HU210170B - Process for the recovery of gibberellic acid in high purity from fusarium moniliforme microorganism culture - Google Patents
Process for the recovery of gibberellic acid in high purity from fusarium moniliforme microorganism culture Download PDFInfo
- Publication number
- HU210170B HU210170B HU117591A HU117591A HU210170B HU 210170 B HU210170 B HU 210170B HU 117591 A HU117591 A HU 117591A HU 117591 A HU117591 A HU 117591A HU 210170 B HU210170 B HU 210170B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- gibberellic acid
- aqueous
- buffer solution
- resin
- acid
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
A találmány tárgya eljárás gibberellinsav kinyerésére Fusarium monoliforme mikroorganizmus tenyészetéből abszorbens gyantán történő adszorpcióval, majd vizes puffer-oldattal történő szelektív eluálással.The present invention relates to a process for recovering gibberellic acid from a culture of a Fusarium monoliforme microorganism by adsorption onto an absorbent resin followed by selective elution with an aqueous buffer solution.
A gibberellinsav, kémiai nevén (la,2P,4aa,4a3,10p)2,4a,7-trihidroxi-1 -metil-8-metilén-gibb-3-én-1,10-dikarbonsav-l,4a-lakton, amelyet gibberellin A3-nak (GA3) is neveznek, a gibberellinek gyűjtőnéven ismert vegyületek csoportjába tartozik. A gibberellinek növényi növekedést szabályozó anyagok. Megfelelő agrotechnikai körülmények között gyorsítják a növények fejlődési folyamatait. Alkalmazzák a mezőgazdasági haszonnövények terméshozamának növelésére, a gyümölcs és zöldségtermesztésben, a virágzás és a termésmennyiség szabályozására, valamint alkalmazást nyert a sörgyártásban a malátázási eljárás során és egyéb mezőgazdasági haszonnövények csírázásakor a kelésbiztonság növelésére.Gibberellic acid, chemically (1a, 2P, 4aa, 4a3, 10β), 2,4a, 7-trihydroxy-1-methyl-8-methylenebib-3-ene-1,10-dicarboxylic acid-1,4a-lactone, also known as gibberellin A 3 (GA 3 ), belongs to a group of compounds known as the gibberellin generic name. Gibberellins are plant growth regulators. They accelerate the development of plants under appropriate agrotechnical conditions. It is used to increase the yield of agricultural crops, to regulate flowering and yield in fruit and vegetable production, and to be used in brewing during the malting process and to increase germination safety when germinating other agricultural crops.
A gibberellinek, így a gibberellinsav (GA3) előállítása nagyüzemileg fermentatív úton Gibberella fujikuroi törzsekkel vagy ezek konidiumos változataival az úgynevezett Fusarium moniliforme törzsekkel történik.The production of gibberellins, such as gibberellic acid (GA3), is carried out in a large-scale fermentative manner by strains of Gibberella fujikuroi or conidium variants thereof, known as Fusarium moniliforme strains.
A Fusarium moniliforme tenyésztése során négy gibberellin típusú vegyület termelődik, amelyek kromatográfiásan elkülöníthetők és azonosíthatók. Ezek a gibberellinsav (GA3), az (la,2p,4aa,4bp,10P)2,4a-dihidroxi- l-metil-8-metilén-gibbán-1,10-dikarbonsav-l,4a-lakton, amelyet az irodalom A4 néven is nevez, az (la,2p,3aa,4bp,10p)-2,4a-dihidroxi-l-metil-8-metilén-gibb-3-én-l,10 dikarbonsav, l,4a-lakton, jele A7 és a 3aS-[3a,4a(lSx, 2Rx,5Sx),7aa]-6metilén-2-(oktahidro-4,7a-dimetil-l,3-dioxo-4-izobenzofuranil)-biciklo[3.2.1 joktán-1 -karboxaldehid, amelyet fujenal néven ismernek.Cultivation of Fusarium moniliforme produces four gibberellin-like compounds which can be separated and identified by chromatography. These are gibberellic acid (GA 3 ), (1a, 2p, 4aa, 4bp, 10P) 2,4a-dihydroxy-1-methyl-8-methylenebibane-1,10-dicarboxylic acid 1,4a-lactone, which is Also referred to as 4 , (1α, 2β, 3αa, 4bp, 10β) -2,4a-dihydroxy-1-methyl-8-methylenebib-3-ene-1,10-dicarboxylic acid, 1,4a-lactone 7 and 3aS- [3a, 4a (1S x , 2R x , 5S x ), 7aa] -6-methylene-2- (octahydro-4,7a-dimethyl-1,3-dioxo-4-isobenzofuranyl) - bicyclo [3.2.1 octane-1-carboxaldehyde, also known as fuuval.
A fermentáció befejezése után a tenyészetből a micéliumot szűréssel eltávolítják és a kapott szűrt fermentléből az aktív anyagokat kinyerik.After the fermentation is complete, the mycelium is removed from the culture by filtration and the active ingredients are recovered from the resulting filtered fermentation broth.
A gibberellinsav fermentléből való kinyerése több eljárás ismert.There are several methods for obtaining gibberellic acid from fermentation broth.
A 188 487 sz. magyar szabadalmi leírás szerint a fermentlé sűrítmény kémhatását pH = 3,5-re állítják és etil-acetáttal extrahálják. Az extraktumból kálium-dihidrogén-foszfát/kálium-hidroxid pufferoldattal, pH = 6,2 kémhatásnál kinyerik a GA3-at, majd ezt követően a kémhatást pH = 6,6-ra emelve dikálium-hidrogénfoszfáttal kinyerik a GA4 és a GA7 elegyét. Az eljárásban a pufferoldat révén sóképződés játszódik le és folyadék-folyadék extrakciós rendszerben kerülnek át a vegyületek a vizes rendszerbe.No. 188,487. According to the Hungarian patent, the pH of the fermentation broth concentrate is adjusted to pH 3.5 and extracted with ethyl acetate. GA 3 is extracted from the extract with potassium dihydrogen phosphate / potassium hydroxide buffer solution at pH 6.2 and then GA 4 and GA 7 are raised to pH 6.6 with dipotassium hydrogen phosphate. mixture. In the process, salt solution is formed through the buffer solution and the compounds are transferred to the aqueous system in a liquid-liquid extraction system.
Az eljárás hátránya, hogy már az etil-acetáttal történő extrakció során számos, nem definiált szennyezőanyag kerül át a szerves fázisba, amelyek a későbbiekben is színezésként vagy egyéb szennyezésként jelentkeznek a végtermékben.The disadvantage of the process is that during the extraction with ethyl acetate, many undefined impurities are transferred to the organic phase, which will subsequently appear as coloring or other impurities in the final product.
Az Izv. Khim. 19(4), 465-70 (1986), (C. A. 106 192 389 k) szerint a savanyú fermentléből Amberlite XAD-2 gyantán kötik meg a gibberellineket, majd azokat a metanollal eluálják. A 272 104 sz. NDK-beli szabadalmi leírás szerint Wofatit 159 jelű hidrofób polimer mátrix segítségével kötik meg a gibberellineket a fermentációs közegből, majd pH = 7 kémhatásnál vizes metanollal végzik az eluálást.The Izv. Khim. 19 (4), 465-70 (1986), (C.A. 106,192,389 k), binds gibberellins from an acidic fermentation broth on Amberlite XAD-2 resin and elutes them with methanol. No. 272,104. According to the GDR patent, Wibatit 159 binds gibberellins from the fermentation medium using a hydrophobic polymer matrix and elutes with aqueous methanol at pH 7.
A metanolos, valamint a vizes metanolos eluálások vagy extrakciók hátránya, hogy azok nem szelektívek, az összes megkötésre került gibberellin típusú vegyületet, valamint a színezőanyagokat is magukba oldják, nagy tisztaságú termék előállítására alkalmatlanok. Itt kell megemlítenünk azt a tapasztalati tényt is, hogy a metanol alkalmazása észterképződéshez is vezethet, ami tovább rontja a termék minőségét vagy kihozatalát. Yabuba és munkatársai (1940) a fermentlé gibberellintartalmát aktív szénen abszorbeál tátják, majd metanollal vagy acetonnal leoldják.The disadvantages of the methanolic and aqueous methanol elutions or extractions are that they are non-selective, they also contain all the bound gibberellin-like compounds and the coloring agents and are not suitable for high purity product. We should also mention here the fact that the use of methanol can also lead to ester formation, which further degrades the quality or yield of the product. Yabuba et al. (1940) absorb the gibberellin content of the fermentation broth on activated carbon and then dissolve in methanol or acetone.
Az eljárás főbb hibája, hogy lehetetlen az adszorbeált gibberellinsav teljes visszanyerése, ugyanis adszorbeálódnak a kísérő szennyező és színanyagok, valamint a bioszintézis során termelődött egyéb gibberellinek is. Ezek a szerves oldószeres leoldás során egyidejűleg deszorbeálódnak és a tiszta gibberellinsav elválasztását gyakorlatilag lehetetlenné teszik. Az eljárásban a szennyezett aktív szén környezetszennyező veszélyes hulladékként jelentkezik.The main mistake of the process is that it is impossible to completely recover the adsorbed gibberellic acid because of the adsorbent impurities and dyes as well as other gibberellins produced during biosynthesis. They are simultaneously desorbed during organic solvent dissolution and render virtually impossible the separation of pure gibberellic acid. In the process, the contaminated activated carbon is contaminated as environmental hazardous waste.
A 819 110 számú angol szabadalmi leírás szerint a gibberellinsavnak a fermentléből való kinyerése észter, alkohol vagy keton típusú oldószenei, leginkább etil-acetáttal történik. Az eljárás hátránya, hogy a szerves oldószer minden kísérő színanyagot és egyéb, a bioszintézis során keletkező anyagot is old, ezért további tisztítási műveleteket igényel, melyek az eljárást költségessé teszik, illetve a többszöri tisztítási lépés miatt a kitermelést 40-50% körülivé csökkentik.According to British Patent No. 819,101, gibberellic acid is recovered from the fermentation broth using ester, alcohol or ketone type solvents, most preferably ethyl acetate. The disadvantage of the process is that the organic solvent also dissolves all the accompanying dyes and other substances produced during the biosynthesis and therefore requires additional purification operations which make the process expensive and reduce the yield to about 40-50% due to the multiple purification steps.
A 1 076 749 számú szovjet szerzői tanúsítvány a gibberellinsav vas(III)-klorid-komplex formában való lecsapását és kinyerését javasolja.Soviet Authorization Certificate No. 1,076,749 recommends precipitating and recovering gibberellic acid in the form of an iron (III) chloride complex.
Az eljárással csak vas-ionokkal szennyezett, technikai minőségű gibberellinsav állítható elő.The process produces only technical grade gibberellic acid contaminated with iron ions.
A gibberellinsav kinyerésének további módja anioncserélők felhasználásán alapszik. Ilyen eljárást ismertet az 1 278 673 számú francia szabadalmi leírás. Ez szerint egy bázikus természetű anioncserélő gyantával megkötik a gibberellinsavat és onnan a leoldást bázisok vizes- vagy alkoholos oldatával, pl. M ammónium-hidroxid-oldattal végzik.A further method of recovering gibberellic acid is based on the use of anion exchangers. Such a process is described in French Patent No. 1 278 673. According to this, a basic anion exchange resin is used to bind gibberellic acid and from there to dissolve with an aqueous or alcoholic solution of bases, e.g. M with ammonium hydroxide solution.
A bázikus anioncserélő gyantán történő megkötés, illetve az elúcióhoz biztosított erősen lúgos közeg a gibberellinsav lakton szerkezetét megtámadja, és a termék kihozatala ezáltal csökken. Az eljárás további hátránya, hogy az alkalmazott lúgos kémhatású eluálószer sok színezőanyagot is leold, így a termék minősége erősen kifogásolható.Binding on the basic anion exchange resin or the highly alkaline medium provided for elution attacks the lactone structure of gibberellic acid, thereby reducing the yield of the product. A further disadvantage of the process is that the alkaline eluent used also dissolves many coloring agents, and thus the quality of the product is very poor.
A 223 354 sz. német demokratikus köztársaságbeli szabadalmi leírás szintetikus szorpciós gyantákat javasol a gibberellinek megkötésére. Az eljárásban a kvantitatív megkötött gibberellineket szerves oldószerek (aceton, metanol, etanol) megfelelő koncentrációjú vizes oldatával oldják le.No. 223,354. German Patent Specification No. 5,102,015 proposes synthetic sorption resins for binding gibberellins. In the process, quantitative bound gibberellins are dissolved in an aqueous solution of an appropriate concentration of organic solvents (acetone, methanol, ethanol).
A fenti eljárások hátránya, hogy az elúció során mindig bekövetkezik a kísérő szín- és egyéb szennyezőanyagoknak a gibberellinsavval egyidőben történőThe disadvantage of the above procedures is that during the elution there is always a co-occurrence of dyes and other impurities at the same time as gibberellic acid
HU 210 170 Β deszorpciója, valamint az, hogy a fermentáció során képződött egyéb gibberellinszármazékok az elúció folyamán nem szelektíven, hanem egyszerre, egyazon frakcióban deszorbeálódnak.EN 210 170 Β and that other gibberellin derivatives formed during fermentation are not selectively desorbed in the same fraction during elution.
Az irodalom által ismertetett eljárások általában csak a fermentlében keletkezett gibberellinsav-tartalmat adják meg, de nem térnek ki arra, hogy abból milyen hatásfokkal nyerhető ki a termék.The methods described in the literature generally only provide the gibberellic acid content of the fermentation broth, but do not address the efficacy of the product.
Üzemi tapasztalataink szerint a fermentlében mért gibberellinsavnak csak 40-50%-a nyerhető ki, 8085%-os hatóanyagtartalommal.According to our experience, only 40-50% of the gibberellic acid measured in the fermentation broth can be recovered with 8085% active ingredient content.
Célul tűzik ki olyan eljárás kidolgozását, amely lehetővé teszi a gibberellinsavnak fermentlevekből 70%-nál magasabb hozammal, 90%-nál jobb tisztasági fokkal való kinyerését.It is an object of the present invention to provide a process which enables gibberellic acid to be recovered from fermentation broths in a yield of greater than 70% and a purity greater than 90%.
A találmány alapja az a felismerés, hogy a nemionos apoláros, vagy közepesen poláros felületű szintetikus szorpciós gyantákon savas kémhatású oldatokból kvantitatív mértékben megkötött gibberellinsav (GA3), A4, A7 és fujenál közül, eltérően a szerves oldószeres, vagy vizes-szerves oldószeres rendszerektől, a gibberellinsav szelektíven leoldható egy pH = 7,58,5, előnyösen pH = 8 kémhatású, nagy hígítású vizes pufferoldattal, miközben az egyéb gibberellinek, valamint a fermentléből a gyantára kötődő olajos természetű anyagok (habzásgátló, táptalaj komponensek) - amelyek a szerves oldósze-res, vagy vizes-szerves oldószeres eluálás esetén leoldódnak és a további kristályosítási műveletnél feldúsulva a kristályosítandó oldatban azt zavarják és ezzel mind a ki-hozatalt, mind a tisztaságot lerontják - a gyantán marad-nak és onnan szükség szerint külön-külön eltávolíthatók.The present invention is based on the discovery that non-ionic apolar or moderately polar surface sorption resins are quantitatively bound from acidic solutions of gibberellic acid (GA3), A4, A7 and fuary, unlike organic solvent or aqueous-organic solvent systems, gibberellic acid is selectively soluble in a high dilution aqueous buffer solution of pH 7.58, preferably pH 8, while other gibberellins and oily substances (antifoam, medium components) that bind from the fermentation broth are organic solvents. or, in the case of elution with an aqueous-organic solvent, dissolve and enriched in the further crystallization operation to interfere with the solution to be crystallized, thereby destroying both the yield and the purity, remaining on the resin and, if necessary, separately removed.
A gibberellinsav szelektív eluálására vizes pufferoldatként alkalmazható a 0,04-0,08 M dinátrium-hidrogén-foszfát és 0,04-0,08 M kálium-dihidrogén-foszfát vizes oldatának megfelelő térfogatarányú elegye, vagy a 0,15-0,25 M dinátrium-hidrogén-foszfát és 0,080,12 mólos citromsav vizes oldatának megfelelő térfogatarányú elegye, vagy 0,08-0,12 M kálium-dihidrogén-foszfát és 0,02-0,07 M bórax vizes oldatának megfelelő térfogatarányú elegye.For the selective elution of gibberellic acid, an aqueous buffer solution of 0.04-0.08 M disodium hydrogen phosphate and 0.04-0.08 M aqueous potassium dihydrogen phosphate, or 0.15-0.25 Aqueous solution of disodium hydrogen phosphate (M) and an aqueous solution of 0.080.12 M citric acid or a volume ratio of 0.08-0.12 M aqueous potassium dihydrogen phosphate (0.02-0.07 M).
Műszaki megoldásuk lényegét képezi tehát egy szorpciós gyantán történő megkötés utáni deszorpciós folyamat, amelynek során a savas kémhatáson adszorbeálódott GA3 a kémhatás emelkedés hatására deszorbeálódik a gyantáról, tehát a deszorpció nem sóképzés révén következik be. Ezt bizonyítja a pufferoldat alacsony koncentrációja (kb. 0,04-0,08 mólos), amelyben a jelenlévő kálium a sóképzéshez sztöchiometrikusan, elméletileg sem elegendő.The essence of their technical solution is a desorption process after binding on a sorption resin, in which GA 3 adsorbed on acidic acid is desorbed from the resin by increasing the pH, so that desorption does not occur by salt formation. This is evidenced by the low concentration of the buffer solution (about 0.04-0.08 M), in which the potassium present is not theoretically sufficient for the formation of salts.
További bizonyítékként említjük meg a citrát-foszfát pufferes leoldást, amelynél az oszlopról távozó eluátum szintén nem tartalmaz kálium-sót. ApH = 7,5-8,5 kémhatású pufferoldatnak az oszlopra engedése előtt, savas kémhatású fermentlevet folyatunk át az oszlopon, amelyet vízzel átmossuk. A mosási művelet végén pH = 3,5-4,0 az oszlopról távozó mosóvíz kémhatása, majd az oszlopra felvezetett pH = 8,0 kémhatású foszfát-puffer az oszlop kémhatás viszonyait csak lassan befolyásolja és emeli. A gyantán megkötött GA3-atAs further evidence, citrate-phosphate buffer solution is mentioned, where the eluate leaving the column also contains no potassium salt. Prior to the addition of the apH = 7.5-8.5 pH buffer to the column, acidic fermentation broth was passed through the column and washed with water. At the end of the washing operation, the pH of the wash water exiting the column is pH 3.5-4.0, and then the pH 8.0 pH phosphate buffer applied to the column only slowly influences and increases the column pH. The resin binds GA 3
80%-ban tartalmazó fő frakció átlagok kémhatása az oszlopról távozó pH-5 értéket mutat.The main fraction containing 80% has an average pH of 5 from the column.
A további lassú kémhatás emelkedés mellett jelennek meg, magasabb pH-értékeknél a többi gibberellinek (GA47 stb.). A kémhatásnak ilyen lassú emelkedése teszi szelektívvé az eljárást és ad lehetőséget a fokozott erősséggel kötődő gibberellinek szétválasztására, illetve arra, hogy a zömében (80-90%-ban) GA3at tartalmazó frakciót az oszlopaljáról lejövő oldat folyamatos értékmérés mellett elkülönítsük.Further slow pH increases occur with other gibberellins (GA 47 , etc.) at higher pH values. This slow increase in pH makes the process selective and allows the separation of the high-potency gibberellins and the separation of the bulk (80-90%) fraction containing GA 3 by continuous measurement of the solution from the bottom of the column.
A találmány tehát eljárás gibberellinsav elválasztására Fusarium moniliforme mikroorganizmus tenyészetéből egy adszorbens gyantán történő megkötéssel, majd vizes pufferoldattal történő szelektív eluálással.The invention thus provides a method for separating gibberellic acid from a culture of Fusarium moniliforme microorganism by binding to an adsorbent resin followed by selective elution with aqueous buffer.
A találmány szerint úgy járunk el, hogy a Fusarium moniliforme mikroorganizmus fermentálását követően a táptalaj maradékot és a micélium tömeget tartalmazó vizes elegyet egy ásványi savval megsavanyítjuk, majd megszűrjük. A szűrést célszerűen ismert módon, keretes szűrőpréssel végezhetjük. A micéliummentesített szűrt, savanyú kémhatású fermentlevet egy polimer anyagú spirál membránszűrőn (ABCOR gyártmányú HFM-100 jelű) átnyomatva fehérjementesítjük. A fehérjementes oldatot egy nemionos apoláros, vagy közepes poláros felületű, szintetikus szorbens gyantával töltött oszlopra tápláljuk. Szorbens gyantaként alkalmazható az Amberlite XAD-7 vagy XAD-4 típusú műgyanta (gyártja: Rhom and Haas).According to the invention, after fermentation of the microorganism Fusarium moniliforme, the aqueous mixture containing the medium residue and mycelial mass is acidified with a mineral acid and filtered. The filtration may conveniently be carried out in a known manner using a framed filter press. The mycelium-filtered filtered sour fermentation broth is decontaminated by passing through a polymeric spiral membrane filter (ABCOR HFM-100). The protein-free solution was applied to a column filled with a synthetic sorbent resin having a nonionic apolar or medium polar surface. Amberlite XAD-7 or XAD-4 synthetic resin (manufactured by Rhom and Haas) can be used as a sorbent resin.
Az oszlopra táplálást mindaddig folytatjuk, amíg az eltávozó folyadékban gibberellinek meg nem jelennek. A gibberellinek megjelenése, amely az oszlopban lévő gyanta telítettségét jelenti, rétegkromatográfiásan detektálható. Az oszlop gyantatartalmának telítettsége után a gyanta szemcsék közül vizes mosással eltávolítjuk a fermentlevet, majd pH = 7,5-8,5, előnyösen pH = 8 kémhatású vizes foszfát-puffért vezetünk az oszlopon keresztül.Feeding to the column was continued until gibberellins appeared in the effluent. The appearance of gibberellins, which represents the saturation of the resin in the column, can be detected by layer chromatography. After saturating the resin content of the column, the fermentation broth is removed from the resin particles by washing with water and then a pH 7.5 to 8.5 aqueous phosphate buffer is passed through the column.
Az oszlopról távozó eluátum kémhatásának lassú emelkedése mellett, abban megjelenik a gibberellinsav tisztán, a kísérő gibberellinek és egyéb szennyezőanyagok nélkül. Az eluálást mindaddig folytatjuk, amíg az eluátumban gibberellinsav kimutatható. Az oszlopon maradt egyéb gibberellinek szintén kinyerhetők szerves oldószerrel, vagy a kémhatás emelésével, de ez nem tartozik a találmány tárgyához. Az eluálás befejezése után az eluátumból szerves oldószeres extrakcióval, majd a szerves oldószer bepárlásával és kristályosítással ismert módon elkülönítjük a tiszta gibberellinsavat. Szerves oldószerként előnyösen etil-acetátot alkalmazunk.Along with a slow rise in the pH of the eluate leaving the column, gibberellic acid appears purely without any accompanying gibberellins and other impurities. The elution is continued until gibberellic acid is detected in the eluate. Other gibberellins remaining on the column can also be recovered with an organic solvent or by increasing the pH, but this is not within the scope of the invention. After completion of the elution, the pure gibberellic acid is isolated from the eluate by extraction with an organic solvent followed by evaporation of the organic solvent and crystallization. Preferably the organic solvent is ethyl acetate.
A találmány szerinti eljárás előnyei a következőkben foglalhatók össze:The advantages of the process of the invention can be summarized as follows:
- a kinyerési eljárás GA3-ra vonatkozóan szelektív,- the recovery process is selective for GA3,
- a koncentráció növekedése következtében kb. tízszeres hatóanyagtartalom növekedés érhető el (az oszlopra felvezetett fermentlé hatóanyagtartalma 500-700 mikrogramm/ml, míg az oszlopról lejövő eluátum 5000-7000 mikrogramm/ml GA3-at tartalmaz),- as a result of increasing concentration, approx. tenfold increase in active ingredient content (500-700 micrograms / ml active ingredient on the column and 5000-7000 micrograms / ml GA 3 on the eluent),
- az adszorbciót követő vizes pufferoldattal végzett eluációval, majd a szerves oldószeres extra3- elution with aqueous buffer after adsorption followed by extraction with organic solvent
HU 210 170 Β hálással lehetővé teszi a gibberellinsav (GA3) 70% feletti kinyerését 90%-nál magasabb tisztasági fokkal.EN 210 170 Β gratitude allows the recovery of gibberellic acid (GA 3 ) above 70% with a purity greater than 90%.
A találmányt a következő példákkal kívánjuk bemutatni anélkül, hogy az oltalmi kört azokra korlátoznánk.The following examples are intended to illustrate the invention, but are not intended to limit the scope thereof.
1. példaExample 1
A 157 367 sz. magyar szabadalmi leírás szerint nyert Fusarium moniliforma [letéti szám: MNG 0049 a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében (Kertészeti Egyetem, Budapest)] tenyészet fermentlevének kémhatását 10 tömeg%-os vizes sósavoldat hozzáadásával pH = 3,0 kémhatásúra állítjuk, majd keretes szűrőprésen megszűrve micéliumtartalmát eltávolítjuk. Az így kapott, savanyú kémhatású fermentlé 16 2 3-ét egy spirál membránszűrőn átnyomva fehérjementesítjük.No. 157,367. The fermentation broth of Fusarium moniliforma [accession no. MNG 0049 of the National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (University of Horticulture, Budapest)] was adjusted to pH 3.0 by addition of 10% aqueous hydrochloric acid and filtered through a filter press mycelium is removed. The 16 2 3 of the acidic fermentation broth thus obtained is deprotected by passing through a spiral membrane filter.
A fehérjementesített fermentlevet egy Amberlite XAD-7 típusú adszorpciós műgyantával töltött oszlopra vezetjük. Az oszlopra vezetett fermentlé gibberellinsav tartalma 620 mg/liter, amely teljes mennyiségben megkötődik a műgyantán. Amikor az oszlopról távozó oldatban a gibberellinsav rétegkromatográfiásan detektálható, ami az oszlop telítettségét jelzi, leállítjuk a fermentlének az oszlopra való táplálását és ionmentes, vagy desztillált vízzel átöblítjük a gyanta töltetet. Ezt követően pH = 8 kémhatású - 0,06 M dinátrium-hidrogén-foszfátot és 0,06 M kálium-dihidrogén-foszfátot 95:5 térfogatarányban tartalmazó vizes puffer-oldattal megkezdjük a műgyantáról a gibberellinsav leoldását. A leoldást addig folytatjuk, amíg az eluátumban rétegkromatográfiásan gibberellinsav kimutatható. Ehhez 2 M3 puffer-oldatot használunk fel. Az elúció befejezése után az eluátumot ellenáramú folyamatos extrakcióval, 2 m3 etil-acetát felhasználásával kivonatoljuk.The protein-free fermentation broth is applied to a column packed with Amberlite XAD-7 adsorption resin. The fermentation broth for the column has a gibberellic acid content of 620 mg / liter which is completely bound to the resin. When gibberellic acid is detected in the effluent from the column by layer chromatography, which indicates the saturation of the column, the feeding of the fermentation broth to the column is stopped and the resin pack is rinsed with deionized or distilled water. Subsequently, a solution of gibberellic acid is resolved in the resin from the resin with a pH 8 of aqueous buffer containing 0.06 M disodium hydrogen phosphate and 0.06 M potassium dihydrogen phosphate (95: 5 by volume). The dissolution is continued until gibberellic acid is detected in the eluate by layer chromatography. 2 M 3 buffer solution is used for this. After the elution is complete, the eluate is extracted by countercurrent continuous extraction using 2 m 3 of ethyl acetate.
Az így kapott gibberellinsavat tartalmazó etil-acetátot 50 °C hőmérsékleten, 4öl04 Pa (kb. 300 torr) nyomás alkalmazásával 25 liter térfogatúra bepároljuk. A bepárolt oldatot 20-25 °C hőmérsékleten állni hagyjuk egy napon át és a kivált kristályos gibberellinsavat szűréssel elkülönítjük és 40-50 ’C hőmérsékleten megszárítjuk.The resulting ethyl acetate containing gibberellic acid was evaporated to 25 liters at 50 ° C under a pressure of about 4,000 psig. The concentrated solution was allowed to stand at 20-25 ° C overnight and the crystalline gibberellic acid precipitated was isolated by filtration and dried at 40-50 ° C.
A kapott termék tömeg 7,2 kg kristályos gibberellinsav, a kinyerés hozama: 72,9%, hatóanyag-tartalom: 93-94% (HPLC-vel).The resulting product weighed 7.2 kg of crystalline gibberellic acid, yield: 72.9%, content 93-94% (by HPLC).
Olvadáspont: 229-231 ’C (irodalmi: 223-235 ’C)Melting point: 229-231 'C (Literary: 223-235' C)
Az oszlop regenerálása 50 tömeg%-os vizes aceton-eleggyel történik.The column is regenerated with 50% aqueous acetone.
A gibberellinsav rétegkromatográfiás detektálásánál etilacetát-kloroform-ecetsav 15:5:1 arányú elegyét használjuk futtatóként, az előhívás etanol-kénsav 95:5 arányú elegyével történik. A gibberellinsav retenciós faktora ebben a rendszerben Rf=0,37. A rétegkromatogtáfiás vizsgálatot minden esetben 97% hatóanyagtartalmú SERVA GA3 mellett végeztük (katalógus szám: 22 278).The layer chromatography of gibberellic acid was carried out using a 15: 5: 1 mixture of ethyl acetate-chloroform-acetic acid as the eluent and developed with 95: 5 ethanol-sulfuric acid. The retention factor of gibberellic acid in this system is Rf = 0.37. Layer chromatography was performed in each case with 97% active ingredient SERVA GA 3 (Cat. No. 22,278).
2. példaExample 2
Mindenben az 1. példában ismertetettek szerint járunk el azzal az eltéréssel, hogy eluensként 0,1 M kálium-dihidrogén-foszfátot és 0,05 M bóraxotExcept for 0.1 M potassium dihydrogen phosphate and 0.05 M borax as eluent.
Na2B4O710H2O) 46,5:53,5 térfogatarányban tartalmazó, pH = 8 kémhatású vizes puffer-oldat alkalmazunk.Na 2 B 4 O 7 10H 2 O) 46.5: 53.5 v / v aqueous buffer solution pH 8 was used.
A kapott kristályos gibberellinsav tömege 7,3 kg, a kinyerés hozama: 73,95%, hatóanyag-tartalom: 93,5%.The resulting crystalline gibberellic acid weighed 7.3 kg, yield: 73.95%, active ingredient: 93.5%.
Olvadáspont: 231-233 °C (irodalmi: 223-235 ’C).Melting point: 231-233 ° C (reference: 223-235 'C).
3. példaExample 3
Mindenben az 1. példának megfelelően járunk el azzal az eltéréssel, hogy eluensként 0,2 M dinátriumhidrogén-foszfátot és 0,1 M citromsavat 97,3:2,7 térfogatarányban tartalmazó pH = 8 kémhatású vizes puffer-oldatot alkalmazunk.Each was treated in the same manner as Example 1, except that an aqueous pH 8 buffer solution containing 0.2 M disodium hydrogen phosphate and 0.1 M citric acid at 97.3: 2.7 was used as eluent.
A kapott gibberellinsav tömege 7,1 kg, a kinyerés hozama: 71,9%, hatóanyag-tartalma: 91,8%.The weight of the resulting gibberellic acid was 7.1 kg, yield 71.9%, content 91.8%.
Olvadáspont: 229-232 °C (irodalmi: 223-235 ’C).Mp 229-232 ° C (reference 223-235 'C).
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU117591A HU210170B (en) | 1991-04-11 | 1991-04-11 | Process for the recovery of gibberellic acid in high purity from fusarium moniliforme microorganism culture |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU117591A HU210170B (en) | 1991-04-11 | 1991-04-11 | Process for the recovery of gibberellic acid in high purity from fusarium moniliforme microorganism culture |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU911175D0 HU911175D0 (en) | 1991-10-28 |
| HUT63206A HUT63206A (en) | 1993-07-28 |
| HU210170B true HU210170B (en) | 1995-02-28 |
Family
ID=10953186
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU117591A HU210170B (en) | 1991-04-11 | 1991-04-11 | Process for the recovery of gibberellic acid in high purity from fusarium moniliforme microorganism culture |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU210170B (en) |
-
1991
- 1991-04-11 HU HU117591A patent/HU210170B/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU911175D0 (en) | 1991-10-28 |
| HUT63206A (en) | 1993-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4861870A (en) | Process for purifying anthracyclinone glycosides by selective adsorption on resins | |
| JPH0767671A (en) | Recovery of citric acid from coarse mixture low in purity by adding strong acid and its salt | |
| KR100470524B1 (en) | Manufacturing method of moenomycin A | |
| HU210170B (en) | Process for the recovery of gibberellic acid in high purity from fusarium moniliforme microorganism culture | |
| CN114671754B (en) | Method for purifying crude abscisic acid | |
| CH660012A5 (en) | PROCEDURE FOR THE PURIFICATION OF THYLOSIN. | |
| CN101591333B (en) | Method for purifying pseudomonas acid A | |
| DE4042156C2 (en) | Process for the purification of mitomycin C. | |
| US5374771A (en) | Process for the preparation of high-purity deferoxamine salts | |
| US2787578A (en) | Recovery and purification of vitamin b12 | |
| JPH036139B2 (en) | ||
| US2480991A (en) | Method of producing penicillin preparations | |
| US4535155A (en) | Method for separating cephalosporins | |
| US3316282A (en) | Anion exchange resin complex of a cycloborate ester of a steroid | |
| JP4076098B2 (en) | Method for purifying 11β-21-dihydroxy-2'-methyl-5'βH-pregna-1,4-dieno [17,16-D] oxazole-3,20-dione | |
| US2980700A (en) | Process of gibberellic acid purification | |
| RU1822885C (en) | Method of isolation of 4- and/or 5-hydroxyindolyl-3-acetic acids | |
| US4128546A (en) | Process for the purification of FR-1923 substance | |
| JP2971128B2 (en) | Purification method of mitomycin C | |
| US5026640A (en) | Process for the conversion of corrinoids produced by microorganisms into cyanocorrinoids | |
| GB2552593A (en) | Process for separating and purifying gibberellin GA3 by using magnetic resin | |
| KR840002477B1 (en) | Method of separating cephalosporing | |
| PL163608B1 (en) | Method of isolating gibberelins from aqueous solutions | |
| PL160653B1 (en) | Method for separating gibelerins from contaminated solutions | |
| US3461113A (en) | Process for recovering flavin-adenine dinucleotide |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |