CN1131236C

CN1131236C - 11β－21－二羟基－2'－甲基－5'βH－孕－1,4－二烯并[17,16－D]噁唑－3,20－二酮的纯化方法

Info

Publication number: CN1131236C
Application number: CN96180009A
Authority: CN
Inventors: L·福特
Original assignee: AVITIS
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1996-02-16
Filing date: 1996-12-04
Publication date: 2003-12-17
Anticipated expiration: 2016-12-04
Also published as: NO311029B1; NO983665D0; DK0885240T3; US6228851B1; EA199800732A1; EA000789B1; HU226936B1; CN1209137A; IL125414A0; CA2246520A1; AU1175897A; WO1997030068A1; KR19990082445A; DE69611548T2; PT885240E; AU709171B2; DE69611548D1; NZ324300A; CA2246520C; EP0885240B1

Abstract

式I化合物11β-21-二羟基-2’-甲基-5’βH-孕-1，4-二烯并[17，16-d-]噁唑啉-3，20-二酮的制备方法，该方法包括将从发酵液或工艺流得到的水溶液中含有的该化合物吸附于具有苯乙烯或丙烯酸基质的吸附性聚合物树脂上，随后通过用水和与水混溶的有机溶剂的适宜混合液洗脱解吸所述化合物。

Description

11β-21-二羟基-2’-甲基-5’βH-孕-1，4-二烯并 [17，16-D]噁唑-3，20-二酮的纯化方法

本发明涉及一种式I化合物11β-21-二羟基-2’-甲基-5’βH-孕-1，4-二烯并[17，16-d-]噁唑-3，20-二酮的新的纯化方法。

上述化合物涉及去氟可特(INN-国际非专利药品名称)，即去氟可特的C-21的乙酸酯部分被羟基取代。

去氟可特作为保钙糖皮质素剂在治疗中已应用数年。

这些化合物属于孕烯并噁唑啉类，据报道其具有抗炎、糖皮质素和激素样药理活性。所述类别的化合物实例公开于US 3413286和US 4440764。

式I化合物的制备公开于EP-B-322630，其中所述的化合物是11β-21-二羟基-2’-甲基-5’βH-孕-1，4-二烯并[17，16-d-]噁唑啉-3，20-二酮。

按照上面引证的EP-B-322630中公开的发酵方法，将2’-甲基-4-孕烯-21-醇-[17a，16a-d-]噁唑啉基-3，20-二酮或2’-甲基-4-孕烯-21-乙酰氧基-[17a，16a-d-]-噁唑啉基-3，20-二酮与弯孢属菌株和节杆菌属(Arthrobacter)菌株顺序地生长的混合培养物接触。更具体地说，根据优选的实施方案，将上述化合物加到新月弯孢(C.lunata)NRRL 2380在适宜发酵培养基中的、接种12-24小时后的生长培养物中，接种48-72小时后，将培养18-36小时的简单节杆菌(A.simplex)ATCC 6946的生长培养物加到该混合物中并再培养40-55小时；发酵在浸没条件下，温度保持在27-32℃并且pH为6-8的条件下进行；然后如下回收式I的发酵产物：通过用有机溶剂(如氯仿)萃取发酵液，浓缩该有机萃取液并加入非溶剂(如石油醚)沉淀该化合物。

由于式I化合物在发酵液中的浓度非常低，为完全萃取该化合物需要大量的有机溶剂。大量有机溶剂，尤其是卤代溶剂的使用给安全性、工业卫生和环境保护带来一些问题。

现在发现式I化合物可方便地从由发酵液或工艺流得到的水溶液回收，通过将所述水溶液中含有的该化合物吸附于具有苯乙烯或丙烯酸基质的吸附性聚合物树脂上，随后通过用水和与水混溶的有机溶剂的适宜混合物洗脱解吸所述化合物。

伴随有不希望的产物的、含式I化合物的代表性水溶液是从适宜菌丝体过滤的发酵液，任选含有所述菌丝体的洗涤水溶液或部分纯化的工艺流。所伴随的不希望的产物的实例包括有色杂质、副产物、未耗尽的原料、发酵培养基的盐和水溶性成分。

本发明的纯化方法尤其可方便地用于从由EP-B-322630公开的发酵方法获得的过滤发酵液回收式I化合物。

用于本发明纯化方法的适宜树脂具有的平均粒径为约20-50目并具有下述平均物理特性：

孔隙体积：约30-75％；

表面积：约140-800m²/g；

骨架密度：约1.06-1.10g/ml(苯乙烯树脂)；

约1.20-1.26g/ml(丙烯酸树脂)；

平均孔直径：约20-100。

适用于上述回收方法的吸附性苯乙烯基聚合物树脂的实例是市售树脂，如KastelS/112(Dow Chemical)或者AmberliteXAD/2、XAD/4或XAD/16(Rohm & Haas)等。适用于上述回收方法的吸附性丙烯酸基聚合物树脂的实例是市售的树脂，如KastelS/221或S/223(Dow Chemical)和AmberliteXAD/7或XAD/8(Rohm & Haas)等。

对于本发明方法，优选使用丙烯酸基聚合物树脂，尤其优选的是那些粒径约为20-50目并具有下述平均物理特性的丙烯酸基聚合物树脂：

孔隙体积：约30-60％；

表面积：约350-550m²/g：

骨架密度：约1.24-1.25g/ml；

平均孔直径：约20-80。

适用的具有上述特性的吸附性丙烯酸基聚合物树脂的实例是前面提及的KastelS/221和AmberliteXAD/7。

对于本发明方法，特别优选的是那些粒径约为20-50目并具有下述平均物理特性的丙烯酸基聚合物树脂：

孔隙体积：约30-60％；

表面积：约350-550m²/g；

骨架密度：约1.25g/ml；

平均孔直径：约20-40。

例如，适用的是市售的树脂KastelS/221。

适宜的洗脱混合液是0％-80％水与水混溶的有机溶剂如低级酮(如丙酮、乙基甲基酮)、低级醇(如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇)等的混合液。

优选使用10％-50％水与上述有机溶剂之一的混合液，尤其优选含约30％水的混合液。丙酮是优选的溶剂。

当采用本发明的方法纯化按照EP-B-322630描述的发酵方法获得的式I化合物时，常方便地应用下列通用方法。

当所述发酵方法完成时，首先将发酵物按已知方法过滤。将菌丝体饼重复地用水洗涤，然后将洗涤液与过滤发酵液合并。或者，菌丝体可用选自那些上面列出的有机溶剂洗涤，以回收其中含有的活性成分；在此情况下，洗涤液只有除去溶剂，如真空除去后才与过滤发酵液合并。

然后将与洗涤液合并的过滤的发酵液加载到装有吸附树脂的柱的顶部；通常，洗脱溶液仅含痕量产物。然后将树脂用水洗涤除去盐和其它水溶性杂质(如上，该水洗涤液通常也只含有痕量产物)。

然后通过用水与上述限定的有机溶剂的混合液，优选30/70水/丙酮混合物洗脱从树脂上解吸式I化合物。将洗脱液浓缩并过滤回收产物。采用该方法，可从过滤的发酵液中回收主要量的产物；通常，该第一次洗脱可回收高于当初加载到柱上的总量90％的所需产物。

可通过将第一次洗脱母液与水洗涤液合并后，重复上述方法回收剩余产物。总回收率为约96％。

为更好地说明本发明，给出下列实施例。

实施例1 新月弯孢和简单节杆菌的顺序生长

I)斜面培养基

Sabouraud培养基(用于新月弯孢)

抗菌琼脂1号(Antibiotic Agar No.1)(用于简单节杆菌)

II)营养和预培养培养基

a)用于新月弯孢的

大豆粉 13g/l

KH₂PO₄ 5g/l

葡萄糖 10g/l

胨 5g/l

高压灭菌前将pH调至6.5-7.5；

b)用于简单节杆菌的

葡萄糖 1.0g/l

大豆粉 5.0g/l

胨 5.0g/l

Basamin Busch 3.0g/l

KH₂PO₄ 5.0g/l

NaCl 5.0g/l

硅氧烷 0.1ml/l

高压灭菌前将pH调至6.5-7.5；

III)发酵培养基

发酵培养基与上述新月弯孢使用的预培养培养基组成相同。

IV)发酵方法

用斜面分别接种500ml烧瓶，在100ml上述营养培养基存在下于28℃培养12-24小时(新月弯孢)或18-36小时(简单节杆菌)。在下述方法中使用这些接种物：

将上述获得的新月弯孢培养物的等份物(约1-5％)转移到盛有上述发酵培养基的8升发酵罐并于29-32℃培养约24小时。

然后将4g 2’-甲基-4-孕烯-21-醇-[17a，16a-d-]噁唑啉基-3，20-二酮加入并继续发酵至接种后36-72小时。

之后，往其中加入简单节杆菌的18-36小时培养物并继续发酵40-55小时。

反应过程通过本领域已知TLC或优选HPLC跟踪原料的消失和/或产物的出现来监测。作为进一步的对比，还可跟踪中间体的出现或消失。根据HPLC的转化率为70-75％。

实施例2 式I化合物的回收

加入简单节杆菌40-55小时后，通常认为转化已完成，可对发酵产物进行后处理，以分离所需的式I化合物。

用硫酸将发酵产物的pH调至3-4，通过使用助滤剂过滤分离该混合物；然后将滤出的菌丝体用酸性水(3＜pH＜4)重复洗涤。将过滤的发酵液和洗涤液合并，得到11升含式I化合物的混合液，其含量(title)为270ppm(通过HPLC经硅胶柱测定；Spherisorb柱3μm，100×4.6mm；流速1.3ml/min，流动相0.0025M NaH₂PO₄∶CH₃CN 7∶3，UV检测器于254nm测定)。然后在室温下将上述混合液加载到装有约300ml水溶胀的丙烯酸基聚合物树脂(KastelS/221，Dow Chemical)的色谱柱(6×11cm)顶部，流速为约300ml/小时。分别收集洗脱下来的发酵液(母液)，该母液含有低于2ppm的活性成分。

然后，该树脂用600ml软化水洗涤以除去盐和其它水溶性杂质。再次分别收集洗脱液(洗涤液)，该洗涤液也含有低于2ppm的活性成分。

通过用70/30丙酮/水混合液以150ml/小时的速率洗脱，从树脂上解吸产物，收集约200ml洗脱液。

将洗脱液真空浓缩至约100ml，产物沉淀。

将该悬浮液冷却至约5℃，2小时后，过滤收集沉淀并用冷水洗涤。于50℃真空干燥后，获得2.8g式I化合物(纯度(title)98％)。

将母液和洗涤液合并，用水稀释(约母液体积的1-2倍)后，以约40ml/小时的速率加载到装有40ml上述溶胀树脂的柱(2×13cm)的顶部。

用80ml水洗涤树脂后，用70/30丙酮/水混合物以约20ml/小时的流速解吸产物。真空浓缩后，冷却，过滤，用冷水洗涤并干燥，又得到0.14g式I化合物。

从发酵混合液获得的总回收率一般为96％。

重复实施例1和2描述的方法，但使用2’-甲基-4-孕烯-21-乙酰氧基-[17a，16a-d]噁唑啉基-3，20-二酮代替2’-甲基-4-孕烯-21-醇[17a，16a-d]噁唑啉基-3，20-二酮，以基本相同的收率获得式I化合物。

Claims

1.式I化合物11β-21-二羟基-2’-甲基-5’βH-孕-1，4-二烯并[17，16-d-]噁唑-3，20-二酮的纯化方法：

该方法包括：

a)将从发酵液或工艺流得到的水溶液中含有的该化合物吸附于具有苯乙烯或丙烯酸基质的吸附性聚合物树脂上，

b)用水洗涤树脂，

c)用由10-50％重量的水和与水混溶的有机溶剂组成的混合物洗脱树脂以解吸式I化合物

d)浓缩洗脱液并通过过滤回收式I化合物。

2.根据权利要求1的方法，其中含有式I化合物的发酵液是从为获得上述化合物的发酵过程中获得的，该过程包括将2’-甲基-4-孕烯-21-醇-[17a，16a-d-]噁唑啉基-3，20-二酮或2’-甲基4-孕烯-21-乙酰氧基-[17a，16a-d-]-噁唑啉基-3，20-二酮与弯孢属菌株和节杆菌菌株顺序地生长的混合培养物接触。

3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤c)的洗脱混合物含30％重量水。

4.根据权利要求1或2的方法，其中：

a)首先将发酵物过滤，菌丝体饼重复地用水洗涤，然后将洗涤液与过滤发酵液合并；

b)将与洗涤液合并的过滤的发酵液加载到装有水溶胀的吸附树脂的柱顶部；

b’)将树脂用水洗涤；

c)用重量比30/70的水/丙酮混合物洗脱从树脂上解吸式I化合物

d)洗脱液浓缩并过滤回收式I化合物。

5.根据权利要求4的方法，其中对由步骤b和b’的洗脱获得的洗涤液和合并的母液重复该纯化方法。

6.根据权利要求1或2的方法，其中的吸附性聚合物树脂是带有苯乙烯或丙烯酸基质的聚合物树脂，其粒径为20-50目并且具有下述平均物理特性：

孔隙体积：30-75％；

表面积：140-800m²/g；

骨架密度：苯乙烯树脂为1.06-1.10g/ml；

丙烯酸树脂为1.20-1.26g/ml；

平均孔直径：20-100。

7.根据权利要求1或2的方法，其中的吸附性聚合物树脂是粒径为20-50目并且具有下述平均物理特性的丙烯酸基的聚合物树脂：

孔隙体积：30-60％；

表面积：350-550m²/g；

骨架密度：1.24-1.25g/ml；

平均孔直径：20-80。

8.根据权利要求1或2的方法，其中的吸附性聚合物树脂是粒径为20-50目并且具有下述平均物理特性的丙烯酸基的聚合物树脂：

孔隙体积：30-60％；

表面积：350-550m²/g；

骨架密度：1.25g/ml；

平均孔直径：20-40。

9.根据权利要求1或2的方法，其中的水混溶的有机溶剂是低级酮或低级醇。

10.根据权利要求1或2的方法，其中的有机溶剂是丙酮。

11.根据权利要求1或2的方法，其中的洗脱混合液是重量比30/70的水/丙酮混合物。