CN113332199A - 一种具有抗衰老改善皮肤微循环的茶叶发酵提取液及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗衰老改善皮肤微循环的茶叶发酵提取液及应用。其中茶叶为四川宝兴的老川茶，发酵菌株为6株冠突散囊菌，分别为来自云南普洱、广州小青柑、广西六堡茶、安化黑茶、正山小种，大红袍等六种后发酵茶中筛选得到。本申请利用冠突散囊菌的孢子和老川茶粉末进行混合发酵120H，通过水提取方式，获得提取液。本发明提供的茶叶发酵提取液能够明显的提高皮肤细胞的胶原蛋白和透明质酸的合成，且加入茶叶发酵提取液的细胞组，β‑半乳糖苷酶活性显著降低。同时对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞分泌iNOS和COX‑2有很好的抑制作用，因此对改善皮肤的衰老及微循环非常有益。

Description

一种具有抗衰老改善皮肤微循环的茶叶发酵提取液及应用

技术领域

本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种具有抗衰老改善皮肤微循环的茶叶发酵提取液及应用。

背景技术

老川茶作为巴蜀地区(茶树起源地)的原生品种，继承和保留了众多的古茶树基因。对环境的适应性较强，在寒冷的高山地区仍然能顽强生长。老川茶进入秋冬后，休眠期长，发芽晚，产量低，积累的内含物质丰富，氨基酸含量偏高。具有苦涩味较轻，口感醇厚等特点。

冠突散囊菌(Eurotium cristatum EC)，是后发酵茶在特定温湿度条件下，通过“发花”工艺长成的自然益生菌体，俗称“金花”，具有较好的抗氧化、抗菌和抗肿瘤等功能。目前已有报道，发酵茶中有益菌冠突散囊菌产生多酚氧化酶、果胶酶、纤维素酶、蛋白酶等胞外酶，催化茶叶中物质的氧化、聚合、降解、转化。吸收茶中的茶多酚后可能分泌产生了3种生物活性更强的成分：以其糖苷化、硫酸化及甲基化等儿茶素的衍生物。

截至目前利用发酵茶制备提取液在化妆品中的应用非常少，主要是因为，一方面发酵茶叶成本过高，市售的后发酵茶动辄4,5百一斤，这样对原料的成本控制不利。另一方面，每一种发酵茶叶的功效差异很大，很难将几种茶叶共同提取。最后就是提取工艺方面，大多数的提取工艺都是简单的通过水提或者醇提获得提取液，这样对提取液的稳定性造成很大的影响，容易产生沉淀，变色，浑浊等现象出现。不论是哪种情形，都限制了它在化妆品领域中的广泛使用。

发明内容

为了解决现有技术和应用中存在的问题，本申请利用筛选得到的6种冠突散囊菌的孢子悬液去发酵老川茶，获得发酵茶液。该发酵茶叶提取液具有稳定，且适于添加至化妆品中。

本发明一方面提供了一种抗衰老改善皮肤微循环的茶叶发酵提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)选择老川茶，进行粉碎处理，加入纯水后通入121℃蒸汽灭菌，然后降至室温，接入冠突散囊菌的孢子悬液；恒温搅拌条件下发酵；之后通入蒸汽121℃灭菌，降至室温过滤；

2)将滤液加热升温至40℃～42℃,然后，加入酸性絮凝剂保温搅拌1小时；搅拌保温结束后，静置1小时；

3)加入红色硅藻土搅拌过滤；

4)依次用0.45um滤膜、10000D滤膜超滤，得到滤液；

5)将滤液减压浓缩得到浓缩液；

6)将浓缩液稀释得到所述茶叶发酵提取液；

所述的冠突散囊菌的孢子悬液是GenBank编号为MW512850,MW512849,MW494668,MW512851,MW512854,MW512855的六种冠突散囊菌的混合孢子悬液。

作为优选，所述冠突散囊菌的孢子悬液的接入量为纯水体积的1％，孢子悬液的质量浓度为10％。

作为优选，所述步骤1)中纯水的加入量为茶叶质量的8-10倍；所述恒温搅拌条件下发酵具体为恒温28℃，搅拌转速为120转/分钟，发酵时间为120h。

作为优选，所述步骤2)中酸性絮凝剂的质量浓度为1％浓度，加入量为步骤1)中所得滤液体积量的2％；所述酸性絮凝剂包括：壳聚糖，聚合硅酸，聚合氯化铝。

作为优选，在步骤3)中红色硅藻土，过滤方法为使用滤布和中速滤纸的板框过滤。

作为优选，所述步骤4)中超滤压力控制在0.4MPa以下。

作为优选，所述步骤3)中减压浓缩的温度为：65℃以下，浓缩真空度保持在－0.075Mpa～-0.085Mpa。

作为优选，述步骤6)中先升温至80℃，再加入溶剂所述溶剂的加入量为浓缩液体积的1％。

本发明另一方面还提供了一种茶叶发酵提取液，所述茶叶发酵提取液是由上述任意一项所述的制备方法得到。

本发明还提供了一种茶叶发酵提取液的应用，即将所述发酵提取液应用于化妆品中。

调研显示冠突散囊菌为后发酵茶中最有益的菌种。因此本申请从中国六种知名的后发酵茶中(云南普洱、广州小青柑、广西六堡茶、安化黑茶、正山小种，大红袍)，分别筛选到一种冠突散囊菌分别命名为Eurotium cristatum CM1,CM2,CM3,CM4,CM5,CM6，其中GenBank号分别MW512850,MW512849,MW494668,MW512851,MW512854,MW512855。与此同时，本申请的发明人通过混合发酵的方式，对老川茶进行液体发酵，获得发酵茶液。在制备工艺上，加入絮凝剂，对细微的颗粒进行吸附沉降，去除固体不溶物。其次，加入红色硅藻土，对提取液进一步进行物理吸附，解决提取液中有沉淀析出的现象。最后利用超滤膜进行渗透，去除提取液中的鞣质等不稳定成分，解决提取液的变色和浑浊现象。

同时本发明发现茶叶发酵提取液能够明显的提高皮肤细胞的I型胶原蛋白和透明质酸的合成，与空白对照组相比，0.1％的提取液对成纤维细胞HSFI型胶原蛋白的分泌增加了12.3％透明质酸增加了9.5％，且加入茶叶发酵提取液的细胞组，β-半乳糖苷酶活性显著降低。同时对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞分泌iNOS和COX-2有很好的抑制作用，因此对改善皮肤的衰老及微循环非常有益。可作为功效添加剂加入皮肤外用剂，如护肤品和化妆品中使用。

附图说明

图1为茶叶发酵提取液对成纤维细胞的I型胶原蛋白分泌的影响；

图2为茶叶发酵提取液对成纤维细胞的透明质酸分泌的影响；

图3为茶叶发酵提取液对β-半乳糖苷酶活性影响；

图4为茶叶发酵提取液对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7炎症介质iNOS分泌影响；

图5为茶叶发酵提取液对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7炎症介质COX-2分泌影响。

具体实施方式

以下将通过实施例来详细说明本申请的实施方式，借此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本申请中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备，均来自市售产品。本申请中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1：冠突散囊菌的筛选

冠突散囊菌的筛选方法，该方法包括以下步骤：

(1)茶叶筛选：选择云南普洱、广州小青柑、广西六堡茶、安化黑茶、正山小种，大红袍等六种后发酵茶，分别从产地获得保存1年左右的茶叶；

(2)菌株筛选：准备灭菌好的生理盐水，以及含有氨苄青霉素的PDA固体平板。将获得的各种茶叶利用生理盐水不断洗涤，取洗涤液在PDA平板上涂布，并置于28℃培养箱中，培养3-5天，挑取单个菌丝接种在含有氨苄青霉素的PDA固体平板，进行分离纯化培养3-5天。

(3)菌株鉴定：将纯化好的菌丝，接种在PDB液体培养基中28℃培养箱中，培养3-5天。液氮冻干研磨，利用真菌基因组DNA快速抽屉试剂盒提取各单菌株的DNA。利用18ITS引物，扩增片段后，进行测序，并在NCBI网站BLAST进行菌株鉴定，将鉴定为冠突散囊菌的菌株进行菌株编号，分别为CM1,CM2,CM3,CM4,CM5,CM6。

上述编号为Eurotium cristatum CM1,CM2,CM3,CM4,CM5,CM6的菌株的GenBank号分别为MW512850，MW512849，MW494668，MW512851，MW512854，MW51285。

实施例2：发酵提取工艺

(1)茶叶发酵

选择来自四川宝兴的老川茶(也可使用其他符合要求的老川茶：天然有机，水分小于10％，重金属小于20ppm)，进行粉碎处理，加入纯水的质量是老川茶的9倍，121℃灭菌20min，灭菌后，利用冷水降温至室温，接入纯水体积的1％的孢子悬液，孢子悬液中6种冠突散囊菌的孢子浓度为(10％)。28℃，120转/分钟，发酵120H。通入蒸汽，121℃灭菌20min，利用冷水降温至室温。料液过滤(可过80目～100目不锈钢或尼龙滤网)，滤液转移至中转储罐待板框过滤。

(2)发酵液絮凝

滤液进入絮凝搅拌罐，温度加热升温至40℃～42℃,然后，向其中加入事先溶解好1％浓度的酸性絮凝剂，酸性絮凝剂(壳聚糖)的加入量为上述“滤液”体积量的2％(v/v).保温搅拌1小时。搅拌保温结束后，静置1小时。

(3)微滤

将底部沉淀出的料液放出，然后开启搅拌，加入5kg红色硅藻土，搅拌10分钟，使用板框(滤布+中速滤纸)过滤，滤液为：酒红色透明、澄清溶液。

(4)超滤处理

微滤液过0.45um滤膜，滤液过10000D滤膜，压力控制在0.4MPa以下；中间再加纯水冲洗，收集滤液为黄色透明、澄清溶液。

(5)浓缩

滤液利用单效浓缩器进行减压浓缩，浓缩控制温度为：65℃以下，浓缩真空度保持在－0.075Mpa～-0.085Mpa.，放料得到浓缩液。

(6)复配

浓缩液进入复配罐，升温至80℃，加入溶剂配置成的溶液，所述溶剂的加入量为浓缩液体积的1％，进行灌装。

实施例3：茶叶发酵提取液有效促进成纤维细胞的I型胶原蛋白的分泌

检测茶叶发酵提取液对人成纤维细胞的I型胶原蛋白的分泌影响，以评价其抗衰老功效。

在无菌操作台中将培养皿中生长至80～90％的人成纤维细胞HSF收集计数。根据计数结果，按照1.0～5.0×10⁴cells/mL接种1ml至12孔细胞培养板中，空白孔加入100μLPBS，样品孔加入不同浓度的样品，每个浓度设三个平行，培养24h。将生长良好的细胞上清液收集在无菌管中，待测。检测方法按照I型胶原蛋白ELISA试剂盒的说明书操作。。

将EGF(人表皮生长因子)溶液、茶叶发酵提取液按照下述方法配制，均用0.22μm滤膜过滤除菌，备用。

空白对照组：110μL PBS溶液；

EGF组：1μg/mL EGF添加10μL，PBS溶液添加100μL；

样品组：茶叶发酵提取液分别配制0.1％(v/v)、0.05％(v/v)、0.01％(v/v)浓度分别添加100μL，试验结果如图1所示。

由图1可知，实验浓度范围内具有促进I型胶原蛋白分泌的效果，0.1％，0.05％的茶叶发酵提取液的加入可以使I型胶原蛋白分泌增加12.3％，7.6％。I型胶原蛋白是主要存在于皮肤中，起到增加皮肤弹性和降低皮肤衰老的作用，他的多少和皮肤弹性成正相关。本试验结果表明本发明的茶叶发酵提取液能有效地促进I型胶原蛋白的生成，增加皮肤弹性，因而具有抗衰老的效果。

实施例4：茶叶发酵提取液有效促进成纤维细胞的透明质酸的分泌

检测茶叶发酵提取液对人成纤维细胞的透明质酸的分泌影响，以评价其抗衰老功效。

在无菌操作台中将培养皿中生长至80～90％的人成纤维细胞HSF收集计数。根据计数结果，按照1.0～5.0×10⁴cells/mL接种1ml至12孔细胞培养板中，空白孔加入100μLPBS，样品孔加入不同浓度的样品，每个浓度设三个平行，培养24h。将生长良好的细胞上清液收集在无菌管中，待测。检测方法按照透明质酸ELISA试剂盒的说明书操作。

将EGF溶液、茶叶发酵提取液按照下述方法配制，均用0.22μm滤膜过滤除菌，备用。

空白对照组：110μL PBS溶液；

EGF组：1μg/mL EGF添加10μL，PBS溶液添加100μL；

样品组：茶叶发酵提取液分别配制0.1％(v/v)、0.05％(v/v)、0.01％(v/v)浓度分别添加100μL，试验结果如图2所示。

由图2可知，实验浓度范围内具有促进透明质酸的效果，0.1％，0.05％的茶叶发酵提取液的加入可以使透明质酸分泌增加9.5％，4.9％。人的体内和皮肤中含有大量的透明质酸，在皮肤的新生、代谢、老化等过程中起到非常重要的作用，它可以促进皮肤的营养代谢，保持皮肤水润、光滑、有弹性，还可以预防衰老等。本试验结果表明本发明的茶叶发酵提取液能有效地促进透明质酸的生成，增加皮肤弹性，因而具有抗衰老的效果。

实施例5：茶叶发酵提取液降低β-半乳糖苷酶活性

检测茶叶发酵提取液对人成纤维细胞的β-半乳糖苷酶活性影响，以评价其抗衰老功效。

在无菌操作台中将培养皿中生长至80～90％的人成纤维细胞HSF收集计数。根据计数结果，按照1.0～5.0×10⁴cells/mL接种1ml至12孔细胞培养板中，每个浓度设三个平行，培养24h。空白孔加入100μL PBS，模型组孔中加入10μL H₂O₂和90μL PBS，样品孔加入10μL H₂O₂和90μL浓度为0.1％的样品，继续培养1H。检测方法按照β-半乳糖苷酶活性试剂盒的说明书操作。试验结果如图3所示。

由图3可知，实验浓度范围内具降低β-半乳糖苷酶活性的效果，0.1％茶叶发酵提取液的加入即可以明显的抑制β-半乳糖苷酶活性。细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒是一种基于衰老时衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase；SA-β-Gal)活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的试剂盒。在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组织的衰老情况。本试验结果表明本发明的茶叶发酵提取液能有效地降低β-半乳糖苷酶活性，因而具有抗衰老的效果。

实施例6：茶叶发酵提取液对人角质细胞分泌炎症介质的影响

检测茶叶发酵提取液对人角质细胞分泌炎症介质的影响，以评价其皮肤微循环的功效。

在无菌操作台中将培养皿中生长至80～90％的角质细胞收集计数。根据计数结果，按照2.0～8.0×10⁴cells/well接种至96孔细胞培养板中，每孔100μL，空白孔加入10μLPBS，样品孔加入不同浓度的样品，每个浓度设三个平行，培养24h。测试样品对角质细胞的毒性，检测出安全浓度后用于测试对炎症介质的影响。

将LPS(细菌脂多糖)溶液、地塞米松溶液、茶叶发酵提取液，均用0.22μm滤膜过滤除菌，备用。

空白对照组：110μL PBS溶液；

LPS组：200μg/mL LPS添加10μL，PBS溶液添加100μL；

地塞米松组：200μg/mL LPS添加10μL，100μg/mL地塞米松溶液添加100μL；

样品组：200μg/mL LPS添加10μL，茶叶发酵提取液分别配制0.1％(v/v)、0.05％(v/v)、0.01％(v/v)浓度分别添加100μL。

实验结果显示茶叶发酵提取液对LPS诱导的角质细胞分泌iNOS和COX-2炎症介质有一定的抑制作用，具有抗炎改善皮肤微循环功效，如图4和图5所示。

本申请还存在其它多种可实施的技术方案，在此不做一一列举，本申请权利要求中要求保护的技术方案都是可以实施的。

本申请说明书中未作详细描述的内容属于本领域技术人员的公知常识。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。

上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种抗衰老改善皮肤微循环的茶叶发酵提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)选择老川茶，进行粉碎处理，加入纯水后通入121℃蒸汽灭菌，然后降至室温，接入冠突散囊菌的孢子悬液；恒温搅拌条件下发酵；之后通入蒸汽121℃灭菌，降至室温过滤；

2)将滤液加热升温至40℃～42℃,然后，加入酸性絮凝剂保温搅拌1小时；搅拌保温结束后，静置1小时；

3)加入红色硅藻土搅拌过滤；

4)依次用0.45um滤膜、10000D滤膜超滤，得到滤液；

5)将滤液减压浓缩得到浓缩液；

6)将浓缩液稀释得到所述茶叶发酵提取液；

所述的冠突散囊菌的孢子悬液是GenBank编号为MW512850,MW512849,MW494668,MW512851,MW512854,MW512855的六种冠突散囊菌的混合孢子悬液。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冠突散囊菌的孢子悬液的接入量为纯水体积的1％，孢子悬液的质量浓度为10％。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中纯水的加入量为茶叶质量的8-10倍；所述恒温搅拌条件下发酵具体为恒温28℃，搅拌转速为120转/分钟，发酵时间为120h。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中酸性絮凝剂的质量浓度为1％浓度，加入量为步骤1)中所得滤液体积量的2％；所述酸性絮凝剂包括：壳聚糖，聚合硅酸，聚合氯化铝。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤3)中红色硅藻土，过滤方法为使用滤布和中速滤纸的板框过滤。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中超滤压力控制在0.4MPa以下。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中减压浓缩的温度为：65℃以下，浓缩真空度保持在－0.075Mpa～-0.085Mpa。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤6)中先升温至80℃，再加入溶剂，所述溶剂的加入量为浓缩液体积的1％。

9.一种茶叶发酵提取液，其特征在于，所述茶叶发酵提取液是由权利要求1～8中任意一项所述的制备方法得到。

10.一种如权利要求9所述茶叶发酵提取液的应用，其特征在于，将所述发酵提取液应用于化妆品中。

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