CN115381818A - 一种促进细胞自噬降解功能的方法及应用 - Google Patents

一种促进细胞自噬降解功能的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药研究领域，具体涉及一种促进细胞自噬降解功能的方法及应用。本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，小分子抑制剂PIK75抑制内涵体/溶酶体上的PI3K可显著诱导细胞自噬。在此基础上，开发了一种特异性的自噬诱导方法：通过小分子抑制剂PIK75抑制内涵体/溶酶体上的PI3K，可显著诱导细胞自噬。不同于经典的PI3K抑制剂诱导自噬小体产生，本方法主要是促进自噬小体/自噬底物降解，因此具有广泛的潜在治疗应用。

Description

一种促进细胞自噬降解功能的方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药研究领域，具体涉及一种促进细胞自噬降解功能的方法及应用。
背景技术
细胞自噬在多细胞动物中起到维持细胞和组织稳态平衡的功能。它将细胞内组份如大的蛋白聚集体、受损的细胞器等运送到溶酶体中降解和循环。自噬与许多病生理过程密切相关，如衰老、自身免疫疾病、炎症性疾病、肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病等。比如，年龄依赖的自噬受阻被认为是衰老一个常见特征。研究发现，雷帕霉素的延长寿命的效果，严格依赖于诱导自噬。
在克罗恩病(Crohn disease)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)中，自噬基因ATG16L1T300A突变，会导致其成为CASP3的底物被酶切，从而造成小鼠更易感染肠道共生菌，或者会加重葡聚糖硫酸钠(DSS)引起的炎症。在肿瘤发生时，自噬可以抑制肿瘤的发生。研究自噬基因Becn(编码蛋白Beclin 1)存在单倍剂量不足现象。表现为Becn+/-小鼠比野生型小鼠更容易发生自发型或癌基因驱动的肿瘤。多种神经退行性疾病与蛋白聚集积累或蛋白高表达有关，如阿兹海默症(Alzheimer disease)相关的胞内MAPT/tau蛋白纠缠和胞外β淀粉样斑块；帕金森病(Parkinson disease)相关的SNCS/ɑ-synuclein高表达。研究认为，这些蛋白的积累/高表达是产生毒性驱动病变的充分必要因素。
临床前研究数据支持自噬能在动脉粥样硬化各个阶段调节的疾病的发展。巨噬细胞中特异性敲除Atg5或血管平滑肌细胞中特异性敲除Atg7会加速喂西方饮食饲料的apoe(apolipoprotein E)敲除小鼠动脉粥样硬化进展。自噬的缺陷促进了以上疾病的发生及发展，提示自噬激活/诱导可能会产生有益的效果。在营养缺乏的情况下自噬通常会被激活。某些临床上在用的药物如西罗莫司(雷帕霉素，Rapamycin)可以增强自噬产生，但并不一定能促进自噬降解。此外，但这些化合物会有多重功能。经典的PI3K/Akt在细胞生长，增殖，生存及代谢方面具有重要作用。PI3K/Akt在细胞质膜上被生长因子激活后，活化mTORC1，从而抑制细胞自噬。
但是，特异性的自噬降解诱导剂/方法是未满足的需求。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种促进细胞自噬降解功能的方法及应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了小分子抑制剂PIK75用于制备细胞自噬降解促进药物的用途。
一种实施方式中，所述细胞自噬降解促进药物至少具有以下功用之一：
促进自噬小体清除；促进肿瘤细胞自噬降解；促进巨噬细胞自噬降解；抑制巨噬细胞分泌炎症因子；减轻肠炎炎症反应。
所述小分子抑制剂PIK75是指对细胞自噬小体清除具有促进效果的分子。
具体地，所述小分子抑制剂PIK75(free base)的结构式是：
Figure BDA0003746260370000021
所述PIK75(free base)的分子式是C16H14BrN5O4S，分子量是452.28。所述PIK75(free base)的CAS登记号是372196-67-3。所述PIK75(free base)由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)规定的名称为：
(E)-N'-((6-bromoimidazo[1,2-a]pyridin-3-yl)methylene)-N,2-dimethyl-5-nitrobenzenesulfono hydrazide。
所述PIK75(free base)的中文名称为：2-甲基-5-硝基苯磺酸[(6-溴咪唑并[1,2-A]吡啶-3-基)亚甲基]甲基肼。
所述小分子抑制剂PIK75(hydrochloride)的结构式是：
Figure BDA0003746260370000022
所述PIK75(hydrochloride)的分子式是C16H14BrN5O4S.HCI，分子量是488.7。所述PIK75(free base)的CAS登记号是372196-77-5。所述PIK75(hydrochloride)由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)规定的名称为：
(E)-N'-((6-bromoimidazo[1,2-a]pyridin-3-yl)methylene)-N,2-dimethyl-5-nitrobenzenesulfonohydr azide hydrochloride。
所述PIK75(hydrochloride)的中文名称为：2-甲基-5-硝基苯磺酸[(6-溴咪唑并[1,2-A]吡啶-3-基)亚甲基]甲基肼盐酸盐。
本发明实施例中使用PIK75(hydrochloride)(式II)为例。
所述细胞自噬降解促进药物必然包括小分子抑制剂PIK75，并以小分子抑制剂PIK75作为前述功用的有效成分。
所述细胞自噬降解促进药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为小分子抑制剂PIK75，亦可包含其他可起到类似功用的分子。
亦即，小分子抑制剂PIK75为所述细胞自噬降解促进药物的唯一有效成分或有效成分之一。
所述细胞自噬降解促进药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述细胞自噬降解促进药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述细胞自噬降解促进药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明的第二方面，提供了一种促进细胞自噬降解的方法，为向对象施用小分子抑制剂PIK75。
所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述细胞可以为离体细胞。
所述对象可以是罹患疾病的患者或者期待治疗的个体。
所述小分子抑制剂PIK75可以在接受治疗前、中、后向对象施用。
本发明的第三方面，提供一种细胞自噬降解促进药物，包括有效剂量的小分子抑制剂PIK75。
进一步地，所述细胞自噬降解促进药物，包括有效剂量的小分子抑制剂PIK75及药用载体。
所述细胞自噬降解促进药物必然包括小分子抑制剂PIK75，并以小分子抑制剂PIK75作为前述功用的有效成分。
所述细胞自噬降解促进药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为小分子抑制剂PIK75，亦可包含其他可起到类似功用的分子。
亦即，小分子抑制剂PIK75为所述细胞自噬降解促进药物的唯一有效成分或有效成分之一。
所述细胞自噬降解促进药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述细胞自噬降解促进药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
以小分子抑制剂PIK75为主要活性成分或主要活性成分之一制备药物。通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。“药学上可接受的载体或辅料”应当与小分子抑制剂PIK75相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
所述细胞自噬降解促进药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明的第四方面，提供一种联合治疗药物组合，包括有效量的小分子抑制剂PIK75和至少一种其他细胞自噬降解促进药物。
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：
一)将小分子抑制剂PIK75和其他细胞自噬降解促进药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。
当其他细胞自噬降解促进药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他细胞自噬降解促进药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。
二)将小分子抑制剂PIK75和其他细胞自噬降解促进药物配置成复方制剂，在将小分子抑制剂PIK75和其他细胞自噬降解促进药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。
抗体常用的用药方法为静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。
小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。siRNA、shRNA、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。
可以同步地或顺序地给予有效量的小分子抑制剂PIK75和至少一种有效量的其他细胞自噬降解促进药物。
使用时，可将有效量的小分子抑制剂PIK75和有效量的其他细胞自噬降解促进药物同时使用，也可将有效量的小分子抑制剂PIK75和有效量的其他细胞自噬降解促进药物先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。
本发明的第五方面，提供一种促进细胞自噬降解的方法，为向对象施用有效量的小分子抑制剂PIK75以及向对象施用有效量的其他细胞自噬降解促进药物和/或向对象实施其他细胞自噬降解促进手段。
可以同步地或顺序地给予有效量的小分子抑制剂PIK75和至少一种有效量的其他细胞自噬降解促进药物。
在与小分子抑制剂PIK75以外的其他细胞自噬降解促进药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强治疗作用。
其他的细胞自噬降解促进药物包括但不限制于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。
所述小分子抑制剂PIK75可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。所述其他细胞自噬降解促进药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。对于抗体药物，一般采用胃肠外给药。
本发明的第七方面，提供小分子抑制剂PIK75在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：
促进自噬小体清除；促进肿瘤细胞自噬降解；促进巨噬细胞自噬降解；抑制巨噬细胞分泌炎症因子；减轻肠炎炎症反应。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，小分子抑制剂PIK75抑制内涵体/溶酶体上的PI3K可显著诱导细胞自噬。在此基础上，开发了一种特异性的自噬诱导方法：通过小分子抑制剂PIK75抑制内涵体/溶酶体上的PI3K，可显著诱导细胞自噬。不同于经典的PI3K抑制剂诱导自噬小体产生，本方法主要是促进自噬小体/自噬底物降解，因此具有广泛的潜在治疗应用。
附图说明
图1：小分子抑制剂PIK75促进自噬小体清除。其中图1A表示PIK75促进自噬小体清除，MDA-MB-231乳腺癌细胞，转染Ad-mRFP-GFP-LC3后，血清饥饿24小时诱导细胞自噬；在血清饥饿最后5-6小时，用100nM PIK75处理细胞；荧光显微镜下观察活细胞中自噬小体水平(红色荧光与绿色荧光双阳性)。图1B是对图1A中自噬小体面积量化分析，Mean±SD，n＝50个细胞/样，P<0.001 by t-test。图1C和图1D，表示PIK75促进溶酶体分散在细胞质中，在MDA-MB-231乳腺癌细胞中，过表达LAMP2-GFP(图1C)或以anti-LAMP2抗体免疫荧光染色(图1D)，考察PIK75处理对溶酶体在细胞中分布情况。图1E是对对图1D中细胞的溶酶体进行量化分析，Mean±SD，n＝50个细胞/样，P<0.01 by t-test。图1F表示去除PIK75抑制引起溶酶体重新聚集在核周，MDA-MB-231乳腺癌细胞，用100nM PIK75处理6小时，换培养基去除PIK75，用1μM Lysotracker标记溶酶体1分钟，荧光显微镜下追踪活细胞中溶酶体动态变化。图1G表示去除PIK75抑制引起细胞中自噬小体重新积累，MDA-MB-231乳腺癌细胞，转染Ad-mRFP-GFP-LC3后，血清饥饿48小时，其中24-30小时添加100nM PIK75，荧光显微镜下观察活细胞中自噬小体水平。图1H，对图1G中对图1A中自噬小体面积量化分析，Mean±SD，n＝50个细胞/样，P<0.001 by t-test。
图2：小分子抑制剂PIK75促进肿瘤细胞自噬降解功能。图2A，PIK75促进细胞自噬降解功能，MDA-MB-231细胞，血清饥饿16小时，并在最后6小时加入100nm PIK75.收集细胞，免疫印迹分析Akt及其磷酸化水平，LC3及p62水平。图2B，PIK75与Rapamycin对自噬作用差异分析。MDA-MB-231细胞，血清饥饿16小时，并在最后6小时加入100nm PIK75或500nMRapamycin.收集细胞，免疫印迹分析自噬相关蛋白表达(LC3，p62)及PI3K/Akt/mTORC1通路蛋白活化水平(Akt及S6K磷酸化)，#1和#2样本为两次生物学重复。
图3：小分子抑制剂PIK75促进巨噬细胞自噬降解功能，抑制巨噬细胞分泌炎症因子。图3A，PIK75呈时间依赖(左)和剂量依赖抑制BMDM巨噬细胞中PI3K/Akt活性。图3B，PIK75促进BMDM巨噬细胞中p62降解；LPS刺激6小时BMDM巨噬细胞或无，同时用100nM PIK75处理细胞；收集细胞，免疫印迹分析自噬相关蛋白表达(LC3，p62)；*，非特异性条带。图3C，细胞处理如图3B，LPS及PIK75作用时间分别为2小时或4小时；收集细胞上清，ELISA检测细胞上清中TNF-a水平。图3D，PIK75诱导BMDM巨噬细胞凋亡；LPS刺激BMDM巨噬细胞，同时用100nM PIK75处理细胞3小时或过夜，或500nM Rapamycin处理细胞过夜；收集细胞，免疫印迹分析PI3K/Akt/mTORC1蛋白磷酸化及细胞调亡Caspase-3活性，Caspase-3活化条带为15kDa。
图4：小分子抑制PIK75可减轻DSS诱导的肠炎。图4A，小鼠以2.5％DSS饮用水诱导肠炎，对照组及PIK75用药组体重变化情况。图4B，小鼠以2.5％DSS饮用水诱导肠炎，结肠组织切片；对照组炎症严重，肠壁增厚，隐窝消失；PIK75给药组炎症相对较轻，隐窝相对完整。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1小分子抑制剂PIK75促进自噬小体清除
1.1、试验目的
考察小分子抑制剂PIK75促进自噬小体清除的功能。
1.2、试验方法及结论
(1)细胞培养
乳腺癌细胞系MDA-MB-231，用含10％FBS，1％P/S的DMEM，在5％CO2，90％湿度培养箱中37℃培养。从小鼠骨髓细胞诱导小鼠BMDM细胞。具体地，冲洗小鼠大腿股骨和胫骨得到小鼠骨髓细胞。小鼠骨髓细胞重悬于ɑ-MEM+10％FBS+1％P/S培养基中，以1x106/mL浓度铺于6-cm培养皿，以10ng/mL M-CSF,10ng/mL IL-4,10ng/mL IL-13诱导6天，其中第三天换液一次。
(2)免疫荧光
为使用Ad-mRFP-GFP-LC3病毒转染考察细胞自噬，细胞以1x105/mL/孔铺于24孔板中。次日，换成无血清培养基，用Ad-mRFP-GFP-LC3病毒转染6小时以上，换完全培养基中培养24小时以使mRFP-GFP-LC3充分表达。血清饥饿约16小时。在血清饥饿的最后5-6小时，用100nM PIK75处理细胞。通过荧光显微镜观察各种处理条件下自噬小体的清除情况。
(3)小分子抑制剂PIK75促进自噬小体清除
MDA-MB-231乳腺癌细胞，血清饥饿16小时，细胞中产生了大量的自噬小体，表现为腺病毒Ad-mRFP-GFP-LC3转染的细胞内存在大量的串联红色荧光蛋白和绿色荧光双阳性的LC3囊泡(图1A，1B)；当在血清饥饿的同时用100nM PIK75处理细胞5小时，细胞内的自噬小体显著减少(图1A，1B)。在表达LAMP-2-GFP的细胞中，血清饥饿导致溶酶体在细胞核周围聚集；当在血清饥饿的同时用100nM PIK75处理细胞5小时，可见溶酶体分散于胞质中(图1C)。与此类似，免疫荧光染色显示PIK75处理细胞，能促进溶酶体分散于胞质中(图1D，图1E)。溶酶体分散在胞质中时，更易与在胞质中形成的自噬小体熔合，形成自噬溶酶小体，从而加速对自噬底物的清除。此外，如果通过更换培养基去除PIK75，在荧光显微镜下可以观察到被Lysotracker标记的溶酶体呈时间依赖性向细胞核周聚集(图1F)。与此同时，去除PIK75会导致细胞中重新积累自噬小体(图1G，图1H)。
实施例2小分子抑制剂PIK75促进肿瘤细胞自噬降解功能
2.1、试验目的
考察小分子抑制剂PIK75促进肿瘤细胞自噬降解功能。
2.2、试验方法及结论
(1)细胞培养
方法同实施例1。
(2)免疫印迹
肿瘤细胞或诱导成熟的BMDM细胞，铺于6孔板中。对于肿瘤细胞，次日血清饥饿约16小时。在血清饥饿的最后5-6小时，用100nM PIK75处理细胞。对于BMDM细胞，次日用100ng/μL LPS刺激细胞，并同时添加100nM PIK75.收集并裂解细胞。收集细胞裂解液上清，测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE分离细胞蛋白，免疫印迹法检测检测自噬相关蛋白的表达情况。一抗及稀释倍数为：rabbit-anti-p62(1:2000)(Novus Bio.),rabbit-anti-LC3(1:4000)(Novus Bio.).二抗及稀释倍数为：HRP-conjugated-goat-anti-rabbit-IgG(H+L)(1:10000)(Thermo).免疫印迹通过ECL显影。
(3)小分子抑制剂PIK75促进肿瘤细胞自噬降解
MDA-MB-231乳腺癌细胞，血清饥饿16小时后，免疫印迹结果表明，细胞中LC3-II蛋白表达增加，显示自噬小体合成增加(图2A)。当在血清饥饿的同时用100nM PIK75处理细胞5小时，细胞中Akt磷酸化水平减少，LC3-II蛋白表达显著减少，同时，自噬底物p62也显著减少，表明PIK75促进了自噬小体及底物的清除(图2A)。Rapamycin通过抑制mTORC1活性(表现为S6K磷酸化减少)，促进细胞自噬小体合成增加，表现为细胞中LC3-II蛋白表达水平显著增加(图2B)。但Rapamycin对自噬底物p62的清除没有影响(图2B)。以上结果说明，PIK75促进细胞自噬降解功能，不是通过抑制经典的PI3K/Akt/mTORC1通路。
实施例3小分子抑制剂PIK75促进巨噬细胞自噬降解功能、抑制巨噬细胞分泌炎症因子
3.1、试验目的
考察小分子抑制剂PIK75促进巨噬细胞自噬降解功能、抑制巨噬细胞分泌炎症因子功能。
3.2、试验方法及结论
(1)细胞培养
方法同实施例1。
(2)免疫印迹
方法同实施例2。
(3)小分子抑制剂PIK75促进巨噬细胞自噬降解功能、抑制巨噬细胞分泌炎症因子
PIK75可抑制BMDM巨噬细胞中PI3K/Akt的活性(具体表现为Akt磷酸化水平减少)，并且呈作用时间(图3A，左边部分)和作用剂量(图3A，右边部分)依赖关系。PIK75能促进巨噬细胞中自噬底物p62蛋白的降解(图3B)。在炎症信号刺激时(如LPS刺激时)，巨噬细胞中p62大量积累(图3B)。PIK75能非常显著地降低炎症信号刺激的巨噬细胞中p62蛋白水平(图3B)。p62积累可能通过NF-kB信号通路激活炎症因子的表达。通过ELISA检测LPS刺激后巨噬细胞分泌TNF-a水平，发现PIK75能显著抑制巨噬细胞分泌TNF-a,并且TNF-a水平与p62蛋白水平正相关(图3C)。此外，PIK75能促进巨噬细胞凋亡，而Rapamycin则没有此功能(图3C)。因此，小分子抑制剂PIK75能促进巨噬细胞自噬降解功能，抑制巨噬细胞分泌炎症因子。
实施例4小分子抑制剂PIK75减轻DSS诱导的肠炎
4.1、试验目的
考察小分子抑制剂PIK75可减轻DSS诱导的肠炎功能。
4.2、试验方法及结论
(1)细胞培养
方法同实施例1。
(2)DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导UC肠炎模型
DSS具有肠上皮细胞毒性，造成黏膜损伤，肠道抗原(微生物等)与DCs、Macrophages接触，激活免疫系统，引起炎症反应。随机选取雌性SPF级C57BL/6小鼠，体重20±2g，适应性饲养于IVC系统(20-25℃，50-60％RH)中。参考Cooper HS等的方法建立急性UC模型：C57BL/6小鼠自由饮用2.5％DSS水溶液5天，每天更换新鲜的DSS溶液，建立小鼠急性UC模型。5天后更换为正常饮水。正常对照组小鼠用饮用蒸馏水。PIK75药物剂量为2mg/kg小鼠体重。PIK75溶解与10％DMSO，30％PEG400，20％Tween80，40％ddH2O中.从DSS诱导UC肠炎第2日起灌胃给药，100μL/日，连续5天。每天定时检测小鼠体重变化，腹泻、便血症状。对照组用溶剂灌胃。第8天处死小鼠后取结肠组织做病理切片。为考察小鼠体重变化，则在第11天处死小鼠。
(3)小分子抑制PIK75可减轻DSS诱导的肠炎
DSS具有肠上皮细胞毒性，造成黏膜损伤，肠道抗原(微生物等)与DCs、巨噬细胞接触，激活免疫系统，引起炎症反应。小鼠在喂2.5％DSS水溶液5天后，不管是否用PIK75进行治疗，体重都开始下降(图4A)。但PIK75治疗组体重下降显著较对照组体重下降慢(图4A)。此外，PIK75治疗组腹泻，便血等较轻。结肠组织切片结果表明，对照组肠道溃疡，炎性细胞浸润，隐窝消失；而PIK75治疗组炎性细胞浸润较轻，隐窝相对完整(图4B)。以上结果表明，PIK75可减轻DSS诱导的肠炎。基于PIK75在巨噬细胞自噬降解中的作用，推测PIK75通过促进UC浸润炎症细胞DCs、巨噬细胞自噬降解，起到缓解UC的作用。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.小分子抑制剂PIK75用于制备细胞自噬降解促进药物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述细胞自噬降解促进药物至少具有以下功用之一：促进自噬小体清除；促进肿瘤细胞自噬降解；促进巨噬细胞自噬降解；抑制巨噬细胞分泌炎症因子；减轻肠炎炎症反应。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述小分子抑制剂PIK75是指对细胞自噬小体清除具有促进效果的分子。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述小分子抑制剂PIK75促进自噬小体/自噬底物降解。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，小分子抑制剂PIK75为所述细胞自噬降解促进药物的唯一有效成分或有效成分之一。
6.一种细胞自噬降解促进药物，包括有效剂量的小分子抑制剂PIK75。
7.一种细胞自噬降解促进药物组合物，包括有效量的小分子抑制剂PIK75和至少一种其他细胞自噬降解促进药物。
8.小分子抑制剂PIK75在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：促进自噬小体清除；促进肿瘤细胞自噬降解；促进巨噬细胞自噬降解；抑制巨噬细胞分泌炎症因子；减轻肠炎炎症反应。
9.一种促进细胞自噬降解的方法，为向对象施用小分子抑制剂PIK75。
10.一种促进细胞自噬降解的方法，为向对象施用有效量的小分子抑制剂PIK75以及向对象施用有效量的其他细胞自噬降解促进药物和/或向对象实施其他细胞自噬降解促进手段。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106674200A (zh) * 2016-12-21 2017-05-17 西安交通大学 一种含有l‑脯氨酰胺片段的化合物及其制备方法和应用
CN109310768A (zh) * 2015-12-29 2019-02-05 得克萨斯大学体系董事会 用于治疗癌症的p38 mapk的抑制
CN111228265A (zh) * 2020-02-10 2020-06-05 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） p38γ抑制剂在制备治疗胰腺癌药物中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109310768A (zh) * 2015-12-29 2019-02-05 得克萨斯大学体系董事会 用于治疗癌症的p38 mapk的抑制
CN106674200A (zh) * 2016-12-21 2017-05-17 西安交通大学 一种含有l‑脯氨酰胺片段的化合物及其制备方法和应用
CN111228265A (zh) * 2020-02-10 2020-06-05 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） p38γ抑制剂在制备治疗胰腺癌药物中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAO MENG等: "Propofol induces proliferation partially via downregulation of p53 protein and promotes migration via activation of the Nrf2 pathway in human breast cancer cell line MDA-MB-231", 《ONCOLOGY REPORTS》, vol. 37, pages 841 - 848 *
NILESH M. DAGIA等: "A preferential p110α/γ PI3K inhibitor attenuates experimental inflammation by suppressing the production of proinflammatory mediators in a NF-κB-dependent manner", 《AM.J. PHYSIOL CELL PHYSIOL.》, vol. 298, pages 929 - 147 *

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