EA000789B1

EA000789B1 - СПОСОБ ОЧИСТКИ 11β-21-ДИГИДРОКСИ-2'-МЕТИЛ-5'βН-ПРЕГНА-1,4-ДИЕНО-(17,16-ди)-ОКСАЗОЛ-3,20-ДИОНА

Info

Publication number: EA000789B1
Application number: EA199800732A
Authority: EA
Inventors: Луиджи Форте
Original assignee: Группо Лепетит С.П.А.
Priority date: 1996-02-16
Filing date: 1996-12-04
Publication date: 2000-04-24
Also published as: EP0885240B1; HU226936B1; ZA971214B; HUP9904410A2; WO1997030068A1; CN1209137A; IL125414A0; EA199800732A1; DK0885240T3; IL125414A; CN1131236C; US6228851B1; KR19990082445A; ES2153996T3; JP4076098B2; DE69611548D1; HUP9904410A3; JP2000511878A; AU1175897A; NO311029B1

Description

В настоящем изобретении идет речь о новом способе очистки соединения 11β-21дигидрокси-2'-метил-5'вН-прегна-1,4-диено( 17, 16-ди-)оксазолин-З,20-диона формулы I

дефлазакорту (ИНН-интернациональное незапатентованное название), в котором ацетатный фрагмент С-21 дефлазакорта замещен гидроксильным фрагментом.

Дефлазакорт - соединение, применяемое в терапии в течение нескольких лет в качестве удерживающего кальций глюкокортикоидного агента.

Эти соединения относятся к более общему классу прегнено-оксазолинов, обладающих противовоспалительной, глюкокортикоидной и гормоноподобной фармакологическими активностями. Примеры соединений вышеупомянутого класса приведены в патентах США № 3413286 и № 4440764.

Способ получения соединения формулы I описан в Европейском патенте ЕР-В-322630, где вышеупомянутое соединение относится к 11 β21 -дигидрокси-2'-метил-5'вН-прегна-1,4диено( 17,16-ди-)оксазолин-3,20-диону.

Согласно процессу ферментации, описанному в вышеупомянутом ЕР-В-322630, 2'-метил4-прегнен-21 -ол-( 17а, 16а-ди-)оксазолинил-3,20дион или 2'-метил-4-прегнен-21-ацетилокси(17а, 16а-ди-)оксазолинил-3,20-дион связывается с последовательно растущими смешанными культурами штаммов Curvularia и Arthrobacter. Более детально, согласно изобретению, вышеупомянутое соединение предпочтительно добавляют к растущей культуре C.lunata NRRL 2380 в соответствующей ферментационной среде через 1 2-24 ч после посева, и через 48-72 ч после посева к этой смеси добавляется 18-36часовая растущая культура A.simplex ATCC 6946 и далее культивируется 40-55 ч; далее ферментацию проводят в следующих условиях: температура поддерживается между 27 и 32°С и рН - между 6 и 8; продукт ферментации формулы I затем извлекают, экстрагируя ферментационный бульон органическим растворителем (например, хлороформом), концентрируют органические экстракты и добавляют не-растворитель, при котором соединение преципитирует (например, петролейный эфир).

В связи с тем, что концентрация соединения формулы I в ферментационном бульоне очень низкая, необходимо большое количество органического растворителя для полной экстракции соединения. Использование больших количеств органических растворителей, в частности галогенированных растворителей, может вызвать некоторые проблемы, связанные с охраной труда и защитой окружающей среды. Сейчас обнаружено, что соединение формулы I может быть извлечено из водного раствора, полученного из ферментационных бульонов или из потоков в ходе процесса путем адсорбции соединения, содержащегося в вышеупомянутом водном растворе, на адсорбционной полимерной смоле, имеющей стирольный или акриловый матриксы, с последующей десорбцией вышеупомянутого соединения путем элюции смолы подходящей смесью воды с водосмешивающимися органическими растворителями.

Типичными водными растворами, содержащими соединение формулы I и сопровождаемыми сопутствующими нежелательными продуктами, являются фильтраты ферментационных бульонов с соответствующих мицелиев, необязательно вместе с водными смывами вышеупомянутых мицелиев, или частично очищенные потоки в ходе процесса. Примерами нежелательных сопутствующих продуктов являются окрашенные примеси, побочные продукты, неизрасходованные исходные материалы, соли и водорастворимые компоненты ферментационной среды.

В частности, процесс очистки согласно изобретению может быть успешно применен для получения соединения формулы I из фильтрата ферментационного бульона, полученного в результате ферментационного процесса, описанного в европейском патенте В-322630.

Соответствующие смолы для процесса очистки могут иметь в среднем частицы размером около 20-50 меш и следующие усредненные физические характеристики:

Свободный объем Площадь поверхности Плотность скелета около 30-75% около 140-800 м²/г около 1,06-1,10 г/мл (стирольные смолы) около 1,20-1 ,26 г/мл (акриловые смолы)

Средний диаметр пор около 20-100 А

Примерами адсорбентов на основе стирольных полимерных смол, подходящих для вышеупомянутого процесса извлечения, являются коммерчески доступные смолы, такие как Kastel® S/112 (Dow Chemical), Amberlite® XAD/2, XAD/4 или XAD/16 (Rohm & Haas), или им подобные. Примерами адсорбентов на основе акриловых полимерных смол, подходящих для вышеупомянутого процесса извлечения, являются коммерчески доступные смолы, такие как Kastel® S/221 или S/223 (Dow Chemical), Amberlite® XAD/7 или XAD/8 (Rohm & Haas) или им подобные.

Вообще, для процесса согласно изобретению использование смол на основе акриловых полимеров является предпочтительным, осо3 бенно это касается смол с размером частиц около 20-50 меш, которые имеют следующие усредненные физические характеристики:

Свободный объем Площадь поверхности Плотность скелета Средний диаметр пор около 30-60% около 350-550 м²/г; около 1,24-1,25 г/мл около 20-80 А

Примеры адсорбентов полимерных смол на акриловой основе с вышеупомянутыми характеристиками, которые могут быть подходящими для работы, упоминаются ранее Kastel® S/221 и Amberlite® XAD/7.

Особенно предпочтительными для представленного процесса очистки являются полимерные смолы на акриловой основе, имеющие частицы размером около 20-50 меш и следующие усредненные физические характеристики:

Свободный объем Площадь поверхности Плотность скелета Средний диаметр пор около 30-60% около 350-550 м²/г около 1,25 г/мл около 20-40 А

В качестве примера для работы подходит коммерчески доступная смола Kastel® S/221.

Подходящими для элюции являются смеси, содержащие от 0 до 80% воды с водосмешивающимися органическими растворителями, такими как низшие кетоны (например, ацетон, этилметилкетон); низшие спирты (например, метанол, этанол, пропанол, бутанол); и подобные.

Предпочтительны смеси, содержащие от 10 до 50% воды с одним из вышеупомянутых органических растворителей, особенно предпочтительной является смесь, содержащая около 30% воды. Ацетон является предпочтительным растворителем.

При использовании процесса согласно изобретению для очистки соединения формулы I, полученного согласно ферментационному процессу, описанному в патенте ЕР-В-322630, применяют следующие основные процедуры.

Когда вышеупомянутый ферментационный процесс закончен, ферментационная масса, вопервых, фильтруется по известной технологии. Мицелиевый осадок на фильтре неоднократно промывают водой, и смывы затем объединяют с фильтратом бульона. Альтернативно, мицелий может быть отмыт органическим растворителем, выбранным из ранее перечисленных, для того, чтобы извлечь содержащуюся там активность; в этом случае смывы объединяются с фильтратом бульона только после удаления растворителя, например, отгонкой под вакуумом.

Фильтрат бульона объединяют со смывами и затем наносят на колонку, содержащую адсорбционную смолу; обычно элюированный раствор содержит только следы продукта. Смола затем отмывается водой для удаления солей и других водорастворимых примесей (как и указанный выше, этот смыв также, в основном, содержит только следы продукта).

Соединение формулы I затем десорбируется со смолы при элюции смесью воды и органического растворителя, как определено выше, преимущественно смесью воды с ацетоном в соотношении 30/70. Элюат концентрируют, и продукт извлекают путем фильтрации. При этой процедуре основное количество продукта получают из фильтрата бульона; показано, что, как правило, более чем 90% общего количества требуемого соединения, исходно помещенного на колонку, извлекается во время первой элюции.

Остаточные количества могут быть извлечены при повторении вышеупомянутой процедуры, после объединения маточного раствора от первой элюции и смывов водой. Общий выход составляет около 96%.

Для наилучшей иллюстрации изобретения даны следующие примеры.

Пример 1. Последовательный рост С. lunata и A. simplex.

I) Питательная среда для скошенного агара

Среда Сабуро (для С. lunata)

Антибиотический агар № 1 (для A. simplex)

II) Вегетативная и предкультуральная среда

а) для С. lunata

Соевая мука	1 3 г/л
KH₂PO₄	5 г/л
Декстроза	10 г/л
Пептон	5 г/л
Перед автоклавированием	устанавливают
рН 6,5-7,5.
б) для A. simplex
Декстроза	1,0 г/л
Соевая мука	5,0 г/л
Пептон	5,0 г/л
Basamin Busch	3,0 г/л
KH2PO4	5,0 г/л
NaCl	5,0 г/л
Силикон	0,1 мл/л
Перед автоклавированием	устанавливают

рН 6,5-7,5.

Ш)Ферментационная среда

Ферментационная среда имеет тот же состав, что и предкультуральная среда для Olunata, о которой сообщалось выше.

1У)Методика ферментации

Скошенный агар использовали в отдельных посевных 500 мл флаконах, которые культивировали при температуре около 28°С в течение 12-24 ч (С. lunata) или 18-36 ч (A. simplex) в присутствии 1 00 мл вегетативной среды, указанной выше. Этот посевной материал использовали в методе, описанном ниже.

Аликвоты (от 1 до 5%) культуры С. lunata, полученные, как описано выше, переносили в 8литровый ферментер, содержащий ферментационную среду, о которой сообщалось выше, и культивировали около 24 ч при 29-32°С.

Затем добавляли 4 г 2'-метил-4-прегнен-21ол-(17а,16а-ди)-оксазолинил-3,20-диона и продолжали ферментацию около 36-72 ч, считая от посева.

Далее в ферментер добавляли 18-36часовую культуру А. simplex, и ферментацию продолжали в течение последующих 40-55 ч.

Течение реакции контролировали с помощью известного метода ТСХ или, что предпочтительнее, ВЭЖХ, наблюдая за исчезновением исходного материала и/или появлением конечного продукта. В качестве дополнительного контроля можно следить за появлением или исчезновением промежуточных продуктов. Выход превращенного продукта, определяемого при помощи ВЭЖХ, составлял 70-75%.

Пример 2. Получение соединения формулы I.

Через 40-55 ч после добавления A. simplex превращение вещества в основном можно считать завершенным, и ферментационная масса может быть использована для выделения требуемого вещества формулы I.

рН ферментационной массы доводили приблизительно до 3-4 с помощью Н₂SO₄, эту смесь фильтровали с помощью фильтрационных приспособлений через отфильтрованный мицелий, затем неоднократно промывали подкисленной водой (3<рН<4). Профильтрованный бульон и смывы объединяли, получая при этом 11 л смеси, содержащей соединение формулы I, имеющее характеристику 270 ppm (полученную с помощью ВЭЖХ на силикагеле; колонка Spherisorb 3μιη, 100 х 4,6 мм; скорость протекания 1,3 мл/мин, подвижная фаза 0,0025 М NaH₂PO₄: CH₃CN 7:3, УФ-регистрация при длине волны 254 нм). Указанную смесь затем наносили при комнатной температуре на верхнюю часть хроматографической колонки (6 х 11 см), содержащей около 300 мл набухшей в воде полимерной смолы на основе акрила (Kastel^®S/221 , Dow Chemical), при скорости протекания около 300 мл/ч. Не связавшийся на колонке материал (маточные растворы), который содержал менее 2 ppm активности, собирали отдельно.

Смолу затем промывали 600 мл деионизованной воды для удаления солей и других водорастворимых примесей. И в этом случае смывы, содержащие менее 2 ppm активности, собирали отдельно.

Связавшийся на колонке со смолой продукт затем десорбировали, элюируя его смесью ацетона с водой в соотношении 70/30 со скоростью около 1 50 мл/ч, собирая около 200 мл элюата.

Элюат концентрировали под вакуумом приблизительно до объема 1 00 мл, при этом продукт преципитировал.

Суспензию охлаждали приблизительно до 5°С и через 2 ч преципитат отделяли фильтрацией и промывали холодной водой. После высушивания под вакуумом при 50°С получали 2,8 г соединения формулы I (чистота 98%).

Маточные растворы и смывы объединяли и после разбавления водой (около 1-2 объемов воды по отношению к 1 объему маточного раствора) наносили прямым током на колонку (2 х 1 3 см), содержащую 40 мл вышеуказанной набухшей смолы, со скоростью около 40 мл/ч.

После того как смолу отмывали 80 мл воды, связавшийся на колонке продукт десорбировали элюцией, используя смесь ацетона и воды в соотношении 70/30 со скоростью 20 мл/ч. После концентрирования под вакуумом, охлаждения, фильтрации, промыва холодной водой и высушивания получали следующие 0,1 4 г соединения формулы I.

Общий выход вещества из ферментационной массы составлял обычно около 96%.

При повторении методов, описанных в примерах 1 и 2, но при использовании 2'-метил4-прегнен-21 -ацетилокси-(1 7а,1 6а-ди)-оксазолинил-3,20-диона вместо 2'-метил-4-прегнен-21ол-(1 7а,1 6а-ди)-оксазолинил-3 ,20-диона, было получено соединение формулы I практически с тем же выходом.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ очистки соединения 11β-21дигидрокси-2'-метил-5'в Н-прегна-1,4-диено[ 17,

16-ди-] -оксазолин-3,20-дион формулы который включает:

а) адсорбцию вышеназванного соединения, содержащегося в водном растворе, полученном из ферментационных бульонов или из потоков в ходе процесса на адсорбирующей полимерной смоле, имеющей в основе стирольный или акриловый матриксы,

б) промыв смолы водой,

в) десорбцию соединения формулы I со смолы путем элюции смесью, содержащей 1 050% воды и смешивающегося с водой органического растворителя,

г) концентрирование элюата и извлечение из него соединения формулы I путем фильтрации.
2. Способ по п.1, в котором ферментационный бульон, содержащий соединение формулы I, был получен в результате процесса ферментации для получения названного соединения, который, в свою очередь, включает взаимодействие 2'-метил-4-прегнен-21 -ол-( 17a, 16ади-) оксазолинил-3,20-диона или 2'-метил-4прегнен-21 -ацетилокси-(1 7а,1 6а-ди)оксазолинил-3,20-диона с последовательно рас7 тущими смешанными культурами штаммов Curvularia и Arthrobacter.
3. Способ по п.1 или 2, в котором элюирующая смесь этапа в) содержит около 30% воды.
4. Способ по пп.1 и 2, в котором

а) ферментационная масса вначале фильтруется, мицелиевый осадок на фильтре неоднократно промывается водой, а смывы объединяются с фильтратом бульона;

б) отфильтрованный бульон, объединенный со смывом, затем наносится на верхнюю часть колонки, содержащей набухшую в воде адсорбционную смолу;

б') смолу промывают водой;

в) соединение формулы I десорбируют со смолы путем элюции смесью воды с ацетоном в соотношении 30/70;

г) элюат концентрируют и соединение формулы I извлекают путем фильтрации.
5. Способ по п.4, в котором процесс очистки повторяют на объединенной фракции маточных растворов и смывов, полученных при элюировании на этапах б) и б').
6. Способ по пп.1, 2, 3, 4 или 5, в котором в качестве адсорбционной полимерной смолы применяется полимерная смола на основе стирольного или акрилового матриксов с размером частиц 20-50 меш, обладающая следующими усредненными физическими характеристиками: Свободный объем около 30-75%

Площадь поверхности около 140-800 м²/г

Плотность скелета для стирольных смол около 1,06-1,10 г/мл для акриловых смол около 1,2-1,26 г/мл

Средний диаметр пор около 20-100 А
7. Способ по пп.1, 2, 3, 4 или 5, в котором в качестве адсорбционной полимерной смолы используется полимерная смола на основе акрила, имеющая частицы размером около 20-50 меш и следующие усредненные физические характеристики:

Свободный объем около 30-60%

Площадь поверхности около 350-550 м²/г

Плотность скелета около 1,24-1 ,25 г/мл

Средний диаметр пор около 20-80 А
8. Способ по пп.1, 2, 3, 4 или 5, в котором в качестве адсорбционной полимерной смолы используется полимерная смола на основе акрила, имеющая частицы размером около 20-50 меш и следующие усредненные физические характеристики:

Свободный объем около Площадь поверхности около Плотность скелета около Средний диаметр пор около
9. Способ по пп.1, 2, 3, 4, ром смешивающийся с водой органический растворитель является низшим кетоном или низшим спиртом.
10. Способ по пп.1, 2, 3, 4, 6 или 7, в котором органическим растворителем является ацетон.

30-60% 350-550 м²/г 1,25 г/мл

20-40 А 6 или 7, в кото11. Способ по пп.1, 2, 3, 6 или 7, в котором элюирующая смесь является смесью воды с ацетоном в соотношении 30/70.