CN108771666A - Kartogenin在制备提高骨髓间充质干细胞成骨分化能力药物的应用 - Google Patents

Kartogenin在制备提高骨髓间充质干细胞成骨分化能力药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞医药领域，公开了Kartogenin在制备提高骨髓间充质干细胞成骨分化能力药物的应用，试验表明，KGN能够促进BM‑MSC成骨分化，可以提高SIRT1、ALP、COL1A1、RUNX2、BGLAP的基因表达水平以及相应蛋白的表达含量。因此本发明证明了KGN对干细胞的成骨分化潜能具有促进作用，本发明提供的Kartogenin在制备提高骨髓间充质干细胞成骨分化能力药物的应用可为医学研究及组织工程学研究等提供全新的促进骨愈合能力的方案。

Description

Kartogenin在制备提高骨髓间充质干细胞成骨分化能力药物 的应用
技术领域
本发明属于细胞医药领域，涉及使用Kartogenin（以下简称KGN）在制备提高骨髓间充质干细胞成骨分化能力药物的应用。
背景技术
骨髓间充质干细胞（BM-MSC）是一种成体干细胞，其与造血干细胞一同存在于骨髓中。成人组织来源的BM-MSC在生物组织工程学中具有高度的吸引力，由于其自我更新、高增值性和中胚层分化潜力，能够在临床实际应用中修复受损组织，促进组织功能修复。当今学术界普遍认为，成骨细胞起源于BM-MSC。提高BM-MSC的成骨分化能力，对骨生物学研究，乃至临床治疗具有指导意义。
SIRT1基因是一种具有NAD-依赖的蛋白去乙酰化酶活性的多功能转录调节因子，在骨与软骨的代谢中发挥着重要的作用。经典的WNT/β-actin信号转导通路是调节骨代谢的重要信号转导通路，SIRT1可通过与FOXO转录因子结合，从而令其去乙酰化，下调 FOXO3表达，调节WNT/β-actin信号转导通路，促进其介导的成骨转录。大量研究表明，使用SIRT1基因激动剂可促进成骨细胞分化，阻碍干细胞向脂肪细胞分化，有利于骨形成。
现阶段研究表明，RUNX2基因是早期启动成骨转录程序的主要转录因子。RUNX2属RUNX蛋白家族，在成骨细胞分化与骨基质蛋白形成中扮演着重要角色。RUNX2的缺失将会直接导致骨发育不良甚至骨缺损。因此，相对高表达的RUNX2对于成骨细胞的生长与成熟有促进作用，进一步地，可以激活I型胶原（COL1A1）和骨钙蛋白（BGLAP）基因的表达。
SIRT1基因参与骨形成过程，体内外实验表明，沉默SIRT1在机体内的表达可直接降低RUNX2转录因子的活性，抑制成骨细胞生长；反之，提高SIRT1的活性有利于RUNX2、ALP及COL1A1的表达，抑制肿瘤坏死因子-α介导的细胞凋亡。干细胞内SIRT1基因及其他骨形成相关基因的表达量直接影响其成骨分化效果。
Kartogenin（KGN）由Kristen Johnson等在2012年被发现，并发现其能够通过调节CBFb-RUNX1转录程序诱导软骨形成，但对于KGN在成骨诱导方面却无相关报道。我们大胆推测KGN在诱导BM-MSC成骨时也发挥着积极作用。发明人尝试通过体外实验在成人BM-MSC成骨分化阶段加入KGN促进成骨，通过检测相关基因在细胞内的表达证明，取得了良好效果。
发明内容
要解决的技术问题：针对以上现有技术存在的问题，本发明公布了使用KGN在制备提高骨髓间充质干细胞成骨分化能力药物的应用，在骨与软骨修复领域受到广泛关注的今日，目前KGN在许多研究中被证实能够诱导软骨形成修复，而未有相关报道说明KGN在成骨诱导方面的作用。促进BM-MSC诱导成骨可为临床开发新型骨修复药物提供靶点，为研究骨缺损提供新的思路。本发明利用KGN促进成骨分化，并揭示了其作用机制。
技术方案：本发明检测内容包括：（1）KGN对于BM-MSC成骨分化茜素红染色及钙结节定量表现。（2）KGN对于BM-MSC中成骨相关基因及蛋白表达的影响。
Kartogenin在制备提高骨髓间充质干细胞成骨分化能力药物的应用。
优选的，所述的药物为片剂、颗粒剂、口服液、注射液或胶囊剂。
优选的，所述的药物包含药学上有效剂量的Kartogenin和药学上可接受的辅料。
使用KGN促进骨髓间充质干细胞成骨分化的实验方法，包括以下步骤：
（1）使用完全培养液培养骨髓间充质干细胞，每三天换液，观察细胞的密度变化；
（2）待细胞密度大于90%后加入成骨诱导液与KGN溶液进行诱导；
（3）在诱导第14天后进行钙结节定量及测定细胞内成骨分化相关基因及蛋白表达。
进一步的，所用KGN来源于上海Targetmol公司，所述的骨髓间充质干细胞取自成年人。
进一步的，步骤（1）中所述的完全培养液组中包括α-MEM、胎牛血清和抗生素，其中α-MEM和胎牛血清的体积比9:1，抗生素浓度为10~200 U/mL。
进一步的，步骤（2）中所述的成骨诱导液为抗坏血酸、地塞米松和β甘油磷酸钠3种溶液的混合物，成骨诱导液为在完全培养基中加入50ug/mL抗坏血酸，100nM地塞米松，10mMβ甘油磷酸钠。
进一步的，步骤（2）中所述的KGN溶液为KGN粉剂和二甲基亚砜（DMSO）的混合物，0.79mL 1μM DMSO中加入5mg KGN配置成20mM KGN溶液，并稀释为10nM、100nM、1000nM三种不同浓度用于该步骤。
进一步的，步骤（3）中所述的测定细胞内成骨分化相关基因包括SIRT1、ALP、COL1A1、RUNX2、BGLAP。
有益效果：本发明公开了Kartogenin在制备提高骨髓间充质干细胞成骨分化能力药物的应用，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：使用BM-MSC进行成骨诱导时加入KGN 14天后，茜素红染色加深，钙结节定量提高。进一步的，成骨诱导时加入KGN可令细胞内SIRT1、ALP、COL1A1、RUNX2、BGLAP表达自发上调。BM-MSC成骨分化能力的提高，能够促进骨愈合，延缓骨质疏松进程，对于干细胞移植及骨生物学研究有十分重要的意义。本结果说明了KGN在成骨诱导分化方面有着促进作用。本发明为医药学及组织工程学领域成骨相关研究提供了新的方向。
附图说明
图1为实施例1促进骨髓间充质干细胞成骨分化的茜素红染色光镜图（标尺：100μM）；
图2为实施例1促进骨髓间充质干细胞成骨分化的钙结界定量值比较；
图3为实施例2 SIRT1基因相对表达量图；
图4为实施例2 SIRT1蛋白表达的琼脂糖凝胶电泳图；
图5为实施例2 SIRT1蛋白相对表达定量图；
图6为实施例2 ALP基因相对表达量图；
图7为实施例2 COL1A1基因相对表达量图；
图8为实施例2 RUNX2基因相对表达量图；
图9为实施例2 BGLAP基因相对表达量图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
实施例1
（1）复苏骨髓间充质干细胞，接种于175cm2培养瓶中，加入20mL完全培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育，每三天换液。取对数生长期细胞接种于多个12孔培养板，加入完全培养基，每三天换液。待细胞密度大于90%后进行分组，加入成骨诱导液，同时分别加入完全培养基（CTRL组）、0.005% DMSO、10nM KGN、100nM KGN、1000nM KGN，每三天换液。14天后进行茜素红染色及钙结节定量。
实施例2
（1）复苏骨髓间充质干细胞，接种于175cm2培养瓶中，加入20mL完全培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育，每三天换液。取对数生长期细胞接种于多个12孔培养板，加入完全培养基，每三天换液。待细胞密度大于90%后进行分组，加入成骨诱导液，同时分别加入完全培养基（CTRL组）、0.005% DMSO、10nM KGN、100nM KGN、1000nM KGN，每三天换液。14天后进行成骨相关基因及蛋白表达检测。
实验方法：
A. 茜素红染色和钙结节定量
（1）去除孔板内培养液，PBS清洗待测细胞3次。
（2）12孔板内加入4%多聚甲醛，室温固定15min后吸尽，PBS清洗3次。而后孔板内每孔加入300ul茜素红染液，室温染色15min后吸尽，PBS清洗3次。
（3）使用Olympus倒置显微镜采集图像。
（4）图像采集完毕后，12孔板每孔加入200ul 5%高氯酸，室温静置10min。溶解液转移至96孔板内，分组后酶标仪检测420nm波长吸光值，每组检测2个复孔取平均值。
B. RT-PCR鉴定成骨标志基因表达
（1）吸尽培养板内培养液，PBS清洗待测细胞3次。
（2）6孔板每孔加入500μL TRIzol试剂（总RNA抽提试剂，Invitrogen公司），室温下吹打混匀后放入1.5mL EP管。各样品加入100μL氯仿，充分震荡，室温静置15min，12000g 4℃离心12min。吸取上层无色透明清液至另一EP管，各样品加入200μL异丙醇，充分震荡，室温静置10min，12000g 4℃离心8min，弃上清液，获得管底微量羽毛状RNA沉淀。加入适量75%乙醇溶液，震荡EP管，混匀上述RNA沉淀，8000g 4℃离心5min，弃上清液，室温下风干30min。使用无RNA酶水混匀RNA沉淀，60℃放置10min。取少量样品稀释10倍后加入96孔板，酶标仪测260nm、280nm波长吸光值，RNA浓度=(A260/A280)*2μg/μL。
（3）使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo)试剂盒逆转录RNA。反应体系： （下述按1μg/ RNA计算）待测RNA、1μL Oligo（d T）18 prinmer、4μL 5X逆转录缓冲液、1μL Ribolock Rnase Inhibitor、2μL 10m M d NTP Mix、1μL Rever Aid M-MuLV Reverse Transcriptase，后加入无RNA酶水至20μL体系。设定PCR仪反应条件为42℃60min，70℃ 5min，4℃ 60min。分别使用SIRT1、ALP、COL1A1、RUNX2、BGLAP基因相对应的iTap™ Universal SYBR® Green Supermix kit（Bio-Rad）试剂盒进行RT-PCR检测。反应体系：cDNA稀释10倍后，按4μL、10μL、0.5μL、0.5μL、5μL体积混合待测cDNA、SYBR Green、上游引物、下游引物、无RNA酶水。反应条件：设定PCR仪反应条件为95℃ 3min，95℃ 10s，60℃30s，65℃ 5s，进行40个循环。基因相对表达量计算公式为χ = 2−ΔΔCt， ΔΔCt = ΔE – ΔC， ΔE = Ctexp − CtGAPDH，ΔC=Ctct1 −CtGAPDH（Ctexp为目标基因的循环值，Ctct1为各测试样品对照组的循坏值）。
C. Western blot检测成骨相关蛋白表达
（1）去除培养板内培养液，PBS清洗待测细胞3次。
（2）使用胰酶消化后用1.5mL EP管收集细胞，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）测定上述待测样品蛋白浓度。
（3）制胶：长短各取一玻璃板夹入制胶卡夹中，玻璃板中央加入10%SDS-PAGE分离胶，上层去离子水液封。待分离胶凝固后，用滤纸吸净去离子水，加入浓缩胶后立即插入制胶专用梳子，待浓缩胶凝固后小心取出梳子。电泳：取等质量的蛋白样品加入等体积2X蛋白上样缓冲液。加样完毕，电泳仪中加入足量电泳液后，将胶置入电泳仪中。设置起始电压60V开始电泳，约15min后待样品全部进入分离胶后将电压调至200V，等待溴酚蓝刚跑至分离胶末端（约30-40min）终止电泳。轻轻撬开玻璃板，塑料铲除去浓缩胶，将分离胶放于滤纸上，盖上硝酸纤维素膜，膜上再次覆盖滤纸，将胶置入转膜仪，电流调至350mA转膜1h。完毕后取出硝酸纤维素膜，用0.1% TBST摇床上清洗2次。免疫反应：室温下，先用封闭液将膜封闭30min，吸除封闭液，加入10mL稀释一抗，检测不同的蛋白加入与之对应的抗体（α-tubulin（α-微管蛋白）、SIRT1抗体，Sigma公司），4℃摇床过夜孵育。取出膜，用TBST清洗3次，加入10mL对应稀释二抗（辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）二抗），室温下孵育1h，TBST清洗后加入化学发光剂室温放置5分钟，在暗室中用X线胶片曝光显影。条带光密度值通过ImageJ软件（National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA）进行分析，待测蛋白相对表达量=待测蛋白光密度值/内参光密度值。
根据以上结果可得知，使用KGN可以提高BM-MSC的成骨分化能力。上述实验结果显示，在BM-MSC进行成骨诱导时加入KGN 14天后，茜素红染色加深，钙结节定量提高（图1、2）。RT-PCR结果显示SIRT1、BGLAP表达随加入KGN浓度上升而上升（图3、9）。具体地，1000nM组相比对照组，SIRT1上升116.9±6.4%，BGLAP上升51.9±2.2%。ALP、COL1A1表达在KGN浓度为100nM及1000nM时无统计学差异，但高于对照组（图6、7）。具体地，1000nM组相比对照组，ALP上升29.2±1.1%，COL1A1上升50.9±1.6%。RUNX2表达在KGN浓度为100nM时达到最大，上升52.6±2.1%，而后随KGN浓度上升而轻度下调（图8）。SIRT1蛋白表达Western-Blot结果与RT-PCR结果一致（图4、5），SIRT1蛋白水平上升66.8±3.9%。
结论：使用KGN主要上调SIRT1等成骨分化相关基因，促进BM-MSC成骨分化能力。

Claims (3)

1.Kartogenin在制备提高骨髓间充质干细胞成骨分化能力药物的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物为片剂、颗粒剂、口服液、注射液或胶囊剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物包含药学上有效剂量的Kartogenin和药学上可接受的辅料。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112877287A (zh) * 2020-06-22 2021-06-01 青岛思拓新源细胞医学有限公司 泥螺多肽在制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂中的用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
丁伟等: "KGN促进软骨、促进腱-骨与合作用的研究进展", 《山东医药》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112877287A (zh) * 2020-06-22 2021-06-01 青岛思拓新源细胞医学有限公司 泥螺多肽在制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂中的用途

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