CN114249650B - 一种甜菊醇衍生物及其制备方法与在制备心脏保护药物中的应用 - Google Patents

一种甜菊醇衍生物及其制备方法与在制备心脏保护药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114249650B
CN114249650B CN202210186347.4A CN202210186347A CN114249650B CN 114249650 B CN114249650 B CN 114249650B CN 202210186347 A CN202210186347 A CN 202210186347A CN 114249650 B CN114249650 B CN 114249650B
Authority
CN
China
Prior art keywords
steviol
derivative
compound
preparation
methoxybenzyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210186347.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114249650A (zh
Inventor
赵昱
徐超
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong University of Technology
Original Assignee
Guangdong University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong University of Technology filed Critical Guangdong University of Technology
Priority to CN202210186347.4A priority Critical patent/CN114249650B/zh
Publication of CN114249650A publication Critical patent/CN114249650A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114249650B publication Critical patent/CN114249650B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/02—Esters of acyclic saturated monocarboxylic acids having the carboxyl group bound to an acyclic carbon atom or to hydrogen
    • C07C69/12—Acetic acid esters
    • C07C69/14—Acetic acid esters of monohydroxylic compounds
    • C07C69/145—Acetic acid esters of monohydroxylic compounds of unsaturated alcohols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
    • C07C51/347—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides by reactions not involving formation of carboxyl groups
    • C07C51/367—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides by reactions not involving formation of carboxyl groups by introduction of functional groups containing oxygen only in singly bound form
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C62/00—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of rings other than six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C62/08—Saturated compounds containing ether groups, groups, groups, or groups
    • C07C62/12—Saturated compounds containing ether groups, groups, groups, or groups polycyclic
    • C07C62/14—Saturated compounds containing ether groups, groups, groups, or groups polycyclic having a carboxyl group on a condensed ring system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/08—Preparation of carboxylic acid esters by reacting carboxylic acids or symmetrical anhydrides with the hydroxy or O-metal group of organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/02—Esters of acyclic saturated monocarboxylic acids having the carboxyl group bound to an acyclic carbon atom or to hydrogen
    • C07C69/22—Esters of acyclic saturated monocarboxylic acids having the carboxyl group bound to an acyclic carbon atom or to hydrogen having three or more carbon atoms in the acid moiety
    • C07C69/24—Esters of acyclic saturated monocarboxylic acids having the carboxyl group bound to an acyclic carbon atom or to hydrogen having three or more carbon atoms in the acid moiety esterified with monohydroxylic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/34—Esters of acyclic saturated polycarboxylic acids having an esterified carboxyl group bound to an acyclic carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/34—Esters of acyclic saturated polycarboxylic acids having an esterified carboxyl group bound to an acyclic carbon atom
    • C07C69/40—Succinic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/74—Esters of carboxylic acids having an esterified carboxyl group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C07C69/757—Esters of carboxylic acids having an esterified carboxyl group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/76—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C69/80—Phthalic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2603/00—Systems containing at least three condensed rings
    • C07C2603/56—Ring systems containing bridged rings
    • C07C2603/86—Ring systems containing bridged rings containing four rings
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本发明涉及药物设计和药物化学领域，具体涉及一种甜菊醇衍生物及其制备方法与在制备心脏保护药物中的应用。所述的甜菊醇衍生物为式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐以及所述的式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐的溶剂化合物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体或其任意比例的混合物，包括外消旋混合物。该衍生物可有效地治疗DOX引起的斑马鱼形态学畸变和心功能不全，通过抑制活性氧的过量产生、恢复线粒体膜电位来保护心肌细胞的死亡和损伤，有具有显著的心脏保护活性，可作为治疗心血管疾病的一种先导化合物。
Figure 423408DEST_PATH_IMAGE002
式Ⅰ。

Description

一种甜菊醇衍生物及其制备方法与在制备心脏保护药物中的 应用
技术领域
本发明涉及药物设计和药物化学领域，具体涉及一种甜菊醇衍生物及其制备方法与在制备心脏保护药物中的应用。
背景技术
心脏保护药物可以保护心脏和血管的代谢、结构和功能，并在一级或二级预防中降低其损害，在心血管疾病或心血管疾病高危患者的治疗中极为重要。尽管包括他汀类药物、血管紧张素转换酶抑制剂（ACEIs）、β受体阻滞剂（BBs）、血管紧张素Ⅱ1型受体阻滞剂（ARBs）和醛固酮受体阻滞剂（AIRBs）在内的几组心脏保护药物已被证明能有效地达到硬终点，但通过这些药物治疗高血压可降低死亡率不超过30%，残余心血管风险仍然相当高。因此，针对新型心脏保护药物的研究发现有增无减。
天然产物是药物的重要来源，长期以来一直被用于治疗心血管疾病。甜菊糖苷是一种天然甜味剂，是甜菊叶的主要成分。甜菊醇（结构式如下所示）由甜菊糖苷经过高碘酸钠氧化，再经碱水解得到，结构如下所示。研究表明，甜菊醇具有良好的抗癌作用，包括抗糖尿病、抗癌作用，但在心肌保护方面的报道却几乎没有。
Figure 979874DEST_PATH_IMAGE001
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种甜菊醇衍生物，该甜菊醇衍生物可有效地治疗多柔比星（DOX，阿霉素）引起的斑马鱼形态学畸变和心功能不全，且活性显著优于阳性药左西孟旦（LSD），通过抑制活性氧的过量产生、恢复线粒体膜电位来保护心肌细胞的死亡和损伤，具有显著的心脏保护活性。
本发明的另一目的在于提供上述甜菊醇衍生物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述甜菊醇衍生物在制备心脏保护药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种甜菊醇衍生物，为式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐，以及所述的式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐的溶剂化合物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体或其任意比例的混合物，包括外消旋混合物：
Figure 931650DEST_PATH_IMAGE002
式Ⅰ
其中，R1为H、烯丙基或甲氧基苄基；R2为COR3或R4；R3为甲基、异丁基、乙基、丙基、2,2-二甲基丙酸基、丙酸基或邻甲基苯甲酸基；R4为H、烯丙基、甲氧乙氧甲基、丁基、甲基或乙基。
所述的甜菊醇衍生物的制备方法，包含如下步骤：
（1）以酸酐和甜菊醇为反应物，吡啶为缚酸剂和溶剂，4-二甲氨基吡啶为催化剂，加热回流搅拌反应，分别得到R1为H、R3为甲基、异丁基、乙基、丙基、2,2-二甲基丙酸基、丙酸基或邻甲基苯甲酸基的甜菊醇衍生物（化合物2-8）；
（2）以烯丙基溴或4-甲氧基苄基氯和甜菊醇为反应物，碱性条件下，加热回流搅拌反应，分别得到R1为烯丙基或甲氧基苄基、R4为H的甜菊醇衍生物（化合物9和10）；
（3）将步骤（2）制备的甜菊醇衍生物、氢氧化钠溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，加热回流搅拌反应；然后加入烯丙基溴、碘甲烷或溴丁烷，继续加热回流搅拌反应，得到R1为烯丙基或甲氧基苄基、R4为烯丙基、甲基或丁基的甜菊醇衍生物（化合物11、13、16和18）；
（4）将步骤（2）制备的甜菊醇衍生物、N,N-二异丙基乙胺和1-氯甲氧基-2-甲氧基乙烷溶解在溶剂中，室温搅拌反应，得到R1为烯丙基或甲氧基苄基、R4为甲氧乙氧甲基的甜菊醇衍生物（化合物12和17）；
（5）将步骤（3）或步骤（4）制得的R1为烯丙基、R4为甲氧乙氧甲基或甲基的甜菊醇衍生物（化合物12或13）、Pd(PPh3)4和吗啉溶解在溶剂中，加热回流搅拌反应，得到R1为H、R4为甲氧乙氧甲基或甲基的甜菊醇衍生物（化合物14或15）；
（6）将步骤（2）制备的甜菊醇衍生物、4-二甲氨基吡啶溶于无水吡啶中，分别加入乙酸酐、2, 2-二甲基丁二酸酐或丁二酸酐，加热回流搅拌反应，得到R1为烯丙基或甲氧基苄基、R3为甲基或2,2-二甲基丙酸基的甜菊醇衍生物（化合物19-22）。
步骤（1）中所述的酸酐为乙酸酐（Ac2O）、异戊酸酐、丙酸酐、丁酸酐、2-二甲基丁二酸酐、丁二酸酐或邻苯二甲酸酐；
步骤（1）中所述的反应条件优选为100℃回流搅拌反应18h；
步骤（2）中所述的反应优选以碳酸钾（K2CO3）为体系提供碱性条件，丙酮为溶剂；
步骤（3）中所述的反应的温度优选为100℃；
步骤（4）中所述的反应条件优选为以四氢呋喃为溶剂，室温搅拌反应6h；
步骤（5）中所述的反应条件优选为以四氢呋喃为溶剂，60℃回流搅拌反应6h；
步骤（6）中所述的反应条件优选为100℃回流搅拌反应18h。
所述的甜菊醇衍生物在制备心脏保护药物中的应用；
所述的药物可含有一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂；
所述的药物的制剂包括多种临床药物剂型，如片剂、注射液、脂质体纳米粒、控释剂等。
一种心脏保护药物，含有有效量的甜菊醇衍生物，余量为药用辅料或其它可配伍的药物；
所述药用辅料是指常规的药用赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂和粘合剂等；
所述其它可配伍的药物，指的是以有效剂量的甜菊醇衍生物为药物原料，再配伍其它天然药物或化学药品。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明通过对甜菊醇进行单一和多位点修饰，得到一种新型甜菊醇衍生物，通过DOX诱导的斑马鱼胚胎模型进行筛选，发现该衍生物对心脏保护活性有显著提高，可作为治疗心血管疾病的一种先导化合物。
（2）本发明对于初筛模型活性效果较好的甜菊醇衍生物进行斑马鱼胚胎心脏功能评价，实验结果表明：化合物22的心脏保护活性最好，且显著优于阳性对照药左西孟旦；对其进行机制研究，通过H9c2细胞的分子机制表明，化合物22通过抑制活性氧的过量产生、恢复线粒体膜电位来保护心肌细胞的死亡和损伤。
附图说明
图1是化合物1、11、22、16和左西孟旦（LSD）在DOX诱导斑马鱼胚胎模型上最佳剂量的结果分析图；其中，数据表示为平均值±标准差，n=4，####P < 0.0001与对照组相比，*P< 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001 和 ****P < 0.0001 与仅 DOX 治疗组相比。
图2是化合物1、11、22、16和LSD在斑马鱼胚胎模型上的毒性测试的结果分析图；其中，数据表示为平均值±标准差，n=3，**P < 0.01 与对照组相比；A：数据统计分析；B：不同药物在不同浓度下的身体形态情况。
图3是化合物1、11、22、16和LSD在Tg[myl7:EGFP]斑马鱼上的心脏功能评价的结果分析图；其中，数据表示为平均值±标准差，n=6，####P < 0.0001与对照组相比，****P <0.0001与仅DOX治疗组相比，A和A`：正置荧光显微镜明场下斑马鱼的身体形态，B和B`：GFP荧光通道下心脏形态，C、D、E和F分别为心率、射血分数、每搏出量和搏出量的统计结果。
图4是化合物22在斑马鱼胚胎模型上的qRT-PCR的结果分析图；其中，数据表示为平均值±标准差，n=3，####P<0.0001与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和****P<0.0001与仅DOX治疗组相比，A：ANP基因表达水平，B：BNP基因表达水平，C：cTnT基因表达水平。
图5是化合物22于DOX诱导的H9C2细胞株存活率的结果分析图，其中，数据表示为平均值±标准差，n=3，##P < 0.01与对照组相比。
图6是化合物22于DOX诱导的H9C2细胞株活性氧ROS水平和线粒体膜电位的影响结果分析图；其中，A：活性氧ROS水平，B：线粒体膜电位。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1化合物2-22的合成
（1）对甜菊醇（化合物1）的环戊醇羟基和19-COOH上进行改性，分别得到化合物2-10（表1）；
①环戊醇羟基的改性：用乙酸酐（Ac2O）、异戊酸酐、丙酸酐、丁酸酐、2-二甲基丁二酸酐、丁二酸酐、邻苯二甲酸酐选择性酰化甜菊醇的环戊醇上的羟基，得到化合物2-8，具体方法为：以乙酸酐/异戊酸酐/丙酸酐/丁酸酐/2-二甲基丁二酸酐/丁二酸酐/邻苯二甲酸酐和甜菊醇为反应物，吡啶（Pyr）为缚酸剂和溶剂，4-二甲氨基吡啶（DMAP）为催化剂，100℃回流搅拌反应18h，分别得到化合物2-8。
②19-COOH的改性：甜菊醇的19-COOH与烯丙基溴（AllylBr）、4-甲氧基苄基氯（PMBCl）和K2CO3在丙酮中的酯化，得到化合物9-10，具体方法为：以烯丙基溴/4-甲氧基苄基氯和甜菊醇为反应物，碳酸钾（K2CO3）为体系提供碱性条件，丙酮为溶剂，60℃回流搅拌反应，分别得到化合物9-10。
表1 化合物2-10的化学结构
Figure 512542DEST_PATH_IMAGE003
（2）通过对化合物9或10的羟基进行烷基化来探索D环的修饰：
①烷基化在DMF中用氢氧化钠进行，因为需要强碱来促进羟基质子的去除以形成醚，得到11、12、13和16-18，具体方法为：将化合物9、氢氧化钠（NaOH）溶解在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，100℃回流搅拌反应1h；然后加入烯丙基溴或碘甲烷，100℃回流搅拌反应18h，得到化合物11和13；将化合物10、NaOH溶解在DMF中，100℃回流搅拌反应1h；然后加入烯丙基溴或溴丁烷，100℃回流搅拌反应18h，得到化合物16和18；将化合物9或10、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）和1-氯甲氧基-2-甲氧基乙烷（MEMCl）溶解在无水四氢呋喃（THF）中，在室温下搅拌反应6h，得到化合物12或17。
②根据Kunz-Waldmann 反应，用吗啉和催化剂四三苯基磷钯（Pd(PPh3)4），将12和13脱酯化，得到14和15；具体方法为：将化合物12或13、Pd(PPh3)4和吗啉（morpholine）溶解在四氢呋喃（THF）中，60℃回流搅拌反应6h，得到化合物14和15。
③用2, 2-二甲基丁二酸酐对9的环戊醇上的羟基进行选择性酯化得到19；具体方法为： 将化合物9和DMAP溶于在无水吡啶中，加入2, 2-二甲基丁二酸酐并100℃回流搅拌反应18h，得到化合物19。
④用合适的酸酐对10的环戊醇上的羟基进行选择性酯化得到20-22。具体方法为：将化合物10、DMAP溶于无水吡啶中，分别加入乙酸酐、2, 2-二甲基丁二酸酐或丁二酸酐，100℃回流搅拌反应18h，得到化合物20-22。
表2 化合物11-22的化学结构
Figure 94833DEST_PATH_IMAGE004
具体步骤如下：
（1）化合物2-8的合成
将甜菊醇 (1，1 eq)、DMAP (1 eq) 和各种的酸酐 (5 eq)溶解于吡啶中，100℃回流搅拌反应18h，然后将溶液用二氯甲烷稀释，再用盐酸(1N)中和，并用盐水洗涤，溶液用无水硫酸钠干燥并真空浓缩，使用硅胶柱对残余物进行色谱分离，得到纯产物(2-8)。
（2）化合物9-10的合成
将甜菊醇 (1，1 eq) 和K2CO3(1.5 eq) 溶解在丙酮中；60℃回流搅拌反应1h，然后加入烯丙基溴（1.5 eq，用于合成9）、PMBCl（1.5 eq，用于合成10），60℃回流搅拌反应10h；然后将该溶液用水稀释并用乙酸乙酯萃取3次，有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，真空浓缩得到粗产物，将其用硅胶柱色谱分离，得到纯产物(9-10)。
（3）化合物11, 13, 16, 18的合成
将化合物9或10 (1 eq)和氢氧化钠(8 eq)溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，100℃回流搅拌反应1h；然后加入烯丙基溴（1.5 eq，用于合成11或16），溴丁烷（1.5 eq，用于合成18）或碘甲烷（1.5 eq，用于合成 13）；100℃回流搅拌反应18h；将溶液用乙酸乙酯稀释，再用HCl(1N)中和，并用盐水洗涤；溶液用无水硫酸钠干燥并真空浓缩，使用硅胶柱对残余物进行色谱分离，得到纯产物（11, 13, 16, 18）。
（4）化合物12和17的合成
将化合物9或10 (1eq)、DIPEA (4eq)和MEMCl (4eq)溶解在无水四氢呋喃中，室温搅拌反应6h；然后将该溶液用水稀释并用EtOAc萃取3次，合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并减压浓缩至干，使用硅胶柱对残余物进行色谱分离，得到纯产物(12和17)。
（5）化合物14和15的合成
将化合物12 (1 eq) 或 13 (1 eq)、Pd(PPh3) (0.25 eq) 和吗啉 (10 eq)溶解在四氢呋喃中， 60℃回流搅拌反应6h；然后将溶液用乙酸乙酯稀释，并用盐水洗涤；溶液经无水硫酸钠干燥并真空浓缩至干，使用硅胶柱对残余物进行色谱分离，得到纯产物（14和15）。
（6）化合物19-22的合成
将化合物9 (1 eq) 或10（1eq）、DMAP (1 eq) 和合适的酸酐 (5 eq) 溶解在无水吡啶中， 100℃回流搅拌反应18h直至所有起始材料耗尽；然后将溶液用DCM稀释，用HCl(1N)中和，并用盐水洗涤，溶液用无水硫酸钠干燥并真空浓缩，残渣经硅胶柱层析得纯品（19-22）。
化合物2-22的结构、外观、熔点、比旋光度、核磁共振谱图数据、高分辨质谱如以下所示：
化合物2：
Figure 531981DEST_PATH_IMAGE005
2：油状（87%），[α]25 D -80 (c 0.4, CH3OH); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 4.90(1H, s, H-17), 4.86 (1H, s, H-17), 2.58 (1H, d, J=12.0Hz, H-3), 2.02 (3H, s,H-2``), 1.24 (3H, s, H-18), 0.99 (3H, s, H-20), 2.41-0.71 (20H, m, CH, CH2 inent-beyerane skeleton); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 169.93, 152.10, 103.36,87.69, 56.90, 53.74, 46.92, 43.70, 42.58, 42.07, 41.15, 40.66, 39.41, 37.77,36.81, 29.02, 22.27, 21.68, 20.07, 19.04, 15.48; HRMS (ESI, m/z) calcd forC22H33O4, 361.2379 [M+H+]; found, 361.2391。
化合物3:
Figure 631655DEST_PATH_IMAGE006
3: 油状（75%），[α]25 D -47 (c 0.2, CH3OH); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 4.91(1H, s, H-17), 4.86 (1H, s, H-17), 2.63 (1H, d, J=8Hz, H-3), 1.24 (3H, s, H-18), 1.00 (3H, s, H-20), 0.96 (3H, s, H-4`), 0.95 (3H, s, H-5`), 1.90–0.70(29H, m, CH, CH2 in ent-beyerane skeleton); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 183.84,172.05, 152.32, 103.43, 87.45, 56.92, 53.76, 46.89, 44.45, 43.71, 42.64,42.17, 41.17, 40.68, 39.41, 37.78, 36.70, 29.70, 29.03, 25.76, 22.44, 21.68,20.08, 19.05, 15.54; HRMS (ESI, m/z) calcd for C25H39O4, 403.2848 [M+H+];found, 403.2840。
化合物4：
Figure 863791DEST_PATH_IMAGE007
4: 白色固体（81%），mp 124.5-125.6 ℃; [α]25 D -76 (c 0.5, CH3OH); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz) 4.90 (1H, s, H-17), 4.86 (1H, s, H-17), 2.63 (1H, d, J=12Hz,H-3), 1.24 (3H, s, H-18), 1.11 (3H, t, J=8.0Hz, H-3`), 1.00 (3H, s, H-20),1.90–0.70 (25H, m, CH, CH2 in ent-beyerane skeleton); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz)δ 173.43, 152.29, 103.36, 87.45, 56.93, 53.76, 46.89, 43.71, 42.61, 42.18,41.18, 40.68, 39.41, 37.77, 36.69, 29.71, 29.01, 28.49, 21.67, 20.09, 19.05,15.51, 9.13; HRMS (ESI, m/z) calcd for C23H34O4Na, 397.2355 [M+Na+]; found,397.2348。
化合物5:
Figure 289087DEST_PATH_IMAGE008
5: 油状（74%），[α]25 D -52 (c 1.6 CH3OH); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 4.90(1H, s, H-17), 4.86 (1H, s, H-17), 2.62 (1H, d, J=12.0Hz, H-3), 2.38-2.25(4H, m, H-2``, H-3``), 1.24 (3H, s, H-18), 0.95 (3H, s, H-20), 2.25-0.74(29H, m, CH, CH2 in ent-beyerane skeleton); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 152.26,103.38, 87.45, 56.95, 53.78, 46.89, 43.74, 42.62, 42.18, 41.17, 40.68, 39.42,37.74, 37.18, 36.70, 29.00, 21.67, 20.08, 19.04, 18.47, 18.14, 15.51, 13.65;HRMS (ESI, m/z) calcd for C24H37O4, 389.2692 [M+H+]; found, 389.2733。
化合物6:
Figure 232772DEST_PATH_IMAGE009
6: 油状（56%），[α]25 D -72 (c 0.4 CH3OH); 1H NMR (CD3OD, 400 MHz) 4.92(1H, s, H-17), 4.90-4.73 (1H, m, H-17), 2.62-2.49 (2H, m, H-2``), 1.27-1.21(6H, m, H-5``, 6``), 1.18 (3H, s, H-18), 0.99 (3H, s, H-20), 2.35-0.79 (21H,m, CH, CH2 in ent-beyerane skeleton); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 182.66,155.85, 103.02, 80.35, 66.56, 61.87, 56.87, 53.82, 53.19, 47.41, 46.97,43.58, 41.71, 41.25, 40.55, 39.50, 39.31, 37.80, 31.46, 29.70, 28.84, 21.81,20.45, 19.03, 15.46; HRMS (ESI, m/z) calcd for C26H39O6, 447.2746 [M+H+];found, 447.2789。
化合物7:
Figure 667296DEST_PATH_IMAGE010
7: 白色固体（42%），mp 185.9-182.5 ℃; [α]25 D -28 (c 1.3 CH3OH); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz) 4.97 (1H, s, H-17), 4.88 (1H, s, H-17), 2.80 (1H, d, J=8.0Hz, H-3), 2.68-2.55 (4H, m, H-2``, H-3``),1.97-1.92 (2H, m, H-3``), 1.23(3H, s, H-18), 1.03 (3H, s, H-20), 2.29-0.73 (28H, m, CH, CH2 in ent-beyeraneskeleton); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 184.63, 178.97, 170.97, 152.22, 103.82,88.10, 77.23, 56.94, 53.82, 46.69, 43.80, 42.72, 42.26, 41.14, 40.71, 39.39,37.83, 36.02, 29.62, 28.96, 21.65, 20.14, 19.06, 15.78; HRMS (ESI, m/z) calcdfor C24H35O6,419.2433, [M+H+]; found, 419.2397。
化合物8:
Figure 52141DEST_PATH_IMAGE011
8: 油状（34%），[α]25 D -52 (c 0.2 CH3OH); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 8.00-7.45 (4H, m, Ph-2, 3, 4, 5), 4.96 (1H, s, H-17), 4.84 (1H, s, H-17), 2.90(1H, d, J=12.0Hz, H-3), 2.80-2.67 (1H, m, H-15), 1.24 (3H, s, H-18), 0.95(3H, s, H-20), 2.34-0.72 (23H, m, CH, CH2 in ent-beyerane skeleton); 13C NMR(CDCl3, 100 MHz) δ 185.08, 172.38, 167.24, 152.17, 132.47, 129.87, 129.80,128.36, 127.73, 103.94, 89.46, 57.08, 53.80, 46.90, 43.79, 42.71, 41.42,40.76, 39.49, 37.70, 36.14, 31.45, 30.21, 29.05, 21.77, 20.33, 18.99, 15.47;HRMS (ESI, m/z) calcd for C28H35O6, 467.2433 [M+H+]; found, 467.2479。
化合物9:
Figure 772972DEST_PATH_IMAGE012
9: 白色固体（87%），mp 114.0-115.8 ℃; [α]25 D -106 (c 0.7, CH3OH); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz) 5.94 (1H, m, H-2`), 5.38-5.21 (2H, m, H-3`), 4.97 (1H, s, H-17), 4.82 (1H, s, H-17), 4.54 (2H, m, H-1`), 1.20 (3H, s, H-18), 0.85 (3H, s,H-20), 2.26-0.76 (22H, m, CH, CH2 in ent-beyerane skeleton); 13C NMR (CDCl3,100 MHz) δ 177.14, 156.15, 132.33, 118.19, 102.92, 80.26, 64.94, 56.98,53.78, 47.43, 46.94, 43.90, 41.65, 41.35, 40.71, 39.34, 39.23, 38.05, 28.82,21.91, 20.43, 19.09, 15.55; HRMS (ESI, m/z) calcd for C23H34O3Na, 381.2406 [M+Na+]; found, 381.2424。
化合物10:
Figure 111943DEST_PATH_IMAGE013
10: 白色固体（91%） mp 180.2-181.2 ℃; [α]25 D -63 (c 0.2 CH3OH); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz) 7.37-7.19 (2H, m, Ph-2, 6), 6.93-6.82 (2H, m, Ph-3, 5),5.15-4.90 (3H, m, H-1`, H-17), 4.81 (1H, s, H-17), 1.17 (3H, s, H-18), 0.76(3H, s, H-20), 2.23-0.78 (23H, m, CH, CH2); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 177.25,159.49, 156.19, 130.09, 128.26, 113.88, 102.89, 80.27, 65.83, 57.08, 55.30,53.75, 47.44, 46.91, 43.89, 41.65, 41.34, 40.69, 39.32, 39.23, 38.04, 28.83,21.88, 20.43, 19.12, 15.48. HRMS (ESI, m/z) calcd for C28H39O4, 439.2848, [M+H+]; found, 439.2857。
化合物11:
Figure 84578DEST_PATH_IMAGE014
11: 油状（46%），[α]25 D -40 (c 1.3, CH3OH); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 5.94(2H, m, H-2`, H-2``), 5.38-5.09 (4H, m, H-3`, H-3``), 4.90 (1H, s, H-17),4.87 (1H, s, H-17), 4.62-4.47 (2H, m, H-1`), 3.89-3.85 (2H, m, H-1``), 1.20(3H, s, H-18), 0.84 (3H, s, H-20), 2.24-0.74 (24H, m, CH, CH2 in ent-beyeraneskeleton); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 177.11, 151.49, 135.98, 132.39, 118.13,115.84, 103.65, 85.51, 64.92, 63.70, 57.04, 54.02, 48.07, 43.91, 41.74,41.63, 40.99, 40.68, 39.36, 39.13, 38.04, 28.88, 21.91, 20.16, 19.12, 15.56;HRMS (ESI, m/z) calcd for C26H38O3K, 437.2458 [M+K+]; found, 437.2495。
化合物12:
Figure 589509DEST_PATH_IMAGE015
12: 白色固体（94%），mp 77.9-78.9 ℃; [α]25 D -43 (c 1.2, CH3OH); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz) 6.02-5.86 (1H, m, H-2`), 5.39-5.18 (2H, m, H-3`), 4.95-4.69(4H, m, H-17, H-1``), 4.55 (2H, m, H-1`), 3.88-3.50 (4H, m, H-2``, 3``), 3.39(3H, s, H-4``), 1.20 (3H, s, H-18), 0.85 (3H, s, H-20), 2.24-0.74 (21H, m,CH, CH2 in ent-beyerane skeleton); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 177.13, 152.70,132.40, 118.04, 103.72, 90.69, 85.51, 71.90, 66.83, 64.89, 58.97, 57.04,53.82, 47.79, 43.92, 43.12, 41.72, 41.47, 40.69, 39.37, 38.76, 38.05, 28.88,21.87, 20.12, 19.14, 15.59; HRMS (ESI, m/z) calcd for C27H43O5, 447.3110 [M+H+]; found, 447.3132。
化合物13:
Figure 323984DEST_PATH_IMAGE016
13: 油状（68%），[α]25 D -75 (c 1.6, CH3OH); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 5.97(2H, m, H-2`), 5.39-5.20 (2H, m, H-3`), 4.87 (2H, d, J=8.0Hz, H-17), 4.63-4.47 (2H, m, H-1`), 4.22 (3H, s, H-1``), 1.20 (3H, s, H-18), 0.84 (3H, s, H-20), 2.26-0.74 (20H, m, CH, CH2 in ent-beyerane skeleton); 13C NMR (CDCl3, 100MHz) δ 177.12, 151.01, 132.39, 118.12, 103.72, 85.27, 64.91, 57.03, 54.02,50.05, 48.09, 43.91, 41.73, 41.54, 40.69, 39.93, 39.37, 38.83, 38.05, 28.86,21.91, 20.17, 19.12, 15.56. HRMS (ESI, m/z) calcd for C24H37O3, 373.2742 [M+H+]; found, 373.2781。
化合物14:
Figure 648786DEST_PATH_IMAGE017
14:白色固体（85%），mp 179.-181.3 ℃; [α]25 D -32 (c 1, CH3OH); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz) 4.95-4.71 (4H, m, H-17, H-1``), 3.87-3.52 (4H, m, H-2``, H-3``), 3.39 (3H, s, H-3``), 1.24 (3H, s, H-18), 0.95 (3H, s, H-20), 2.24-0.74(25H, m, CH, CH2 in ent-beyerane skeleton); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 152.71,103.73, 90.72, 85.50, 71.94, 66.90, 58.96, 56.95, 53.85, 47.80, 43.72, 43.18,41.75, 41.47, 40.65, 39.49, 38.73, 37.82, 28.97, 21.75, 20.14, 19.06, 15.57.HRMS (ESI, m/z) calcd for C24H39O5, 407.2797 [M+H+]; found, 407.2841。
化合物15:
Figure 628375DEST_PATH_IMAGE018
15: 白色固体（72%），mp 154.2-155.8 ℃; [α]25 D -72 (c, 0.4 CH3OH); 1H NMR(CDCl3, 400 MHz) 4.88 (2H, d, J=8.0Hz, H-17), 3.23 (3H, s, OCH3), 1.24 (3H, s,H-18), 0.94 (3H, s, H-20), 2.24-0.74 (21H, m, CH, CH2 in ent-beyeraneskeleton); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 183.91, 150.90, 103.78, 85.43, 56.95,54.02, 50.02, 48.08, 43.71, 41.69, 41.56, 40.62, 40.00, 39.50, 38.84, 37.76,28.95, 21.79, 20.19, 19.06, 15.53; HRMS (ESI, m/z) calcd for C21H33O3, 333.2429[M+H+]; found, 333.2481。
化合物16:
Figure 319355DEST_PATH_IMAGE019
16: 油状（53%），[α]25 D -22 (c 2.0, CH3OH); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 7.35-7.26 (2H, m, Ph-2, 6), 6.95-6.85 (2H, m, Ph-3, 5), 6.02-5.82 (1H, m, H-2``),5.33-5.09 (2H, m, H-3``), 5.08-4.97 (2H, m, H-1`), 4.90 (1H, s, H-17), 4.86(1H, s, H-17), 3.97-3.86 (2H, m, H-1``), 3.81 (3H, s, OCH3), 1.17 (3H, s, H-18), 0.75 (3H, s, H-20), 2.23-0.77 (23H, m, CH, CH2 in ent-beyeraneskeleton); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 177.24, 159.49, 152.03, 130.08, 128.32,113.85, 103.40, 84.85, 65.75, 62.11, 57.14, 55.26, 53.99, 48.19, 43.90,41.61, 40.67, 39.35, 39.10, 38.04, 32.74, 31.96, 31.46, 30.21, 29.73, 28.86,22.72, 21.92, 20.16, 19.47, 15.50, 14.09; HRMS (ESI, m/z) calcd for C32H47O4,495.3396 [M+H+]; found, 495.3351。
化合物17:
Figure 54093DEST_PATH_IMAGE020
17：油状（80%），[α]25 D -17 (c 0.7, CH3OH); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 7.35-7.23 (2H, m, Ph-2, 6), 6.93-6.82 (2H, m, Ph-3, 5), 5.15-4.69 (6H, m, H-17, H-1`, H-1``), 3.19-3.76 (4H, m, H-2`, H-2``), 3.69-3.51 (3H, m, H-2``, H-3``),3.39 (3H, s, H-4``), 1.17 (3H, s, H-18), 0.78 (3H, s, H-20), 2.24-0.73 (25H,m, CH, CH2 in ent-beyerane skeleton); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 177.20,159.49, 152.70, 129.96, 128.31, 113.88, 103.69, 90.70, 85.49, 71.91, 66.87,65.74, 58.96, 57.11, 55.26, 53.80, 47.82, 43.89, 43.03, 41.72, 41.47, 40.68,39.34, 38.78, 38.03, 31.52, 30.16, 29.70, 28.85, 21.85, 20.11, 19.15, 15.51;HRMS (ESI, m/z) calcd for C32H46O6Na, 549.3192 [M+Na+]; found, 549.3174。
化合物18:
Figure 803874DEST_PATH_IMAGE021
18: 油状（41%）[α]25 D -38 (c 3.0, CH3OH); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 7.32-7.26 (2H, m, Ph-2, 6), 6.90-6.85 (2H, m, Ph-3, 5), 5.12-4.96 (2H, m, H-1`),4.86 (1H, s, H-17), 4.84 (1H, s, H-17), 3.81 (3H, s, H-2`), 3.34 (2H, t, J=8.0Hz, H-1``), 1.17 (3H, s, H-18), 0.75 (3H, s, H-20), 2.23-0.77 (42H, m, CH,CH2 in ent-beyerane skeleton); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 151.53, 135.99,130.09, 115.83, 113.82, 103.60, 85.49, 65.75, 63.71, 57.08, 55.28, 53.91,48.00, 43.87, 41.69, 41.60, 40.90, 40.63, 39.32, 39.05, 38.00, 28.84, 21.87,20.13, 19.11, 15.46; HRMS (ESI, m/z) calcd for C31H43O4, 479.3161 [M+H+];found, 479.3127。
化合物19:
Figure 180629DEST_PATH_IMAGE022
19:油状（51%），[α]25 D -96 (c, 0.5 CH3OH); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 6.02-5.84 (1H, m, H-2`), 5.38-5.1 (2H, m, H-3`), 4.90-4.81 (2H, m, H-17), 4.66-4.39 (2H, m, H-1`), 1.30-1.28 (6H, m, H-5``, 6``), 1.19 (3H, s, H-18), 0.87(3H, s, H-20), 2.70-0.71 (28H, m, CH, CH2 in ent-beyerane skeleton); 13C NMR(CDCl3, 100 MHz) δ 177.06, 169.77, 151.50, 132.37, 118.07, 103.66, 88.18,64.90, 56.97, 53.73, 46.93, 45.14, 43.86, 42.59, 42.00, 41.12, 40.69, 40.52,39.26, 38.02, 36.83, 28.85, 25.34, 25.14, 21.80, 20.00, 19.10, 15.45. HRMS(ESI, m/z) calcd for C29H43O6, 487.3059 [M+H+]; found, 487.3089。
化合物20：
Figure 722469DEST_PATH_IMAGE023
20: 油状（61%），[α]25 D -54 (c 0.6, CH3OH); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 7.36-7.20 (2H, m, Ph-2, 6), 6.93-6.82 (2H, m, Ph-3, 5), 5.12-4.95 (2H, m, H-1`),4.86 (2H, d, J=12.0Hz, H-17), 3.83 (3H, s, H-2`), 2.50-2.42 (1H, m, H-3),2.03 (3H, s, H-2``), 1.16 (3H, s, H-18), 0.82 (3H, s, H-20), 2.07–0.90 (21H,m, CH, CH2 in ent-beyerane skeleton); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ177.21,169.81, 159.46, 152.05, 130.02, 128.30, 113.90, 103.28, 87.63, 65.78, 57.04,55.27, 53.67, 46.95, 43.86, 42.54, 41.94, 41.16, 40.70, 39.27, 38.03, 36.88,29.71, 28.80, 22.26, 21.82, 20.03, 19.11, 15.36.; HRMS (ESI, m/z) calcd forC30H41O5, 481.2954 [M+H+]; found, 481.2977。
化合物21:
Figure 595484DEST_PATH_IMAGE024
21：油状（81%），[α]25 D -76 (c 0.5, CH3OH); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 7.34-7.27 (2H, m, Ph-2, 6), 6.95-6.85 (2H, m, Ph-3, 5), 5.12-4.77 (4H, m, H-17, H-1`), 3.83 (3H, s, H-2`), 1.34-1.24 (6H, m, H-5``, 6``), 1.17 (3H, s, H-18),0.77 (3H, s, H-20), 2.07–0.90 (22H, m, CH, CH2 in ent-beyerane skeleton); 13CNMR (CDCl3, 100 MHz) δ 156.19, 151.63, 130.18, 130.08, 113.94, 113.88,103.57, 102.88, 88.16, 80.29, 65.78, 57.02, 55.30, 53.77, 47.45, 46.92,45.20, 43.88, 42.59, 41.35, 41.12, 40.72, 39.28, 38.05, 36.83, 28.83, 25.39,21.83, 20.44, 20.02, 19.09, 15.48, 15.38; HRMS (ESI, m/z) calcd for C34H47O7,567.3322 [M+H+]; found, 567.3358。
化合物22:
Figure 222775DEST_PATH_IMAGE025
22：油状（61%），[α]25 D -24 (c 1.3 CH3OH); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 7.35-7.20 (2H, m, Ph-2, 6), 6.95-6.85 (2H, m, Ph-3, 5), 5.09-4.96 (2H, m, H-1`),4.87 (1H, s, H-17), 4.84 (1H, s, H-17), 3.82 (3H, s, OCH3), 2.69-2.55 (4H, m,H-2``, H-3``), 2.43 (1H, d, J=8.0Hz, H-3), 1.16 (3H, s, H-18), 0.97 (3H, s,H-20), 2.29-0.84 (27H, m, CH, CH2); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 177.22, 170.84,159.38, 151.66, 130.09, 128.37, 113.92, 103.51, 88.15, 65.79, 57.02, 55.32,53.63, 46.91, 43.86, 42.57, 41.90, 41.14, 40.69, 39.27, 38.03, 36.86, 31.94,31.52, 29.90, 29.71, 28.94, 28.79, 21.81, 20.03, 19.10, 15.35. HRMS (ESI, m/z) calcd for C32H43O7, 539.3009 [M+H+]; found, 539.3049。
实施例2
将实施例1获得的一系列化合物进行斑马鱼实验，具体方法为：
（1）斑马鱼养殖与胚胎收集：从国家斑马鱼资源中心购买斑马鱼（3-12月龄），在光周期为14:10 h（光照：暗照），温度为28.5 ± 1℃的流动饲养箱中进行养殖，每天两次活饱和食盐水虾喂食；斑马鱼（雌：雄=1:1）交配，收集胚胎，用Holt Buffer缓冲液冲洗，在培养箱（28.5±1℃）中培养24h，通过显微镜检查进行筛选。
（2）溶液配制：将实施例1获得的一系列化合物用二甲基亚砜溶解，加入到含DOX的Holt Buffer溶液中（二甲基亚砜体积分数为0.5%），得到给药组溶液；将二甲基亚砜直接溶于Holt Buffer溶液中（二甲基亚砜体积分数为0.5%），得到空白组溶液；将二甲基亚砜加入到含DOX的Holt Buffer溶液中（二甲基亚砜体积分数为0.5%），得到模型组溶液。
（3）DOX诱导斑马鱼胚胎心衰模型对药物筛选：将24 hpf（受精后24小时）野生型斑马鱼胚胎分配到24孔板中（20个胚胎/孔），每孔加入不同组溶液（其中，DOX终浓度为100 µM，受试化合物终浓度为1，5，40 µM）1ml，每组四个孔做技术重复，处理72 h，在倒置荧光显微镜（蔡司，德国）下观察胚胎存活率及异常情况，心房和心室失去收缩力，被视为死亡，以存活率作为化合物活性的评价标准，如表3所示，化合物11、16、22能有效提高DOX模型中斑马鱼的存活率，故对其进行DOX诱导的斑马鱼胚胎心脏功能评价研究。
表3甜菊醇衍生物对DOX诱导的斑马鱼胚胎存活率的影响
Figure 75324DEST_PATH_IMAGE026
（4）化合物有效剂量探究实验：如图1所示，筛选出活性显著、结构特征不同的衍生物11、16、22，以及起始原料甜菊醇（化合物1）、阳性药物LSD（左西孟旦），以供进一步研究。为了确定斑马鱼模型上衍生物的最佳剂量，根据上述初步筛选的结果，为五种衍生物设计了五种不同的浓度。化合物1、11、16、22和LSD的最佳终浓度分别为60、20、1.0、1.0和60μM。
（5）斑马鱼胚胎对药物毒性试验：将24 hpf野生型斑马鱼胚胎分配到96孔板中（1个胚胎/孔），加入200 µL含不同浓度试验化合物的Holt Buffer溶液单独处理胚胎，暴露72h，在倒置荧光显微镜（蔡司，德国）下观察胚胎孵化率及孵化后的生长形态，测试化合物（11、16、22）是否会引起任何毒性。
如图2，即使浓度远高于有效剂量，所有试验化合物也不会导致斑马鱼死亡，并且身体形态发育正常。
（6）DOX诱导的斑马鱼胚胎心脏功能评价：将24 hpf转基因Tg[myl7:EGFP] 斑马鱼（购自国家斑马鱼资源中心）胚胎分配到24孔板中（20个胚胎/孔），每孔加入不同组溶液（DOX终浓度为70 µM，1、11、16、22、LSD为对应最佳浓度），处理48 h，在正置荧光显微镜（蔡司，德国）下记录斑马鱼的心脏状态和各项心脏指标，拍摄并记录斑马鱼20s，测量收缩末期和舒张末期的长轴（a）和短轴（b），并用公式v=4/3πab2计算心室容积。每搏量是舒张末期容积和收缩末期容积的差值。博出量是每搏量和心率的乘积。收缩分数（%）的计算公式为：（舒张短轴-收缩短轴）/（舒张短轴）×100%。
如图3所示，单独使用DOX暴露的斑马鱼（模型组）收缩分数、每搏量和博出量显著降低，心率中度下降，表明心室充盈异常和收缩功能障碍。DOX与供试品（1、11、16、22、LSD）以最佳剂量联合应用，可显著减轻DOX所致的心脏水肿，维持正常的心脏形态，改善DOX所致的心功能损害。在所有被测化合物中，化合物22表现出最显著的效率，心肌保护活性排序为22>11>16>1>LSD。
（7）定量聚合酶链反应：按照步骤（6）所述方法进行胚胎处理，其中，化合物22终浓度为0.1、1µM，将经过2d处理的20个胚胎用标准的TRIzol方案（Generay Biotech）进行RNA提取，使用Nanodrop 2000 S分光光度计（Thermo-Scientific）测定RNA浓度和质量。用两步RT-PCR试剂盒（南京诺唯赞）进行qRT-PCR扩增总RNA。qRT-PCR分析至少重复三次。qPCR引物如下：
β-actin-L：CCT ACT AAT ACA CAG CCA TGG ATG A；
β-actin-R：GTC CCA TGC CAA CCA TCA C；
cTnT-L：GTC TGC ACT TCG GCG GTT ACA；
cTnT-R：AGG TAA AAT CTA TAT TGT TCA GTG AAA TCT AAC CG；
ANP-L：ATG GCC GGG GGA CTA ATT CT；
ANP-R：AGA GTT GCA ACC GAG GGT GC；
BNP-L：AAG AGC AGC CCG ATA CTT ACC T；
BNP-R：TCC CAA AGA CGA CAT TGA ACC。
如图4所示，DOX暴露导致ANP、BNP和cTnT的mRNA水平显著增加，化合物22能显著降低ANP、BNP和cTnT水平，且呈剂量依赖性，这些结果为化合物22的心脏保护效力提供了强有力的分子证据。
（8）细胞活力测定：以含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的完全培养基为培养基，将H9c2细胞（购买于上海ATCC细胞库）在37℃、5% CO2的加湿培养箱中培养至细胞达到70%以上融合；然后将H9C2接种在96孔板中，用LSD和22以1、3、10 µM和DOX（2.5µM）共处理48h后，改用含有CCK-8的完全培养基处理4h，用酶标仪在450nm测量光密度，并与空白组做比较，求出恢复率。
结果如图5所示，与对照组相比，DOX处理后的细胞存活率仅为50%，而化合物22则保护了部分DOX处理后的H9C2细胞，存活率有明显的升高（图5）。
（9）细胞内活性氧（ROS）的评估：使用DCFH-DA测定细胞内活性氧。具体操作为：将培养后的H9C2细胞接种在96孔板中，用化合物22以3、10µM和DOX（2.5µM）共处理48h后，用磷酸盐缓冲饱和食盐水（PBS）洗涤三次；将用完全培养基稀释至最终浓度5 μmol/L的活性氧荧光探针（DCFH-DA）加入H9C2细胞中，将混合物在37℃下培养40分钟；然后去除染料，并用（PBS）洗涤孔三次，然后用共焦显微镜（Carl-Zeiss）测量荧光强度以确定活性氧水平（如图6A）。
如图6A所示，与对照组相比，DOX处理的H9c2细胞的荧光强度更高，这表明DOX诱导ROS过量产生。化合物22和DOX联合处理显著降低荧光强度，且呈剂量依赖性。这些结果清楚地表明，化合物22可以减少ROS的过量产生，从而保护细胞免受氧应激损伤。
（10）线粒体膜电位（Δψm）的测定用阳离子JC-1（Sigma-Aldrich）染料测定线粒体膜电位：将培养后的H9C2细胞接种在共聚焦培养皿中，化合物22以3、10µM和DOX（2.5µM）共处理48h后，将制备成最终浓度为1 μg/mL的JC-1工作溶液以500μL/孔添加到H9c2细胞中，混合物在37℃下培养20分钟。然后去除染料，并用PBS清洗孔三次。用卡尔蔡司共聚焦显微镜（Carl-Zeiss）观察H9c2细胞，分析红、绿荧光强度比值，测定Δψm。
如图6B所示，DOX处理后细胞∆ψm明显降低，化合物22剂量依赖性的共处理恢复了∆ψm，化合物22能有效地减轻DOX诱导的氧化应激，恢复线粒体膜电位，从而保护细胞免受损伤。
上述实验结果表明本发明所述化合物具有显著的心脏保护作用，通过抑制ROS的过度积累，恢复线粒体的电位，从而保护心肌细胞的死亡和损伤，作为一个潜在的心脏保护临床试验候选物值得进一步开发。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东工业大学
<120> 一种甜菊醇衍生物及其制备方法与在制备心脏保护药物中的应用
<130> 1
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> β-actin-L
<400> 1
cctactaata cacagccatg gatga 25
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> β-actin-R
<400> 2
gtcccatgcc aaccatcac 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> cTnT-L
<400> 3
gtctgcactt cggcggttac a 21
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> cTnT-R
<400> 4
aggtaaaatc tatattgttc agtgaaatct aaccg 35
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANP-L
<400> 5
atggccgggg gactaattct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ANP-R
<400> 6
agagttgcaa ccgagggtgc 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> BNP-L
<400> 7
aagagcagcc cgatacttac ct 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> BNP-R
<400> 8
tcccaaagac gacattgaac c 21

Claims (8)

1.一种甜菊醇衍生物，为式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003669164900000011
其中，R2为COR3或R4；
当R1为H、R2为COR3时，R3为
Figure FDA0003669164900000012
当R1为
Figure FDA0003669164900000013
R2为R4，R4为H；
当R1为
Figure FDA0003669164900000014
时，R2为R4，R4为
Figure FDA0003669164900000015
当R1为
Figure FDA0003669164900000016
R2为COR3时，R3为
Figure FDA0003669164900000017
当R1为
Figure FDA0003669164900000018
R2为COR3时，R3为
Figure FDA0003669164900000019
2.权利要求1所述的甜菊醇衍生物的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)以酸酐和甜菊醇为反应物，吡啶为缚酸剂和溶剂，4-二甲氨基吡啶为催化剂，加热回流搅拌反应，分别得到R1为H、R3为
Figure FDA00036691649000000110
的甜菊醇衍生物；
(2)以烯丙基溴或对甲氧基苄基氯和甜菊醇为反应物，碱性条件下，加热回流搅拌反应，分别得到R1为烯丙基或对甲氧基苄基、R4为H的甜菊醇衍生物；
(3)将步骤(2)制备的R1为对甲氧基苄基、R4为H的甜菊醇衍生物、氢氧化钠溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，加热回流搅拌反应；然后加入烯丙基溴或溴丁烷，继续加热回流搅拌反应，得到R1为对甲氧基苄基、R4为烯丙基的甜菊醇衍生物、或R1为对甲氧基苄基、R4为丁基的甜菊醇衍生物；
(4)将步骤(2)制备的甜菊醇衍生物、4-二甲氨基吡啶溶于无水吡啶中，分别加入乙酸酐、2,2-二甲基丁二酸酐或丁二酸酐，加热回流搅拌反应，得到R1为烯丙基、R3为
Figure FDA0003669164900000021
的甜菊醇衍生物、或R1为对甲氧基苄基、R3为甲基的甜菊醇衍生物、或R1为对甲氧基苄基、R3为
Figure FDA0003669164900000022
的甜菊醇衍生物。
3.根据权利要求2所述的甜菊醇衍生物的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的酸酐为2,2-甲基丁二酸酐或邻苯二甲酸酐。
4.权利要求1所述的甜菊醇衍生物在制备心脏保护药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的甜菊醇衍生物在制备心脏保护药物中的应用，其特征在于：
所述的药物含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
6.根据权利要求4所述的甜菊醇衍生物在制备心脏保护药物中的应用，其特征在于：
所述的药物的制剂为片剂、注射液、脂质体纳米粒或控释剂。
7.一种心脏保护药物，其特征在于含有有效量的权利要求1所述的甜菊醇衍生物，余量为药用辅料。
8.根据权利要求7所述的心脏保护药物，其特征在于：
所述药用辅料为溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂或粘合剂。
CN202210186347.4A 2022-02-28 2022-02-28 一种甜菊醇衍生物及其制备方法与在制备心脏保护药物中的应用 Active CN114249650B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210186347.4A CN114249650B (zh) 2022-02-28 2022-02-28 一种甜菊醇衍生物及其制备方法与在制备心脏保护药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210186347.4A CN114249650B (zh) 2022-02-28 2022-02-28 一种甜菊醇衍生物及其制备方法与在制备心脏保护药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114249650A CN114249650A (zh) 2022-03-29
CN114249650B true CN114249650B (zh) 2022-08-12

Family

ID=80800012

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210186347.4A Active CN114249650B (zh) 2022-02-28 2022-02-28 一种甜菊醇衍生物及其制备方法与在制备心脏保护药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114249650B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113105348B (zh) * 2021-03-24 2022-11-22 广东工业大学 一种异甜菊醇衍生物及其制备方法和应用
CN117986205B (zh) * 2024-03-04 2024-06-18 广东工业大学 一种异甜菊醇衍生物及其制备方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102079700A (zh) * 2009-11-27 2011-06-01 中国药科大学 由甜菊苷合成新颖四环二萜类化合物的方法
CN108348481A (zh) * 2015-09-10 2018-07-31 东莞市凯法生物医药有限公司 贝壳杉烷类化合物在治疗心肌肥厚和肺动脉高压的药物应用
CN109925302A (zh) * 2019-02-18 2019-06-25 东莞市凯法生物医药有限公司 一种使用贝壳杉烷类化合物保护蒽环类抗肿瘤药物心脏毒性的应用
CN112472690A (zh) * 2020-11-15 2021-03-12 珠海沅芷健康科技有限公司 一种制备增强CNPase活性的化合物或生物药物的方法用于治疗心脏疾病
CN113262215A (zh) * 2020-02-15 2021-08-17 东莞市凯法生物医药有限公司 贝壳杉烷类化合物在制备预防和治疗脓毒症及多器官损伤的药物中的应用
CN114133327A (zh) * 2022-01-30 2022-03-04 广东工业大学 一种甜菊醇衍生物及其制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2229164A1 (en) * 2007-12-05 2010-09-22 Aarhus Universitet Elevation of the plasma hdl-cholesterol level

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102079700A (zh) * 2009-11-27 2011-06-01 中国药科大学 由甜菊苷合成新颖四环二萜类化合物的方法
CN108348481A (zh) * 2015-09-10 2018-07-31 东莞市凯法生物医药有限公司 贝壳杉烷类化合物在治疗心肌肥厚和肺动脉高压的药物应用
CN109925302A (zh) * 2019-02-18 2019-06-25 东莞市凯法生物医药有限公司 一种使用贝壳杉烷类化合物保护蒽环类抗肿瘤药物心脏毒性的应用
CN113262215A (zh) * 2020-02-15 2021-08-17 东莞市凯法生物医药有限公司 贝壳杉烷类化合物在制备预防和治疗脓毒症及多器官损伤的药物中的应用
CN112472690A (zh) * 2020-11-15 2021-03-12 珠海沅芷健康科技有限公司 一种制备增强CNPase活性的化合物或生物药物的方法用于治疗心脏疾病
CN114133327A (zh) * 2022-01-30 2022-03-04 广东工业大学 一种甜菊醇衍生物及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114249650A (zh) 2022-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114249650B (zh) 一种甜菊醇衍生物及其制备方法与在制备心脏保护药物中的应用
Zhang et al. Synthesis and in vivo screening of isosteviol derivatives as new cardioprotective agents
CN116063372B (zh) 一类线粒体靶向的抗肿瘤化合物及其制备方法和应用
CN113105348B (zh) 一种异甜菊醇衍生物及其制备方法和应用
CN115043820B (zh) Par-1抑制剂及其类似物的制备方法和在血栓性疾病防治中的应用
US6750247B2 (en) Sponge-derived terpenoids and methods of use
CN111393421B (zh) 丁烯酸内酯类衍生物及其制备方法与应用
CN114315855B (zh) 莪术醇类衍生物、制备方法及其在制备抗炎药物中的应用
CN114349700A (zh) 一种氧化异阿朴菲生物碱衍生物及其制备方法和抗抑郁用途
CN117986205B (zh) 一种异甜菊醇衍生物及其制备方法和应用
EP2870133B1 (en) Tetrahydro-isohumulone derivatives, methods of making and using
CN106977561B (zh) Sutherlandin-5-p-hydroxybenzoate的制备及其在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用
KR20200118158A (ko) 신경퇴행성 질환의 치료약물 및 그의 응용
CN111825608A (zh) 四氢喹啉类与四氢异喹啉类化合物及其用途
BE1028852B1 (fr) PRODROGUE DU 5α-hydroxy-6β-[2-(1H-imidazol-4-yl) éthylamino]cholestan-3β-ol ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LE COMPRENANT POUR UTILISATION DANS LE TRAITEMENT DU CANCER
CN114599643B (zh) 一种芳基葡糖苷衍生物
WO2024061048A1 (zh) 一类石蒜碱衍生物、其药物组合物及其在制备抗病毒药物中的用途
WO2023155757A1 (zh) 基于菝契皂苷元结构的衍生物及其药物组合物的用途
CN114751841B (zh) N-(3-(3-氯苯甲酰胺)苯基)-4-甲氧基-3-硝基苯甲酰胺及其制备方法与应用
US20240150279A1 (en) C prime agents for treating metabolic disorders
CN102285933B (zh) 一种对亚型过氧化物酶增殖物激活受体具有激动作用的化合物、其制备方法和应用
CN101607954B (zh) 一种丹参素衍生物及其制备方法和在药学上的应用
US10344049B2 (en) Substituted steroids for the treatment of cancer
CN118320117A (zh) 多细胞器靶向、原位释放的分子基药物递送系统
CN106974923B (zh) Sutherlandin-5-cis-p-coumarate的制备及其在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant