CN112877287A - 泥螺多肽在制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂中的用途 - Google Patents

泥螺多肽在制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于干细胞技术领域，尤其涉及泥螺多肽在制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂中的用途。本发明通过如下制备方法制备出一种泥螺多肽：将泥螺洗净，取软体组织，冻干粉碎，加入3倍重量的水，得到泥螺匀浆液；加入0.02倍泥螺匀浆液重量的木瓜蛋白酶，调节pH为6，55℃恒温水浴4小时，得到泥螺酶解液；95℃水浴加热20分钟，5000r/min离心取上清，得到粗泥螺提取液；将粗泥螺提取液经过孔径2nm的纳滤膜，得到细泥螺提取液；将细泥螺提取液置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，得到泥螺多肽。通过实验发现，本发明所制备的泥螺多肽能够有效的促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

Description

泥螺多肽在制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂中的用途
本案为分案申请，原申请的发明名称为一种促进间充质干细胞成骨分化的促进剂，原申请的申请日为：2020-06-22，原申请的申请号为：CN202010576883.6。
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，尤其涉及泥螺多肽在制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂中的用途。
背景技术
在骨损伤的临床治疗工作中，治疗和预防大块骨缺损、术后骨不连以及骨质疏松已经成为骨科亟待解决的难题。传统的植骨手术损伤大，骨量有限，需要一种创伤小、安全有效的方法代替它，目前组织工程技术已经成为解决骨不连和骨缺损的重要方法，增强骨形成是有效治疗骨损伤的重要策略。
骨髓间充质干细胞是一类具有自我更新以及多向分化潜能的原始细胞，是体内成骨细胞的主要来源。骨髓间充质干细胞的增殖以及成骨分化对于维持成骨细胞的数量具有重要的意义。目前，组织工程技术常常会面临成骨细胞不足的问题，因此，寻找新的能够存进骨髓间充质干细胞成骨分化的物质是目前急需解决的问题。
由于海洋生物资源繁多，再生能力强，因此，海洋生物成为活性肽的重要来源。海洋生物因其生活环境的不同，而拥有独特的生理性状，从而存在许多具有特殊生物活性的物质，因而具有巨大的开发潜力。
泥螺属软体动物门、泥螺属，为太平洋西岸海水及咸淡水特产的种类。我国主要在宁波和辽宁的东港产泥螺。泥螺软体部分含有丰富的蛋白质和多肽。目前的研究显示，泥螺多肽具有抗肿瘤的作用，但是关于泥螺多肽在骨髓间充质干细胞成骨分化方面的研究目前尚无。
发明内容
本发明的目的在于提供一种泥螺多肽促进骨髓间充质干细胞成骨分化中的新用途。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种促进间充质干细胞成骨分化的促进剂，所述促进剂为泥螺多肽。
优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
优选地，所述泥螺多肽的制备方法如下：
（1）将泥螺洗净，取软体组织，冻干粉碎，加入3倍重量的水，得到泥螺匀浆液；
（2）加入0.02倍泥螺匀浆液重量的木瓜蛋白酶，调节PH为6，55℃恒温水浴4小时，得到泥螺酶解液；
（3）95℃水浴加热20分钟,5000r/min离心取上清，得到粗泥螺提取液；
（4）将粗泥螺提取液经过孔径2nm的纳滤膜，得到细泥螺提取液；
（5）将细泥螺提取液置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，得到泥螺多肽。
优选地，所述促进剂用于促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞。
此外，本发明提供了一种泥螺多肽在促进骨髓间充质干细胞成骨分化中的用途。
优选地，所述用途包括泥螺多肽在促进骨髓间充质干细胞成骨分化基因ALP、RUNX2和BGLAP表达中的用途。
优选地，所述泥螺多肽的制备方法如下：
（1）将泥螺洗净，取软体组织，冻干粉碎，加入3倍重量的水，得到泥螺匀浆液；
（2）加入0.02倍泥螺匀浆液重量的木瓜蛋白酶，调节PH为6，55℃恒温水浴4小时，得到泥螺酶解液；
（3）95℃水浴加热20分钟,5000r/min离心取上清，得到粗泥螺提取液；
（4）将粗泥螺提取液经过孔径2nm的纳滤膜，得到细泥螺提取液；
（5）将细泥螺提取液置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，得到泥螺多肽。
此外，本发明提供了一种泥螺多肽的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
（1）将泥螺洗净，取软体组织，冻干粉碎，加入3倍重量的水，得到泥螺匀浆液；
（2）加入0.02倍泥螺匀浆液重量的木瓜蛋白酶，调节PH为6，55℃恒温水浴4小时，得到泥螺酶解液；
（3）95℃水浴加热20分钟,5000r/min离心取上清，得到粗泥螺提取液；
（4）将粗泥螺提取液经过孔径2nm的纳滤膜，得到细泥螺提取液；
（5）将细泥螺提取液置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，得到泥螺多肽。
除此之外，本发明提供了泥螺多肽在制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂中的用途。
本发明的有益效果在于：
本发明首次证明泥螺多肽具有促进骨髓间充质干细胞成骨分化的用途，并且证明泥螺多肽能够有效的促进成骨分化相关基因BGLAP、ALP和RUNX2的表达，从而可以为治疗骨质疏松，骨损伤等疾病提供更多的成骨细胞。
附图说明
图1 不同浓度泥螺多肽对于成骨分化相关基因ALP mRNA表达的影响。
图2 不同浓度泥螺多肽对于成骨分化相关基因BGLAP mRNA表达的影响。
图3 不同浓度泥螺多肽对于成骨分化相关基因RUNX2 mRNA表达的影响。
图4 泥螺多肽对于成骨分化相关基因 BGLAP、ALP、RUNX2 蛋白表达的影响。
图5 泥螺多肽对于骨髓间充质干细胞矿化的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明实质性内容进行具体介绍，需要说明的是本发明实施例只是对发明内容进行进一步的解释说明，并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1
（1）将泥螺洗净，取100g软体组织，冻干粉碎，加入300g水，得到泥螺匀浆液；
（2）加入8g木瓜蛋白酶，调节PH为6, 55℃恒温水浴4小时，得到泥螺酶解液；
（3）95℃水浴加热20分钟,5000r/min离心取上清，得到粗泥螺提取液；
（4）将粗泥螺提取液经过孔径2nm的纳滤膜，得到细泥螺提取液；
（5）将细泥螺提取液置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，得到泥螺多肽。
实施例2
荧光定量PCR实验
1.RNA提取
（1）将骨髓间充质干细胞接种于培养板中，当细胞密度达到70%时，分别加入含有0mg/ml，25mg/ml，50mg/ml和100mg/ml泥螺多肽的成骨诱导培养液，每2-3天进行一次换液，每组设置有3个重复。
（2）培养14天后，去除培养基，加入500μL Trizol，反复的吹打细胞，直到形成清亮不粘稠的液体；
（3）将混合液转移至1.5mlEP管中，加入100μL氯仿，在振荡器上剧烈震荡充分混匀15s，室温静置5分钟；
（4）4℃，低温高速离心机，12000r/min离心15min，小心将上层透明RNA水相转移至新的无RNA酶EP管中；
（5）加入等体积的异丙醇混匀，冰上放置10min，13000r/min，4℃离心10min，弃去上清，保留沉淀；
（6）加入40μL70%乙醇温和震荡，12000r/min 4℃ 离心5min，弃去上清，管口向下，紧贴滤纸，去除管口的液体，室温下干燥5-10min，检测RNA质量和浓度。
2.RNA反转录为cDNA
（1）反转录体系
试剂 体积
5×Prime Script RT Master Mix 2μL
RNA模板 0.5μg
无RNA酶水 Up to 10μL
（2）反转录反应条件
37℃ 15min；85℃ 5s；4℃
3.荧光定量PCR反应
反应体系：
反应试剂 添加量
SYBR Green Premix Ex Taq（2×） 10μL
Forward 引物 0.4μL
Reverse 引物 0.4μL
cDNA模板 2μL
ddH2O 7.2μL
反应条件：
95℃ 10min；95℃ 30s，60℃ 40s，40个循环；72℃ 5min。
4.引物序列
分子名称 序列
RUNX2 TTCTCCAACCCACGAATGCA（SEQ ID NO.1）
GGTGTGGTAGTGAGTGGTGG（SEQ ID NO.2）
ALP TCGTTGACACCTGGAAGAGC（SEQ ID NO.3）
CCTGTTCAGCTCGTACTGCA（SEQ ID NO.4）
BGLAP GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG（SEQ ID NO.5）
CGGATTGAGCTCACACACCT（SEQ ID NO.6）
GAPDH ACATGGCTGAGAACGGGAAG（SEQ ID NO.7）
GCCTTCTCCATGGTGGTGAA（SEQ ID N0.8）
实验结果如图1，图2和图3所示，从图1可以看出，25mg/ml 泥螺多肽组的ALP基因的相对表达量为1.10±0.06（P＞0.05）, 50mg/ml组的ALP基因的相对表达量为1.57±0.14（P＜0.01），100mg/ml组的ALP基因的相对表达量为2.10±0.18（P ＜0. 001）。
从图2可以看出，25mg/ml泥螺多肽组的BGLAP基因的相对表达量为1.61±0.14（P＜0.01）, 50mg/ml组的BGLAP基因的相对表达量为2.40±0.08（P＜0. 001）, 100mg/ml组的BGLAP基因的相对表达量为2.71±0.19（P＜0. 001）。
从图3可以看出，25mg/ml泥螺多肽组的RUNX2基因的相对表达量为1.12±0.04（P＜0.05）, 50mg/ml组的RUNX2基因的相对表达量为1.323±0.11（P＜0.05）, 100mg/ml组的RUNX基因的相对表达量为1.737±0.06（P＜0.001）。
上述结果说明，泥螺多肽能够有效的促进骨髓间充质干细胞成骨分化相关基因ALP、BGLAP和RUNX2的表达，且在100mg/ml时具有优异的效果。
实施例3
Western blot检测
1.蛋白提取
（1）将骨髓间充质干细胞接种于培养板中，当细胞密度达到70%时，分别加入含有0mg/ml和100mg/ml泥螺多肽的成骨诱导培养液，每2-3天进行一次换液，每组设置有3个重复。
（2）14天后，将100μL RIPA裂解液加入到培养板中，用细胞刮刀将细胞刮下，将细胞裂解液收集至EP管中；
（3）用细胞超声破碎仪将细胞破碎，4℃，12000r/min，离心15min；
（4）将上清转移至新的EP管中，使用BCA法测量蛋白浓度；
（5）使用5×上样缓冲液调整蛋白浓度为2μg/μL，沸水煮5min，得到蛋白样品。
2.Western blot实验
（1）配置12%分离胶，5%浓缩胶，每孔加入10μL蛋白样品；
（2）电泳条件：浓缩胶为恒压90V，时间约20分钟；分离胶为130V，时间约1h；
（3）电转条件：恒流280mA，0.45nm孔径NC膜；转膜时间1.5h；
（4）用镊子轻轻将膜取出，置于5%脱脂奶粉中，室温封闭1h；
（5）按照蛋白大小裁剪条带，孵育相应的ALP，RUNX2和BGLAP一抗，4℃孵育过夜；
（6）第二天将膜取出，在室温下孵育30min，用TBST洗膜，每次3分钟，重复3次；
（7）孵育二抗，室温，摇床孵育1h；
（8）用TBST洗膜，每次3分钟，重复3次，进行显影曝光。
实验结果如图4所示，从图中可以看出，泥螺多肽对于成骨分化相关基因ALP、RUNX2和BGLAP蛋白表达具有促进作用。
实施例4
茜素红染色实验
（1）将骨髓间充质干细胞接种于培养板中，当细胞密度达到70%时，分别加入含有0mg/ml和100mg/ml泥螺多肽的成骨诱导培养液，每2-3天进行一次换液，每组设置有3个重复。
（2）培养21天后，将细胞培养基去除，使用PBS清洗细胞3次，每次3分钟，每孔加入2ml 4%多聚甲醛，室温固定30min；
（3）将多聚甲醛去除，使用PBS清洗细胞3次，每次3分钟，每孔加入1.5ml的茜素红染液，37℃放置30min；
（4）使用PBS清洗细胞3次，每次3分钟，使用倒置显微镜进行拍照。
实验结果如图5所示，从图中可以看出，泥螺多肽能够显著的增强骨髓间充质干细胞的矿化能力。
综上所述，本发明证明，泥螺多肽能够显著的促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。
序列表
<110> 青岛思拓新源细胞医学有限公司
<120> 泥螺多肽在制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂中的用途
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttctccaacc cacgaatgca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtgtggtag tgagtggtgg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgttgacac ctggaagagc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctgttcagc tcgtactgca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgcagcctt tgtgtccaag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 7
<211> 20
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acatggctga gaacgggaag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gccttctcca tggtggtgaa 20

Claims (2)

1.泥螺多肽在制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂中的用途，其特征在于，所述泥螺多肽的制备方法如下：
（1）将泥螺洗净，取软体组织，冻干粉碎，加入3倍重量的水，得到泥螺匀浆液；
（2）加入0.02倍泥螺匀浆液重量的木瓜蛋白酶，调节pH为6，55℃恒温水浴4小时，得到泥螺酶解液；
（3）95℃水浴加热20分钟，5000r/min离心取上清，得到粗泥螺提取液；
（4）将粗泥螺提取液经过孔径2nm的纳滤膜，得到细泥螺提取液；
（5）将细泥螺提取液置于真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，得到泥螺多肽。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途包括泥螺多肽在制备促进骨髓间充质干细胞成骨分化基因ALP、RUNX2和BGLAP表达促进剂中的用途。
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