CN112924600A - 一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法 - Google Patents
一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法，所述指纹图谱建立方法是采用HPLC法对胶囊剂、片剂或颗粒剂等制剂中透骨香、汉桃叶、大血藤、八角枫、金铁锁五味药材，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B进行梯度洗脱的指纹图谱表征过程，本发明建立了指纹图谱表征，提高了对产品质量的检测要求，有助于建立产品完善的质量控制体系，进而有助于保障药品质量和临床药效。
Description
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法。
背景技术
金骨莲胶囊或金骨莲片等制剂是由大血藤、八角枫、透骨香、汉桃叶、金铁锁组方而成，具有祛风除湿，消肿止痛之功效，治疗风湿痹阻所致的关节肿痛、屈仲不利等，目前关于金骨莲胶囊的现行质量标准编号为WS-10093(ZD-0093)-2002，其以透骨香、大血藤、金铁锁为对照药材分别进行薄层色谱鉴别，但仅对透骨香、大血藤和金铁锁三味药进行TLC鉴别是不能保证质量标准的完善和鉴别的精确性的。为此，本申请人继续研究，申请了如下专利：1)治疗关节肿痛的胶囊制剂的检测方法(CN200910312147.3)，该方案在对透骨香、大血藤和金铁锁进行TLC鉴别的基础上增加了对胶囊中富马酸的含量测定(参照中国药典2005年版一部附录VI D中高效液相色谱法)；2) 一种治疗关节疼痛的药物制剂的检测方法(CN201410068821.9)，该方法将TLC鉴别和有效成分测定相结合，其中鉴别是对透骨香、大血藤、金铁锁、八角枫的TLC鉴别，含量测定是照中国药典2010年版一部附录VID高效液相色谱法对胶囊中八角枫碱的含量测定，照中国药典2010年版一部附录VA紫外-可见分光光度法对胶囊中总黄酮类的含量测定；但考虑到金骨莲胶囊的物质基础研究还不够完善，其有效成分尚未完全清晰，所以目前已公开的方法仍不能有效、准确的评价、控制产品质量。
为了提高对药品质量的控制精确度，分析出金骨莲制剂中活性成分，本申请人首次对金骨莲胶囊、片剂等建立指纹图谱，这对金骨莲制剂的质量评价、控制具有指导意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提出了一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法，具体表现为：指纹图谱表征较全面，客观真实地反映了产品内在化学成分的种类与数量，与对照相比相似度高，本发明首次建立金骨莲胶囊、片剂、颗粒剂等制剂的指纹图谱，提高了对产品质量的检测要求，以便于使得金骨莲质量检测方法的测量结果更准确可靠，提高金骨莲制剂的质量控制，有助于建立产品完善的质量控制体系，进而有助于保障药品质量和临床药效。
具体是通过以下技术方案来实现的：
一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法，所述制剂是由以下重量份的主药与辅料制成：透骨香300-400g、汉桃叶 350-450g、大血藤350-420g、八角枫40-60g、金铁锁40-60g；
所述指纹图谱建立方法是采用HPLC法对制剂中透骨香、汉桃叶、大血藤、八角枫、金铁锁五味药材，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B进行梯度洗脱的指纹图谱表征过程。
所述高效液相色谱，其工作条件：色谱柱为ACE Excel 5 C18-PFP，流速0.7-1.0mL/min，柱温25-40℃，检测波长200-220nm，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水，进样量10μL；所述梯度洗脱条件为：0-40min，流动相A 5-20％；40-50min，流动相A 20-25％；50-55min，流动相A25-35％。
进一步优选，所述高效液相色谱，其工作条件：色谱柱为ACE Excel 5C18-PFP，流速0.8mL/min，柱温40℃，检测波长210nm，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水，进样量10μL；所述梯度洗脱条件为：0-40min，流动相A 5-20％；40-50min，流动相A20-25％； 50-55min，流动相A25-35％。
所述指纹图谱表征方法，是将供试品溶液、参照物溶液分别注入液相色谱仪，按照高效液相色谱工作条件进行测定，记录0-55min的色谱图；
其中，供试品溶液的制备：称取金骨莲制剂内容物1.0g置于具塞锥形瓶中，然后加入甲醇25mL后称定重量，在200-300W、35-40kHz 条件下超声处理30min后取出，冷却后称重，采用甲醇补足减失重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：以甲醇为溶剂，分别制成1.100-1.150mg/mL 富马酸对照品溶液、1.000-1.100mg/mL没食子酸对照品溶液、 1.000-1.100mg/mL原儿茶酸对照品溶液、1.000-1.100mg/mL红景天苷对照品溶液、1.100-1.200mg/mL绿原酸对照品溶液、0.300-0.500mg/mL 香草酸对照品溶液、1.000-1.100mg/mL表儿茶素对照品溶液、 0.900-1.000mg/mL鹅掌楸苷对照品溶液、1.100-1.150mg/mL滇白珠苷 A对照品溶液，精密移取各单一对照品溶液，用甲醇配制成参照物溶液；
所述指纹图谱表征项目中：供试品指纹图谱分别呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，分析0min～55min图谱，供试品指纹图谱与参照物指纹图谱经相似度计算不低于0.85。
进一步优选，所述指纹图谱表征方法，是将供试品溶液、参照物溶液分别注入液相色谱仪，按照高效液相色谱工作条件进行测定，记录0-55min的色谱图；
其中，供试品溶液的制备：称取金骨莲制剂内容物1.0g置于具塞锥形瓶中，然后加入50％甲醇25mL后称定重量，在300W、40kHz 条件下超声处理30min后取出，冷却后称重，采用50％甲醇补足减失重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：以甲醇为溶剂，分别制成1.120mg/mL富马酸对照品溶液、1.002mg/mL没食子酸对照品溶液、1.038mg/mL原儿茶酸对照品溶液、1.046mg/mL红景天苷对照品溶液、1.182mg/mL绿原酸对照品溶液、0.402mg/mL香草酸对照品溶液、1.032mg/mL表儿茶素对照品溶液、0.950mg/mL鹅掌楸苷对照品溶液、1.116mg/mL滇白珠苷A对照品溶液，精密移取各单一对照品溶液，用50％甲醇配制成参照物溶液；
所述指纹图谱表征项目中：供试品指纹图谱分别呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，分析0min～55min图谱，供试品指纹图谱与参照物指纹图谱经相似度计算不低于0.85。
所述指纹图谱由富马酸、没食子酸、原儿茶酸、红景天苷、绿原酸、香草酸、表儿茶素、鹅掌楸苷、滇白珠苷A色谱峰组成了治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的特征性指纹图谱。
所述指纹图谱由19个共有峰组成，其中2号峰为富马酸峰、3 号峰为没食子酸峰、6号峰为原儿茶酸峰、7号峰为红景天苷峰、9 号峰为绿原酸峰、12号峰为香草酸峰、13号峰为表儿茶素峰、15号峰为鹅掌楸苷峰、16号峰为滇白珠苷A峰。
所述治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂为胶囊剂、颗粒剂、片剂中任一。
所述治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂为金骨莲制剂，比如上市产品金骨莲胶囊。
有益效果：
1、本发明采用HPLC对金骨莲制剂进行指纹图谱的表征，标定了19个峰，并结合参照物溶液的色谱图进行比较，明确了9个共有峰，分别为富马酸、没食子酸、原儿茶酸、红景天苷、绿原酸、香草酸、槲皮素、鹅掌楸苷和滇白珠苷A，指纹图谱表征较全面，客观真实地反映了产品内在活性成分的种类与数量，与参照物溶液的色谱图相比相似度高，相似度大于0.85，能有效表征产品质量。
2、本发明方法简单、易操作、耐用性高，并且通过多批样品的指纹图谱考察，进一步表明了金骨莲制剂工艺和产品质量稳定性，与本申请人前期申请的CN200910312147.3、CN201410068821.9比较，更适合金骨莲制剂的质量控制，方法准确有效。
3、本发明方法准确有效、精密度高、重现性好、稳定性优。
为能更好的阐述本发明的有益效果，本发明还列举了如下研究过程，旨在说明本发明的有益效果，但决不仅限于本发明的保护范围。
一、指纹图谱表征研究
本发明研究过程中，虽然CN200910312147.3、CN201410068821.9 均公开了金骨莲制剂的检测方法，但是两者主要为薄层鉴别和含量测定，并未建立完善的指纹图谱。
同时，在现行标准中公开了金铁锁(DB52/YC240-2003)、八角枫(YNZYC-0097-2007)、大血藤、汉桃叶(DB52-YC140-2003)的鉴别，但主要是在细胞学鉴别以及薄层鉴别，对于指纹图谱的建立尚不全面，而对于透香骨的鉴别还存在空白。
另外，虽然专利申请号CN201811226190.3公开了一种八味龙钻颗粒HPLC指纹图谱及主要成分含量测定方法，专利申请号 CN200410097191.4公开了一种治疗癌性疼痛中药组合物的质量控制方法及应用，两者均是利用高效液相色谱法记录色谱图，但是八味龙钻颗粒由飞龙掌血、大钻、两面针、青风藤、鸡血藤、九龙藤、八角枫及五指毛桃八味药组成，治疗癌性疼痛中药组合物由青风藤、白屈菜、汉桃叶组成；所以原料药组成成分是截然不同的，由于产品活性成分不同，所以参考意义不大。
因此，本发明力图寻找更加适合金骨莲制剂的指纹图谱表征方法，使得图谱反映信息丰富、共有峰多、且成分确认、共有峰的来源清晰。主要进行了供试品制备的研究、色谱条件研究、方法学考察研究、金骨莲样品检测研究等内容。
1.1供试品溶液制备
称取金骨莲制剂内容物1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，称定重量，于300W、40kHz条件下超声处理30min，取出，冷却后称重，50％甲醇补足减失重量，摇匀，取适量过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
1.2色谱条件
采用ACE Excel 5C18-PFP(250×4.6mm id)色谱柱，流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水(B)；流速为0.8mL/min；进样量为10μL；柱温为40℃；检测波长：210nm；梯度洗脱为：0-40min，流动相A 5-20％；40-50min，流动相A20-25％；50-55min，流动相A25-35％。
1.3方法学研究
按照指纹图谱相关技术要求，对指纹图谱检测方法进行精密度、稳定性和重复性考察，并采用指纹图谱相似度评价软件计算相关结果，其结果均符合要求；
其中，精密度试验是按“供试品溶液制备”制备1份供试品溶液，连续进样6次进行检测，记录所得图谱，以15号峰鹅掌楸苷为参照峰(分离度良好，峰面积较大且为所有批次共有)，计算主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果显示各色谱峰的相对保留时间的RSD均小于0.08％，相对峰面积的RSD均小于2.69％，说明该仪器精密度良好。
稳定性试验是按“供试品溶液制备”制备1份供试品溶液，分别在约0，4，8，16，26，34小时检测，以15号峰鹅掌楸苷为参照峰，计算主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD；结果显示各色谱峰的相对保留时间的RSD均小于0.42％，相对峰面积的RSD均小于4.77％，说明供试溶液在24h稳定性良好；
重复性试验是按“供试品溶液制备”平行制备6份供试品溶液，分别在前述色谱条件下进行检测，以15号峰鹅掌楸苷为参照峰，计算主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果显示各色谱峰的相对保留时间的RSD均小于0.37％，相对峰面积的RSD均小于4.73％，说明该分析方法重复性良好。
1.4样品检测研究
对12批样品进行了指纹图谱检测，并采用指纹图谱相似度评价软件计算相关结果，生成对照指纹图谱，结果表明，相似度在0.91 以上，各批次重复性良好，制剂工艺较稳定。
1.5对照品峰指认研究
在相同色谱条件下，进样参照物溶液；
参照物溶液的制备：以甲醇为溶剂，分别制成1.120mg/mL富马酸对照品溶液、1.002mg/mL没食子酸对照品溶液、1.038mg/mL原儿茶酸对照品溶液、1.046mg/mL红景天苷对照品溶液、1.182mg/mL绿原酸对照品溶液、0.402mg/mL香草酸对照品溶液、1.032mg/mL表儿茶素对照品溶液、0.950mg/mL鹅掌楸苷对照品溶液、1.116mg/mL滇白珠苷A对照品溶液，精密移取各单一对照品溶液，用50％甲醇配制成参照物溶液；
结果表明，在此色谱条件下，确定：2号峰为富马酸、3号峰为没食子酸、6号峰为原儿茶酸、7号峰为红景天苷、9号峰为绿原酸、 12号峰为香草酸、13号峰为表儿茶素、15号峰为鹅掌楸苷、16号峰为滇白珠苷A。
1.6峰归属研究
按照现有技术中金骨莲制剂的制备工艺，分别制备大血藤、透骨香、汉桃叶、八角枫、金铁锁单煎液，然后按照“供试品溶液的制备方法”分别制成各药材供试品溶液，在已确定的色谱条件下，分别进样各单味药材对比溶液和成品供试品溶液，确定对照指纹图谱中各峰的归属。
结果见图2：1号为5味药材共有；2、8、11号峰来源于汉桃叶； 5、7、10、12、15号峰来源于大血藤药材；16、17、19号峰来源于透骨香药材；3号为八角枫和大血藤共有；4、9、14、18号峰为大血藤和汉桃叶共有；6号为大血藤、汉桃叶、透骨香共有。
二、供试品溶液制备方法与色谱工作条件研究
1.1供试品溶液的制备方法研究
金骨莲制剂由大血藤、八角枫、透骨香、汉桃叶和金铁锁五味药制成，经HPLC初步检测后，发现含有大量化合物，极性相近且色谱峰众多，因此样品需进行预处理，以得到分离度较好的更多的色谱峰信号。
方法一：称取金骨莲制剂内容物1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，称定重量，于300W、40kHz条件下超声处理30min，取出，冷却后称重，50％甲醇补足减失重量，摇匀，取适量过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
方法二：称取金骨莲制剂内容物1.0g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入50％甲醇25ml，称定重量，水浴回流提取2小时，冷却，称重，以50％甲醇补足减失重量，以022μm微孔滤膜滤过，即得；
方法三：称取金骨莲制剂内容物1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入75％乙醇25mL，称定重量，于300W、40kHz条件下超声处理30min，取出，冷却后称重，75％乙醇补足减失重量，摇匀，取适量过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
结果：首先方法二的提取时间过长，会导致成本变化造成多杂峰，因此不适用；其次，方法三中由于乙醇有极强的挥发性，虽然能够减少干扰因子，但溶解性不如甲醇，并且若将乙醇和水浴的热量或超声波的振动作用力配合，易造成有效成分挥发进而导致检测准确性下降，所以相比之下，以甲醇为溶剂，配合超声波处理，更能保证精确度等。
1.2色谱条件选择研究
1.2.1检测波长选择：对供试品溶液进行了全波长检测，结果表明，大多数成分在200-220nm处有较好的紫外吸收，且在210nm处峰特征最为显著、清晰。
1.2.2色谱柱选择
考虑到ACE Excel 5C18-PFP是将C18结合五氟苯基，具有构型的选择性，所以能够发现多种杂质、同分异构体、位置异构体等，因此选择ACE Excel 5C18-PFP。
附图说明
图1为金骨莲制剂对照指纹图谱；
9个共有峰：2号峰为富马酸、3号峰为没食子酸、6号峰为原儿茶酸、7号峰为红景天苷、9号峰为绿原酸、12号峰为香草酸、13号峰为表儿茶素、15号峰为鹅掌楸苷、16号峰为滇白珠苷A；
图2：参照物溶液和金骨莲制剂的指纹图谱对比图；其中，A为参照物溶液指纹图谱，B为金骨莲制剂指纹图谱；
图3：单味药材对比溶液和金骨莲制剂的指纹图谱对比图；
图4：12批金骨莲胶囊聚类分析树状图；
图5：金骨莲胶囊的PCA得分图；
图6：金骨莲胶囊主成分模型载荷图；
图7：金骨莲胶囊正交偏最小二乘法判别分析得分图；
图8：金骨莲胶囊正交偏最小二乘法判别分析VIP值图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂(金骨莲制剂)的指纹图谱建立方法，是采用HPLC法对制剂中透骨香、汉桃叶、大血藤、八角枫、金铁锁五味药材，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B 进行梯度洗脱的指纹图谱表征过程，具体地：将供试品溶液、参照物溶液、单味药材对比溶液分别注入液相色谱仪，按照高效液相色谱工作条件进行测定，记录0-55min的色谱图；
所述高效液相色谱，其工作条件：色谱柱为ACE Excel 5 C18-PFP，流速0.8mL/min，柱温40℃，检测波长210nm，流动相A 为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水，进样量10μL；所述梯度洗脱条件为：0-40min，流动相A 5-20％；40-50min，流动相A 20-25％； 50-55min，流动相A25-35％；
供试品溶液的制备：称取金骨莲制剂内容物1.0g置于具塞锥形瓶中，然后加入50％甲醇25mL后称定重量，在300W、40kHz条件下超声处理30min后取出，冷却后称重，采用50％甲醇补足减失重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：以甲醇为溶剂，分别制成1.120mg/mL富马酸对照品溶液、1.002mg/mL没食子酸对照品溶液、1.038mg/mL原儿茶酸对照品溶液、1.046mg/mL红景天苷对照品溶液、1.182mg/mL绿原酸对照品溶液、0.402mg/mL香草酸对照品溶液、1.032mg/mL表儿茶素对照品溶液、0.950mg/mL鹅掌楸苷对照品溶液、1.116mg/mL滇白珠苷A对照品溶液，精密移取各单一对照品溶液，用50％甲醇配制成参照物溶液；
单味药材对比溶液参照“供试品溶液的制备”将金骨莲制剂内容物替换为大血藤、透骨香、汉桃叶、八角枫、金铁锁；
所述指纹图谱表征项目中：供试品指纹图谱分别呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，分析0min～55min图谱，供试品指纹图谱与参照物指纹图谱经相似度计算不低于0.85；
按前述方法测定金骨莲制剂12批，采用《中药指纹图谱相似度评价系统》(2012版)对12批金骨莲制剂的指纹图谱进行相似度计算，结果：12批金骨莲制剂的相似度均在0.91以上，说明该制剂各批次之间相似度良好，质量较稳定；19个共有峰(见图1)：15号色谱峰保留时间适中、分离度良好，峰面积较大的鹅掌楸苷作为参照峰；
与参照物溶液的色谱图信息对比(见图2)，共指认9个成分，分别为2号峰为富马酸、3号峰为没食子酸、6号峰为原儿茶酸、7 号峰为红景天苷、9号峰为绿原酸、12号峰为香草酸、13号峰为表儿茶素、15号峰为鹅掌楸苷、16号峰为滇白珠苷A。
与单味药材对比溶液的HPLC色谱图信息对比(见图3)，将金骨莲制剂内容物的指纹图谱共有峰进行药材归属，结果如下：1号峰为5味药材共有；2、8、11号峰来源于汉桃叶；5、7、10、12、15 号峰来源于大血藤药材；16、17、19号峰来源于透骨香药材；3号为八角枫和大血藤共有；4、9、14、18号峰为大血藤和汉桃叶共有；6 号为大血藤、汉桃叶、透骨香共有。
实施例2
一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法，所述制剂的制备：透骨香343g、汉桃叶400g、大血藤370g、八角枫50g、金铁锁50g、淀粉125g，以上五味药材，金铁锁加水煎煮3小时，滤过，滤液备用，药渣干燥后粉碎成细粉，备用；其余四味，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，合并上述滤液，浓缩至60℃测相对密度为1.25～1.28的清膏，然后加入细粉及淀粉，混匀，干燥，粉碎，过筛，装入胶囊，制成1000粒；
所述检指纹图谱建立方法是采用HPLC法对胶囊剂中透骨香、汉桃叶、大血藤、八角枫、金铁锁五味药材，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B进行梯度洗脱的指纹图谱表征过程；
所述高效液相色谱，其工作条件：色谱柱为ACE Excel 5 C18-PFP，流速0.8mL/min，柱温32℃，检测波长200nm，流动相A 为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水，进样量10μL；所述梯度洗脱条件为：0-40min，流动相A 5-20％；40-50min，流动相A 20-25％； 50-55min，流动相A25-35％；
所述指纹图谱表征方法，是将供试品溶液或参照物溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱工作条件进行测定，记录0-55min的色谱图，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算不低于0.91；
其中，供试品溶液的制备：称取金骨莲胶囊内容物1.0g置于具塞锥形瓶中，然后加入50％甲醇25mL后称定重量，在200W、35kHz 条件下超声处理30min后取出，冷却后称重，采用50％甲醇补足减失重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：以甲醇为溶剂，分别制成1.100mg/mL富马酸对照品溶液、1.000mg/mL没食子酸对照品溶液、1.000mg/mL原儿茶酸对照品溶液、1.000mg/mL红景天苷对照品溶液、1.100mg/mL绿原酸对照品溶液、0.300mg/mL香草酸对照品溶液、1.000g/mL表儿茶素对照品溶液、0.900mg/mL鹅掌楸苷对照品溶液、1.100mg/mL滇白珠苷A对照品溶液，精密移取各单一对照品溶液，用50％甲醇配制成参照物溶液；
所述指纹图谱表征项目中：供试品指纹图谱分别呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，分析0min～55min图谱，供试品指纹图谱与参照物指纹图谱经相似度计算不低于0.85；
按前述方法测定金骨莲胶囊12批，采用《中药指纹图谱相似度评价系统》(2012版)对12批金骨莲胶囊的指纹图谱进行相似度计算，结果：12批金骨莲胶囊的相似度均在0.91以上，说明该制剂各批次之间相似度良好，质量较稳定；19个共有峰：15号色谱峰保留时间适中、分离度良好，峰面积较大的鹅掌楸苷作为参照峰；
与参照物溶液的色谱图信息对比，共指认9个成分，分别为2号峰为富马酸、3号峰为没食子酸、6号峰为原儿茶酸、7号峰为红景天苷、9号峰为绿原酸、12号峰为香草酸、13号峰为表儿茶素、15 号峰为鹅掌楸苷、16号峰为滇白珠苷A。
实施例3
一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法，建立方法同实施例2，区别在于：所述胶囊剂的制备：透骨香343g、汉桃叶400g、大血藤370g、八角枫50g、金铁锁50g、淀粉125g，以上五味药材，金铁锁加5倍量水煎煮2小时，滤过，滤液备用，药渣干燥后粉碎成细粉，备用；其余四味，加4倍量水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，合并上述滤液，浓缩至60℃测相对密度为1.25～1.28的清膏，然后加入细粉及淀粉，混匀，干燥，粉碎，过筛，装入胶囊，制成1000粒。
实施例4
一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法，所述片剂的制备：透骨香343g、汉桃叶400g、大血藤370g、八角枫50g、金铁锁50g、淀粉125g，以上五味药材，金铁锁加水煎煮3小时，滤过，滤液备用，药渣干燥后粉碎成细粉，备用；其余四味，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，合并上述滤液，浓缩至60℃测相对密度为1.25～1.28的清膏，然后加入细粉及淀粉，混匀，干燥，粉碎，过筛，压片，制成1000片；
所述检指纹图谱建立方法是采用HPLC法对片剂中透骨香、汉桃叶、大血藤、八角枫、金铁锁五味药材，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B进行梯度洗脱的指纹图谱表征过程；
所述高效液相色谱，其工作条件：色谱柱为ACE Excel 5 C18-PFP，流速0.8mL/min，柱温25℃，检测波长220nm，流动相A 为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水，进样量10μL；所述梯度洗脱条件为：0-40min，流动相A 5-20％；40-50min，流动相A 20-25％； 50-55min，流动相A25-35％；
所述指纹图谱表征方法，是将供试品溶液或参照物溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱工作条件进行测定，记录0-55min的色谱图；
其中，供试品溶液的制备：称取金骨莲片剂内容物1.0g置于具塞锥形瓶中，然后加入50％甲醇25mL后称定重量，在240W、38kHz 条件下超声处理30min后取出，冷却后称重，采用50％甲醇补足减失重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：以甲醇为溶剂，分别制成1.150mg/mL富马酸对照品溶液、1.100mg/mL没食子酸对照品溶液、1.100mg/mL原儿茶酸对照品溶液、1.100mg/mL红景天苷对照品溶液、1.200mg/mL绿原酸对照品溶液、0.500mg/mL香草酸对照品溶液、1.100mg/mL表儿茶素对照品溶液、1.000mg/mL鹅掌楸苷对照品溶液、1.150mg/mL滇白珠苷A对照品溶液，精密移取各单一对照品溶液，用50％甲醇配制成参照物溶液；
所述指纹图谱表征项目中：供试品指纹图谱分别呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，分析0min～55min图谱；
按前述方法测定金骨莲片12批，采用《中药指纹图谱相似度评价系统》(2012版)对12批金骨莲片的指纹图谱进行相似度计算，结果：12批金骨莲片的相似度均在0.910以上，说明该制剂各批次之间相似度良好，质量较稳定；19个共有峰：15号色谱峰保留时间适中、分离度良好，峰面积较大的鹅掌楸苷作为参照峰；
与参照物溶液的色谱图信息对比，共指认9个成分，分别为2号峰为富马酸、3号峰为没食子酸、6号峰为原儿茶酸、7号峰为红景天苷、9号峰额绿原酸、12号峰为香草酸、13号峰为表儿茶素、15 号峰为鹅掌楸苷、16号峰为滇白珠苷A。
实验例1化学模式识别
1.1聚类分析
运用SPSS24.0软件，以实施例中12批金骨莲胶囊的19个共有峰的相对峰面积为变量，采用Word法，以欧氏距离作为度量标准进行聚类分析(HCA)，结果见图4；当欧氏距离为20时，12批样品共聚为2类：S1～S7聚为一类；S8～S12聚为另一类；当欧氏距离为 10时，12批样品共聚为3类：S1～S4，S7批次样品聚为第一类；S8～S12 批次样品聚为第二类；S5、S6聚为第三类；
1.2主成分分析
以12×19峰面积数据矩阵为数据，运用SIMCA14.0软件对12 批金骨莲胶囊进行主成分分析，特征值、方差贡献率及累计贡献率见表1；提取的前3个主成分的累计方差贡献率达到85.324％，表明前三个成分能够反映金骨莲胶囊的基本特征和大部分信息；图5为PCA得分图，结果与聚类分析基本一致，也进一步验证了聚类分析的分类结果。根据变量离原点的距离判定变量对主成分的权重影响，离远点越远则表明该该变量对主成分的影响权重越大；由载荷散点图(见图 6)分析得到5、14、9(绿原酸)、2和10、16(滇白珠苷A)、17、 18、19、11、15(鹅掌楸苷)号色谱峰对主成分2的贡献较大。
表1金骨莲胶囊主成分分析特征值与方差贡献率
1.3正交偏最小二乘法-判别分析
将12批样品得19个共有峰分面积导入SIMCA14.0，对12批金骨莲胶囊正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)，在该模型下12 批金骨莲制剂样品的得分矩阵图[R2X＝0.82912，R2Y＝1.000， Q2＝0.907，均大于0.5]，表明该模型具有较好预测能力。12批样品共分为3类(见图7)与聚类分析和主成分分析一致。
为进一步筛选出导致12批样品产生差异的成分，通过提取 OPLS-DA模型中19个变量的重要值(Variable importance in projection, VIP)，以VIP>1为标准，筛选出15号峰(鹅掌楸苷)、14号峰、6 号峰(原儿茶酸)、18号峰、16号峰(滇白珠苷A)、19号峰、9 号峰(绿原酸)(见图8)可能是导致样品之间产生差异的主要原因，具有一定的标志性作用，该结果与主成分分析载荷图中寻找的重要性权重变量基本一致。
从聚类分析结果来看，在不同年份及月份生产的金骨莲胶囊中的化学成分含量存在一定的差异，可能与制剂所用的原药材来源、采收季节以及原药材批间质量差异有关。随后进行了无监督的主成分分析，该分类结果与聚类分析一致，也进一步验证了聚类分析的结果。在对金骨莲胶囊进行一致性评价的同时进行了差异性评价，通过 OPLS-DA法筛选对样品组分影响较大的色谱峰，发现导致样品批次间差异的成分主要为15号峰(鹅掌楸苷)、14号峰、6号峰(原儿茶酸)、18号峰、16号峰(滇白珠苷A)、19号峰、9号峰(绿原酸)，这与本发明指纹图谱分析结果相似度极高，说明了本发明对金骨莲制剂的指纹图谱建立是科学合理、高有效性的。
Claims (9)
1.一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法，所述药物制剂是由以下重量份的主药与辅料制成：透骨香300-400g、汉桃叶350-450g、大血藤350-420g、八角枫40-60g、金铁锁40-60g制剂；其特征在于，所述指纹图谱建立方法是采用HPLC法对制剂中透骨香、汉桃叶、大血藤、八角枫、金铁锁五味药材，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水为流动相B进行梯度洗脱的指纹图谱表征过程。
2.如权利要求1所述一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述高效液相色谱，其工作条件：色谱柱为ACE Excel 5C18-PFP，流速0.7-1.0mL/min，柱温25-40℃，检测波长200-220nm，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水，进样量10μL。
3.如权利要求1或2所述一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述高效液相色谱，其工作条件：色谱柱为ACE Excel 5C18-PFP，流速0.8mL/min，柱温40℃，检测波长210nm，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水，进样量10μL。
4.如权利要求1所述一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，梯度洗脱条件为：0-40min，流动相A5-20％；40-50min，流动相A20-25％；50-55min，流动相A25-35％。
5.如权利要求1所述一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述指纹图谱表征方法，是将供试品溶液、参照物溶液分别注入液相色谱仪，按照高效液相色谱工作条件进行测定，记录0-55min的色谱图；
其中，供试品溶液的制备：称取金骨莲制剂内容物1.0g置于具塞锥形瓶中，然后加入甲醇25mL后称定重量，在200-300W、35-40kHz条件下超声处理30min后取出，冷却后称重，采用甲醇补足减失重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：以甲醇为溶剂，分别制成1.100-1.150mg/mL富马酸对照品溶液、1.000-1.100mg/mL没食子酸对照品溶液、1.000-1.100mg/mL原儿茶酸对照品溶液、1.000-1.100mg/mL红景天苷对照品溶液、1.100-1.200mg/mL绿原酸对照品溶液、0.300-0.500mg/mL香草酸对照品溶液、1.000-1.100mg/mL表儿茶素对照品溶液、0.900-1.000mg/mL鹅掌楸苷对照品溶液、1.100-1.150mg/mL滇白珠苷A对照品溶液，精密移取各单一对照品溶液，用甲醇配制成参照物溶液。
6.如权利要求1或5所述一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述指纹图谱表征方法，是将供试品溶液、参照物溶液分别注入液相色谱仪，按照高效液相色谱工作条件进行测定，记录0-55min的色谱图；
其中，供试品溶液的制备：称取金骨莲制剂内容物1.0g置于具塞锥形瓶中，然后加入50％甲醇25mL后称定重量，在300W、40kHz条件下超声处理30min后取出，冷却后称重，采用50％甲醇补足减失重量，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：以甲醇为溶剂，分别制成1.120mg/mL富马酸对照品溶液、1.002mg/mL没食子酸对照品溶液、1.038mg/mL原儿茶酸对照品溶液、1.046mg/mL红景天苷对照品溶液、1.182mg/mL绿原酸对照品溶液、0.402mg/mL香草酸对照品溶液、1.032mg/mL表儿茶素对照品溶液、0.950mg/mL鹅掌楸苷对照品溶液、1.116mg/mL滇白珠苷A对照品溶液，精密移取各单一对照品溶液，用50％甲醇配制成参照物溶液。
7.如权利要求5或6所述一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述指纹图谱表征项目中：供试品指纹图谱分别呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，分析0min～55min图谱，供试品指纹图谱与参照物指纹图谱经相似度计算不低于0.85。
8.如权利要求1所述一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述指纹图谱由富马酸、没食子酸、原儿茶酸、红景天苷、绿原酸、香草酸、表儿茶素、鹅掌楸苷、滇白珠苷A色谱峰组成了治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的特征性指纹图谱。
9.如权利要求1所述一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述指纹图谱由19个共有峰组成，其中2号峰为富马酸峰、3号峰为没食子酸峰、6号峰为原儿茶酸峰、7号峰为红景天苷峰、9号峰为绿原酸峰、12号峰为香草酸峰、13号峰为表儿茶素峰、15号峰为鹅掌楸苷峰、16号峰为滇白珠苷A峰。
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