CN108823272A - 一种多肽及用于提高脐带间充质干细胞扩增效率的生物用途 - Google Patents

一种多肽及用于提高脐带间充质干细胞扩增效率的生物用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多肽及用于提高脐带间充质干细胞扩增效率的生物用途，多肽制备方法为：1、金盏菊种子酶解，酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液浓缩、冻干，得多肽冻干粉；2、用DA201‑C型大孔树脂对多肽冻干粉初步分离纯化，依次用40％、50％、60％、70％乙醇梯度洗脱，各梯度洗脱3BV，收集各梯度洗脱液，浓缩、冷冻干燥得F40、F50、F70粗品；3、凝胶过滤色谱纯化：根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的流份，冷冻干燥，分别得多肽F40、F50、F70。本发明多肽可显著提高脐带间充质干细胞增殖率，可用于脐带间充质干细胞快速扩增。

Description

一种多肽及用于提高脐带间充质干细胞扩增效率的生物用途
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种多肽及用于提高脐带间充质干细胞扩增效率的生物用途。
背景技术
间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，在1966年首先由Friedenstein等从骨髓中发现，大量研究发现间充质干细胞具有向内、中、外3个胚层包括肌腱、韧带、肝细胞、心肌细胞和骨髓基质细胞等分化发育的潜能。而成人骨髓源间充质干细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，且供者间充质干细胞的采集须行骨髓穿刺，由于疾病的原因，患者常有感染、体质较弱等因素也限制了自体骨髓间充质干细胞的应用。因此寻找新的间充质干细胞来源是目前国内外干细胞研究的热点，人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)具有来源丰富、对供者无影响、易于采集和运输、无异体排斥反应、避免伦理争议等诸多优点，因此hUCMSCs有望成为骨髓间充质干细胞的理想替代来源。hUCMSCs与骨髓间充质干细胞一样是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。理论上，在一定条件下，hUCMSCs可以定向分化成机体内的各种功能细胞，形成任何类型的组织和器官，即具有“可塑性”。并且，与骨髓间充质干细胞相比，hUCMSCs具有诸多优点而成为近年来医学界的研究热点。
因为hUCMSCs在基础研究及临床应用方面均具有巨大潜能，所以对于其培养扩增仍然需要更进一步研究，以便可以更为高效地获取利用这种细胞。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多肽及用于提高脐带间充质干细胞扩增效率的生物用途。
本发明通过如下技术方案实现：
技术方案一：
一种促进脐带间充质干细胞增殖的多肽，通过如下步骤制备而成：
步骤1、金盏菊种子多肽冻干粉的制备
金盏菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L+胰蛋白酶酶解，酶解结束后升温进行灭酶处理得金盏菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得金盏菊种子多肽冻干粉。
步骤2、大孔树脂初步分离纯化
采用DA201-C型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：
(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/mL的多肽冻干粉水溶液以0.5BV/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值A220，以A220＝0.05为穿透点；
(2)上样结束后，用去离子水以1BV/h流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，采用40％乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉进行洗脱，洗脱3BV，收集洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得F40粗品。
步骤3、凝胶过滤色谱纯化
将F40粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的SephadexG-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检测波长220nm，根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，得到多肽F40。
优选地，所述金盏菊种子为菊科植物金盏菊的种子，洗净晾干，粉碎成80目细粉。
优选地，碱性蛋白酶Alcalase2.4L酶活力为2.4AU/g。
优选地，胰蛋白酶的酶活力为2500U/g。
优选地，金盏菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L(2.4AU/g)+胰蛋白酶(2500U/g)在复合配比3:1、pH为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/L、加酶量6％、酶解时间6h条件酶解。
优选地，酶解结束后升温至90℃保持20min灭酶。
优选地，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液于55℃旋转蒸发减压浓缩。
上述多肽在促进脐带间充质干细胞增殖方面的应用。
技术方案二：
一种促进脐带间充质干细胞增殖的多肽，通过如下步骤制备而成：
步骤1、金盏菊种子多肽冻干粉的制备
金盏菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L+胰蛋白酶酶解，酶解结束后升温进行灭酶处理得金盏菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得金盏菊种子多肽冻干粉。
步骤2、大孔树脂初步分离纯化
采用DA201-C型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：
(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/mL的多肽冻干粉水溶液以0.5BV/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值A220，以A220＝0.05为穿透点；
(2)上样结束后，用去离子水以1BV/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，依次采用40％、50％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉进行梯度洗脱，每个梯度洗脱3BV，收集50％乙醇洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得F50粗品。
步骤3、凝胶过滤色谱纯化
将F50粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的SephadexG-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检测波长220nm，根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，得到多肽F50。
优选地，所述金盏菊种子为菊科植物金盏菊的种子，洗净晾干，粉碎成80目细粉。
优选地，碱性蛋白酶Alcalase2.4L酶活力为2.4AU/g。
优选地，胰蛋白酶的酶活力为2500U/g。
优选地，金盏菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L(2.4AU/g)+胰蛋白酶(2500U/g)在复合配比3:1、pH为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/L、加酶量6％、酶解时间6h条件酶解。
优选地，酶解结束后升温至90℃保持20min灭酶。
优选地，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液于55℃旋转蒸发减压浓缩。
上述多肽在促进脐带间充质干细胞增殖方面的应用。
技术方案三：
一种促进脐带间充质干细胞增殖的多肽，通过如下步骤制备而成：
步骤1、金盏菊种子多肽冻干粉的制备
金盏菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L+胰蛋白酶酶解，酶解结束后升温进行灭酶处理得金盏菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得金盏菊种子多肽冻干粉。
步骤2、大孔树脂初步分离纯化
采用DA201-C型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：
(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/mL的多肽冻干粉水溶液以0.5BV/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值A220，以A220＝0.05为穿透点；
(2)上样结束后，用去离子水以1BV/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，依次采用40％、50％、60％、70％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉进行梯度洗脱，每个梯度洗脱3BV，收集70％乙醇洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得F70粗品。
步骤3、凝胶过滤色谱纯化
将F70粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的SephadexG-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检测波长220nm，根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，得到多肽F70。
优选地，所述金盏菊种子为菊科植物金盏菊的种子，洗净晾干，粉碎成80目细粉。
优选地，碱性蛋白酶Alcalase2.4L酶活力为2.4AU/g。
优选地，胰蛋白酶的酶活力为2500U/g。
优选地，金盏菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L(2.4AU/g)+胰蛋白酶(2500U/g)在复合配比3:1、pH为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/L、加酶量6％、酶解时间6h条件酶解。
优选地，酶解结束后升温至90℃保持20min灭酶。
优选地，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液于55℃旋转蒸发减压浓缩。
上述多肽在促进脐带间充质干细胞增殖方面的应用。
有益效果：
本发明提供的多肽可以显著提高脐带间充质干细胞的增殖率，可以用于脐带间充质干细胞的体外快速扩增，丰富脐带间充质干细胞的细胞源。
附图说明
图1为F40粗品的Sephadex G-15凝胶滤过色谱图；
图2为F50粗品的Sephadex G-15凝胶滤过色谱图；
图3为F60粗品的Sephadex G-15凝胶滤过色谱图；
图4为F70粗品的Sephadex G-15凝胶滤过色谱图；
图5为多肽F40、F50、F60、F70对脐带间充质干细胞增殖的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验方法
1、金盏菊种子多肽冻干粉的制备
金盏菊种子(菊科植物金盏菊的种子，洗净晾干，粉碎成80目细粉)经诺维信碱性蛋白酶Alcalase2.4L(2.4AU/g)+胰蛋白酶(2500U/g)在复合配比3:1、pH为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/L、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持20min进行灭酶处理得金盏菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液于55℃旋转蒸发减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得金盏菊种子多肽冻干粉。
2、大孔树脂初步分离纯化
采用DA201-C型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：
(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/mL的多肽冻干粉水溶液以0.5BV/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值A220，以A220＝0.05为穿透点；
(2)上样结束后，用去离子水以1BV/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，依次采用40％、50％、60％、70％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉进行梯度洗脱，每个梯度洗脱3BV，收集各梯度洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得F40、F50、F60、F70粗品。
3、凝胶过滤色谱纯化
将F40、F50、F60、F70粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的Sephadex G-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检测波长220nm，根据色谱图收集各样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，分别得到多肽F40、F50、F60、F70。
4、对脐带间充质干细胞的增殖促进作用
脐带间充质干细胞的分离、培养：将无菌条件下取得的足月妊娠分娩胎儿脐带，用PBS洗3次，去掉残留的血细胞。把脐带剪切成2.0cm左右的片段并剔除血管(1条脐静脉，2条脐动脉)，取出其中的凝胶状组织，将其剪成大小约1mm3的组织块，然后置于培养瓶中。6h后，加入含体积分数为10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM/F12培养基，放置在37℃、体积分数为5％CO2培养箱中培养。3d后半量换液，1周后再次换液，此后每隔3d换液1次。观察贴壁组织周围的细胞生长情况，当细胞达到80％-90％融合度时，用胰酶消化传代，并将组织转移到一个新的培养瓶中，按上述方法继续培养，获得第二次组织块贴壁培养的细胞。取第二次组织培养得到的脐带间充质干细胞进行下述实验。
多肽F40、F50、F60、F70对脐带间充质干细胞增殖活力的影响：将第二次组织培养得到的脐带间充质干细胞培养至对数期后，调整至2×106个/mL，于96孔平底细胞培养板每孔加入细胞悬液50μL，设实验组和对照组，实验组分为4组，分别加入多肽F40、F50、F60、F70终浓度为10μg/mL的DMEM/F12培养基各50μL，对照组使用不含多肽的培养基培养，另设置只含有培养基的空白组，置于细胞培养箱中处理细胞72h，加入10μL CCK-8溶液，4h后用酶联免疫检测仪检测OD450值A(吸光度的大小与活细胞的数量呈正比)。根据所测OD值计算细胞增殖率，细胞增殖率＝(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％。以对照组增殖率为100％。
二、实验结果
1、凝胶过滤色谱纯化结果
对F40、F50、F60、F70粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的Sephadex G-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检测波长220nm，根据色谱图1～4收集各样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，分别得到多肽F40、F50、F60、F70。
2、对脐带间充质干细胞的增殖促进作用
结果如表1和图5所示。与对照组相比，多肽F40、F50、F70组脐带间充质干细胞增殖率显著较高(P＜0.05)，多肽F60组脐带间充质干细胞增殖率与对照组差异不明显(P＞0.05)。
表1多肽F40、F50、F60、F70对脐带间充质干细胞增殖的影响
本发明提供的多肽可以显著提高脐带间充质干细胞的增殖率，可以用于脐带间充质干细胞的体外快速扩增，丰富脐带间充质干细胞的细胞源。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (8)

1.一种促进脐带间充质干细胞增殖的多肽，其特征在于，通过如下步骤制备而成：
步骤1、金盏菊种子多肽冻干粉的制备
金盏菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L+胰蛋白酶酶解，酶解结束后升温进行灭酶处理得金盏菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得金盏菊种子多肽冻干粉。
步骤2、大孔树脂初步分离纯化
采用DA201-C型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：
(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/mL的多肽冻干粉水溶液以0.5BV/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值A220，以A220＝0.05为穿透点；
(2)上样结束后，用去离子水以1BV/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，依次采用40％、50％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉进行梯度洗脱，每个梯度洗脱3BV，收集50％乙醇洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得F50粗品。
步骤3、凝胶过滤色谱纯化
将F50粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的Sephadex G-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检测波长220nm，根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，得到多肽F50。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述金盏菊种子为菊科植物金盏菊的种子，洗净晾干，粉碎成80目细粉。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：碱性蛋白酶Alcalase2.4L酶活力为2.4AU/g。
4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：胰蛋白酶的酶活力为2500U/g。
5.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：金盏菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L(2.4AU/g)+胰蛋白酶(2500U/g)在复合配比3:1、pH为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/L、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解。
6.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：酶解结束后升温至90℃保持20min灭酶。
7.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液于55℃旋转蒸发减压浓缩。
8.权利要求1所述的多肽在促进脐带间充质干细胞增殖方面的应用。
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