CN112870187A - 贝壳杉烷类化合物在制备人体组织中磷酸二酯酶活性的调节剂的药物应用 - Google Patents

贝壳杉烷类化合物在制备人体组织中磷酸二酯酶活性的调节剂的药物应用 Download PDF

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Abstract

本发明是关于一种使用贝壳杉烷化合物制备磷酸二酯酶调节剂的方法。该磷酸二酯酶与心肌病、心脏肥大、肺动脉高压、正常组织纤维化重构、慢性神经退行性疾病或其他相关疾病的治疗相关，其结构式如图(I)所示。

Description

贝壳杉烷类化合物在制备人体组织中磷酸二酯酶活性的调节 剂的药物应用
背景技术
磷酸二酯酶5(PDE-5)是一种催化环磷酸鸟苷(cGMP)水解的酶，后者是一种胞内必需的第二信使，调控着活细胞的多种生物过程。世界上已有数百万心肌肥大、心肌病、肺动脉高压和其它循环系统疾病患者成功地使用三种PDE-5抑制剂(西地那非，伐地那非和他达拉非)进行治疗。近期的研究结果发现，PDE-5抑制剂可用于包括心脏肥大、心肌病、中风和神经退行性疾病等多种与神经相关疾病。通过用西地那非阻断PDE-5，从而增加cGMP，能抑制心室和心肌细胞肥大，改善慢性主动脉缩窄(TAC)模型小鼠的心脏功能(Yuan F.,JMCC.1997；29(10):2836-48)。西地那非也可以逆转由于压力负荷引起的心肌肥大，并恢复心室功能。
PDE-5抑制剂也可用于预防脑部中风和其他神经退行性疾病。在大脑中动脉栓塞2小时或24小时后连续口服西地那非七天，在不影响梗死区域体积的情况下，可显著促进神经系统的恢复。作者认为，通过西地那非的治疗，患者大脑皮层cGMP水平的升高可促进神经再生和减少神经功能障碍。然而，西地那非可能给患者带来严重的副作用。因此，开发防治心、肺组织纤维化方面的高效低毒的新一代磷酸二酯酶药物，是目前临床所需要的。
化合物A是一种来自甜菊糖的贝叶烷二萜类化合物。甜菊糖是广为熟知的南美洲的传统药物，具有甜味以及对心血管系统的功效(Geuns JMC.Stevioside.Phytochemistry.2003；64(5):913-21)。先前的研究表明，该贝壳杉烷型化合物，例如化合物A和B，在心脏急性缺血再灌注损伤的模型大鼠中具有心脏保护作用和抗心律失常作用(Tan,US Patent,11/596,514,2006)。目前，没有关于该类化合物以及甜菊醇(化合物A)对cGMP或TGF-β的作用的报道，而cGMP或TGF-β是公认与心脏肥厚和纤维化重要的信号蛋白/信使。
在此发明中，我们首次提出结构式(I)的贝壳杉烷类化合物，如化合物A，可用于治疗TAC诱导的大鼠心肌肥大，减少心肌纤维化和胶原沉积以及心肌细胞的大小从而预防心脏重构及减少肺动脉增厚。贝壳杉烷类化合物如化合物A，具有增强cGMP信号通路和清除活性氧的作用。此外，本发明揭示了化合物A的治疗效果优于其他药物，以及化合物A涉及其他磷酸二酯酶或机制。
发明内容
本发明揭示贝壳杉烷类化合物，如结构式(I)，用于治疗心肌肥厚和肺动脉高压的效果。结构式(I)代表一类天然的、合成的或半合成的化合物。其中许多化合物已被公众所知(Kinghorn AD,2002,p86-137；Sinder BB et al.,1998；Chang FR et al.,1998；Hsu FLet al.,2002)。结构式(I)的化合物可能有一个或多个不对称中心，也有可能以不同的立体异构体存在。
Figure BDA0002872192070000021
其中
ii.R1:氢、羟基或烷氧基。
iii.R2：羧基、羧酸盐、酰卤、醛基、羟甲基，和可以生成羧基的酯基、丙烯酰胺基、酰基或醚键基团。
iv.R3、R4、R5、R6、R8：氧、羟基、羟甲基和能水解生成羟甲基的酯基或烷氧甲基。
v.R7：甲基、羟基，和能水解生成羟甲基的酯基或烷氧甲基。
vi.R9：亚甲基或氧
一组优选化合物的结构如式(I’)所示。所述化合物具有贝壳杉烷结构，在C13位置上被取代，在C17，C18上衍生化。所述化合物可能具有多个不对称中心，并存在不同的立体异构体或非对映异构体。位置8和13的绝对构型为(8R，13S)或(8S，13R)。
Figure BDA0002872192070000031
其中
vii.R2：羧基、羧酸盐、醛基、羟甲基、甲基酯、酰甲基、酰卤。
viii.R7：甲基，羟甲基或甲基醚。
ix.R9：亚甲基或氧。
天然甜菊苷酸解后可以得到化合物A。化合物B是甜菊糖的糖苷配基，甜菊糖是化合物B的苷类。化合物A和B是同分异构体。化合物B可通过甜菊糖水解、氧化得到，或通过动物肠道细菌催化反应得到。
Figure BDA0002872192070000041
化合物A的分子式为C20H30O3，化学名称为(4α，8β，13β)-13-methyl-16-oxo-17-norkauran-18-oic acid。化合物A也被称为ent-16-ketobeyran-18-oic acid。该化合物是含有贝壳杉烷结构的四环二萜类化合物，其中，不对称碳原子的绝对构型为：(4R，5S，8R，9R，10s、13s)，碳13位上为甲基取代基，碳16上为羰基，碳18位上为羧基(Rodrigues etal.,1988)。
化合物B的分子式为C20H30O3，化学名称为ent-13-hyrdoxykaur-16-en-18-oicacid，它也被称为甜菊醇。该化合物也是含有贝壳杉烷结构的四环二萜类化合物。其中，手性碳原子的绝对构型为(4R,5S,8R,9R,10S,13S)，碳13上连接羟基，与碳16相邻的双键连接亚甲基，碳18连接羧基(Rodrigues et al.,1993)。
化合物A或B在碳18位上也可以羧酸盐的形式存在，其中羧酸盐是钠和碱性金属或氯化物和卤素。化合物A和B都是含有贝壳杉烷结构的贝壳杉烷类化合物。化合物A是本发明的优选化合物。本发明公开了化合物A或B在治疗和预防心脏肥大和肺动脉高压方面具有相似的治疗效果。可以推断，结构式(I)的所有其它化合物也具有与A化合物相同的治疗效果。据报道，化合物B在体外一定条件下会致突变。因此，与化合物B相比，化合物A更适合作为治疗药物。
本发明所使用的化合物A是溶解度较好的化合物A的钠盐。
结构式(I)所代表的贝壳杉烷类化合物可能的生物学和药理的作用已被广泛研究。大多数研究关注它们在代谢机制中的作用(Kinghorn,AD.2002,Stevia,byTaylor&Francis Inc.)。
例如，所述化合物对细胞代谢、肠道内葡萄糖吸收和碳水化合物代谢、肝细胞线粒体能量代谢和肾细胞碳水化合物和氧代谢产物都有影响。目前没有研究表明结构式(I)的贝壳杉烷类化合物可以作为磷酸二酯酶抑制剂或活性氧(ROS)清除剂。
本发明揭示了在TAC诱导的心肌肥厚和心肌重构大鼠中：1)化合物A的作用是通过抑制PDE而升高cGMP；2)化合物A的心脏保护作用显著优于PDE-5A抑制剂西地那非,这表明化合物A的心脏保护作用可能涉及一个新的机制；3)化物A也可以调节心肌成纤维细胞中的cGMP和cAMP的水平，既包括2’，3’-环化结构，也包括3’，5-环化结构。
本发明揭示化合物A比西地那非在上述治疗中效果更加明显。本发明揭示化合物A能抑制TGF-β诱导的新生大鼠心脏成纤维细胞增殖。此外，本发明揭示经过化合物A处理的心脏成纤维细胞中，cGMP水平显著增加，这与它的抗肥厚和抗纤维化作用有关。cGMP的增加可能是由于刺激BNP或抑制PDE的结果。由于化合物A对BNP具有显著抑制作用，因此由化合物A诱导的cGMP的增加可能是其抑制PDE作用所致。
研究表明，cAMP、cGMP和它们的异构体都可能在细胞内信号通路中发挥作用。通过高效液相色谱-质谱法可以同时检测不同的细胞产生的cAMP和cGMP的异构体。本发明揭示化合物A能显著改变在心肌肥大细胞、正常心肌细胞和成纤维细胞里的3’,5’-cGMP,2’,3’-cGMP,3’,5’-cAMP和2’,3’-cAMP水平，而且随着化合物A处理的时间不同，这种改变的程度也不同。这些结果表明，不同的cAMP、cGMP和其同分异构体与化合物A对纤维化、心肌肥大等疾病的治疗作用有关。关于化合物A的这些治疗作用从未被报道过。
在本发明中，我们揭示了化合物A可以通过减少细胞外基质或线粒体中的活性氧(ROS)来抑制心肌细胞肥大，同时还抑制PDE。然而迄今没有报道经典的磷酸二酯酶抑制剂如西地那非具有相似的作用。这说明与西地那非相比，化合物A在抑制心肌肥大和其他疾病方面具有优势。本发明也揭示了具有新机制的作为磷酸二酯酶抑制剂的化合物A的新用途，其机制与作用方式与现有文献报道的不同。
本发明表明，化合物A在治疗心肌肥大和胶原蛋白的沉积，以及刺激cGMP生成比西地那非更为有效，而西地那非是治疗勃起功能障碍的一线药物。
本发明也揭示化合物A可用于治疗阿尔茨海默病。现有文献揭示了西地那非可以增强cGMP的信号转导通路，而本发明中显示化合物A具有比西地那非更强的cGMP刺激作用(Rc Kukreja,et al.exp clin cardiol 2011；16(4):e30-e35)。
在现有技术中，上述的化合物A或化合物B的治疗效果可能涉及多种机制。Wang KL等的研究表明化合物A的降压作用可能与平滑肌细胞的钾通道有关(Wang,KL et al,2004)。然而，Jeppesen PB等的研究表明化合物A促进胰岛素的分泌作用与钾通道没有关系(Jeppesen PB.,et al,2000)。Tan揭示化合物A和B在缺血线粒体起保护作用，这种保护作用只能被5-OH-decdanoate(一种三磷酸腺苷敏感钾通道抑制剂)部分阻断((Tan,USPatent,11/596,514,2006)。因此，化合物A和三磷酸腺苷敏感钾通道的相关作用目前尚不清楚。
本发明清晰的揭示了化合物A本身对肌膜或线粒体三磷酸腺苷敏感钾通道没有直接的开放作用。化合物A不是一种开放剂，而只是一种增敏剂，它可以增加钾离子-三磷酸腺苷敏感钾通道对已知开放剂的反应程度，这些开放剂包括吡那地尔和ATP的改变。
现有文献公开了化合物A能增强心肌收缩力和保护心肌缺血损伤。然而，所有已知的能增加心功能的正性肌力药物都会同时增加细胞内Ca2+的浓度，从而增加氧耗量。因此，使用正性肌力药物反而会使心肌缺血和心功能进一步恶化，比如出现心电图的ST段抬高或降低。在现有文献中只公开了化合物A的正性肌力作用。
本发明选择性的公开了化合物A的新用途，即化合物A改善恶化的心脏功能而不增加胞浆Ca2+浓度和氧耗量。此外，使用化合物A不仅没有使肥大心肌的缺血心电图恶化，反而出现心电图的改善。这是由于在肥大心脏的心肌中，化合物A可降低在静息状态下心肌内Ca2+的水平，而只增加在每次收缩过程中瞬时Ca2+的峰值。这一新的发现揭示了化合物A的独特性质，它不同于其他已知的传统的正性肌力药，比如洋地黄和β-受体激动剂如肾上腺素等。
如上提及的，化合物A可通过抑制PDE来增加cGMP。目前已知cGMP可抑制由脑损伤造成的星形胶质细胞增生，这可能是化合物A的治疗机制所在。
结构式(I)的化合物B与化合物A作用机制相似，但常常效应偏低。
结构式(I)的化合物，包括化合物A和B可以与其他药用材料制备成可接受的盐，如碱性金属(如钠)和卤素。它们可以与药物载体结合制成载体药物。结构式(I)的化合物及它们的组合药物可通过口服、静脉、吸入给药，或其他途径，也可经导管介入静脉和动脉。
此外，本发明使用共溶剂技术，制备了一种医用的化合物A钠盐的静脉注射制剂。通过静脉注射给药，可以产生快速的治疗效果。由于化合物A等萜烯化合物具有疏水的烃基骨架，极大的限制了其静脉注射的给药方式。目前，尚未有技术报道足够稳定、安全的，可用于静脉注射给药的化合物A液体制剂。对于医用药物，需要按照药监相关部门的要求，在严格的条件下，根据药物的毒性，对其溶解性及稳定性进行严格的药代动力学研究。而目前尚未有可用于临床注射的化合物A制剂。本发明首次发明了一种化合物A的药物制剂，其具有合适的生理pH，良好的溶解性，足够的物理化学稳定性，并被证明具有良好的生物学安全性。
目前有多种增加疏水化合物的水溶性的方法，包括使用表面活性剂，纳米微粒体系(例如脂质体，胶束和微乳液)和环糊精。然而，由于表面活性剂较明显的毒性，其在静脉注射给药的应用非常受限，而纳米颗粒系统目前的临床应用仍具有挑战性。
在本发明中，通过调节pH值和使用低剂量的有机溶剂，开发了可用于静脉注射的化合物A液体制剂，其涉及到的有机溶剂均为药学和临床广泛接受的溶剂。
本发明中，用于增加化合物A溶解度的有机溶剂均已被FDA批准用于静脉注射。通过对几种溶剂进行筛选后，本发明确定了化合物A的最佳溶剂体系，其由pH为10.0的盐水，25％的乙醇和20％的丙二醇(2％，w/w)(化合物A钠)组成。化合物A钠盐以20mg或50mg/ml的最大浓度充分溶解在本发明的溶剂中，以最小化溶剂的用量，减少负面影响。本发明的这种优化的制剂在至少90天内物理化学稳定，在高湿度和高温条件下的加速测试中，30天内无结晶或降解。高温灭菌可以保证此化合物制剂的静脉注射安全性，并且不会破坏化合物A钠盐的稳定性。
此注射制剂在低温和高温储存期间保持稳定。在加速和严苛环境的长期研究过程中，此注射制剂产生的杂质和含量可以忽略不计，并在FDA指导原则的可接受的范围内。本发明中检查了化合物A的溶血作用和细胞相容性。在H9C2细胞系中，该制剂在9.1％(v/v)浓度下，3小时内不诱导溶血作用，且在50μg/ml以内均没有显著的细胞毒性。体内研究表明，给予过量制剂的大鼠中，未观察到显著的急性毒性。这些测试表明此注射用制剂具有药学上可接受的安全性。
此化合物制剂可使用的药学上可接受的盐包括常规的药学上可接受的无机或有机酸，例如：硫酸氢盐，磷酸二氢盐，甲磺酸盐，溴化物，甲基硫酸盐，乙酸盐，草酸盐，马来酸盐，富马酸盐，琥珀酸盐，2-萘磺酸盐，葡糖酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，乳酸盐，丙酮酸羟乙基磺酸盐，苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。
以上是本发明整体的介绍。为了更好地说明本发明的方法和技术，以下将给出实施案例，以便可以由本领域技术人员执行。
在以下实施例中详细提供了本发明的方法和实施方式。
具体实施方式
为了进一步说明用于实现本发明目的的技术，下文描述了关于确定和鉴定本发明中化合物的药物和治疗用途的详细方法，技术，流程和特点。案例提供了用于支持及验证本发明所使用的动物模型的实验方法和结果。涉及的案例均使用了适当的对照组实验及统计分析方法。以下的案例均用于描述而非限制本发明的应用。这些案例所涉及的方法及技术可用于筛选及确定此类Kaurane制剂的治疗效果。其他此类化合物制剂的治疗效果评价可使用相同的方法。
本发明中列举的案例用于支持本发明的实验方法和结果，并验证本发明中使用的动物模型。本发明的所有实验均采用了适当的对照和统计检验。提供以下实施例来说明而非限制本发明。这些例子说明了用于筛选和确定结构式(I)中某些具有特定药理活性的贝壳杉烷化合物的方法和技术。也可以用相同的方法测定结构式(I)的其他化合物的治疗用途。
实验材料实验动物：成年雄性Wistar大鼠，体重200g±20g，9周龄。每只大鼠被安置在一个单独的笼子里，饲养环境包括恒定的温度、湿度以及严格的黑暗光照周期，自由采食。
化学试剂：化合物A(ent-17-norkaurane-16-oxo-18-oic acid，分子式，C20H40O3，分子量：318.5)是由甜菊糖通过酸性水解、结晶纯化而得到。化合物A的钠盐可以通过加入NaOH或其他含钠碱获得；用高效液相色谱法测得化合物A的钠盐的纯度大于99％。化合物B(ent-13-hydroxykaur-16-en-18-oic acid)是由甜菊糖通过氧化、水解、酸化、萃取、纯化与结晶等一系列过程得到的；用红外分析和核磁共振证实了化合物B的结构，与已报道的数据一致。利用高效液相色谱法测定，化合物B的纯度大于99％。受试化合物的给药方式：静脉注射或腹腔注射或口服。剂量：化合物A(或其钠盐)，0.5mg/kg至10mg/kg；化合物B，2mg/kg至20mg/kg。
实验方法
心肌肥厚(主动脉弓缩窄)动物模型的建立及实验方案
实验动物采用3％戊巴比妥钠进行腹腔注射(40毫克/公斤体重)麻醉。在无名动脉和左颈总动脉之间进行压力超负荷，持续3周或9周，诱导主动脉弓缩窄。假手术组进行同样的操作，但没有进行主动脉狭窄。手术期间，大鼠进行气管插管和用小动物呼吸机辅助通气(HarvardApparatus,Holliston,MA,USA)。
3周和9周的TAC模型动物随机被分为五个剂量组(每组8-10只)，包括TAC空白对照组、化合物A低剂量(L，TAC+化合物A，1mg/kg/d)，中间剂量(M，TAC+化合物A，2mg/kg/d)，高剂量(H，TAC+化合物A，8mg/kg/d)和作为阳性对照的西地那非组(TAC+SIL，70mg/kg/d)。假手术组使用溶剂处理作为对照。分别在手术后3周和9周检查动物，大鼠TAC模型的急性和慢性手术死亡率＜5％。利用盐水和有机溶剂中溶解(1:1，0.5毫升)化合物A钠盐，利用蒸馏水溶解西地那非，然后分别进行灌胃给药。手术后三天给予药物或者溶剂处理，每日两次。观察期结束，测定体内血流动力学后，将所有动物处死，并把心脏取出做进一步分析。
心脏血流动力学参数测量
采用压力容积(PV)导管进行心脏血流动力学分析。实验导管采用肝素盐水(100U/ml)处理，防止血液凝固。大鼠麻醉后放在37℃的暖垫上，分离气管并连接呼吸机，潮气量4-6mL/200g，呼吸频率70次/分钟。分离右颈总动脉，将四电极压力容积导管(model SPR-838,Millar Instrument Inc)插入右颈总动脉，然后缓慢推入左心室直到获得了稳定的PV环。当信号稳定10-15分钟后，记录稳定状态下的PV环基线。然后打开腹部找到门静脉和下腔静脉，用棉签压迫下腔静脉施加负荷。在数据采集时，将小动物呼吸机关闭5秒，以避免肺运动产生的干扰。在稳定状态下记录数据后，从右颈静脉注入40μL高渗盐水，以便获得平行电导值。通过使用先前描述的方法，校准电导信号和绝对体积信号。在测量体内左心室功能时，外周动脉导管经股动脉逆行插入到腹主动脉，将外周动脉导管连接到压力传感器，使用Powerlab系统采集数据。
组织学分析
利用10％的中性福尔马林固定大鼠心肌组织，进行石蜡包埋，切成3毫米的切片，然后用苏木精-伊红(H&E)，天狼星红或鬼笔环肽染色。采用尼康系统和蔡司共聚焦显微镜拍照。用H&E染色结果检测细胞形态大小，使用天狼星红染色检测纤维化，使用鬼笔环肽染色检测纤维型肌动蛋白的数量。使用计算机辅助图像分析(图像处理软件)来确定细胞横截面面积和间隙胶原含量。样本量至少为四个或五个不同的心脏组织。
心脏成纤维细胞的分离与培养
参照文献方法，从1-2日龄的SD新生大鼠分离出心脏成纤维细胞。简而言之，将1-2日龄SD新生大鼠的心脏置于冰上切碎，在37℃下，使用胰蛋白酶孵化分离细胞。采用差速贴壁法除去非心肌细胞，将成纤维细胞培养在培养皿里。细胞传代3天后，使用0.05％的胰蛋白酶溶液消化。使用含有5％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞，保持温度37℃，5％CO2的条件。
细胞增殖
采用(3-(4,5-二甲基噻唑-2-炔)-2,5-二苯基四唑溴化物)(MTT)法评估心肌成纤维细胞活力。这个实验检测活细胞中线粒体酶降低MTT底物(黄色到蓝色)的能力。在无血清96孔板上培养所分离的原代心脏成纤维细胞。培养24h后，加入0.5mg/mL MTT底物，再孵育细胞4个小时，然后在室温下用DMSO溶解10min。
统计分析
依次通过方差分析(单因素方差分析)，Fisher检验比较多组间的差异。所有检验的P值均为双尾，以P<0.05被认为是具有统计学差异。
实施例1
本案例主要说明化合物A在降低TAC诱导的心肌肥厚和心肌扩张中的作用。
成年的Wistar大鼠经过TAC诱导3周后，分别使用赋形剂、化合物A和西地那非治疗。心脏体重比(HW/BW)是反映心肌肥大的指数。在3周TAC模型组中，心脏体重比(HW/BW)增加34.6％(P＜0.001)的同时，伴随有心脏横截面积增加81.6％(P＜0.001)。在3周TAC模型组，化合物A或西地那非可显著改善心脏和心肌细胞肥大(表1)。经过化合物A处理，心肌细胞的横截面积增幅减少到15.1％(1mg/kg)和4.1％(2mg/kg)，而西地那非使心肌细胞的横截面积增幅减少到16.3％(70mg/kg)。与西地那非相比，化合物A更有效。
表1.化合物A对TAC模型大鼠心重与体重的影响(n＝8)
Figure BDA0002872192070000131
实施例2
本案例主要说明了化合物A在抑制心肌重塑和纤维化形成中的作用。
一些重要的转录因子影响肌动蛋白的动力学，其受游离的G肌动蛋白和聚合的F-肌动蛋白调节。激活心肌肥大通路的一个重要结果是得到更高的F/G肌动蛋白含量。用FITC标记的鬼笔环肽染色测量心肌F-肌动蛋白的水平。9周后，TAC组的免疫荧光图像显示F-肌动蛋白的绿色荧光明显增加，而通过化合物A(8mg/kg/d)或西地那非(70mg/kg/d)治疗后恢复到正常组的水平。大鼠经过TAC处理后，F-肌动蛋白的水平明显增加，进而导致肌动蛋白的动态变化。化合物A和西地那非均可降低F-肌动蛋白的表达，并且维持F/G-肌动蛋白的平衡。
为了确定化合物A是否可以减弱TAC诱导的心肌纤维化，我们使用天狼猩红染色检测左心室心肌间质胶原的分布。在3和9周TAC组中，TAC引起明显的间质纤维化(P＜0.05)。与对照组相比，3周和9周TAC组中的胶原蛋白含量分别增加了5.7倍和7.5倍。化合物A(8mg/kg/d)使3周和9周TAC组的间质纤维化分别减少58.2％和80.8％。与化合物A相比，西地那非抑制心肌纤维化的作用较弱。
实施例3
本案例说明了化合物A对cGMP产生的影响。
cGMP的测定
使用赋形剂、化合物A和西地那非处理后，采用ELISA试剂盒检测新生大鼠中成纤维细胞的cGMP水平。使用不同剂量的化合物A(1M，10M)或西地那非(100M)处理稳定期细胞3小时。处理后，用0.1N HCl溶解细胞，通过ELISA方法检测cGMP。结果见下表。
表1.化合物A和西地那非刺激cGMP的产生(以对照组为参比，％)
对照组 1.00±0.00
化合物A-1Na1μm 1.57±0.43
化合物A-1Na10μm 2.07±0.54
西地那非 1.41±0.27
实施例4
这个例子说明通过抑制交感神经活动，化合物A稳定TAC组中受损的心脏自主神经平衡。
心电图监测
TAC手术后的3周或9周，利用戊巴比妥钠麻醉大鼠(腹腔注射40mg/kg)。心电图(ECG)的检测采用体表II导联。三个不锈钢电极针分别插入右前腿(G1)和右后腿(GND)，左(G2)后腿。采样率为2kHz，记录给药前10分钟的心电图数据。采用快速傅立叶变换分析心率变异性谱。频域分为极低频(VLF；<0.04Hz)、低频(LF；0.04-0.6Hz)，或高频率(HF；0.6-2.5Hz)。心率变异性(HRV)以归一化单位表示，即总功率减去极低频部分的百分比。迷走神经副交感神经传出活性是HF成分的主要贡献者。交感神经和迷走神经的影响有助于LF组分，因此LF与HF的比值通常被用作衡量交感神经平衡的指标。
心率变异性(HRV)是反映心脏自主神经平衡的指标。RR变异性的功率谱分析表明，经过TAC处理9周的大鼠在HRV的相对光谱成分的分布上显示出显著的变化。LF/HF比值显著高于假手术组，但经化合物A治疗后，LF/HF比值逆转为正常(p＜0.01)。西地那非治疗并没有降低LF/HF比值。本发明揭示一种新型使用化合物A通过抑制交感神经活性升高恢复心脏自主神经平衡的方法，而西地那非没有这种作用。

Claims (11)

1.一种使用贝壳杉烷类化合物制备人体组织中磷酸二酯酶活性的调节剂的药物的方法。其特征在于该磷酸二酯酶的活性与心肌病、心脏肥大、肺动脉高压、组织纤维化重构等疾病发生或治疗相关。其特征还在于使用贝壳杉烷化合物及药学上可接受的盐来制备特定药用标准的固体或液体制剂，以供患者使用。
2.权利要求1中的方法所述的磷酸二酯酶，其特征在于该磷酸二酯酶包括腺苷酸磷酸二酯酶，鸟苷酸磷酸二酯酶，环核苷酸磷酸二酯酶和或它们的同工酶。
3.权利要求1中的方法所述的调节剂，其特征在于抑制或上调或下调环核苷酸包括2’,3’-cGMP、3’,5’cGMP、2’,3-cAMP和3’,5’-cGMP的浓度。
4.权利要求3中所述的抑制或上调或下调环核苷酸，其特征在于改变2’,3’-cGMP、3’,5’cGMP、2’,3-cAMP和3’,5’-cGMP之间的相对浓度比值。
5.权利要求1中的方法所述的化合物是代表结构式(I)的化合物A。
Figure FDA0002872192060000011
6.权利要求1中的方法所述的化合物是代表结构式(II)的化合物B。
Figure FDA0002872192060000012
7.权利要求1中的方法所述的药物的制备，其特征是片剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂、软膏剂，以及经口服、经皮或阴道或直肠给药的缓控释剂或由经肺或经鼻的吸入雾化剂、定量气雾剂或干粉吸入剂。
8.权利要求1的方法所述的特定药物标准，其特征在于使用符合药典药用标准的水和有机溶剂或混合溶剂作为溶剂或增溶剂。
9.权利要求8的方法所述的溶剂是乙醇、1,2-丙二醇、甘油、聚乙二醇或其它药用有机溶剂，混合体积从5％到90％。
10.权利要求8的方法所述的增溶剂包括符合药典药用标准的醇、二氧杂环戊烷、乙醚、甘油、胺、酯类，植物油、亚砜，高分子化合物和其它药用的增溶剂。
11.权利要求8的方法所述的特定的药物标准的药用液体注射剂，其特征在于注射剂的杂质含量、长期稳定性及溶血作用和细胞相容性的标准满足美国、欧盟、日本和中国药典的相关要求。
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