CN1101682C - 由牝马尿液获取雌激素的方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了通过固相萃取吸附于非离子半极性聚合吸附树脂上的、由妊娠牝马的尿液来源的共轭雌激素混合物，从牝马尿液中获取一种天然的共轭雌激素混合物提取物的方法。

Description

由牝马尿液获取雌激素的方法

本发明涉及由妊娠牝马的尿液中获取一种天然的共轭雌激素混合物的方法。

雌激素在医学上用于激素替代疗法中。尤其是雌激素混合物应用于治疗和预防妇女在自然的或人工的绝经期后出现的更年期病症。例如存在于妊娠牝马尿液中的、天然的共轭雌激素混合物对此具有特别好的疗效和良好的耐受性。

溶解于妊娠牝马尿液(＝妊娠牝马尿液，以下简称为“PMU”)中的固态物质含量自然可以在很大的范围内波动，一般来说在40-90g干品/升的范围内。除尿素和其它常见的尿内含物质以外，在PMU的固态物质中所含有的酚类成份剂量约为干品的2-5重量％。在这些酚类成份中有甲酚和作为HPMF已知的二氢-3，4-双[(3-羟基苯基)甲基]-2(3H)-呋喃酮。它们可以以游离的或共轭的形式存在。在PMU中含有一种天然的雌激素混合物，它可以进一步以共轭的形式存在，例如作为硫酸半酯-钠盐(以下简称为“硫酸盐”)。共轭雌激素的含量(以雌激素硫酸盐计算)可以为干品的0.3-1重量％。

通常用不可与水混合或者仅仅少量与水混合的极性有机溶剂例如醋酸乙酯、正-丁醇或环己醇经过萃取，由PMU获得含有共轭雌激素的提取物。但在这种液体-液体-萃取过程中会出现诸多问题，譬如大量泡沫形成、沉淀形成、乳剂形成和相分离差。一般来说需要进行多个萃取步骤，从而丧失雌激素，而仅仅获得部分雌激素。

1968年H.L.Bradlow建议(参见甾类11(1968)，265-272)，为了由尿液提取雌激素，可应用大网状树脂XAD-2^R，它是Rohm和Haas公司的一种中性非极性的疏水聚苯树脂。根据说明，其吸附容量甚微。根据Bradlow的方法，将任选稀释的尿液以较低的流速通过含有树脂的柱。将雌激素用甲醇或乙醇洗脱。但是没有说明在含有雌激素的洗脱液中所含有的其它物质。

本发明的目的是，开发出一种由PMU获得天然共轭雌激素混合物的工业方法，同时又能避免迄今常用的液体-液体-萃取方法中的已知缺点，该方法能提供一种摒弃了酚类尿内含物质、并且基本上不含甲酚和HPMF的产物。

现已发现一种方法，它可以在用非离子型半极性聚合吸附树脂进行固相萃取的过程中，可获得一种摒弃了酚类尿内含物质、并且不含甲酚和HPMF的、但却几乎完全保留了PMU天然雌激素含量的混合物，该混合物可以用来作为起始物质，用于制备含有PMU来源的天然共轭雌激素混合物活性物质的药物。

获得摒弃了酚类尿内含物质的、PMU来源的天然共轭雌激素混合物的本发明方法的特征是，a)  将一种尿液，它为不含有粘液物质和固态物质的尿液、该尿液的一

种浓缩液或者一种通过膜过滤该尿液而获得的浓缩尿潴留液，与为

了吸收尿液中所含有的共轭雌激素混合物所需足够剂量的半极性

聚合吸附树脂接触，然后将负载有共轭雌激素混合物的半极性聚合

吸附树脂与剩余的尿液分离，b)  用经过调节pH值至少为12.0、尤其是在12.5-14之间的洗涤水将

负载有共轭雌激素混合物的半极性聚合吸附树脂洗涤，c)  将洗涤过的吸附树脂与为了解吸吸附在其上的共轭雌激素混合物

所需足够剂量的洗脱液接触，该洗脱液为一种可与水混合的有机溶

剂，它来源于可与水混合的醚、低级链烷醇和低级脂族酮等化合

物，或者该洗脱剂为可与水混合的有机溶剂和任选调节至碱性的水

的混合液，然后将含有天然共轭雌激素混合物的洗脱液与吸附树脂

分离和任选浓缩。

在本发明方法中可以应用这样一些PMU，即由此通过浓缩所获得的浓缩液或者由此通过膜过滤所获得的潴留液。将所收集的尿液首先按照本身已知的方法去除粘液物质和固态物质。较为合适的是使固态物质和粘液物质沉淀，然后按照本身已知的分离方法，例如倾析法、分离法和/或过滤法将它们分离。这样可以将PMU倾入例如分离器、过滤装置或者沉降器内。作为分离装置可以应用例如砂浴器、或者市场上常见的分离器，例如喷气式分离器或者室式分离器。需要时还可以应用微量过滤装置或超滤装置，在应用这些装置时的同时还可以使过滤后的PMU达到无菌无病毒。

需要时可以向尿液内添加贮藏剂、杀(霉)菌剂、杀(细)菌剂和/或驱虫剂。

如果替代PMU而应用浓缩的PMU-潴留液，可以由PMU通过本身已知的膜过滤方法获得之。由于所应用的PMU的不同、膜过滤中所应用的膜例如其孔径的不同、以及过滤条件的不同，潴留液中固态物质的含量及其组成成份也可以有所不同。例如在应用毫微过滤膜时，可以在PMU-潴留液中近乎毫无损失地获得雌激素浓缩液，同时又能去除高达50重量％的低分子PMU-内含物。在本发明方法中所应用的PMU-潴留液可以浓缩至约1∶10的比例，例如约1∶7，并且其体积可以浓缩至约原PMU-体积的1/10，例如约1/7。

在方法步骤a)中所应用的半极性聚合吸附树脂为多孔的有机非离子聚合物，它们与非极性疏水聚合吸附树脂相反，具有中间极性(＝例如树脂活性表面的偶极矩在1.0至3.0德拜的范围内，尤其是1.5至2.0德拜)，并且具有亲水结构，例如聚羧酸酯树脂。较为合适的是应用带有优选大网状结构的、平均孔径在50至150，优选在70至100埃范围的、比表面在300至900，优选在400至500m²/g范围内的大孔半极性树脂。尤其合适的是大孔交联脂族聚羧酸酯树脂，尤其是交联聚丙烯酸酯树脂，例如Rohm和Haas公司的Amberlite XAD-7^R。

按照本发明，可以通过将PMU或者其潴留液与吸附树脂接触，进行共轭雌激素吸附于半极性吸附树脂上的吸附过程，方法是将尿液注入含有吸附树脂的反应器中，并且在其中使之与吸附树脂接触，接触时间的长短为吸附雌激素所需要的足够时间。在完成共轭雌激素于半极性吸附树脂上的吸附过程后，可以按照本身已知的方式，将负载有共轭雌激素混合物的吸附树脂与其它的尿液分离。较为合适的是，将尿液注入含有吸附树脂的柱，其通过柱的速度以雌激素能够充分接触以至吸附为宜。例如较为合适的流通速度相当于通过3至10，优选5至7体积份PMU/每体积份吸附树脂/小时的速度。优选在室温下进行吸附。较为合适的是，通过在微量超压下或者在减压下工作，以调节控制尿液通过反应器的流通速度。根据所应用的吸附树脂类型的不同和尿液中固态物质含量的不同，所应用的半极性吸附树脂的剂量也有所不同。在应用PMU时，例如可以将一份吸附树脂例如交联脂族聚羧酸酯-吸附树脂，用至多80体积份预先处理过的PMU负载，经证实，在流出的尿液中没有明显剂量的雌激素。在应用PMU-浓缩液或PMU-潴留液时，吸附树脂的负载容量自然地减小至它们已浓缩的范围。这样，例如1体积份量交联脂族聚羧酸酯-吸附树脂可以用相当于20至80，优选30至50体积份量PMU的尿液负载。

在方法步骤b)中，用经过调节后pH值至少为12.0、尤其是在12.5至14之间的、优选约12.5至13.5之间的洗涤水将用共轭雌激素混合物负载的半极性吸附树脂洗涤。作为洗涤水可以应用可溶解于尿液中的惰性碱性物质的水溶液，其碱性强度足以使pH值至少达到12.5。作为与半极性聚合吸附树脂相反的惰性水溶性碱性物质，合适的是优选水溶性无机碱，例如碱金属-或碱土金属氢氧化物，尤其是氢氧化钠。较为合适的是，洗涤水中所含有的碱性物质的剂量仅仅为达到所需pH-值、优选约pH 13所需要的剂量。所选择的洗涤水量应能足以进一步摒弃酚类尿内含物质，同时又不致附带洗涤掉显著剂量的共轭雌激素。经过证明较为合适的是，例如每单位池体积的吸附树脂应用2至10、尤其是4至6池体积的洗涤液。较为合适的是，洗涤水通过含有吸附树脂的反应器的流通速度为3至10、优选5至7体积份洗涤水/1体积份吸附树脂/小时。

在方法步骤c)中，接着将经过洗涤的、负载有共轭雌激素混合物的吸附树脂用洗脱共轭雌激素混合物所需足够量的洗脱液处理，之后获得含有PMU天然共轭雌激素混合物的洗脱液。本发明所应用的洗脱液为一种可与水混合的有机溶剂，它来源于可与水混合的醚、低级链烷醇和低级脂族酮等化合物组，或者该洗脱剂为可与水混合的有机溶剂与任选调节至碱性的水的混合液。作为洗脱液的醚成份，合适的有可与水混合的环醚如四氢呋喃或二噁烷，合适的还有可与水混合的开链醚例如乙二醇二甲醚(＝单甘醇二甲醚)、二甘醇二甲醚(＝二甘醇二甲醚)或者乙氧基乙氧基乙醇(＝二甘醇一乙醚)。作为低级链烷醇，合适的有可与水混合的、带有1-4、优选1-3碳原子的烷基醇，尤其是乙醇或异丙醇。作为低级脂族酮，合适的有可与水混合的、带有3-5碳原子的酮尤其是丙酮。尤其合适的洗脱液是其中的有机溶剂为乙醇。合适的是应用由上述可与水混合的有机溶剂和任选调节至碱性的水的混合液作为洗脱液。这种含水洗脱剂的pH-值在中性至pH低于13的碱性的范围内，较为有利的是在约10至12之间。含水洗脱液中的溶剂成份宜选择在所应用的pH-值范围内稳定的溶剂。pH-值在约10至12之间的含水碱性洗脱液中，合适的溶剂成份为低级链烷醇，优选乙醇。通过添加相应剂量的水溶性惰性碱性物质，优选无机碱例如碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物，尤其是氢氧化钠，可以调节所需要的含水洗脱液pH-值。在含水洗脱液中，可与水混合的有机溶剂与水的体积比例可以在40∶60至20∶80的范围内，优选约30∶70。所应用的洗脱液剂量可以为约3至10，尤其是约4至6池体积/每池体积吸附树脂。较为合适的是，洗脱液通过含有载有雌激素混合物的吸附树脂的反应器，其流通速度以雌激素能够充分接触以至吸附为宜。在应用乙醇与水的体积比例为30∶70的混合液时，合适的流通速度例如为3至10、优选5至7体积份洗脱液/每1体积份吸附树脂·每小时。合适的是在室温至约60℃的温度之间，优选在约40至50℃的温度之间进行洗脱。必要时通过在稍加升压力下，例如在高至0.2巴的超压下工作处理，以调节通过速度，并且在多个分馏液中接收洗脱液。各个洗脱分馏液中共轭雌激素和酚类尿内含物如甲酚和HPMF的含量可以按照本身已知的方式，通过高效液体-色谱分离法(＝高效液体色谱分离法，简称为“HPLC”)测定。

在洗脱过程中，首先获得的是淡染色甚至无色的、不含雌激素的前体分馏液，其剂量一般约相当于一个池体积量。大部分剂量的、例如在80-99％之间的起始-PMU中存在的共轭雌激素量，存在于后面的暗黄棕色主要洗脱分馏液中，其剂量一般约2至4个池体积。在后面的后续分馏液中一般只含有微量其轭雌激素。后续分馏液还含有超过10重量％干品物质的共轭雌激素和低于0.6重量％干品物质的甲酚和HPMF，如果保留这些后续分馏液，可以将它们与富含雌激素的主要洗脱液合并后用于进一步处理中。

按照前面所叙述的方法由吸附树脂分离出来的主要洗脱液含有PMU中出现的天然共轭雌激素混合物，此外还有微量的、原本在PMU中存在的酚类尿内含物质。这种洗脱液可以作为起始物质用于制备含有天然共轭雌激素混合物的药物。需要时可以按照本身已知的方式，将此洗脱液进一步浓缩，以便获得不含有机溶剂的、适合于盖仑氏进一步处理的浓缩液。需要时还可以通过喷雾干燥法制备不含洗脱液的固态物质混合物。如果应用天然共轭雌激素混合物制备固态药物，则较为合适的是，在浓缩或者喷雾干燥前，即已向含有共轭雌激素的洗脱液中添加混合固态载体物质，以这种方式可以获得含有共轭雌激素和载体物质的固态混合物。含有该雌激素混合物的洗脱液、以及由此制备的浓缩液或者喷雾干燥的固态产物可以按照已知的方式制备成固态的或液态的盖仑氏制剂，例如片剂、糖衣丸剂、胶囊或乳剂。可以按照本身已知的方法，应用通常的固态或液态载体物质例如淀粉、纤维素、乳糖、或滑石粉、或者液态石蜡，和/或应用通常的制药学佐剂例如片剂崩解剂、增溶剂或贮藏剂，制备这些盖仑氏制剂。这样可以将含有共轭雌激素的产物与制药学载体物质或佐剂一起，按照本身已知的方式混合，然后将混合物转化成合适的剂量剂型。

以下实施例可以进一步说明本发明，但并非仅限于此。实施例1-3

由PMU获得摒弃了酚类尿内含物质的、含有天然的PMU中所含有的共轭雌激素混合物的提取物的一般工作程序。A)   PMU的雌激素成份吸附于半极性聚丙烯酸酯-吸附树脂

用65ml于水中泡涨的半极性聚丙烯酸酯-吸附树脂(＝Rohm和

Haas公司的Amberlite XAD-7^R，颗粒大小约0.3-1.2mm，偶极矩1.8

德拜，平均孔径80埃，比表面约450m²/g干燥态)充盈30cm高、直

径为2.4cm的柱。将2升经过微过滤装置过滤的、或者通过分离

器提纯的PMU(＝干品物质含量(＝TS)、以及借助于HPLC测定的雌

激素硫酸盐、甲酚和HPMF的含量，参见以下实施例表)，在室温

下以6ml/分钟(＝约5.5池体积/每小时)的流速注入柱。PMU中含

有的雌激素在这样负载的半极性吸附树脂-柱上完全解吸。借助于

PHLC检查所流出的尿液中共轭雌激素含量(按雌激素硫酸盐计

算)，经过证实，它几乎不含有共轭雌激素。摒弃流出液。B)   洗涤负载的吸附树脂柱

将负载的吸附树脂柱用300ml pH值为实施例表中所给定数值的、

水溶性氢氧化钠溶液洗涤。为此将碱性洗涤水以6ml/分钟(约5.5

浴池体积每小时)的流速通过柱。借助于HPLC测定流出的洗涤液

中雌激素硫酸盐、甲酚和HPMF的含量。检查结果表明，在洗涤

期间低于柱上负载的雌激素总含量的5％被洗涤出来。C)   经过洗涤的吸附树脂柱的共轭雌激素的解吸

以约6ml/分钟的流速，在实施例表中所给定的洗脱温度下，使315

ml洗脱液(通过添加氢氧化钠调节成碱性的水/溶剂-混合液，组成

以及pH值参见以下实施例表)通过预热过的柱。将流出的洗脱液分

成6个分馏液接收。第一分馏液约65ml(＝约1池体积)，其余的分

馏液分别约50ml。借助于HPLC检测各个分馏液中的雌激素硫酸

盐、甲酚和HPMF的含量。收集第一分馏液，直至洗脱液由无色

变为淡黄色。该分馏液仅仅含有微量的雌激素硫酸盐。

    当第一浴池体积的洗脱液流完以后，洗脱液颜色转变为很暗的

深棕色。在以后的分馏液2至4中，含有柱上吸附的共轭雌激素的

总剂量的约80-98％，剩余的分馏液仅仅含有微量的雌激素硫酸

盐。这一点也可以由颜色深度的降低看出。在蒸馏去除溶剂后，可

以任选将剩余分馏液再次进行方法步骤A)。

以下实施例表中分别说明了主要量的、含共轭雌激素的分馏液

中以重量％表示的TS-含量、和通过HPLC测定的雌激素硫酸盐、

甲酚和HPMF的含量。这些分馏液为适合于进一步盖仑氏处理的

提取液。D)   吸附树脂柱的再生

为了再生，首先用100ml pH值调节至12的、含有50％乙醇的乙

醇/水-混合液，然后用150ml10％的水溶性柠檬酸钠溶液，接着再

次用150ml乙醇/水-混合液，最后用100ml蒸馏水洗涤柱。所有

的再生过程在45℃的温度下进行。柱可以多次地、例如至多40次

地被负载、然后又再生。

实施例号	1	2	3
				起始-PMU重量％TS雌激素硫酸盐含量  mg/l(重量％TS)甲酚含量          mg/l(重量％TS)HPMF含量          mg/l(重量％TS)	7.3110  (0.15)232  (0.32)74   (0.10)	6.5125  (0.19)263  (0.40)86   (0.13)	7.1124  (0.17)269  (0.38)88   (0.12)
洗涤水＝水溶性NaOH-溶液	pH12.5	pH13.0	pH13.5
				洗脱液	乙醇/水30∶70pH12	乙醇/水30∶70pH12	乙醇/水30∶70pH12
洗脱温度	45℃	45℃	45℃
				洗脱液2    重量％TS雌激素硫酸盐含量  mg/l(重量％TS)甲酚含量          mg/l(重量％TS)HPMF含量          mg/l(重量％TS)洗脱液3    重量％TS雌激素硫酸盐含量  mg/l(重量％TS)甲酚含量          mg/l(重量％TS)HPMF含量          mg/l(重量％TS)洗脱液4    重量％TS雌激素硫酸盐含量  mg/l(重量％TS)甲酚含量          mg/l(重量％TS)HPMF含量          mg/l(重量％TS)	1.02241(22.41)112 (1.120)0   (0.00)1.61625(10.16)62  (0.39)2   (0.01)0.1240 (24.00)16  (1.60)3   (0.30)	1.52217(14.78)82  (0.55)0   (0.00)0.71731(24.73)0   (0.00)0   (0.00)0.1285 (28.50)9   (0.90)0   (0.00)	3.91461(3.75)161 (0.41)0   (0.00)1.22201 (18.34)59   (0.49)0    (0.00)0.4652 (16.30)9   (0.22)2   (0.05)

Claims (11)

1.获取摒弃了酚类尿内含物质的、由妊娠牝马的尿液中来源的天然共轭雌激素混合物的方法，其特征是，

a)将一种尿液，它为不含有粘液物质和固态物质的尿液、该尿液的一种浓缩液或者一种通过膜过滤该尿液而获得的浓缩尿潴留液，与为了吸收尿液中所含有的共轭雌激素混合物所需的、足够剂量的非离子性半极性聚合吸附树脂接触，该非离子性半极性聚合吸附树脂为大孔的聚羧酸酯树脂，然后将负载有共轭雌激素混合物的半极性聚合吸附树脂与剩余的尿液分离，

b)将负载有共轭雌激素混合物的非离子性半极性聚合吸附树脂，用经过调pH值至少为12.0的洗涤水洗涤，

c)将洗涤过的吸附树脂与为了解吸附其上的共轭雌激素混合物所需要的足够剂量的洗脱液接触，该洗脱液为一种可与水混合的有机溶剂，它来源于可与水混合的醚、低级链烷醇和低级脂酮等化合物，或者该洗脱剂为可与水混合的有机溶剂与任选调节至碱性的水的混合液，有机溶剂与水的体积比在20∶80至40∶60的范围内，然后将含有天然共轭雌激素混合物的洗脱液与吸附树脂分离和任选浓缩。

2.按照权利要求1的方法，其特征在于，作为聚羧酸酯树脂，应用交联脂族聚羧酸酯树脂。

3.按照权利要求2的方法，其特征在于，作为聚羧酸酯树脂，应用交联聚丙烯酸酯树脂。

4.按照权利要求3的方法，其特征在于，作为聚羧酸酯树脂，应用具有大网状结构的交联聚丙烯酸酯树脂。

5.按照权利要求1或2的方法，其特征在于，在方法步骤a)中1体积份量非离子性半极性吸附树脂用相当于20至80体积份量尿液的含尿液体负载。

6.按照权利要求5的方法，其特征在于，在方法步骤a)中1体积份量非离子性半极性吸附树脂用相当于30至50体积份量尿液的含尿液体负载。

7.按照权利要求1或2的方法，其特征在于，在方法步骤a)中，以相当于3-10体积份尿/l体积份吸附树脂/小时的流通速度，使尿液通过含有非离子性半极性聚合吸附树脂的反应器。

8.按照权利要求7的方法，其特征在于，流通速度相当于5-7体积份尿/l体积份吸附树脂/小时。

9.按照权利要求1或2的方法，其特征在于，在方法步骤b)中所应用的洗涤水为一种pH值调节至12.5-13.5的水溶性氢氧化钠溶液。

10.按照权利要求1或2的方法，其特征在于，在方法步骤c)中所应用的洗脱液为一种由水和一种可与水混合的有机溶剂组成的混合液，可与水混合的有机溶剂与水的体积比在30∶70的范围内。

11.按照权利要求1或2的方法，其特征在于，在方法步骤c)中应用含醇洗脱液。