JP4076098B2 - １１β―２１―ジヒドロキシ―２’―メチル―５’βＨ―プレグナ―１，４―ジエノ［１７，１６―Ｄ］オキサゾール―３，２０―ジオンの精製方法 - Google Patents

Description

本発明は、式Ｉ：

の化合物１１β−２１−ジヒドロキシ−２’−メチル−５’βＨ−プレグナ−１，４−ジエノ［１７，１６−ｄ−］オキサゾリン−３，２０−ジオンの新規精製方法に関する。
上記化合物は、デフラザコルト（ｄｅｆｌａｚａｃｏｒｔ）（ＩＮＮ−国際一般的名称）のＣ−２１における酢酸部分が、ヒドロキシ部分によって置換されているデフラザコルトに関する。
デフラザコルトは、カルシウム倹約性（ｃａｌｃｉｕｍ−ｓｐａｒｉｎｇ）グルココルチコイド剤として数年来治療に用いられている化合物である。
これらの化合物は、プレグネノ−オキサゾリンのより一般的種類に属していて、これに関しては、抗炎症剤、グルココルチコイドおよびホルモン様薬物活性が報告されている。上記種類の化合物の例は、米国特許第3413286号および同第4440764号に開示されている。
式Ｉの化合物の製造は、欧州特許第322630号に開示されていて、ここでは、該化合物は、１１β−２１−ジヒドロキシ−２’−メチル−５’βＨ−プレグナ−１，４−ジエノ［１７，１６−ｄ−］オキサゾリン−３，２０−ジオンとして言及されている。
先に引用された欧州特許第322630号に開示されている発酵法によれば、２’−メチル−４−プレグネン−２１−オール−［１７ａ，１６ａ−ｄ−］オキサゾリニル−３，２０−ジオンもしくは２’−メチル−４−プレグネン−２１−アセチルオキシ−［１７ａ，１６ａ−ｄ−］オキサゾリニル−３，２０−ジオンが、クルブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）菌株とアルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）菌株の連続的に増殖する混合培養物と接触される。より具体的には、好適な実施態様によれば、上記化合物が、接種後１２〜２４時間後の適切な発酵培地で増殖中のＣ．ルナタ（Ｃ．ｌｕｎａｔａ）ＮＲＲＬ２３８０培養物に添加され、そして接種後４８〜７２時間後に、その混合液に、１８〜３６時間の増殖中のＡ．シンプレックス（Ａ．ｓｉｍｐｌｅｘ）ＡＴＣＣ６９４６培養物が添加され、さらに４０〜５５時間培養される；発酵は、液内培養条件下で実施され、温度は２７℃〜３２℃、ｐＨは６〜８に維持される；次いで、式Ｉの発酵生産物が、発酵ブロスを有機溶媒（例えばクロロホルム）で抽出し、有機抽出液を濃縮し、そして非溶媒（例えば石油エーテル）を添加して化合物沈殿させることによって回収される。
発酵ブロス中の式Ｉの化合物の濃度は非常に低いので、多量の有機溶媒が、化合物を完全に抽出するために必要である。多量の有機溶媒、特にハロゲン化溶媒の使用は、安全性、産業上の衛生および環境保護に関して、いくつかの問題を引き起こすであろう。
式Ｉの化合物は、発酵ブロスもしくは処理工程液から得られる水溶液から、該水溶液中に含有される化合物をスチレンもしくはアクリル酸骨格をもつ吸着重合樹脂に吸着させ、続いて、水と水に混和性の有機溶媒の適切な混合液を用いて樹脂を溶出して該化合物を脱着させることによって、都合よく回収できることが、今回見出された。
望ましくない生産物を伴う式Ｉの化合物を含有している典型的な水溶液は、適切な菌体を濾過された発酵ブロスであり、場合によっては該菌体の水洗浄液か、または部分精製された処理工程液と一緒にされてもよい。望ましくない随伴生産物の例は、着色不純物、副生産物、未利用の出発材料、塩類および発酵培地の水可溶成分である。
特に、本発明の精製方法は、欧州特許第322630号に開示された発酵法より得られる濾過発酵ブロスから、式Ｉの化合物を回収するために都合よく適用することができる。
本精製方法のための適切な樹脂は、平均粒度約２０〜５０メッシュで次に示す平均的な物理特性をもつであろう：
細孔容積：約３０％〜７５％；
表面積：約１４０〜８００ｍ²／ｇ；
骨格密度：約１．０６〜１．１０ｇ／ｍｌ（スチレン樹脂）
約１．２０〜１．２６ｇ／ｍｌ（アクリル酸樹脂）；
平均細孔径：約２０〜１００Å。
上記回収法のために適切な吸着スチレン系重合樹脂の例は、市販の樹脂、例えばＫａｓｔｅｌ^▲Ｒ▼Ｓ／１１２（Dow Chemical）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ^▲Ｒ▼ＸＡＤ／２、ＸＡＤ／４もしくはＸＡＤ／１６（Rohm & Haas）、またはそれに類するものである。上記回収法のために適切な吸着アクリル酸系重合樹脂の例は、市販の樹脂、例えばＫａｓｔｅｌ^▲Ｒ▼Ｓ／２２１もしくはＳ／２２３（Dow Chemical）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ^▲Ｒ▼ＸＡＤ／７もしくはＸＡＤ／８（Rohm & Haas）、およびそれに類するものである。
一般に、本発明の方法では、好ましくは、アクリル酸系重合樹脂が使用され、特に、好適な樹脂は、粒度約２０〜５０メッシュで次に示す平均的な物理特性をもつものである：
細孔容積：約３０％〜６０％；
表面積：約３５０〜５５０ｍ²／ｇ；
骨格密度：約１．２４〜１．２５ｇ／ｍｌ；
平均細孔径：約２０〜８０Å。
適切に使用できる上記特性をもつ吸着アクリル酸系重合樹脂の例は、先に述べたＫａｓｔｅｌ^▲Ｒ▼Ｓ／２２１およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ^▲Ｒ▼ＸＡＤ／７である。
本精製方法のための特に好適な樹脂は、粒度約２０〜５０メッシュで次に示す平均的な物理特性：
細孔容積：約３０％〜６０％；
表面積：約３５０〜５５０ｍ²／ｇ；
骨格密度：約１．２５ｇ／ｍｌ；
平均細孔径：約２０〜８０Å
をもつアクリル酸系重合樹脂である。
例えば、市販の樹脂Ｋａｓｔｅｌ^▲Ｒ▼Ｓ／２２１が、適切に使用できる。
適切な溶出混合液は、水に混和性の有機溶媒、例えば低級ケトン類（例えばアセトン、エチルメチルケトン）；低級アルコール類（例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール）；およびそれに類するものと水０％〜８０％との混合液である。
好ましくは、１種の上記有機溶媒と水１０％〜５０％との混合液が用いられ、特に好適な混合液は、水約３０％を含有する混合液である。アセトンが好適な溶媒である。
本発明の方法が、欧州特許第322630号に記載のような発酵法により得られる式Ｉの化合物の精製のために使用される場合は、次に示す一般的操作が都合よく適用できる。
該発酵工程が終了した時、発酵全液が、先ず、既知の技術にしたがって濾過される。菌体ケーキは、水で繰り返し洗浄され、次いで、洗液が濾過ブロスと合体される。さもなくば、菌体が、先に挙げたものから選ばれる有機溶媒を用いて洗浄されて、その中に含有されている活性物質を回収することができる；この場合には、洗液は、例えば真空下の溜去によって溶媒を除去した後にのみ、濾過ブロスと合体される。
次に、洗液と合体された濾過ブロスは、吸着性樹脂を含有しているカラムの上部に適用される；一般に、溶出された溶液は、痕跡量の生産物を含有するだけである。次いで、樹脂が、水で洗浄されて塩および他の水可溶性不純物（前記のとおり、またこの洗浄水は、一般に、痕跡量の生産物のみを含有するであろう）が除去される。
次に、式Ｉの化合物は、先に定められた水と有機溶媒の混合液、好ましくは水／アセトン３０／７０混合液により溶出することによって樹脂から脱着される。溶離液は濃縮され、そして生産物が濾過によって回収される。この操作を用いれば、生産物の大部分が濾過ブロスから回収される；一般的には、最初にカラムに適用された所望の化合物全量の９０％以上がこの第１回の溶出により回収される。
残りの量は、第１回の溶出からの母液と水による洗液を合わせた後、上記操作を繰り返すことによって回収することができる。総回収率は約９６％である。
本発明をより具体的に説明するために、次の実施例が示される。
実施例１ Ｃ．ルナタとＡ．シンプレックスの連続増殖
Ｉ）スラント培地
サブロウ培地（Ｃ．ルナタ用）
抗生物質アガーＮｏ．１（Ａ．シンプレックス用）
ＩＩ）増殖および前培養培地
ａ）Ｃ．ルナタ用
大豆粉 １３ｇ／ｌ
ＫＨ₂ＰＯ₄ ５ｇ／ｌ
デキストロース １０ｇ／ｌ
ペプトン ５ｇ／ｌ
オートクレーブ前にｐＨ６．５〜７．５に調整；
ｂ）Ａ．シンプレックス用
デキストロース １．０ｇ／ｌ
大豆粉 ５．０ｇ／ｌ
ペプトン ５．０ｇ／ｌ
Ｂａｓａｍｉｎ Ｂｕｓｃｈ ３．０ｇ／ｌ
ＫＨ₂ＰＯ₄ ５．０ｇ／ｌ
ＮａＣｌ ５．０ｇ／ｌ
シリコン ０．１ｍｌ／ｌ
オートクレーブ前にｐＨ６．５〜７．５に調整。
ＩＩＩ）発酵培地
上記のＣ．ルナタ用前培養培地と同じ組成をもつ発酵培地。
ＩＶ）発酵操作
スラントは、上記増殖培地１００ｍｌ存在下で、約１２〜２４時間（Ｃ．ルナタ）または１８〜３６時間（Ａ．シンプレックス）、約２８℃で培養される５００ｍｌフラスコに別々に接種するために使用される。これらの種菌は、下記操作において使用される：
上記の得られたＣ．ルナタの培養物の一定分量（約１〜５％）が、上記発酵培地を含有する８リットル発酵槽に移植され、２９〜３２℃で約２４時間培養される。
次いで、２’−メチル−４−プレグネン−２１−オール−［１７ａ，１６ａ−ｄ−］オキサゾリニル−３，２０−ジオン４ｇが添加され、そして発酵は接種から約３６〜７２時間まで継続される。
その後、Ａ．シンプレックスの１８〜３６時間培養物が、これに添加され、そして発酵がさらに４０〜５５時間継続される。
反応の過程は、技術的に既知のようにＴＬＣまたは好ましくはＨＰＬＣにより原料の消失および／または最終生産物の出現を追跡することによってモニターされる。さらなる対照として、中間体の出現・消失もまたモニターされる。ＨＰＬＣ転化率：７０〜７５％。
実施例２ 式Ｉの化合物の回収
Ａ．シンプレックスの添加から４０〜５５時間後、変換は、一般に完了したとみなされ、そして発酵全液が精製されて、所望の式Ｉの化合物が単離される。
発酵全液のｐＨが、Ｈ₂ＳＯ₄で約３〜４に調整され、そして混合液は、濾過助剤を用いる濾過によって分離される；次いで、濾過された菌体が酸性水（３＜ｐＨ＜４）で繰り返し洗浄される。濾過ブロスと洗液が合体され、力価２７０ｐｐｍ（シリカゲルのＨＰＬＣによって定量；カラム Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ３μｍ、１００ｘ４，６ｍｍ；流速 １．３ｍｌ／ｍｉｎ、移動相 ０．００２５ＭＮａＨ₂ＰＯ₄：ＣＨ₃ＣＮ ７：３、２５４ｎｍにおけるＵＶ検出器）をもつ式Ｉの化合物を含有する混合液１１ ｌを得る。次いで、上記混合液は、流速約３００ｍｌ／ｈにおいて、水で膨潤したアクリル酸系重合樹脂（Ｋａｓｔｅｌ^▲Ｒ▼Ｓ／２２１，Dow Chemical）約３００ｍｌを含有するクロマトグラフィーカラム（６ｘ１１ｃｍ）の上部に室温で適用される。活性物質２ｐｐｍ以下を含む溶出ブロス（母液）は、別に回収される。
次いで、樹脂は、脱塩水６００ｍｌで洗浄されて塩および他の水に可溶性の不純物が除去される。またこの場合には、活性物質２ｐｐｍ以下を含む溶出液（洗液）も別に回収される。
次いで、生産物が、アセトン／水 ７０／３０混合液を用いる流速約１５０ｍｌ／ｈでの溶出によって樹脂から脱着され、溶出液約２００mlが回収される。
溶出液は容量約１００ｍｌまで真空濃縮され、その間に生産物が沈殿する。
その懸濁液が約５℃に冷却され、そして２時間後、沈殿物が濾過によって回収され、冷水で洗浄される。５０℃において真空乾燥した後、式Ｉの化合物２．８ｇが得られる（力価９８％）。
母液と洗液が合体され、水（母液量に関して約１〜２倍容量）で希釈された後、流速約４０ｍｌ／ｈにおいて、上記膨潤樹脂４０ｍｌを含有するカラム（２ｘ１３ｃｍ）の上部に適用される。
水８０ｍｌで樹脂を洗浄後、生産物が、アセトン／水 ７０／３０混合液を用いる流速約２０ｍｌ／ｈでの溶出によって脱着される。真空濃縮、冷却、濾過、冷水での洗浄、そして乾燥によって、さらなる式Ｉの化合物０．１４ｇが得られる。
発酵混合液からの総回収率は、典型的には約９６％である。
実施例１と２に概略示した操作を繰り返すが、２’−メチル−４−プレグネン−２１−オール−［１７ａ，１６ａ−ｄ−］オキサゾリニル−３，２０−ジオンの代わりに２’−メチル−４−プレグネン−２１−アセチルオキシ−［１７ａ，１６ａ−ｄ−］オキサゾリニル−３，２０−ジオンを用いることによって、式Ｉの化合物が、実質的に同じ収率により得られる。

Claims (11)

1. 式:
   

   

   の化合物11β−21ジヒドロキシ−２'−メチル−５'βＨ−プレグナ−１，４−ジエノ［17，16−ｄ−］−オキサゾリン−３，20−ジオンの精製方法であって、
   a）発酵ブロスもしくは処理工程液から得られる水溶液中に含有される上記式Iの化合物を、スチレンもしくはアクリル酸骨格をもつ吸着重合樹脂に吸着させ、
   b）樹脂を水で洗浄し、
   c）水10〜50％と水に混和性の有機溶媒の混合液を用いて樹脂を溶出して式Iの化合物を脱着させ、
   d）溶離液を濃縮し、そして式Iの化合物が濾過によってそれから回収されること
   を含んでなる方法。
2. 式Iの化合物を含有している発酵ブロスが、２'−メチル−４−プレグネン−21−オール−［17a，16a−ｄ−］オキサゾリニル−３，20−ジオンもしくは２'−メチル−４−プレグネン−21−アセチルオキシ−［17a，16a−ｄ−］オキサゾリニル−３，20−ジオンを、クルブラリア（Curvularia）菌株およびアルトロバクター（Arthrobacter）菌株の連続的に増殖する混合培養物と接触させることを含んでなる該化合物を得るための発酵法から得られる請求項１記載の方法。
3. 段階c）の溶出用混合液が水30％を含有する、請求項１または２に記載の方法。
4. a）先ず、発酵全液が濾過され、菌体ケーキが水で繰り返し洗浄され、次いで、洗液が濾過ブロスと合体される;
   b）次いで、洗液と合体された濾過ブロスが、水で膨潤した吸着性樹脂を含有しているカラムの上部に適用される;
   b'）樹脂が水で洗浄される;
   c）式Iの化合物が、水／アセトン30／70混合液により溶出することによって樹脂から脱着される;
   d）溶離液が濃縮され、そして式Iの化合物が濾過によって回収される請求項１または２記載の方法。
5. 精製操作が、合体された母液および段階bとb'による溶出から得られる洗液について繰り返される、請求項４に記載の方法。
6. 吸着重合樹脂が、粒度20〜50メッシュをもつスチレンもしくはアクリル酸骨格をもち、そして次に示す平均的な物理特性:
   細孔容積:30％〜75％;
   表面積:140〜800m²／ｇ;
   骨格密度:1.06〜1.10ｇ／ml（スチレン樹脂）
   1.20〜1.26ｇ／ml（アクリル酸樹脂）;平均細孔径:20〜100Åをもつ重合樹脂である請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
7. 吸着重合樹脂が、粒度20〜50メッシュで次に示す平均的な物理特性:
   細孔容積:30％〜60％;
   表面積:350〜550m²／ｇ;
   骨格密度:1.24〜1.25ｇ／ml;
   平均細孔径:20〜80Å
   をもつアクリル酸系重合樹脂である請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
8. 吸着重合樹脂が、粒度20〜50メッシュで次に示す平均的な物理特性:
   細孔容積:30％〜60％;
   表面積:350〜550m²／ｇ;
   骨格密度:1.25ｇ／ml;
   平均細孔径:20〜40Å
   をもつアクリル酸系重合樹脂である請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
9. 水に混和性の有機溶媒が、低級ケトン類もしくは低級アルコール類である、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
10. 有機溶媒がアセトンである、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
11. 溶出用混合液が、水／アセトン30／70混合液である、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。