CN108753887A - 一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用 - Google Patents

一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用，多肽制备方法为：1、六棱菊种子酶解，酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液浓缩、冻干，得多肽冻干粉；2、用DA201‑C型大孔树脂对多肽冻干粉初步分离纯化，依次用30％、45％、60％、75％乙醇梯度洗脱，各梯度洗脱4BV，收集各梯度洗脱液，浓缩、冷冻干燥得F30、F60、F75粗品；3、凝胶过滤色谱纯化：根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的流份，冷冻干燥，分别得多肽F30、F60、F75。本发明多肽可显著提高骨髓间充质干细胞增殖率，可用于骨髓间充质干细胞快速扩增。

Description

一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。
背景技术
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)已成为21世纪生命科学研究的重点，它是一类由Friedenstein等最先发现的成纤维样细胞，能够自我增殖和多向分化。BMSCs是一个有广阔前景的研究领域，有望被用在细胞疗法治疗中，这些都归功于其特殊能力，包括自身增殖能力强、分化范围广，能够修复损伤的功能组织及免疫调节等功能，不像人类胚胎干细胞一样涉及伦理道德方面的问题。此外，因为它们具有归巢性，所以可能作为运载工具定向运送生物制剂来治疗某些疾病。目前，BMSCs已在动物实验和临床应用中取得了巨大的成果，包括骨或软骨损伤、心脏疾病、中枢神经系统损伤、肝损伤、脊髓损伤等方面都有突破。
因为BMSCs在基础研究及临床应用方面均具有巨大潜能，所以对于其培养增殖仍然需要更进一步研究，以便可以更为高效地获取利用这种细胞。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。
本发明通过如下技术方案实现：
技术方案一：
一种促进骨髓间充质干细胞增殖的多肽，通过如下步骤制备而成：
步骤1、六棱菊种子多肽冻干粉的制备
六棱菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L+胰蛋白酶在复合配比3:1、pH为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/L、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持适当时间进行灭酶处理得六棱菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得六棱菊种子多肽冻干粉。
步骤2、大孔树脂初步分离纯化
采用DA201-C型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：
(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/mL的多肽冻干粉水溶液以0.5BV/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值A220，以A220＝0.05为穿透点；
(2)上样结束后，用去离子水以1BV/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，采用30％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉洗脱4BV，收集洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得F30粗品。
步骤3、凝胶过滤色谱纯化
将F30粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的SephadexG-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检测波长220nm，根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，得到多肽F30。
优选地，所述六棱菊种子为六棱菊属植物六棱菊的种子，洗净晾干，粉碎成80目细粉。
优选地，碱性蛋白酶Alcalase2.4L酶活力为2.4AU/g。
优选地，胰蛋白酶的酶活力为2500U/g。
优选地，酶解结束后升温至90℃保持20min灭酶。
优选地，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液于55℃旋转蒸发减压浓缩。
上述多肽在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。
技术方案二：
一种促进骨髓间充质干细胞增殖的多肽，通过如下步骤制备而成：
步骤1、六棱菊种子多肽冻干粉的制备
六棱菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L+胰蛋白酶在复合配比3:1、pH为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/L、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持适当时间进行灭酶处理得六棱菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得六棱菊种子多肽冻干粉。
步骤2、大孔树脂初步分离纯化
采用DA201-C型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：
(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/mL的多肽冻干粉水溶液以0.5BV/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值A220，以A220＝0.05为穿透点；
(2)上样结束后，用去离子水以1BV/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，依次采用30％、45％、60％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉进行梯度洗脱，每个梯度洗脱4BV，收集60％乙醇洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得F60粗品。
步骤3、凝胶过滤色谱纯化
将F60粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的SephadexG-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检测波长220nm，根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，得到多肽F60。
优选地，所述六棱菊种子为六棱菊属植物六棱菊的种子，洗净晾干，粉碎成80目细粉。
优选地，碱性蛋白酶Alcalase2.4L酶活力为2.4AU/g。
优选地，胰蛋白酶的酶活力为2500U/g。
优选地，酶解结束后升温至90℃保持20min灭酶。
优选地，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液于55℃旋转蒸发减压浓缩。
上述多肽在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。
技术方案三：
一种促进骨髓间充质干细胞增殖的多肽，通过如下步骤制备而成：
步骤1、六棱菊种子多肽冻干粉的制备
六棱菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L+胰蛋白酶在复合配比3:1、pH为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/L、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持适当时间进行灭酶处理得六棱菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得六棱菊种子多肽冻干粉。
步骤2、大孔树脂初步分离纯化
采用DA201-C型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：
(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/mL的多肽冻干粉水溶液以0.5BV/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值A220，以A220＝0.05为穿透点；
(2)上样结束后，用去离子水以1BV/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，依次采用30％、45％、60％、75％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉进行梯度洗脱，每个梯度洗脱4BV，收集75％乙醇洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得F75粗品。
步骤3、凝胶过滤色谱纯化
将F75粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的SephadexG-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检测波长220nm，根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，得到多肽F75。
优选地，所述六棱菊种子为六棱菊属植物六棱菊的种子，洗净晾干，粉碎成80目细粉。
优选地，碱性蛋白酶Alcalase2.4L酶活力为2.4AU/g。
优选地，胰蛋白酶的酶活力为2500U/g。
优选地，酶解结束后升温至90℃保持20min灭酶。
优选地，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液于55℃旋转蒸发减压浓缩。
上述多肽在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。
有益效果：
本发明提供的多肽可以显著提高骨髓间充质干细胞的增殖率，可以用于骨髓间充质干细胞的体外快速扩增，丰富骨髓间充质干细胞的细胞源。
附图说明
图1为F30粗品的Sephadex G-15凝胶滤过色谱图；
图2为F45粗品的Sephadex G-15凝胶滤过色谱图；
图3为F60粗品的Sephadex G-15凝胶滤过色谱图；
图4为F75粗品的Sephadex G-15凝胶滤过色谱图；
图5为多肽F30、F45、F60、F75对骨髓间充质干细胞增殖的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验方法
1、六棱菊种子多肽冻干粉的制备
六棱菊种子(六棱菊属植物六棱菊的种子，洗净晾干，粉碎成80目细粉)经诺维信碱性蛋白酶Alcalase2.4L(2.4AU/g)+胰蛋白酶(2500U/g)在复合配比3:1、pH为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/L、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持20min进行灭酶处理得六棱菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液于55℃旋转蒸发减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得六棱菊种子多肽冻干粉。
2、大孔树脂初步分离纯化
采用DA201-C型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：
(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/mL的多肽冻干粉水溶液以0.5BV/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值A220，以A220＝0.05为穿透点；
(2)上样结束后，用去离子水以1BV/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，依次采用30％、45％、60％、75％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉进行梯度洗脱，每个梯度洗脱4BV，收集各梯度洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得F30、F45、F60、F75粗品。
3、凝胶过滤色谱纯化
将F30、F45、F60、F75粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的Sephadex G-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检测波长220nm，根据色谱图收集各样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，分别得到多肽F30、F45、F60、F75。
4、对骨髓间充质干细胞的增殖促进作用
SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离：采用全骨髓法(直接培养法)分离培养。①取体质量为100g左右的雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死，用体积分数为75％乙醇浸泡3-5min(头部朝下，使乙醇没过于全身)。②移置细胞培养用超净台内，剪开大鼠腿部皮肤，分离腿部肌肉，取出大鼠股骨、胫骨。③用无菌纱块剔除大鼠股骨、胫骨部附着的肌肉组织，置入25cm2培养皿中备用。④用注射器吸取含有体积分数为12％胎牛血清的L-DMEM 10mL，备用。⑤用剪刀去除大鼠股骨、胫骨一端的软骨帽，将含有10mL培养基的注射器插入骨髓腔内缓慢冲洗四五遍，直至股骨、胫骨变成白色，尽量冲出骨骺中的细胞。⑥将冲洗好的细胞移入15mL离心管中，进行1000r/min离心，5min后去除上清液，再重新加入8mL完全培养基，用巴氏吸管吹打均匀后分别种入25cm2的培养瓶里，并放入37℃，体积分数为5％CO2培养箱中进行培养。⑦原代培养48h，待细胞贴壁生长后进行第1次换液，两三天后细胞增殖达到80％-90％融合，第1代细胞以1:1传代，并加入碱性成纤维细胞生长因子(培养瓶中培养基量的1/200)，第1代以后传代则以1:2传代。骨髓间充质干细胞生长因子的制备：在10mL的PBS中加入10μg的碱性成纤维细胞生长因子和10mg的牛血清白蛋白配置成骨髓间充质干细胞生长因子溶液，用1mL的离心管分装，-20℃保存备用。
多肽F30、F45、F60、F75对骨髓间充质干细胞增殖活力的影响：将第3代对数期骨髓间充质干细胞的细胞数调整至2×106个/mL，于96孔平底细胞培养板每孔加入细胞悬液50μL，设实验组和对照组，实验组分为4组，分别加入多肽F30、F45、F60、F75终浓度为10μg/mL的L-DMEM培养基各50μL，对照组使用不含多肽的培养基培养，另设置只含有培养基的空白组，置于细胞培养箱中处理细胞72h，加入10μL CCK-8溶液，4h后用酶联免疫检测仪检测OD450值A(吸光度的大小与活细胞的数量呈正比)。根据所测OD值计算细胞增殖率，细胞增殖率＝(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％。以对照组增殖率为100％。
二、实验结果
1、凝胶过滤色谱纯化结果
对F30、F45、F60、F75粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的Sephadex G-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检测波长220nm，根据色谱图1～4收集各样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，分别得到多肽F30、F45、F60、F75。
2、对骨髓间充质干细胞的增殖促进作用
结果如表1和图5所示。与对照组相比，多肽F30、F60、F75组骨髓间充质干细胞增殖率显著较高(P＜0.05)，多肽F45组骨髓间充质干细胞增殖率与对照组差异不明显(P＞0.05)。
表1多肽F30、F45、F60、F75对骨髓间充质干细胞增殖的影响
本发明提供的多肽可以显著提高骨髓间充质干细胞的增殖率，可以用于骨髓间充质干细胞的体外快速扩增，丰富骨髓间充质干细胞的细胞源。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (7)

1.一种促进骨髓间充质干细胞增殖的多肽，其特征在于，通过如下步骤制备而成：
步骤1、六棱菊种子多肽冻干粉的制备
六棱菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L+胰蛋白酶在复合配比3:1、pH为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/L、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持适当时间进行灭酶处理得六棱菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得六棱菊种子多肽冻干粉。
步骤2、大孔树脂初步分离纯化
采用DA201-C型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：
(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/mL的多肽冻干粉水溶液以0.5BV/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值A220，以A220＝0.05为穿透点；
(2)上样结束后，用去离子水以1BV/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，采用30％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉洗脱4BV，收集洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得F30粗品。
步骤3、凝胶过滤色谱纯化
将F30粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的Sephadex G-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检测波长220nm，根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，得到多肽F30。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述六棱菊种子为六棱菊属植物六棱菊的种子，洗净晾干，粉碎成80目细粉。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：碱性蛋白酶Alcalase2.4L酶活力为2.4AU/g。
4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：胰蛋白酶的酶活力为2500U/g。
5.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：酶解结束后升温至90℃保持20min灭酶。
6.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液于55℃旋转蒸发减压浓缩。
7.权利要求1所述的多肽在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN112877287A (zh) * 2020-06-22 2021-06-01 青岛思拓新源细胞医学有限公司 泥螺多肽在制备骨髓间充质干细胞成骨分化促进剂中的用途

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