀速流加20％诱导碳源，60～72h 匀速流加24％诱导碳源，72～84h匀速流加16％诱导碳源，84～96h匀速流加12％诱导碳源，将发酵液过滤离心；并且，当发酵体系的泡沫高度到达电极处，启动第二消泡剂的加入，添加发酵液原始体积0.025v‰的第二消泡剂，泡沫消除后，随着发酵继续进行，泡沫再次升高至电极处，并再次启动第二消泡剂的加入，再次添加发酵液原始体积0.025v‰的第二消泡剂，多次重复直至反应完全。
所述复合型诱导碳源具体制备方法如下：
B1：将20％(w/v)经蒸汽爆破预处理的秸秆材料溶解于里氏木霉不加复合型诱导碳源发酵的粗酶液中，50℃，pH 4.8，180rpm条件下反应24h，得到秸秆木质纤维素酶解液。
B2：使用50％(w/v)的葡萄糖溶液，添加20-25CBU/g的β-葡萄糖苷酶，60℃，pH4.8，180rpm的条件下反应24h，得到葡萄糖酶解液。
B3：秸秆木质素酶解液与葡萄糖酶解液按照3：7的质量比混合，得到复合型诱导碳源。
第一消泡剂包括如下组分：
40wt％的硅氧烷改性的烯丙基聚醚、3.5wt％的乳化剂、20wt％硅膏和余量的水；
其中，所述硅氧烷改性的烯丙基聚醚使用含氢硅油和烯丙基聚醚进行硅氢加成获得，且所述含氢硅油和烯丙基聚醚按照碳碳双键和硅氢键数量比为1.25:1混合；所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的摩尔比为2.5:1；
所述乳化剂为14.6wt％的Arlacel 40和37.2wt％的Span80和47.2％的Tween80的混合，所述乳化剂HLB值为9.7；
所述硅膏通过如下方法制备得到，将1重量份气相法白炭黑均匀分散在300～500cp 的3.0重量份的二甲基硅油中，然后加入混合分散相，所述混合分散相包括6重量份的1000～1200cp的二甲基硅油、0.05重量份的羧甲基纤维素、0.6重量份的800～1100cp 的羟基硅油；
第二消泡剂包括如下组分：
40wt％的硅氧烷改性的烯丙基聚醚、8wt％的乳化剂、20wt％硅膏和余量的水；
其中，所述硅氧烷改性的烯丙基聚醚使用含氢硅油和烯丙基聚醚进行硅氢加成获得，且所述含氢硅油和烯丙基聚醚按照碳碳双键和硅氢键数量比为1.25:1混合；所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的摩尔比为1.3:1；
所述乳化剂为7wt％的Arlacel 40和27wt％的Span80和66％的Tween80的混合，所述乳化剂HLB值为11.5；
所述硅膏通过如下方法制备得到，将1重量份气相法白炭黑均匀分散在300～500cp 的3.0重量份的二甲基硅油中，然后加入混合分散相，所述混合分散相包括6量份的1000～1200cp的二甲基硅油、0.01重量份的羧甲基纤维素、0.4重量份的800～1100cp 的羟基硅油。
实施例2
其他条件与实施例1相同，与实施例1的区别在于
在步骤S3中，与种子液一起加入发酵液0.25v％的第一消泡剂，然后进行发酵，当发酵体系的泡沫高度到达电极处，启动第二消泡剂的加入，添加发酵液原始体积0.020v‰的第二消泡剂，泡沫消除后，随着发酵继续进行，泡沫再次升高至电极处，并再次启动第二消泡剂的加入，再次添加发酵液原始体积0.020v‰的第二消泡剂，多次重复直至反应完全。
实施例3
其他条件与实施例1相同，与实施例1的区别在于：
在步骤S3中，与种子液一起加入发酵液0.35v％的第一消泡剂，然后进行发酵，当发酵体系的泡沫高度到达电极处，启动第二消泡剂的加入，添加发酵液原始体积0.030v‰的第二消泡剂，泡沫消除后，随着发酵继续进行，泡沫再次升高至电极处，并再次启动第二消泡剂的加入，再次添加发酵液原始体积0.030v‰的第二消泡剂，多次重复直至反应完全。
对比例1
其他条件与实施例1相同，与实施例1的区别在于：
从产生泡沫开始计时，在10h至产酶高峰期内，每3.5h加入一次发酵体系重量0.15wt％的第一消泡剂和第二消泡剂的混合物(混合质量比为0.1:1)。
对比例2
以下实验作为对比例2，为空白试验。
一种里氏木霉制备纤维素酶过程的泡沫处理方法，发酵罐中的发酵液占发酵罐体积的 60v％，并在发酵罐顶部体积90％处设置电极，包括如下步骤：
(1)非可溶性碳源的制备：
A1：分别配制质量浓度为2％的H2SO4溶液和质量浓度为2％的富马酸溶液，将两种溶液等体积混合，得到质量浓度均为1％的含H2SO4和富马酸的稀酸溶液；
A2：将玉米秸秆放入步骤A1所得稀酸溶液中浸泡24h，拿出后烘干，将烘干后的秸秆粉碎至1-2cm的粗粒，在通风环境下将粗粒用75％的乙醇进行熏蒸4h；
A3：将步骤A2所得熏蒸后秸秆粗粒加入等体积水混合，投入汽爆罐中，加热至190℃，维持10min后瞬间释放压力，降温后取出压榨、烘干、粉碎，得到非可溶性碳源。
(2)培养里氏木霉生产纤维素酶
S1：用移液枪吸取里氏木霉种子液加到培养基平板(培养基组分为2％无水葡萄糖，4％产酶大量元素营养液，0.04％产酶微量元素浓缩液，0.2％玉米浆，2％吐温80，2％琼脂其余为水，其中，产酶大量元素浓缩液组分为7％磷酸二氢钾，9.8％硫酸铵，2.1％硫酸镁，其余为水，微量元素浓缩液组分为3.5％七水硫酸亚铁，1.09％一水硫酸锰，0.98％七水硫酸锌， 1.4％六水氯化钴)上；每个培养皿中接种孢子总数约为1×105个，培养皿置于霉菌培养箱中，培养温度30℃、湿度60％，培养时长5天，观察到绿色绒状孢子布满整个平板，向培养皿中加超纯水用玻璃棒刮下生长好的菌丝和孢子，得孢子液，用移液枪吸取到离心管或EP管中，4℃冰箱保存；
S2：种子培养基为1％的无水葡萄糖，1.4％种子大量元素浓缩液(14％磷酸二氢钾，9.8％硫酸铵，2.1％硫酸酶余量为水)，0.14％微量元素浓缩液(3.5％七水硫酸亚铁，1.09％一水硫酸锰，0.98％七水硫酸锌，1.4％六水氯化钴)，0.07％玉米浆粉，其余为水。种子罐投入培养基后121℃灭菌20min，灭菌后放入超净工作台，用移液枪吸取4℃保存的孢子液(由 S1中制备)，接种罐内，接种孢子浓度约1×109个/L，种子罐转速180rpm，通气量1vvm，常温培养24h，培养期间通过流加2M NaOH溶液控制种子培养pH在4.8～5.0，取样测吸光度达到7～7.2，得种子液，即可接入发酵罐进行后续发酵；
S3：产纤维素酶发酵基础料为3.5-4.5％非可溶性碳源(由步骤(1)制备)，1％葡萄糖，4％产酶大量元素营养盐浓缩液(7％磷酸二氢钾，9.8％硫酸铵，2.1％硫酸镁，其余为水)， 0.04％产酶微量元素浓缩液(3.5％七水硫酸亚铁，1.09％一水硫酸锰，0.98％七水硫酸锌， 1.4％六水氯化钴)，0.2％玉米浆粉；发酵罐投料完毕后高温蒸汽121℃灭菌20min，灭菌完成后设置通气量1.0vvm，将步骤S2中的种子液接入发酵罐中，接种量为10％，发酵过程中通气量保持不变，根据发酵罐内溶氧变化来调控搅拌转速，搅拌转速调节范围在180～200rpm/min，控制发酵液溶氧在1.2～2.5mg/L，期间通过流加10％的氨水控制发酵液的 pH值不低于4.0，发酵第30h检测发现发酵液溶氧低于1.5mg/mL且还有继续降低趋势，开始流加复合型诱导碳源，30～36h匀速流加12％诱导碳源，36～48h匀速流加16％诱导碳源，48～60h匀速流加20％诱导碳源，60～72h匀速流加24％诱导碳源，72～84h匀速流加16％诱导碳源，84～96h匀速流加12％诱导碳源，将发酵液过滤离心。
所述复合型诱导碳源具体制备方法如下：
B1：将20％(w/v)经蒸汽爆破预处理的秸秆材料溶解于里氏木霉不加复合型诱导碳源发酵的粗酶液中，50℃，pH 4.8，180rpm条件下反应24h，得到秸秆木质纤维素酶解液。
B2：使用50％(w/v)的葡萄糖溶液，添加20-25CBU/g的β-葡萄糖苷酶，60℃，pH4.8， 180rpm的条件下反应24h，得到葡萄糖酶解液。
B3：秸秆木质素酶解液与葡萄糖酶解液按照3：7的质量比混合，得到复合型诱导碳源。
实施例4
其他条件与实施例1相同，不同之处在于：
在步骤S3中，与种子液一起加入发酵液0.30v％的第一消泡剂，然后进行发酵，当发酵体系的泡沫高度到达电极处，启动第二消泡剂的加入，添加发酵液原始体积0.025v‰的第二消泡剂，泡沫消除后，随着发酵继续进行，泡沫再次升高至电极处，并再次启动第二消泡剂的加入，再次添加发酵液原始体积0.025v‰的第二消泡剂，多次重复直至反应完全。
第一消泡剂包括如下组分：
35wt％的硅氧烷改性的烯丙基聚醚、3wt％的乳化剂、22wt％硅膏和余量的水；
其中，所述硅氧烷改性的烯丙基聚醚使用含氢硅油和烯丙基聚醚进行硅氢加成获得，且所述含氢硅油和烯丙基聚醚按照碳碳双键和硅氢键数量比为1.3:1混合；所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的摩尔比为3.0:1；
所述乳化剂为13wt％的Arlacel 40和46wt％的Span80和41％的Tween80的混合，所述乳化剂HLB值为9.0；
所述硅膏通过如下方法制备得到，将1重量份气相法白炭黑均匀分散在300～500cp 的3.5重量份的二甲基硅油中，然后加入混合分散相，所述混合分散相包括5.2重量份的1000～1200cp的二甲基硅油、0.06重量份的羧甲基纤维素、0.8重量份的800～1100cp的羟基硅油；
第二消泡剂包括如下组分：
35wt％的硅氧烷改性的烯丙基聚醚、7wt％的乳化剂、22wt％硅膏和余量的水；
其中，所述硅氧烷改性的烯丙基聚醚使用含氢硅油和烯丙基聚醚进行硅氢加成获得，且所述含氢硅油和烯丙基聚醚按照碳碳双键和硅氢键数量比为1.2:1混合；所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的摩尔比为1.5:1；
所述乳化剂为4wt％的Arlacel 40和26wt％的Span80和70％的Tween80的混合，所述乳化剂HLB值为11.9；所述硅膏通过如下方法制备得到，将1重量份气相法白炭黑均匀分散在300～500cp的1.8重量份的二甲基硅油中，然后加入混合分散相，所述混合分散相包括6.5量份的1000～1200cp的二甲基硅油、0.01重量份的羧甲基纤维素、 0.3重量份的800～1100cp的羟基硅油。
实施例5
其他条件与实施例1相同，不同之处在于：
在步骤S3中，与种子液一起加入发酵液0.30v％的第一消泡剂，然后进行发酵，当发酵体系的泡沫高度到达电极处，启动第二消泡剂的加入，添加发酵液原始体积0.025v‰的第二消泡剂，泡沫消除后，随着发酵继续进行，泡沫再次升高至电极处，并再次启动第二消泡剂的加入，再次添加发酵液原始体积0.025v‰的第二消泡剂，多次重复直至反应完全。
第一消泡剂包括如下组分：
45wt％的硅氧烷改性的烯丙基聚醚、4wt％的乳化剂、18wt％硅膏和余量的水；
其中，所述硅氧烷改性的烯丙基聚醚使用含氢硅油和烯丙基聚醚进行硅氢加成获得，且所述含氢硅油和烯丙基聚醚按照碳碳双键和硅氢键数量比为1.2:1混合；所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的摩尔比为2.0:1；
所述乳化剂为14.6wt％的Arlacel 40和35.4wt％的Span80和50％的Tween80的混合，所述乳化剂HLB值为10；
所述硅膏通过如下方法制备得到，将1重量份气相法白炭黑均匀分散在300～500cp 的2.8重量份的二甲基硅油中，然后加入混合分散相，所述混合分散相包括6.5重量份的1000～1200cp的二甲基硅油、0.04重量份的羧甲基纤维素、0.5重量份的800～1100cp的羟基硅油；
第二消泡剂包括如下组分：
45wt％的硅氧烷改性的烯丙基聚醚、9wt％的乳化剂、18wt％硅膏和余量的水；
其中，所述硅氧烷改性的烯丙基聚醚使用含氢硅油和烯丙基聚醚进行硅氢加成获得，且所述含氢硅油和烯丙基聚醚按照碳碳双键和硅氢键数量比为1.3:1混合；所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的摩尔比为1.1:1；
所述乳化剂为14wt％的Arlacel 40和31wt％的Span80和55％的Tween80的混合，所述乳化剂HLB值为10.5；所述硅膏通过如下方法制备得到，将1重量份气相法白炭黑均匀分散在300～500cp的2.5重量份的二甲基硅油中，然后加入混合分散相，所述混合分散相包括2.2量份的1000～1200cp的二甲基硅油、0.02重量份的羧甲基纤维素、 0.6重量份的800～1100cp的羟基硅油。
对比例3
其他条件与实施例1相同，与实施例1的区别在于：
第一消泡剂为：
所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的摩尔比为1.5:1，所述乳化剂为13wt％的Arlacel40和52wt％的Span80和35％的Tween80的混合，所述乳化剂HLB值为8.4；所述硅膏通过如下方法制备得到，将1重量份气相法白炭黑均匀分散在300～500cp的3重量份的二甲基硅油中，然后加入混合分散相，所述混合分散相包括4量份的1000～1200cp 的二甲基硅油、0.02重量份的羧甲基纤维素、0.6重量份的800～1100cp的羟基硅油。
对比例4
其他条件与实施例1相同，与实施例1的区别在于：
第一消泡剂为：
所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的摩尔比为3.3:1，所述乳化剂为14wt％的Arlacel40和31wt％的Span80和55％的Tween80的混合，所述乳化剂HLB值为10.5；所述硅膏通过如下方法制备得到，将1重量份气相法白炭黑均匀分散在300～500cp的5重量份的二甲基硅油中，然后加入混合分散相，所述混合分散相包括6量份的 1000～1200cp的二甲基硅油、0.02重量份的羧甲基纤维素、0.6重量份的800～1100cp 的羟基硅油。
实施例6
其他条件与实施例1相同，与实施例1的区别在于：
第二消泡剂为：
所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的摩尔比为0.5:1，所述乳化剂为14.6wt％的Arlacel 40和35.4wt％的Span80和50％的Tween80的混合，所述乳化剂HLB值为10.0；所述硅膏通过如下方法制备得到，将1重量份气相法白炭黑均匀分散在300～500cp的 1重量份的二甲基硅油中，然后加入混合分散相，所述混合分散相包括2量份的 1000～1200cp的二甲基硅油、0.02重量份的羧甲基纤维素、0.6重量份的800～1100cp 的羟基硅油。
实施例7
其他条件与实施例1相同，与实施例1的区别在于：
第二消泡剂为：
所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的摩尔比为2:1，所述乳化剂为5wt％的Arlacel 40和15wt％的Span80和80％的Tween80的混合，所述乳化剂HLB值为13.0；所述硅膏通过如下方法制备得到，将1重量份气相法白炭黑均匀分散在300～500cp的5重量份的二甲基硅油中，然后加入混合分散相，所述混合分散相包括5量份的1000～1200cp 的二甲基硅油、0.02重量份的羧甲基纤维素、0.6重量份的800～1100cp的羟基硅油。
性能测试：
(1)消泡剂的抑菌性
用摇瓶培养里氏木霉菌，在种子培养基中添加第一消泡剂0.5％、第二消泡剂0.5％，以及第一消泡剂和第二消泡剂按照重量比1:1混合的消泡剂0.5％，灭菌接种后，30℃培养24h检测孢子数量，记为n1，以不加消泡剂的摇瓶为对照组，其孢子数记为n0，计算消泡剂抑制效率E％＝(n0-n1)/n0×100％；抑制效率越低，表明消泡剂对里氏木霉菌生物量的影响越小。
(2)酶活测定
以滤纸酶活力(FPA)表示纤维素酶的总活力，测试方法按照IUPAC推荐方法进行。
(3)消泡剂添加总量：以发酵液初始体积为100v％计，计算第一消泡剂和第二消泡剂的添加总量。
测试结果见表1.
表1
Figure RE-GDA0003254163100000161
Figure RE-GDA0003254163100000171
从表1可以看出，在产酶的起始起泡阶段和后续阶段，添加具有消泡和抑泡不同效果的消泡剂，能够有效的对泡沫进行抑制，提高酶的产率。此外从对比例1可以看出，将两种消泡剂混合后，抑菌性有所增加，对里氏木霉不友好，降低了纤维素酶的产率，从而导致酶活的测试数据降低。从实施例和对比例2(对照实验)可以看出，两个步骤加入本申请中的消泡剂所得纤维素酶的酶活测试数据提高，这可能是因为能够有效消除泡沫，降低了传质壁垒，提高了纤维素酶的生成效率。从对比例3～4可以看出，当选择本申请限定的范围以外的消泡剂时，其消泡剂用量明显增加，这说明其消泡抑泡效果变差，需要不停的加入消泡剂，而其酶活测试数据也变低，这可能是因为消泡剂的加入量过大，导致了发酵环境变化，影响了纤维素酶的产率。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种里氏木霉制备纤维素酶中使用的消泡剂，其特征在于，所述消泡剂包括如下组分：
35～45wt％的硅氧烷改性的烯丙基聚醚、3～4wt％的乳化剂、18～22wt％硅膏和余量的水；
其中，所述硅氧烷改性的烯丙基聚醚使用含氢硅油和烯丙基聚醚进行硅氢加成获得，且所述含氢硅油和烯丙基聚醚按照碳碳双键和硅氢键数量比为1.2:1～1.3:1混合；所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的摩尔比为2:1～3:1；
所述乳化剂包括至少一种亲油表面活性剂和至少一种亲水表面活性剂；所述亲油表面活性剂中必须含有一种含量在70wt％以上的HLB为4～7的亲油表面活性剂；所述亲水表面活性剂中必须含有一种含量在70wt％以上的HLB为13～16的亲水表面活性剂；所述乳化剂的综合HLB值为9～10；
所述硅膏为气相法白炭黑的二甲基硅油分散液，且所述气相法白炭黑和二甲基硅油的比例为1:10～1:8。
2.如权利要求1所述的消泡剂，其特征在于，所述HLB为4～7的亲油表面活性剂包括Span80、Arlacel80、Span60、Arlacel60中的任意一种或至少两种的组合，优选Span80；
优选地，所述HLB为13～16的亲水表面活性剂包括Tween21、Atlas、Tween60、Tween80、Tween40中的任意一种或至少两种的组合，优选Tween80。
3.如权利要求1或2所述的消泡剂，其特征在于，所述含氢硅油的数均分子量为0.8w～1.5w，优选0.9w～1.1w；
优选地，所述烯丙基聚醚的数均分子量为0.08w～0.12w，优选0.09w～0.11w。
4.如权利要求1～3之一所述的消泡剂，其特征在于，所述硅膏通过如下方法制备得到，将气相法白炭黑均匀分散在300～500cp的二甲基硅油中，然后加入混合分散相，所述混合分散相包括1000～1200cp的二甲基硅油、羧甲基纤维素、800～1100cp的羟基硅油；
优选地，所述硅膏按照重量份数包括如下组分：
气相法白炭黑1
300～500cp的二甲基硅油2.8～3.5
1000～1200cp的二甲基硅油5.2～6.5
羧甲基纤维素0.04～0.06
800～1100cp的羟基硅油0.5～0.8。
5.一种里氏木霉制备纤维素酶过程的泡沫处理方法，其特征在于，所述泡沫处理方法包括，按照如下顺序加入消泡剂：
在里氏木霉生产纤维素酶的过程中，与种子液一起加入发酵液0.25～0.35v％的第一消泡剂，然后进行发酵，并通过加入第二消泡剂对发酵体系的泡沫进行控制，具体为：
当发酵体系的泡沫体积大于等于发酵液起始体积的0.4～0.6倍时，加入发酵液原始体积0.020v‰～0.030v‰的第二消泡剂；
同时，在里氏木霉生产纤维素酶的过程中，第一消泡剂和第二消泡剂的加入和占发酵液起始体积的0.8～1v％；
所述第一消泡剂为权利要求1～4之一所述的消泡剂。
6.如权利要求5所述的泡沫处理方法，其特征在于，所述第二消泡剂包括如下组分：
35～45wt％的硅氧烷改性的烯丙基聚醚、7～9wt％的乳化剂、18～22wt％硅膏和余量的水；
其中，所述硅氧烷改性的烯丙基聚醚使用含氢硅油和烯丙基聚醚进行硅氢加成获得，且所述含氢硅油和烯丙基聚醚按照碳碳双键和硅氢键数量比为1.2:1～1.3:1混合；所述烯丙基聚醚的PO段和EO段的摩尔比为1:1～1.5:1；
所述乳化剂包括至少一种亲油表面活性剂和至少一种亲水表面活性剂；所述亲油表面活性剂中必须含有一种含量在70wt％以上的HLB为4～7的亲油表面活性剂；所述亲水表面活性剂中必须含有含量在70wt％以上的Tween80；所述乳化剂的综合HLB值为10.5～12；
所述硅膏为气相法白炭黑的二甲基硅油分散液，且所述气相法白炭黑和二甲基硅油的比例为1:9～1:4。
7.如权利要求6所述的泡沫处理方法，其特征在于，所述HLB为4～7的亲油表面活性剂包括Span80、Arlacel80、Span60、Arlacel60中的任意一种或至少两种的组合，优选Span80。
8.如权利要求6或7所述的泡沫处理方法，其特征在于，所述含氢硅油的数均分子量为1.0w～1.5w，优选1.0w～1.2w；
优选地，所述烯丙基聚醚的数均分子量为0.08w～0.12w，优选0.09w～0.11w。
9.如权利要求6～8之一所述的泡沫处理方法，其特征在于，所述硅膏通过如下方法制备得到，将气相法白炭黑均匀分散在300～500cp的二甲基硅油中，然后加入混合分散相，所述混合分散相包括1000～1200cp的二甲基硅油、羧甲基纤维素、800～1100cp的羟基硅油；
优选地，所述硅膏按照重量份数包括如下组分：
气相法白炭黑1
300～500cp的二甲基硅油1.8～2.5
1000～1200cp的二甲基硅油2.2～6.5
羧甲基纤维素0.01～0.02
800～1100cp的羟基硅油0.3～0.6。
10.一种促进里氏木霉产纤维素酶的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)制备非可溶性碳源：利用烯酸浸泡玉米秸秆后烘干粉碎，利用乙醇熏蒸后，加水高温高压进行反应，然后压榨、烘干、粉碎，得到非可溶性碳源；
(2)培养里氏木霉生产纤维素酶：S1在培养皿中接种孢子得到菌丝和孢子；S2然后将得到的菌丝和孢子加入至种子罐中，向所述种子罐通气，常温培养并调整pH在4.8～5.0，取样测吸光度达到7～7.2，得种子液；S3发酵罐灭菌后，维持通气，将S2中的种子液按照接种量5-15％加入发酵罐中，同时按照0.-2-0.4v％的比例将权利要求1～4之一所述的消泡剂加入至种子罐中，发酵过程中通气量保持不变，根据发酵罐内溶氧变化来调控搅拌转速；
在步骤S3中，监测发酵罐中的气泡体积，当气泡体积超过发酵液起始体积的0.4～0.6倍时，加入发酵体系原始体积0.020v‰～0.030v‰的第二消泡剂；
同时，在步骤S3中，第一消泡剂和第二消泡剂的加入和占发酵液起始体积的0.8～1v％。
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