CN106674200A - 一种含有l‑脯氨酰胺片段的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有L‑脯氨酰胺片段的化合物及其制备方法和应用，属于抗肿瘤药物技术领域。所述的含有L‑脯氨酰胺片段的化合物包括含有L‑脯氨酰胺片段的5‑芳基吡啶类化合物、含有L‑脯氨酰胺片段的5‑芳基吡嗪类化合物和含有L‑脯氨酰胺片段的6‑芳基苯并噻唑类化合物，其结构式为或药理学实验表明该类化合物具有良好的抗肿瘤活性，可应用于抗肿瘤药物的制备，为抗肿瘤药物的开发和应用提供了新的选择，还可进一步应用于抗肿瘤药物的设计与优化。该类化合物的制备方法具有原料易得、反应条件温和、合成方法容易实现、反应过程操作简单、所用试剂便宜、产率较高的优点。
Description
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物技术领域，涉及一种含有L-脯氨酰胺片段的化合物及其制备方法和应用，为抗肿瘤药物的开发和应用提供了新的选择。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一。根据2013年全国肿瘤登记结果，中国恶性肿瘤发病率为235/10万，肺癌和乳腺癌分别位居男、女性发病首位，十年来中国恶性肿瘤发病率呈上升趋势，发病率与世界水平接近。但是，恶性肿瘤死亡率高于世界水平，2012年中国恶性肿瘤发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；恶性肿瘤死亡人数为220.5万，约占全球恶性肿瘤死亡人数的四分之一。在美国，恶性肿瘤患者的5年生存率大约在60％至70％，而我国恶性肿瘤患者5年生存率大约在30％左右。
目前，临床对于恶性肿瘤的治疗，一般有外科手术、放射治疗及药物化疗等。其中药物化疗可以针对局部性和扩散性癌变组织，临床上应用十分广泛。但是，传统的药物选择性较差，在杀死肿瘤细胞的同时也会杀死正常组织的细胞，导致明显的毒副作用。因此，研究开发新结构类型的抗肿瘤药物具有重要意义。
研究发现，在很多肿瘤患者中存在PI3K信号转导通路的异常调节。形成PI3K通路异常调节的原因包括抑癌基因PTEN的缺失，受体酪氨酸激酶的扩增或过度活化(例如：erbB3，erbB2，EGFR)，Akt基因区域或PIK3CA基因的扩增。特别是在很多肿瘤患者中存在PIK3CA突变。统计数据显示，32％的结肠直肠癌患者，27％的恶性胶质瘤患者，25％的胃癌患者，36％的肝癌患者，18～40％的乳腺癌患者中存在PIK3CA突变，尚未发现PIK3CB，PIK3CD和PIK3CG突变。另外，PIK3CA中存在两个主要的突变位点E545K和H1047R，其中Glu545在螺旋区域(外显子9)，His1047在PI3Kα的催化区域(外显子10)。
研究表明，在肿瘤细胞中，PIK3CA基因敲除后，会阻断信号转导通路，阻碍细胞生长；在小鼠体内，删除纯合子p110α后会导致小鼠胚胎坏死。进一步说明了PI3Kα靶标的重要性。目前，已有一些PI3Kα抑制剂被报道，例如PIK75、A66S、MLN1117、BYL719等，它们都在动物模型中表现出很好的抑制肿瘤的作用，其中MLN1117和BYL719已进入临床研究。
因此，设计并合成一系列新的具有抗肿瘤作用的化合物，尤其是对PI3Kα具有抑制作用的抗肿瘤化合物，对抗肿瘤药物的研究与开发及日后的临床应用具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有L-脯氨酰胺片段的化合物及其制备方法和应用，该类化合物具有抗肿瘤活性，可应用于抗肿瘤药物的制备，而且其合成原料易得、合成方法容易实现。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种含有L-脯氨酰胺片段的化合物，包括含有L-脯氨酰胺片的5-芳基吡啶类化合物、含有L-脯氨酰胺片的5-芳基吡嗪类化合物和含有L-脯氨酰胺片的6-芳基苯并噻唑类化合物；所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物的结构式为：
其中，R为取代苯基或取代吡啶基；X为C或N；R1为取代苯基、取代吡啶基或取代嘧啶基。
式(1)中，当X为C时，该化合物为含有L-脯氨酰胺片的5-芳基吡啶类化合物，其中R为3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶基、N-(2-氯-5-溴苯基)-4-氟苯磺酰氨基、N-(4-氟苯基)-2-氯-5-溴苯磺酰氨基、5-三氟甲基-6-氯-3-吡啶基、3-三氟甲基-4-氯苯基、3-三氟甲氧基-4-氯苯基、4-吡啶基或3-吡啶基；
式(1)中，当X为N时，该化合物为含有L-脯氨酰胺片的5-芳基吡嗪类化合物，其中R为3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶基、N-(2-氯-5-溴苯基)-4-氟苯磺酰氨基、N-(4-氟苯基)-2-氯-5-溴苯磺酰氨基、5-三氟甲基-6-氯-3-吡啶基、3-三氟甲基-4-氯苯基、3-三氟甲氧基-4-氯苯基或4-(1H-1-吡唑基)苯基；
式(2)为含有L-脯氨酰胺片的6-芳基苯并噻唑类化合物，其中R1为3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶基、2-甲氧基-3-甲磺酰氨基-5-溴吡啶基、5-三氟甲基-6-氯-3-吡啶基、3-三氟甲基-4-氯苯基、3-三氟甲氧基-4-氯苯基、2-三氟甲基-5-溴吡啶、2-甲氧基-5-溴吡啶、3-甲氧基-5-溴吡啶、2-氨基-5-溴吡啶、2-氨基-5-溴嘧啶、3-羟基苯基或3-羟甲基苯基。
所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，制备含脲的母核：
2-氨基-5-溴吡啶与CDI和L-脯氨酰胺发生两步缩合反应得到含脲的母核(S)-N1-(5-溴-2-吡啶基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺；
或者2-氨基-5-溴吡嗪与三光气和L-脯氨酰胺发生两步缩合反应得到含脲的母核(S)-N1-(5-溴-2-吡嗪基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺；
或者2-氨基-6-溴苯并噻唑与CDI和L-脯氨酰胺发生两步缩合反应得到含脲的母核(S)-N1-(6-溴-2-苯并噻唑基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺；
步骤2，制备中间体：
对氟苯磺酰氯与3-氨基-2-氯-5-溴吡啶或2-氯-5-溴苯胺经磺酰化及水解反应得到中间体3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶或N-(2-氯-5-溴苯基)-4-氟苯磺酰胺；
或者对氟苯胺与2-氯-5-溴苯磺酰氯发生磺酰化反应得到中间体N-(4-氟苯基)-2-氯-5-溴苯磺酰胺。
步骤3，制备目标化合物：
步骤2制得的中间体与双频哪醇硼酸酯反应得到芳烃硼酸酯；芳烃硼酸酯再与步骤1制得的含脲的母核发生Suzuki偶联反应，得到含有L-脯氨酰胺片段的化合物。
所述步骤1的具体操作为：将2-氨基-5-溴吡啶和CDI溶解于溶剂二氧六环中，在氮气保护下进行反应，反应结束后冷却至室温，加入L-脯氨酰胺和TEA，室温下搅拌进行反应，反应结束后旋蒸除去溶剂，再加入水抽滤，滤饼烘干后经硅胶柱色谱分离纯化，得到含脲的母核(S)-N1-(5-溴-2-吡啶基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺；
或者将三光气溶解于溶剂二氯甲烷中，在冰浴条件下向其中滴加2-氨基-5-溴吡嗪的二氯甲烷溶液，滴完后撤去冰浴，室温下搅拌进行反应，反应结束后再加入L-脯氨酰胺的二氯甲烷溶液和TEA，室温下搅拌继续进行反应，反应结束后旋蒸除去溶剂，用乙酸乙酯萃取，萃取的有机相经洗涤、干燥后用硅胶柱色谱分离纯化，得到含脲的母核(S)-N1-(5-溴-2-吡嗪基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺；
或者称取2-氨基-6溴苯并噻唑和CDI，加入DMF作为溶剂，室温下搅拌进行反应，反应结束后抽滤，将滤饼放入反应容器中，加入L-脯氨酰胺和DMF，室温下搅拌继续进行反应，反应结束后，加水析出沉淀并抽滤，滤饼烘干后经硅胶柱色谱分离纯化，得到含脲的母核(S)-N1-(6-溴-2-苯并噻唑基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺。
所述步骤2的具体操作为：称取3-氨基-2-氯-5-溴吡啶或2-氯-5-溴苯胺，加入对氟苯磺酰氯，再加入吡啶进行反应，反应结束后冷却至室温，加水析出固体并抽滤，将滤饼放入反应容器中，加入无水K2CO3、水和甲醇，室温下搅拌进行反应，反应结束后旋蒸除去溶剂，经硅胶柱色谱分离纯化，得到中间体3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶或N-(2-氯-5-溴苯基)-4-氟苯磺酰胺；
或者称取2-氯-5-溴苯磺酰氯和对氟苯胺，加入二氯甲烷和吡啶，室温下搅拌进行反应，反应结束后旋蒸除去二氯甲烷，加水，抽滤，滤饼烘干后经硅胶柱色谱分离纯化，得到中间体N-(4-氟苯基)-2-氯-5-溴苯磺酰胺。
所述步骤3的具体操作为：称取中间体，加入双频哪醇硼酸酯、乙酸钾和Pd(dppf)Cl2，再加入二氧六环，氮气保护下加热回流反应，反应结束后冷却至室温，得到芳烃硼酸酯，再加入含脲的母核、碳酸钾、Pd(dppf)Cl2和水，氮气保护下加热回流反应，反应结束后冷却至室温，旋蒸除去溶剂，再经硅胶色谱柱分离纯化，即得到含有L-脯氨酰胺片段的化合物。
所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物在制备具有PI3Kα抑制作用的抗肿瘤药物中的应用。
所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物在制备抗结肠癌药物和/或抗乳腺癌药物中的应用。
所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物添加辅料制成片剂、胶囊剂、软胶囊剂或注射剂，其中每片、每粒或每支制剂中含有10～500mg的含有L-脯氨酰胺片段的化合物；所述的辅料包括添加剂、稳定剂、增溶剂、润滑剂、崩解剂中的一种或几种。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供的含有L-脯氨酰胺片段的化合物，包括含有L-脯氨酰胺片段的5-芳基吡啶类化合物、含有L-脯氨酰胺片段的5-芳基吡嗪类化合物和含有L-脯氨酰胺片段的6-芳基苯并噻唑类化合物，是以吡啶、吡嗪和苯并噻唑作为母核，并在母核上连接L-脯氨酰胺片段后得到的。药理学实验表明，本发明提供的含有L-脯氨酰胺片段的化合物在多种肿瘤细胞株上具有良好的抑制活性，具有较强的体外抗肿瘤活性，可应用于抗肿瘤药物的制备，为抗肿瘤药物的开发和应用提供了新的选择，还可进一步应用于抗肿瘤药物的设计与优化。
本发明提供的含有L-脯氨酰胺片段的化合物的制备方法，先以2-氨基-5-溴吡啶、2-氨基-5-溴吡嗪和2-氨基-6-溴苯并噻唑作为起始化合物，经两步缩合反应得到含脲的母核，然后制备出需要在母核5位或6位上引入的中间体，中间体与双频哪醇硼酸酯反应得到芳烃硼酸酯后再与母核发生Suzuki偶联反应，即得到目标化合物。该方法具有原料易得、反应条件温和、合成方法容易实现、反应过程操作简单、所用试剂便宜、产率较高的优点。
进一步的，药理学研究表明，本发明提供的含有L-脯氨酰胺片段的6-芳基苯并噻唑类化合物在100nmol/L时对PI3Kα的抑制作用明显，且对肿瘤细胞HCT-116和MDA-MB-453有明显的增殖抑制活性。
进一步的，药理学研究表明，本发明制备的化合物T23具有对PI3Kα的选择性，且在HCT116和MDA-MB-453上表现出明显的抑制活性。化合物T16-T18、T21-T27在100nmol/L时对PI3Kα的抑制作用明显，其中T16、T17和T23对PI3Kα的IC50值达到纳摩尔级别。化合物T4-T6对HCT116的半数抑制浓度均小于10μmol/L，化合物T16-T27对HCT116和MDA-MB-453两株细胞的半数抑制浓度均小于或接近10μmol/L。化合物T16、T18-T20和T23对HCT116的抑制活性与阳性药BYL719相当，化合物T16、T17和T22-T25对MDA-MB-453的抑制活性与阳性药BYL719相当。
进一步的，本发明提供的含有L-脯氨酰胺片段的化合物，能够用于制备抗肿瘤药物制剂，其中每片、每粒或每支药物制剂中含有10-500mg含有L-脯氨酰胺片段的化合物。在利用本发明的含有L-脯氨酰胺片段的化合物制备抗肿瘤药物制剂时，可以将该药物制成片剂、胶囊剂、软胶囊剂或注射剂。这些药物制剂可按照各种制剂的常规制备工艺制成。对于片剂或胶囊剂，优选的含量为20-150mg。并且本发明涉及的口服制剂中可含有药用辅料，包括添加剂、稳定剂、增溶剂、润滑剂、崩解剂等，如淀粉、糊精、葡萄糖、乳糖、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、交联聚乙烯吡咯烷酮、果胶、环糊精、土温-80、聚乙烯醇、硬脂酸镁、滑石粉等。
具体实施方式
本发明提供的含有L-脯氨酰胺片段的化合物，包括含有L-脯氨酰胺片段的5-芳基吡啶类化合物、含有L-脯氨酰胺片段的5-芳基吡嗪类化合物和含有L-脯氨酰胺片段的6-芳基苯并噻唑类化合物，具有原料易得、反应条件温和、反应过程操作简单的特点。其中本发明提供的含有L-脯氨酰胺片段的6-芳基苯并噻唑类化合物具有较强的抗肿瘤活性，可进一步应用于抗肿瘤药物的设计与优化。
下面结合实施例对本发明做详细的说明，实施例仅用于说明本发明，而不是以任何方式限制本发明。尽管用较佳的实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围下可以对本发明进行修改、变形或等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1(S)-N1-{5-[3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-3-吡啶基]-2-吡啶基}-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T1)的制备
(1)(S)-N1-(5-溴-2-吡啶基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺的合成
称取2-氨基-5-溴吡啶1.0g(5.78mmol)和CDI 3.75g(23.12mmol)于100mL茄形瓶中，再加入15mL二氧六环作为溶剂，氮气保护，80℃反应12h，冷却至室温，加入1.98g(17.34mmol)L-脯氨酰胺和1mL TEA，室温搅拌5h，停止反应，旋蒸除去溶剂，加水后抽滤，取滤饼烘干，硅胶柱色谱分离纯化，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝30/1，得1.20g白色晶体，产率66.30％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.86(s,1H,-CONHAr),8.34(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),7.91(dd,1H，J＝2.0Hz,J＝8.0Hz,Ar-H),7.86(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.39(s,1H,-NH2),6.99(s,1H,-NH2),4.27-4.28(m,1H,-CO-NCH-),3.59-3.64(m,1H,-NCH 2CH2-),3.45-3.49(m,1H,-NCH 2CH2-),2.04-2.10(m,1H,-NCHCH2-),1.84-1.89(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
(2)3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶的合成
称取化合物3-氨基-2-氯-5-溴吡啶1.00g(4.82mmol)和对氟苯磺酰氯2.80g(14.46mmol)于100mL茄形瓶中，再加入10mL吡啶，70℃反应8h，冷却至室温，加水析出固体，抽滤，将滤饼转移至100mL茄形瓶中，加入无水K2CO3 3.00g(21.71mmol)，水6mL，甲醇20mL，室温搅拌12h，旋蒸除去溶剂，硅胶柱色谱分离纯化，洗脱剂(V/V)：石油醚/乙酸乙酯＝10/1，得1.40g白色固体，产率：79.53％。
(3)3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡啶的合成
称取化合物3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶0.53g(1.44mmol)、双联频哪醇硼酸酯0.44g(1.73mmol)、乙酸钾0.42g(4.32mmol)和Pd(dppf)Cl2 0.11g(0.14mmol)于100mL茄形瓶中，加入12mL二氧六环，氮气保护，120℃加热回流3h，冷却至室温，直接投下一步。
(4)(S)-N1-{5-[3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-3-吡啶基]-2-吡啶基}-1,2-四氢吡咯二甲酰胺的合成
向3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡啶(理论产量0.59g，1.44mmol)的反应体系中，加入(S)-N1-(5-溴-2-吡啶基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺0.30g(0.96mmol)、碳酸钾0.40g(2.88mmol)、Pd(dppf)Cl2 0.07g(0.10mmol)和水3mL，氮气保护，120℃加热回流3h，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，硅胶柱色谱分离纯化三次，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝15/1，得0.11g淡黄色固体，产率：22.80％，mp：218-220℃。ESI-MS(m/z)：519.0[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ10.50(br,1H,-SO2NHAr),δ8.90(s,1H,-CONHAr),8.63(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),8.56(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),8.05(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝9.2Hz,Ar-H),8.01(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.99(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),7.80-7.83(m,2H,Ar-H),7.42-7.46(m,2H,Ar-H),7.39(s,1H,-NH2),6.99(s,1H,-NH2),4.31-4.34(m,1H,-CO-NCH-),3.63-3.69(m,1H,-NCH 2CH2-),3.48-3.54(m,1H,-NCH 2CH2-),2.08-2.13(m,1H,-NCHCH2-),1.86-1.92(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例2(S)-N1-{5-[3-(4-氟苯磺酰氨基)-4-氯苯基]-2-吡啶基}-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T2)的制备
制备方法同实施例1，用2-氯-5-溴苯胺代替2-氨基-5-溴吡啶。产率：18.03％，mp：166-168℃。ESI-MS(m/z)：518.0[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ10.21(br,1H,-SO2NHAr),δ8.83(s,1H,-CONHAr),8.41(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),7.98(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.91(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝8.8Hz,Ar-H),7.78-7.82(m,2H,Ar-H),7.57(dd,1H,J＝2.0Hz,J＝8.8Hz,Ar-H),7.50(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.41-7.46(m,3H,Ar-H),7.38(s,1H,-NH2),6.98(s,1H,-NH2),4.31-4.33(m,1H,-CO-NCH-),3.63-3.67(m,1H,-NCH 2CH2-),3.49-3.54(m,1H,-NCH 2CH2-),2.08-2.12(m,1H,-NCHCH2-),1.87-1.92(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例3(S)-N1-(5-{4-氯-3-[N-(4-氟苯基)磺酰氨基]苯基}-2-吡啶基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T3)的制备
(1)N-(4-氟苯基)-2-氯-5-溴苯磺酰胺的合成
称取化合物2-氯-5-溴苯磺酰氯0.50g(1.72mmol)和对氟苯胺0.21g(1.90mmol)于100mL茄形瓶中，加入20mL二氯甲烷和0.15mL吡啶，室温搅拌12h，旋蒸除去二氯甲烷，向体系中加入一定量的水，抽滤烘干，硅胶柱色谱分离纯化，洗脱剂(V/V)：石油醚/乙酸乙酯＝5/1，得0.66g白色固体，产率：88.01％，mp：171-173℃。
(2)3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-6-氯-N-(4-氟苯基)苯磺酰胺的合成
称取化合物N-(4-氟苯基)-2-氯-5-溴苯磺酰胺0.42g(1.15mmol)、双联频哪醇硼酸酯0.35g(1.38mmol)、乙酸钾0.34g(3.45mmol)和Pd(dppf)Cl2 0.06g(0.08mmol)于100mL茄形瓶中，加入12mL二氧六环，氮气保护，120℃加热回流3h，冷却至室温，直接投下一步。
(3)合成(S)-N1-(5-{4-氯-3-[N-(4-氟苯基)磺酰氨基]苯基}-2-吡啶基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺
向3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-6-氯-N-(4-氟苯基)苯磺酰胺(理论产量0.47g，1.15mmol)的反应体系中，加入(S)-N1-(5-溴-2-吡啶基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺0.30g(0.96mmol)、碳酸钾0.40g(2.88mmol)、Pd(dppf)Cl2 0.05g(0.07mmol)和水3mL，氮气保护，120℃加热回流3h，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，硅胶柱色谱分离纯化三次，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝25/1，得0.25g白色固体，产率：50.28％，mp：134-136℃。ESI-MS(m/z)：518.0[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ10.68(br,1H,-SO2NHAr),δ8.86(s,1H,-CONHAr),8.54(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),8.18(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),8.03(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝8.8Hz,Ar-H),7.98(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.94(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝8.4Hz,Ar-H),7.71(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.41(s,1H,-NH2),7.15-7.18(m,2H,Ar-H),7.07-7.11(m,2H,Ar-H),6.99(s,1H,-NH2),4.30-4.32(m,1H,-CONCH-),3.62-3.66(m,1H,-NCH 2CH2-),3.51-3.53(m,1H,-NCH 2CH2-),2.06-2.13(m,1H,-NCHCH2-),1.87-1.91(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例4(S)-N1-[5-(5′-三氟甲基-6′-氯-3′-吡啶基)-2-吡啶基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T4)的制备
(1)3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-5-三氟甲基-6-氯吡啶的合成
称取化合物3-三氟甲基-2-氯-5-溴吡啶0.20g(0.77mmol)、双联频哪醇硼酸酯0.23g(0.92mmol)、乙酸钾0.23g(2.31mmol)和Pd(dppf)Cl2 0.04g(0.05mmol)于100mL茄形瓶中，加入12mL二氧六环，氮气保护，120℃加热回流3h，冷却至室温，直接投下一步。
(2)(S)-N1-[5-(5′-三氟甲基-6′-氯-3′-吡啶基)-2-吡啶基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺的合成
向3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-5-三氟甲基-6-氯吡啶(理论产量0.24g，0.77mmol)的反应体系中，加入(S)-N1-(5-溴-2-吡啶基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺0.16g(0.51mmol)、碳酸钾0.21g(1.53mmol)、Pd(dppf)Cl2 0.06g(0.05mmol)和水3mL，氮气保护，120℃加热回流3h，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，硅胶柱色谱分离纯化三次，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝25/1，得0.06g白色固体，产率：30.21％，mp：190-192℃。ESI-MS(m/z)：414.0[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ9.07(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),δ8.92(s,1H,-CONHAr),8.77(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),8.61(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),8.23(dd,1H,J＝2.8Hz,J＝8.8Hz,Ar-H),8.01(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.41(s,1H,-NH2),6.99(s,1H,-NH2),4.31-4.32(m,1H,-CONCH-),3.63-3.67(m,1H,-NCH 2CH2-),3.51-3.52(m,1H,-NCH 2CH2-),2.06-2.12(m,1H,-NCHCH2-),1.88-1.91(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例5(S)-N1-[5-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-2-吡啶基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T5)的制备
制备方法同实施例4，用2-三氟甲基-4-溴苄氯代替3-三氟甲基-2-氯-5-溴吡啶。产率：35.32％，mp：176-178℃。ESI-MS(m/z)：413.1[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.85(s,1H,-CONHAr),8.67(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),8.14(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝8.8Hz,Ar-H),8.11(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),8.03(dd,1H,J＝2.0Hz,J＝8.4Hz,Ar-H),7.99(d,1H,J＝9.2Hz,Ar-H),7.81(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.41(s,1H,-NH2),6.99(s,1H,-NH2),4.30-4.33(m,1H,-CONCH-),3.64-3.68(m,1H,-NCH 2CH2-),3.51-3.53(m,1H,-NCH 2CH2-),2.08-2.13(m,1H,-NCHCH2-),1.85-1.91(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例6(S)-N1-[5-(3-三氟甲氧基-4-氯苯基)-2-吡啶基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T6)的制备
制备方法同实施例4，用2-三氟甲氧基-4-溴苄氯代替3-三氟甲基-2-氯-5-溴吡啶。产率：36.44％，mp：200-204℃。ESI-MS(m/z)：429.1[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.84(s,1H,-CONHAr),8.64(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),8.10(dd,1H,J＝1.2Hz,J＝8.8Hz,Ar-H),7.98(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.91(s,1H,Ar-H),7.76-7.83(m,2H,Ar-H),7.41(s,1H,-NH2),6.99(s,1H,-NH2),4.30-4.32(m,1H,-CONCH-),3.63-3.68(m,1H,-NCH 2CH2-),3.49-3.51(m,1H,-NCH 2CH2-),2.08-2.13(m,1H,-NCHCH2-),1.85-1.91(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例7(S)-N1-[5-(4′-吡啶基)-2-吡啶基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T7)的制备
称取化合物(S)-N1-(5-溴-2-吡啶基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺0.30g(0.96mmol)、4-吡啶基硼酸0.18g(1.44mmol)、碳酸钾0.40g(2.88mmol)和Pd(dppf)Cl2 0.07g(0.10mmol)于100mL茄型瓶中，加入二氧六环12mL和水3mL，氮气保护，120℃加热回流3h，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，硅胶柱色谱分离纯化三次，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝20/1，得0.10g白色固体，产率：33.49％，mp：243-245℃。ESI-MS(m/z)：312.1[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.90(s,1H,-CONHAr),8.74(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),8.62(d,1H,J＝6.0Hz,Ar-H),8.19(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝8.8Hz,Ar-H),8.02(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.77(d,1H,J＝6Hz,Ar-H),7.40(s,1H,-NH2),7.00(s,1H,-NH2),4.31-4.37(m,1H,-CO-NCH-),3.63-3.71(m,1H,-NCH 2CH2-),3.48-3.54(m,1H,-NCH 2CH2-),2.06-2.13(m,1H,-NCHCH2-),1.83-1.93(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例8(S)-N1-[5-(4-甲氧基苯基)-2-吡啶基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T8)的制备
制备方法同实施例7，用4-甲氧基苯硼酸代替4-吡啶基硼酸。产率：52.03％，mp：206-208℃。ESI-MS(m/z)：341.1[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.65(s,1H,-CONHAr),8.51(d,1H,J＝1.6Hz,Ar-H),7.97(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝8.8Hz,Ar-H),7.93(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.63(d,2H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.38(s,1H,-NH2),7.03(d,2H,J＝8.8Hz,Ar-H),6.98(s,1H,-NH2),4.30-4.32(m,1H,-CO-NCH-),3.80(s,3H,-OCH3),3.62-3.66(m,1H,-NCH 2CH2-),3.47-3.53(m,1H,-NCH 2CH2-),2.07-2.11(m,1H,-NCHCH2-),1.86-1.92(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例9(S)-N1-{5-[3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-3-吡啶基]-2-吡嗪基}-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T9)的制备
(1)(S)-N1-(5-溴-2-吡嗪基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺的合成
称取三光气0.85g(2.87mmol)于100mL茄形瓶中，加入溶剂二氯甲烷，冰浴下滴加0.50g(2.87mmol)2-氨基-5-溴吡嗪的二氯甲烷溶液，滴加完成后，撤去冰浴，室温搅拌12h，再加入0.98g(8.61mmol)L-脯氨酰胺的二氯甲烷溶液和1.2mL TEA，室温搅拌1h，停止反应，旋蒸除去溶剂，用乙酸乙酯萃取，收集有机相，饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥后，硅胶柱色谱分离纯化，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝30/1，得0.30g黄色晶体，产率33.27％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ8.86(s,1H,-CONHAr),8.34(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),7.91(dd,1H,J＝2.0Hz,J＝8.0Hz,Ar-H),7.86(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.39(s,1H,-NH2),6.99(s,1H,-NH2),4.27-4.28(m,1H,-CO-NCH-),3.59-3.64(m,1H,-NCH 2CH2-),3.45-3.49(m,1H,-NCH 2CH2-),2.04-2.10(m,1H,-NCHCH2-),1.84-1.89(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
(2)(S)-N1-{5-[3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-3-吡啶基]-2-吡嗪基}-1,2-四氢吡咯二甲酰胺的合成
向3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡啶(理论产量0.59g，1.43mmol)的反应体系中，加入(S)-N1-(5-溴-2-吡嗪基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺0.24g(0.95mmol)、碳酸钾0.39g(2.85mmol)、Pd(dppf)Cl2 0.07g(0.10mmol)和水3mL，氮气保护，120℃加热回流3h，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，硅胶柱色谱分离纯化三次，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝15/1，得0.06g淡黄色固体，产率：12.15％，mp：159-161℃。ESI-MS(m/z)：520.0[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ10.53(br,1H,-SO2NHAr),δ9.41(s,1H,-CONHAr),9.22(s,1H,Ar-H),9.00(s,1H,Ar-H),8.93(s,1H,Ar-H),8.35(s,1H,Ar-H),7.80-7.83(m,2H,Ar-H),7.44-7.46(m,3H,Ar-H,-NH2),7.01(s,1H,-NH2),4.34-4.35(m,1H,-CONCH-),3.67(s,1H,-NCH 2CH2-),3.52-3.54(m,1H,-NCH 2CH2-),2.10-2.12(m,1H,-NCHCH2-),1.89(s,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例10(S)-N1-{5-[3-(4-氟苯磺酰氨基)-4-氯苯基]-2-吡嗪基}-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T10)的制备
制备方法同实施例9，用N-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-6-氯苯基]-4-氟苯磺酰胺代替3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡啶。产率：27.09％，mp：233-235℃。ESI-MS(m/z)：519.0[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ10.22(br,1H,-SO2NHAr),δ9.30(s,1H,-CONHAr),9.17(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),8.30(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),7.93(d,2H,J＝9.2Hz,Ar-H),7.77-7.80(m,2H,Ar-H),7.52(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H),7.39-7.44(m,3H,Ar-H,-NH2),7.01(s,1H,-NH2),4.33-4.34(m,1H,-CONCH-),3.65-3.68(m,1H,-NCH 2CH2-),3.53-3.58(m,1H,-NCH 2CH2-),2.09-2.13(m,1H,-NCHCH2-),1.89-1.91(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例11(S)-N1-(5-{4-氯-3-[N-(4-氟苯基)磺酰氨基]苯基}-2-吡嗪基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T11)的制备
制备方法同实施例9，用3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-6-氯-N-(4-氟苯基)苯磺酰胺代替3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡啶。产率：30.10％，mp：202-205℃。ESI-MS(m/z)：519.0[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ10.68(br,1H,-SO2NHAr),δ9.37(s,1H,-CONHAr),9.20(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),8.98(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),8.66(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),8.30(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝8.4Hz,Ar-H),7.75(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.43(s,1H,-NH2),7.14-7.17(m,2H,Ar-H),7.07-7.11(m,2H,Ar-H),7.01(s,1H,-NH2),4.33-4.35(m,1H,-CONCH-),3.64-3.70(m,1H,-NCH 2CH2-),3.53-3.55(m,1H,-NCH 2CH2-),2.09-2.13(m,1H,-NCHCH2-),1.87-1.91(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例12(S)-N1-[5-(5-三氟甲基-6-氯-3-吡啶基)-2-吡嗪基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T12)的制备
称取3-三氟甲基-2-氯-5-溴吡啶0.37g(1.43mmol)、双联频哪醇硼酸酯0.44g(1.716mmol)、乙酸钾0.28g(2.86mmol)和Pd(PPh3)4 0.08g(0.072mmol)于100mL茄型瓶中，加入DME 8mL，氮气保护，120℃加热回流3h，得到含有产物3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-5-三氟甲基-6-氯吡啶的反应体系，冷却至室温，向此体系中加入(S)-N1-(5-溴-2-吡嗪基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺0.30g(0.95mmol)、碳酸钠0.20g(1.90mmol)、Pd(PPh3)4 0.06g(0.05mmol)、乙醇8mL和水5.2mL，氮气保护，120℃加热回流3h，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，硅胶柱色谱分离纯化三次，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝25/1，得0.14g白色固体，产率：35.54％，mp：237-239℃。ESI-MS(m/z)：415.0[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ9.48(s,1H,-CONHAr),9.37(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),9.26(d,1H,J＝1.6Hz,Ar-H),9.18(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),8.86(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),7.43(s,1H,-NH2),7.01(s,1H,-NH2),4.35-4.36(m,1H,-CONCH-),3.66-3.40(m,1H,-NCH 2CH2-),3.50-3.56(m,1H,-NCH 2CH2-),2.10-2.15(m,1H,-NCHCH2-),1.88-1.92(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例13(S)-N1-[5-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-2-吡嗪基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T13)的制备
制备方法同实施例9，用2-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷代替3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡啶。产率：37.80％，mp：175-180℃。ESI-MS(m/z)：414.0[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ9.37(s,1H,-CONHAr),9.22(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),9.08(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),8.48(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),8.39(dd,1H,J＝2.0Hz,J＝8.4Hz,Ar-H),7.85(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.43(s,1H,-NH2),7.01(s,1H,-NH2),4.33-4.35(m,1H,-CONCH-),3.65-3.69(m,1H,-NCH 2CH2-),3.53-3.55(m,1H,-NCH 2CH2-),2.09-2.13(m,1H,-NCHCH2-),1.88-1.91(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例14(S)-N1-[5-(3-三氟甲氧基-4-氯苯基)-2-吡嗪基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T14)的制备
制备方法同实施例9，用2-(3-三氟甲氧基-4-氯苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷代替3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡啶。产率：27.14％，mp：182-184℃。ESI-MS(m/z)：430.0[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ9.38(s,1H,-CONHAr),9.21(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),9.05(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),8.23(s,1H,Ar-H),8.18(dd,1H,J＝2.0Hz,J＝8.4Hz,Ar-H),7.82(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.42(s,1H,-NH2),7.00(s,1H,-NH2),4.34-4.35(m,1H,-CONCH-),3.65-3.69(m,1H,-NCH 2CH2-),3.50-3.57(m,1H,-NCH 2CH2-),2.07-2.14(m,1H,-NCHCH2-),1.87-1.90(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例15(S)-N1-{5-[4-(1H-1-吡唑基)苯基]-2-吡嗪基}-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T15)的制备
称取1-(4-溴苯基)-1H-吡唑0.26g(1.16mmol)、双联频哪醇硼酸酯0.35g(1.38mmol)、乙酸钾0.34g(3.48mmol)和Pd(dppf)Cl2 0.06g(0.08mmol)于100mL茄型瓶中，加入二氧六环12mL，氮气保护，120℃加热回流3h，得到含有产物1-[4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基]-1H-吡唑的反应体系，冷却至室温，向此体系中加入(S)-N1-(5-溴-2-吡嗪基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺0.30g(0.95mmol)、碳酸钾0.39g(2.85mmol)、Pd(dppf)Cl2 0.05g(0.07mmol)和水3mL，氮气保护，120℃加热回流3h，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，硅胶柱色谱分离纯化三次，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝20/1，得0.12g白色固体，产率：33.48％，mp：235-238℃。ESI-MS(m/z)：378.1[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ9.25(s,1H,-CONHAr),9.20(d,1H,J＝1.6Hz,Ar-H),8.99(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),8.62(d,1H,J＝2.8Hz,Ar-H),8.22(d,2H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.98(d,2H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.80(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),7.43(s,1H,-NH2),7.02(s,1H,-NH2),6.59-6.60(m,1H,Ar-H),4.33-4.35(m,1H,-CONCH-),3.65-3.71(m,1H,-NCH 2CH2-),3.50-3.56(m,1H,-NCH 2CH2-),2.09-2.14(m,1H,-NCHCH2-),1.88-1.92(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例16(S)-N1-{6-[3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-3-吡啶基]-2-苯并噻唑基}-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T16)的制备
(1)(S)-N1-(6-溴-2-苯并噻唑基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺的合成
称取2-氨基-6溴-苯并噻唑1.00g(4.36mmol)和CDI 2.83g(17.46mmol)于100mL茄形瓶中，加入15mL DMF作为溶剂，常温搅拌24h，停止反应，抽滤取滤饼于100mL茄型瓶中，加入0.50g(4.36mmol)L-脯氨酰胺和12mL DMF，室温搅拌5h，停止反应，加水析出大量白色沉淀，抽滤，取滤饼烘干，硅胶柱色谱分离纯化，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝25/1，得1.10g白色固体，产率68.34％，mp：203-205℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ11.15(br,1H-CONHAr),8.15(s,1H,Ar-H),7.50-7.55(m,2H,Ar-H),7.45(s,1H,-NH2),7.01(s,1H,-NH2),4.29-4.31(m,1H,-CONCH-),3.63-3.64(m,1H,-NCH 2CH2-),3.49-3.51(m,1H,-NCH 2CH2-),2.09-2.14(m,1H,-NCHCH2-),1.88-1.89(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
(2)(S)-N1-{6-[3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-3-吡啶基]-2-苯并噻唑基}-1,2-四氢吡咯二甲酰胺的合成
向3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡啶(理论产量0.79g，1.91mmol)的反应体系中，加入(S)-N1-(6-溴-2-苯并噻唑基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺0.47g(1.27mmol)、碳酸钾0.53g(3.81mmol)、Pd(dppf)Cl2 0.09g(0.13mmol)和水3mL，氮气保护，120℃加热回流10h，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，硅胶柱色谱分离纯化三次，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝15/1，得0.15g淡黄色固体，产率：13.65％，mp：222-224℃。ESI-MS(m/z)：575.0[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ11.20(br,1H,-CONHAr)，δ10.54(br,1H,-SO2NHAr),8.62(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),8.27(s,1H,Ar-H),8.01(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),7.80-7.83(m,2H,Ar-H),7.74-7.75(m,1H,Ar-H),7.66(d,J＝7.6Hz,1H,Ar-H),7.42-7.49(m,3H,Ar-H,-NH2),7.03(s,1H,-NH2),4.24-4.37(m,1H,-CONCH-),3.66-3.68(m,1H,-NCH 2CH2-),3.58-3.62(m,1H,-NCH 2CH2-),2.10-2.15(m,1H,-NCHCH2-),1.89(s,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例17(S)-N1-[6-(5-甲磺酰氨基-6-甲氧基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T17)的制备
称取3-甲磺酰氨基-2-甲氧基-5-溴吡啶0.32g(1.15mmol)、双联频哪醇硼酸酯0.35g(1.38mmol)、乙酸钾0.34g(3.48mmol)和Pd(dppf)Cl2 0.06g(0.08mmol)于100mL茄型瓶中，加入二氧六环12mL，氮气保护，120℃加热回流3h，得到含有产物3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-5-甲磺酰胺基-6-甲氧基吡啶的反应体系，冷却至室温，向此体系中加入(S)-N1-(6-溴-2-苯并噻唑基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺0.35g(0.96mmol)、碳酸钾0.48g(3.45mmol)、Pd(dppf)Cl2 0.11g(0.14mmol)和水3mL，氮气保护，120℃加热回流7h，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，硅胶柱色谱分离纯化三次，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝25/1，得白色固体0.05g，产率：10.83％，mp：190-194℃。ESI-MS(m/z)：491.0[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ11.11(br,1H,-CONHAr),δ9.35(br,1H,-SO2NHAr),8.35(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),8.20(s,1H,Ar-H),7.91(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),7.63-7.71(m,2H,Ar-H),7.45(s,1H,-NH2),7.01(s,1H,-NH2),4.29-4.32(m,1H,-CONCH-),3.97(s,3H,-OCH3),3.66(s,1H,-NCH 2CH2-),3.48-3.53(m,1H,-NCH 2CH2-),3.10(s,3H,-SO2CH3),2.10-2.14(m,1H,-NCHCH2-),1.89-1.92(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例18(S)-N1-[6-(5-三氟甲基-6-甲氧基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T18)的合成
(1)6-(5-三氟甲基-6-甲氧基-3-吡啶基)-2-氨基苯并噻唑的合成
称取3-三氟甲基-2-甲氧基-5-溴吡啶0.50g(1.95mmol)、双联频哪醇硼酸酯0.60g(2.34mmol)、乙酸钾0.57g(5.85mmol)和Pd(dppf)Cl2 0.10g(0.14mmol)于100mL茄型瓶中，加入二氧六环12mL，氮气保护，120℃加热回流3h，得到含有产物3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-5-甲磺酰胺基-6-甲氧基吡啶的反应体系，冷却至室温，向此体系中加入2-氨基-6-溴苯并噻唑0.37g(1.63mmol)、碳酸钾0.67g(4.88mmol)、Pd(dppf)Cl20.15g(0.20mmol)和水3mL，氮气保护，120℃加热回流6h，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，硅胶柱色谱分离纯化，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝50/1，得0.40g白色固体，产率：75.43％。
(2)合成(S)-N1-[6-(5-三氟甲基-6-甲氧基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺
称取6-(5-三氟甲基-6-甲氧基-3-吡啶基)-2-氨基苯并噻唑0.40g(1.23mmol)和CDI 0.80g(4.92mmol)于100mL茄形瓶中，加入8mL DMF作为溶剂，常温搅拌24h，停止反应，抽滤取滤饼于100mL茄型瓶中，加入0.14g(1.23.mmol)L-脯氨酰胺和8mL DMF，室温搅拌5h，停止反应，加水析出大量白色沉淀，抽滤，取滤饼烘干，硅胶柱色谱分离纯化，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝25/1，得0.30g白色固体，产率52.40％，mp：245-247℃。ESI-MS(m/z)：466.0[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ11.14(br,1H,-CONHAr),8.82(s,1H,Ar-H),8.39(s,1H,Ar-H),8.33(s,1H,Ar-H),7.75-7.77(m,2H,Ar-H),7.46(s,1H,-NH2),7.02(s,1H,-NH2),4.28-4.32(m,1H,-CONCH-),4.04(s,3H,-OCH3),3.66-3.68(m,1H,-NCH 2CH2-),3.52-3.53(m,1H,-NCH 2CH2-),2.08-2.15(m,1H,-NCHCH2-),1.89(s,3H,-CH2-CH2-CH2-CH-)ppm。
实施例19(S)-N1-[6-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T19)的制备
制备方法同实施例16，用2-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷代替3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡啶。产率：26.33％，mp：191-193℃。ESI-MS(m/z)：469.0[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ11.16(br,1H,-CONHAr),8.37(s,1H,Ar-H),8.12(s,1H,Ar-H),8.05(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.76-7.83(m,3H,Ar-H),7.46(s,1H,-NH2),7.01(s,1H,-NH2),4.29-4.33(m,1H,-CONCH-),3.65-3.66(m,1H,-NCH 2CH2-),3.52-3.54(m,1H,-NCH 2CH2-),2.08-2.15(m,1H,-NCHCH2-),1.89(s,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例20(S)-N1-[6-(3-三氟甲氧基-4-氯苯基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T20)的制备
制备方法同实施例16，用2-(3-三氟甲氧基-4-氯苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷代替3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡啶。产率：25.46％，mp：188-190℃。ESI-MS(m/z)：485.0[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ11.16(br,1H,-CONHAr),8.33(s,1H,Ar-H),7.90(s,1H,Ar-H),7.82(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.74-7.79(m,3H,Ar-H),7.46(s,1H,-NH2),7.01(s,1H,-NH2),4.29-4.33(m,1H,-CONCH-),3.66-3.67(m,1H,-NCH 2CH2-),3.52-3.53(m,1H,-NCH 2CH2-),2.10-2.15(m,1H,-NCHCH2-),1.89-1.90(m,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例21(S)-N1-[6-(6-三氟甲基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T21)的制备
称取2-三氟甲基-5-溴吡啶0.26g(1.15mmol)、双联频哪醇硼酸酯0.35g(1.38mmol)、乙酸钾0.34g(3.48mmol)和Pd(dppf)Cl2 0.06g(0.08mmol)于100mL茄型瓶中，加入二氧六环12mL，氮气保护，120℃加热回流3h，得到含有产物3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-5-三氟甲基吡啶的反应体系，冷却至室温，向此体系中加入(S)-N1-(6-溴-2-苯并噻唑基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺0.35g(0.96mmol)、碳酸钾0.48g(3.45mmol)、Pd(dppf)Cl2 0.11g(0.14mmol)和水3mL，氮气保护，120℃加热回流6h，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，硅胶柱色谱分离纯化三次，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝25/1，得0.09g白色固体，产率：21.53％，mp：237-239℃。ESI-MS(m/z)：436.0[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ11.20(br,1H,-CONHAr),8.16(d,1H,J＝0.8Hz,Ar-H),8.41(d,2H,J＝6.4Hz,Ar-H),7.99(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.77-7.85(m,2H,Ar-H),7.46(s,1H,-NH2),7.02(s,1H,-NH2),4.31-4.34(m,1H,-CONCH-),3.66-3.67(s,1H,-NCH 2CH2-),3.53-3.54(m,1H,-NCH 2CH2-),2.10-2.15(m,1H,-NCHCH2-),1.90(s,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例22(S)-N1-[6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T22)的制备
制备方法同实施例21，用2-甲氧基-5-溴吡啶代替2-三氟甲基-5-溴吡啶。产率：26.21％，mp：248-249℃。ESI-MS(m/z)：398.1[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ11.09(br,1H,-CONHAr),8.53(s,1H,Ar-H),8.21(s,1H,Ar-H),8.06(dd,1H,J＝1.6Hz,J＝8.4Hz,Ar-H),7.66-7.67(m,2H,Ar-H),7.46(s,1H,-NH2),7.01(s,1H,-NH2),6.92(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),4.30-4.32(m,1H,-CONCH-),3.91(s,3H,-OCH3),3.66-3.67(m,1H,-NCH 2CH2-),3.52-3.53(m,1H,-NCH 2CH2-),2.10-2.12(m,1H,-NCHCH2-),1.90(s,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例23(S)-N1-[6-(5-甲氧基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T23)的制备
(1)6-(5-甲氧基-3-吡啶基)-2-氨基苯并噻唑的合成
称取3-甲氧基-5-溴吡啶0.49g(2.62mmol)、双联频哪醇硼酸酯0.80g(3.14mmol)、乙酸钾0.77g(7.86mmol)和Pd(dppf)Cl2 0.13g(0.18mmol)于100mL茄型瓶中，加入二氧六环12mL，氮气保护，120℃加热回流3h，得到含有产物3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-5-甲氧基吡啶的反应体系，冷却至室温，向此体系中加入2-氨基-6-溴苯并噻唑0.50g(2.18mmol)、碳酸钾0.90g(6.54mmol)、Pd(dppf)Cl2 0.16g(0.22mmol)和水3mL，氮气保护，120℃加热回流6h，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，硅胶柱色谱分离纯化，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝40/1，得0.35g白色固体，产率：62.40％。
(2)(S)-N1-[6-(5-甲氧基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺的合成
称取6-(5-甲氧基-3-吡啶基)-2-氨基苯并噻唑0.35g(1.36mmol)和CDI 0.88g(5.44mmol)于100mL茄形瓶中，加入8mL DMF作为溶剂，常温搅拌24h，停止反应，抽滤取滤饼于100mL茄型瓶中，加入0.16g(1.36mmol)L-脯氨酰胺和8mL DMF，室温搅拌5h，停止反应，加水析出大量白色沉淀，抽滤，取滤饼烘干硅胶柱色谱分离纯化，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝25/1，得0.25g白色固体，产率46.25％，mp：211-212℃。ESI-MS(m/z)：398.1[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ11.14(br,1H,-CONHAr),8.54(s,1H,Ar-H),8.33(s,1H,Ar-H),8.28(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),7.69-7.78(m,3H,Ar-H),7.46(s,1H,-NH2),7.01(s,1H,-NH2),4.31-4.32(m,1H,-CONCH-),3.93(s,3H,-OCH3),3.66-3.67(m,1H,-NCH 2CH2-),3.52-3.54(m,1H,-NCH 2CH2-),2.10-2.15(m,1H,-NCHCH2-),1.90(s,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例24(S)-N1-[6-(6-氨基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T24)的制备
制备方法同实施例21，用2-氨基-5-溴吡啶代替2-三氟甲基-5-溴吡啶。产率：10.62％，mp：249-250℃。ESI-MS(m/z)：383.1[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ11.14(br,1H,-CONHAr),8.29(d,1H,J＝1.6Hz,Ar-H),8.08(s,1H,Ar-H),7.79(dd,1H,J＝2.0Hz,J＝8.4Hz,Ar-H),7.57-7.60(m,2H,Ar-H),7.44(s,1H,-NH2),7.01(s,1H,-NH2),6.58(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),6.21(s,2H,Ar-NH2),4.31-4.32(m,1H,-CONCH-),3.65-3.67(m,1H,-NCH 2CH2-),3.48-3.51(m,1H,-NCH 2CH2-),2.07-2.13(m,1H,-NCHCH2-),1.90(s,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例25(S)-N1-[6-(6-氨基-3-嘧啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T25)的制备
制备方法同实施例21，用2-氨基-5-溴嘧啶代替2-三氟甲基-5-溴吡啶。产率：21.74％，mp：220-221℃。ESI-MS(m/z)：384.0[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ11.06(br,1H,-CONHAr),8.62(s,2H,Ar-H),8.16(s,1H,Ar-H),7.61-7.63(m,2H,Ar-H),7.45(s,1H,-NH2),7.01(s,1H,-NH2),6.77(s,2H,Ar-NH2),4.31-4.32(m,1H,-CONCH-),3.66-3.67(m,1H,-NCH 2CH2-),3.52-3.54(m,1H,-NCH 2CH2-),2.10-2.15(m,1H,-NCHCH2-),1.90(s,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例26(S)-N1-[6-(3-羟苯基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T26)的制备
称取3-羟基苯硼酸0.14g(0.98mmol)、(S)-N1-(6-溴-2-苯并噻唑基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺0.30g(0.81mmol)、碳酸钾0.41g(2.94mmol)和Pd(dppf)Cl2 0.05g(0.07mmol)于100mL的茄型瓶中，加入二氧六环12mL和水3mL，氮气保护，120℃加热回流6h，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，硅胶柱色谱分离纯化三次，洗脱剂(V/V)：氯仿/甲醇＝15/1，得0.14g白色固体，产率：45.19％，mp：213-215℃。ESI-MS(m/z)：383.0[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ11.08(br,1H,-CONHAr),9.53(s,1H,-OH),8.12(s,1H,Ar-H),7.75-7.67(m,2H,Ar-H),7.45(s,1H,-NH2),7.24-7.28(m,1H,Ar-H),7.11-7.13(d,1H,J＝7.2Hz,Ar-H),7.06(s,1H,Ar-H),7.01(s,1H,-NH2),6.76(d,1H,J＝7.2Hz,Ar-H),4.31-4.33(m,1H,-CONCH-),3.65(s,1H,-NCH 2CH2-),3.51-3.53(m,1H,-NCH 2CH2-),2.10-2.12(m,1H,-NCHCH2-),1.89(s,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例27(S)-N1-[6-(3-羟甲苯基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T27)的制备
制备方法同实施例26，用3-羟甲基苯硼酸代替3-羟基苯硼酸。产率：68.31％，mp：226-228℃。ESI-MS(m/z)：397.1[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ11.09(br,1H,-CONHAr),8.19(s,1H,Ar-H),7.66-7.68(m,2H,Ar-H),7.58(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.41-7.44(m,2H,Ar-H,-NH2),7.30-7.32(d,1H,J＝7.2Hz,Ar-H),7.01(s,1H,-NH2),5.25-5.28(m,1H,Ar-H),4.58(d,2H,J＝6Hz,Ar-CH2-),4.29-4.35(m,1H,-CONCH-),3.66(s,1H,-NCH 2CH2-),3.52-3.53(m,1H,-NCH 2CH2-),2.10-2.15(m,1H,-NCHCH2-),1.89(s,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例28(R)-N1-[6-(5-甲氧基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氢吡咯二甲酰胺(T28)的制备
制备方法同实施例23，用D-脯氨酰胺代替L-脯氨酰胺。产率46.17％，mp：172-173℃。ESI-MS(m/z)：398.0[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ11.14(br,1H,-CONHAr),8.54(d,1H,J＝1.6Hz,Ar-H),8.33(s,1H,Ar-H),8.27(d,1H,J＝2.8Hz,Ar-H),7.69-7.78(m,3H,Ar-H),7.46(s,1H,-NH2),7.02(s,1H,-NH2),4.30-4.33(m,1H,-CONCH-),3.93(s,3H,-OCH3),3.66(s,1H,-NCH 2CH2-),3.51-3.53(m,1H,-NCH 2CH2-),2.08-2.15(m,1H,-NCHCH2-),1.89(s,3H,-CH2-CH 2-CH 2-CH-)ppm。
实施例29N1-[6-(5-甲氧基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氢吡咯(T29)的制备
制备方法同实施例23，用四氢吡咯代替L-脯氨酰胺。产率55.67％，mp：>290℃。ESI-MS(m/z)：355.1[M+H]+，1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ11.06(br,1H，-CONHAr),8.54(d,1H,J＝1.6Hz,Ar-H),8.33(s,1H,Ar-H),8.27(d,1H,J＝2.8Hz,Ar-H),7.76(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝8.4Hz,Ar-H),7.66-7.67(m,2H,Ar-H),3.93(s,3H,-OCH3),3.45(s,4H,-NCH 2CH 2-),1.87(s,4H,-NCH 2CH 2-)ppm。
药效学实验部分
1、目标化合物体外激酶抑制实验：主要测定化合物对PI3Kα激酶的抑制活性，并测定部分化合物对PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ和PI3Kδ激酶的IC50值。
p110α/p85的测试方法及具体操作步骤：
(1)准备化合物
①化合物的连续稀释液和源板的准备：将待测化合物用100％的DMSO配制至最终最高抑制浓度的100倍，将100μL的化合物溶液加入到96孔板中。例如，当最高抑制浓度为0.1μmol/L时，在这一步就将化合物用DMSO配制成10μmol/L。在同一96孔板的两个孔中分别加入100μL的DMSO溶液(100％)，作为空白对照。并将此板标记为源板。
②中间板的准备：在源板中取4μL的化合物溶液加入到新的96孔板中，将此板作为中间板。在中间板的每个孔中加入96μL的激酶缓冲液，振荡混匀10min。
③试验板的准备：在中间板的每个孔中取2.5μL的化合物溶液加入到384孔板中，准备两份这样的384孔板。例如，将标号为A1的96孔板中的溶液转移到标号为A1和A2的384孔板中；将标号为A2的96孔板中的溶液转移到标号为A3和A4的384孔板中等。
(2)激酶PI3Kα反应
①激酶反应缓冲液的准备：1倍量激酶缓冲液的组成：50mmol/L HEPES(pH 7.4)、3mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA、100mmol/L NaCl、0.03％CHAPS和2mmol/L DTT。
②准备四倍量的激酶溶液：用1倍量激酶缓冲液配制PI3Kα溶液至其最终浓度的4倍。本实验中PI3Kα的最终浓度为1.65nmol/L。取2.5μL的激酶溶液加入到试验板的每个孔中，没有酶的对照孔除外(此对照孔加入2.5μL的缓冲溶液)，振荡混匀。
③准备两倍量的底物溶液：用1倍量的激酶反应缓冲液配制PIP2底物和ATP底物溶液至其最终试验浓度的2倍。本实验中PIP2的最终浓度为50μmol/L，ATP的最终浓度为25μmol/L。取5μL的底物溶液加入到试验板的每个孔中，振荡混匀。
④激酶反应：封上试验板，室温下孵育1h。
⑤激酶检测：使Kinase-Glo试剂平衡至室温。在试验板的每个孔中加入10μL的Kinase-Glo试剂终止反应。用离心机短暂混匀，放在摇床上缓慢振荡15min后，用酶标仪检测化学发光信号。
⑥读取并收集Flexstation酶标仪上的数据。
⑦曲线拟合：在Flexstation酶标仪程序中复制相对光单位(relative lightunit，RLU)的值。将RLU值转换为百分抑制率。曲线用Graphpad 5.0拟合。
百分抑制率＝100-(最大值-样本RLU)/(最大值-最小值)×100％
最大值是没有酶的对照孔的RLU值，最小值是没有化合物的对照孔的RLU值。
p110β/p85、p110δ/p85和p110γ的测试方法与p110α/p85相同。
2、目标化合物体外抑制肿瘤细胞增殖实验：采用MTT法评价化合物对人结肠癌(HCT116)和乳腺癌(MDA-MB-453)的增殖抑制活性。
具体操作步骤：
(1)复苏：从液氮罐中取出一支冻存的HCT116(或MDA-MB-453)细胞，迅速放入37℃温水中，将融化的冻存液加入15mL离心管中，加入8mL培养基，离心，弃上清，用5mL培养基将离心管中的细胞转移至培养瓶中，培养瓶置于含5％CO2的37℃培养箱中培养。
(2)传代：复苏后约1～2天细胞铺满培养瓶底，倾倒培养基，用PBS洗培养瓶内细胞2次，洗完后将PBS倒干净，加入1mL 0.25％胰蛋白酶，显微镜下观察，待细胞松动变圆后，加入带血清的培养基(2mL)终止，轻轻吹打瓶底，使细胞脱离，待细胞完全脱离瓶底时，转移至离心管中离心，倾倒上清液，用培养基将细胞吹打均匀后，转移至新的培养瓶中培养。
(3)MTT实验：当细胞处于对数生长期时，接种96孔培养板，每孔200μL细胞悬液，接种密度为结肠癌细胞HCT116 4500个/孔，乳腺癌细胞MDA-MB-453为8000个/孔，置37℃、5％CO2的培养箱中培养24小时后给药。将96孔板分为空白组、阴性组、实验组和阳性对照组，首先给药浓度设为1×10-5mol/L以进行化合物的初步筛选，每个药设三个平行孔。给药后置于37℃，5％的CO2培养箱中孵育72h(MDA-MB-453细胞孵育5天)，然后每孔均加入5mg/mL的MTT溶液20μL，继续孵育4小时后，取出96孔板，小心吸取上清液，向各孔加入150μL DMSO，置于酶标仪中震荡10分钟，于490nm测定吸光度值(OD值)，计算抑制率。
抑制率＝[(阴性组OD平均值-给药组OD平均值)/阴性组OD平均值]×100％
(4)细胞水平的IC50评价：对于在给药浓度为1×10-5mol/L时的抑制率高于或接近50％的化合物，设5.00×10-5、1.67×10-5、5.56×10-6、1.85×10-6、6.17×10-7和2.06×10- 7mol/L 6个浓度梯度给药，按初筛方法分别测得OD值。IC50采用Graphpad Prism软件计算，各实验组均独立重复三次。
实验结果如表1至3所示，其中T1-T29分别为实施例1-29制得的产物。
表1化合物T1-T15对PI3Kα的抑制活性和对肿瘤细胞的增殖抑制活性(n＝3)
a药物作用浓度为1×10-7mol/L；b药物作用浓度为1×10-5mol/L；c“---”表示未做。
表2化合物T16-T27对PI3Kα的抑制活性和对肿瘤细胞的增殖抑制活性(n＝3)
a药物作用浓度为1×10-7mol/L；b药物作用浓度为1×10-5mol/L。
表3化合物T16、T17、T23、T26、T28和T29对不同亚型的PI3K的抑制活性
由表1可看出，含有L-脯氨酰胺片段的5-芳基吡啶化合物和含有L-脯氨酰胺片段的5-芳基吡嗪类化合物在100nmol/L时对PI3Kα的抑制活性较弱。目标化合物T1-T15中，除了化合物T4、T5和T6在HCT116上有较明显作用外，均对两株细胞的作用不明显。
由表2可看出，含有L-脯氨酰胺片的6-芳基苯并噻唑类化合物T16-T18、T21-T27在100nmol/L时对PI3Kα的抑制作用明显。且化合物在两株细胞上均表现出明显抑制作用。化合物T16、T18-T20和T23对HCT116的抑制活性与阳性药BYL719相当；化合物T16、T17和T22-T25对MDA-MB-453的抑制活性与阳性药BYL719相当。
由表3可看出，化合物T16、T17和T23对PI3Kα的IC50达到了纳摩尔级别，且T23和T26对PI3Kα的抑制作用明显强于PI3Kβ、PI3Kγ和PI3Kδ。而T28和T29对PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ和PI3Kδ的抑制作用很弱。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (10)
1.一种含有L-脯氨酰胺片段的化合物，其特征在于：其结构式为：
其中，R为取代苯基或取代吡啶基；X为C或N；R1为取代苯基、取代吡啶基或取代嘧啶基。
2.根据权利要求1所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物，其特征在于：当X为C时，R为3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶基、N-(2-氯-5-溴苯基)-4-氟苯磺酰氨基、N-(4-氟苯基)-2-氯-5-溴苯磺酰氨基、5-三氟甲基-6-氯-3-吡啶基、3-三氟甲基-4-氯苯基、3-三氟甲氧基-4-氯苯基、4-吡啶基或3-吡啶基；
当X为N时，R为3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶基、N-(2-氯-5-溴苯基)-4-氟苯磺酰氨基、N-(4-氟苯基)-2-氯-5-溴苯磺酰氨基、5-三氟甲基-6-氯-3-吡啶基、3-三氟甲基-4-氯苯基、3-三氟甲氧基-4-氯苯基或4-(1H-1-吡唑基)苯基；
R1为3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶基、2-甲氧基-3-甲磺酰氨基-5-溴吡啶基、5-三氟甲基-6-氯-3-吡啶基、3-三氟甲基-4-氯苯基、3-三氟甲氧基-4-氯苯基、2-三氟甲基-5-溴吡啶、2-甲氧基-5-溴吡啶、3-甲氧基-5-溴吡啶、2-氨基-5-溴吡啶、2-氨基-5-溴嘧啶、3-羟基苯基或3-羟甲基苯基。
3.权利要求1或2所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，制备含脲的母核：
2-氨基-5-溴吡啶与CDI和L-脯氨酰胺发生两步缩合反应得到含脲的母核(S)-N1-(5-溴-2-吡啶基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺；
或者2-氨基-5-溴吡嗪与三光气和L-脯氨酰胺发生两步缩合反应得到含脲的母核(S)-N1-(5-溴-2-吡嗪基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺；
或者2-氨基-6-溴苯并噻唑与CDI和L-脯氨酰胺发生两步缩合反应得到含脲的母核(S)-N1-(6-溴-2-苯并噻唑基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺；
步骤2，制备中间体：
对氟苯磺酰氯与3-氨基-2-氯-5-溴吡啶或2-氯-5-溴苯胺经磺酰化及水解反应得到中间体3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶或N-(2-氯-5-溴苯基)-4-氟苯磺酰胺；
或者对氟苯胺与2-氯-5-溴苯磺酰氯发生磺酰化反应得到中间体N-(4-氟苯基)-2-氯-5-溴苯磺酰胺；
步骤3，制备目标化合物：
步骤2制得的中间体与双频哪醇硼酸酯反应得到芳烃硼酸酯；芳烃硼酸酯再与步骤1制得的含脲的母核发生Suzuki偶联反应，得到含有L-脯氨酰胺片段的化合物。
4.权利要求3所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤1的具体操作为：将2-氨基-5-溴吡啶和CDI溶解于溶剂二氧六环中，在氮气保护下进行反应，反应结束后冷却至室温，加入L-脯氨酰胺和TEA，室温下搅拌进行反应，反应结束后旋蒸除去溶剂，再加入水抽滤，滤饼烘干后经硅胶柱色谱分离纯化，得到含脲的母核(S)-N1-(5-溴-2-吡啶基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺；
或者将三光气溶解于溶剂二氯甲烷中，在冰浴条件下向其中滴加2-氨基-5-溴吡嗪的二氯甲烷溶液，滴完后撤去冰浴，室温下搅拌进行反应，反应结束后再加入L-脯氨酰胺的二氯甲烷溶液和TEA，室温下搅拌继续进行反应，反应结束后旋蒸除去溶剂，用乙酸乙酯萃取，萃取的有机相经洗涤、干燥后用硅胶柱色谱分离纯化，得到含脲的母核(S)-N1-(5-溴-2-吡嗪基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺；
或者称取2-氨基-6溴苯并噻唑和CDI，加入DMF作为溶剂，室温下搅拌进行反应，反应结束后抽滤，将滤饼放入反应容器中，加入L-脯氨酰胺和DMF，室温下搅拌继续进行反应，反应结束后，加水析出沉淀并抽滤，滤饼烘干后经硅胶柱色谱分离纯化，得到含脲的母核(S)-N1-(6-溴-2-苯并噻唑基)-1,2-四氢吡咯二甲酰胺。
5.权利要求3所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤2的具体操作为：称取3-氨基-2-氯-5-溴吡啶或2-氯-5-溴苯胺，加入对氟苯磺酰氯，再加入吡啶进行反应，反应结束后冷却至室温，加水析出固体并抽滤，将滤饼放入反应容器中，加入无水K2CO3、水和甲醇，室温下搅拌进行反应，反应结束后旋蒸除去溶剂，经硅胶柱色谱分离纯化，得到中间体3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶或N-(2-氯-5-溴苯基)-4-氟苯磺酰胺；
或者称取2-氯-5-溴苯磺酰氯和对氟苯胺，加入二氯甲烷和吡啶，室温下搅拌进行反应，反应结束后旋蒸除去二氯甲烷，加水，抽滤，滤饼烘干后经硅胶柱色谱分离纯化，得到中间体N-(4-氟苯基)-2-氯-5-溴苯磺酰胺。
6.权利要求3所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤3的具体操作为：称取中间体，加入双频哪醇硼酸酯、乙酸钾和Pd(dppf)Cl2，再加入二氧六环，氮气保护下加热回流反应，反应结束后冷却至室温，得到芳烃硼酸酯，再加入含脲的母核、碳酸钾、Pd(dppf)Cl2和水，氮气保护下加热回流反应，反应结束后冷却至室温，旋蒸除去溶剂，再经硅胶色谱柱分离纯化，即得到含有L-脯氨酰胺片段的化合物。
7.权利要求1或2所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物在制备具有PI3Kα抑制作用的抗肿瘤药物中的应用。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物在制备抗结肠癌药物和/或抗乳腺癌药物中的应用。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物添加辅料制成片剂、胶囊剂、软胶囊剂或注射剂，其中每片、每粒或每支制剂中含有10～500mg的含有L-脯氨酰胺片段的化合物；所述的辅料包括添加剂、稳定剂、增溶剂、润滑剂、崩解剂中的一种或几种。
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