CN113262215A - 贝壳杉烷类化合物在制备预防和治疗脓毒症及多器官损伤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种贝壳杉烷类化合物在预防和治疗脓毒症，系统性炎症反应综合征(SIRS)以及脓毒症导致的多器官衰竭，包括急性肺功能衰竭、急性心功能衰竭和肾功能衰竭的药物用途。

Description

贝壳杉烷类化合物在制备预防和治疗脓毒症及多器官损伤的 药物中的应用

发明领域

本发明公开了一种贝壳杉烷类化合物在脓毒症，系统性炎症反应综合征(SIRS)以及脓毒症导致的多器官衰竭的缓解和治疗作用。本发明公开了该类贝壳杉烷类化合物可以显著降低脓毒症导致的死亡率；降低脓毒症引起的炎症反应，抑制脓毒症引起的炎性细胞的增殖，抑制脓毒症时血浆细胞因子的增加。本发明公开了该类贝壳杉烷类化合物对脓毒症导致的急性肺功能抑制和衰竭综合征，脓毒症导致的肺损伤、心肌损伤和心功能衰竭、肝功能损伤、肾功能损伤以及脾脏功能损伤均具有显著的缓解和治疗作用。同时还可以改善和治疗脓毒症痊愈后上述器官发生重构和纤维化。本发明公开了该类贝壳杉烷类化合物对脓毒症发生时巨噬细胞的激活和增殖的抑制与调节作用。

背景技术

脓毒症是机体对感染的免疫反应失调导致多器官功能障碍(心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺)。在临床实践脓毒症主要累及器官系统-心血管系统(包括微循环系统)，呼吸系统，肾脏系统，神经系统，血液系统和肝系统。脓毒症的发生有两个重要的病理阶段：系统性炎症反应和代偿性抗炎反应，二者之间的平衡对于机体的生存和预后有很重要的影响。脓毒症的死亡率高达30％以上，脓毒症是导致临床死亡的主要疾病之一。

病原微生物相关的结构分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，如革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)，细菌脂蛋白，病毒的双链或单链核酸等是导致脓毒症发生的重要诱因。来自病原的PAMPs可以被人体固有免疫细胞表面的结构识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)所识别，例如(toll-like receptors，TLRs)。两者结合后可以启动和激活机体的炎症免疫反应。比如LPS可以通过激活巨噬细胞表面TLR4受体，然后激活NF-κB和MAKP等炎症转录因子，从而产生一系列的大量的炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和相关的炎性蛋白等，造成的过度炎症反应并吸引更多炎性细胞发生趋化反应，并形成恶性循环，最终导致过度的全身性的炎症免疫反应，严重时引起系统性炎性反应综合征(SIRS)或脓毒症和多器官衰竭，导致死亡(QiuP.etal.,Inflammation.2019:42(1):6-19)。非感染性疾病如心衰、脑梗、严重创伤和大面积烧伤等也可能造成系统性炎性反应综合征。脓毒症(SIRS合并感染)死亡率可以高达30％，是目前临床死亡的主要病症之一。肺脏是脓毒症时最容易被累及的器官，约70％的脓毒症病人会先后出现急性肺损伤，急性呼吸抑制综合征(ARDS)和急性呼吸衰竭。其次肾脏功能衰竭、肝脏功能衰竭和心脏功能衰竭也很常见。单器官或合并多器官衰竭最终导致死亡，对于部分恢复的病人，也会出现纤维化造成器官的永久性损伤。

研究发现，巨噬细胞在脓毒症发展中发挥关键作用。巨噬细胞是关键的促炎细胞因子产生的主要细胞。静态的巨噬细胞是代谢的稳定状态，代谢以氧化磷酸化为主。脓毒症时巨噬细胞被活化，释放大量炎症因子和炎性化学毒性物质如：干扰素(IFN-γ)，白细胞介素(IL-1,ΙL-12,IL-10等)，肿瘤坏死因子(TNF-α),nitric oxide(NO)，以及过氧化物(ROS)等。它们再进而激化NK细胞和淋巴细胞,从而导致更多的细胞因子的释放和局部及全身性的炎症反应。形成所谓“细胞因子风暴”(cytokine storm)。

巨噬细胞激活时需要提供足够的ATP发挥其效应功能，因此需要通过代谢调节和重构(KellyB.et al.,Cell Res.2015:25(7):771-784.)。活化的巨噬细胞依据诱导活化的细胞因子不同，以及线粒体内代谢途径不同可分为M1型和M2型巨噬细胞。抑制巨噬细胞的糖酵解可降低炎症因子产生，从而调节巨噬细胞功能。因此，免疫反应的调节也可能通过巨噬细胞的代谢调节和重构而实现，从而干预机体脓毒症的发生和发展。

目前还没有任何针对脓毒症的特效治疗措施。临床主要是对症治疗，以消除感染和免疫调节为主。在确定诊断后，主要是抗感染，体液治疗、抗低血压休克、器官保护与呼吸支持、和辅助治疗。免疫调节方面，一些抗炎和坑炎症因子的实验性药物还没有发现确定的治疗效果。此外，皮质激素治疗的使用较为普遍，但其对脓毒症的临床治疗效果和潜在的副作用存在较多的争议。过去数十年里，脓毒症的发生率和死亡率并没有明显的改善。脓毒症是危及生命的重大疾病，近年来其死亡率有所下降，但发病率却持续上升。世界卫生组织也决议提高对脓毒症的重视呼吁各国和健康医疗机构推进脓毒症的诊断和治疗。因此，开发治疗脓毒症及多器官衰竭的安全有效的治疗药物，关系众多的临床相关病人的生存，是当前未被满足临床急切需求。

化合物A是从甜菊糖分离的一种贝叶烷萜类化合物。甜菊糖是广为熟知的南美洲的传统植物，并是全球广泛使用的甜味剂。甜菊对代谢和心血管系统的功效(Geuns JMC.Stevioside.Phytochemistry.2003；64(5):913-21)也有报道。

先前的研究表明，以化合物A为代表类贝壳杉烷型化合物，具有心脏和脑组织的保护作用，可以用于治疗心肌缺血和脑梗塞(专利1：CN100508962 C)。此外，化合物A及相关的贝壳杉烷型化合物也可抑制组织损伤导致炎症反应，抑制心肌和肺组织的纤维化(专利2：CN108348481 A)。化合物A对同时也可能用于代谢性疾病和糖尿病心肌炎等。研究还证明，化合物A对一些细胞因子如TNF-α，白介素IL-6等也有抑制作用。

然而，化合物A及相关贝壳杉烷类化合物在治疗病原感染导致的脓毒症和保护脓毒症引起的器官衰竭并没有报道。现已知道，感染或其他重症导致的细胞因子风暴和免疫功能失调是诱发脓毒症的主要原因，而巨噬细胞的过度激活对上述细胞因子风暴启动和发展起着关键作用。然而，化合物A及相关贝壳杉烷类化合物对上述感染导致的免疫功能失调和巨噬细胞的激活作用，也没有报道。

在此发明中，我们首次提出化合物A及相关贝壳杉烷类化合物，可用于治疗脓毒症以及脓毒症引起的多器官损伤；可以改善脓毒症引起的心功能、肝功能、脾功能、肺功能和肾功能的损伤和降低脓毒症动物的死亡率。化合物A及相关贝壳杉烷类化合物还可以通过抑制病原感染和脓毒症导致巨噬细胞的极化，抑制多种细胞因子和化学毒性物质的表达，从而调节感染导致的异常的免疫炎症反应，达到治疗脓毒症的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种贝壳杉烷类化合物在制备脓毒症多器官损伤的治疗、预防药物中的药物的应用。本发明公开了一种新型治疗和/或预防脓毒症多器官损伤的药物。

本发明公开了贝壳杉烷类化合物，如化合物A(结构式(I))，用于治疗脓毒症和多器官衰竭。结构式(I)代表一类天然的、合成的或半合成的化合物。其中许多化合物已被公众所知(Kinghorn AD,2002,p86-137；Sinder BB et al.,1998；Chang FR et al.,1998；Hsu FL et al.,2002)。结构式(I)的化合物可能有一个或多个不对称中心，也有可能以不同的立体异构体存在。

其中

ii.R1:氢、羟基或烷氧基。

iii.R2：羧基、羧酸盐、酰卤、醛基、羟甲基，和可以生成羧基的酯基、丙烯酰胺基、酰基或醚键基团。

iv.R3、R4、R5、R6、R8：氧、羟基、羟甲基和能水解生成羟甲基的酯基或烷氧甲基。

v.R7：甲基、羟基，和能水解生成羟甲基的酯基或烷氧甲基。

vi.R9：亚甲基或氧

一组优选化合物的结构如式(I’)所示。所述化合物具有贝壳杉烷结构，在C13位置上被取代，在C17，C18上衍生化。所述化合物可能具有多个不对称中心，并存在不同的立体异构体或非对映异构体。位置8和13的绝对构型为(8R，13S)或(8S，13R)。

其中

vii.R2：羧基、羧酸盐、醛基、羟甲基、甲基酯、酰甲基、酰卤。

viii.R7：甲基，羟甲基或甲基醚。

ix.R9：亚甲基或氧。

天然甜菊苷酸解后可以得到化合物A。化合物B是甜菊糖的糖苷配基，甜菊糖是化合物B的苷类。化合物A和B是同分异构体。化合物B可通过甜菊糖水解、氧化得到，或通过动物肠道细菌催化反应得到。

化合物A的分子式为C₂₀H₃₀O₃，化学名称为(4α，8β，13β)-13-methyl-16-oxo-17-norkauran-18-oic acid。化合物A也被称为ent-16-ketobeyran-18-oic acid。该化合物是含有贝壳杉烷结构的四环二萜类化合物，其中，不对称碳原子的绝对构型为：(4R，5S，8R，9R，10s、13s)，碳13位上为甲基取代基，碳16上为羰基，碳18位上为羧基(Rodrigues etal.,1988)。

化合物B的分子式为C₂₀H₃₀O₃，化学名称为ent-13-hyrdoxykaur-16-en-18-oicacid，它也被称为甜菊醇。该化合物也是含有贝壳杉烷结构的四环二萜类化合物。其中，手性碳原子的绝对构型为(4R,5S,8R,9R,10S,13S)，碳13上连接羟基，与碳16相邻的双键连接亚甲基，碳18连接羧基(Rodrigues et al.,1993).

化合物A或B在碳18位上也可以羧酸盐的形式存在，其中羧酸盐是钠和碱性金属或氯化物和卤素。化合物A和B都是含有贝壳杉烷结构的贝壳杉烷类化合物。化合物A是本发明的优选化合物。本发明公开了化合物A或B在治疗和预防心脏肥大和肺动脉高压方面具有相似的治疗效果。可以推断，结构式(I)的所有其它化合物也具有与化合物A相同的治疗效果。据报道，化合物B在体外一定条件下会致突变。因此，与化合物B相比，化合物A更适合作为治疗药物。本发明所使用的化合物A是溶解度较好的化合物A的钠盐。

本发明公开化合物A结构式(I)在治疗和预防感染导致的脓毒症或急性系统性炎症反应综合症(SIRS)方面的应用。LPS诱发小鼠脓毒症后，小鼠全部因脓毒症死亡。如给与LPS后再腹腔给与化合物A则大部分小鼠能存活。在本发明的一个实验中，腹腔注射大剂量LPS后，小鼠的在24h内全部死亡，如腹腔注射同样剂量LPS后，再给予化合物A(10-20mg/kg)，小鼠的生存率显著提高，高达三分之二以上的LPS小鼠可以存活。LPS小鼠的存活率与化合物A的给药剂量存在明显的相关性。

本发明还公开了在LPS诱发的脓毒症小鼠，血液血常规检测结果显示小鼠的白细胞，中性粒细胞和单核细胞值较正常组有显著性升高，显示LPS模型组的小鼠出现炎症反应；给予化合物A后小鼠的白细胞，中性粒细胞和单核细胞，比LPS模型组有显著性下降，同时接近正常水平。表明化合物A对脓毒症或SIRS导致的免疫功能紊乱有明显的调节作用，并使其恢复正常。本发明公开的另一实施中，结构式(I)中的化合物B也具有和化合物A相似的效果。以上公开内容是以往未被报道的，也不是业内人士可以预测和推知的，应被视为具备新颖性和创造性。

另一方面，本研究还公开了，令人意外的发现：在上述LPS诱发脓毒症的小鼠，给予皮质激素地塞米松后，白细胞，中性粒细胞和单核细胞与脓毒症小鼠相比反而进一步增加。表明免疫功能紊乱不仅没有恢复正常，反而加重了免疫功能的失调。此外，脾脏是调节免疫抗体的重要器官，它生成的各类免疫球蛋白对于机体对抗病原至关重要，LPS感染后脾脏/体重比例明显增加。然而使用激素治疗后，该比例明显减少。且低于正常对照水平。体重机体对抗病原的能力有所降低。上述公开结果可以解释临床脓毒症使用皮质激素往往失败的原因。本发明第一次公开了，使用化合物A治疗脓毒症可以避免临床使用皮质激素治疗脓毒症的毒副作用。本发明公开的另一实施中，结构式(I)中的化合物B也具有和化合物A相似的效果。以上公开内容是以往未被报道的，也不是业内人士可以预测和推知的，应被视为具备新颖性和创造性。

病原感染导致的细胞因子在机体系统性的大量产生(细胞因子风暴)是脓毒症发生和发展的重要原因。本发明公开的实验中，在腹腔注射LPS 6h后，检测小鼠血浆中TNF-α(A)、IL-1β(B)和IL-6(C)含量较正常组显著性增加(P﹤0.01)，给予不同剂量的化合物A后血浆中的TNF-α、IL-1β和IL-6显著性减少，并与给药剂量明显相关。现有文献报道了化合物A可以抑制缺血损伤时上述炎症因子的增加。本发明首次公开了化合物A对可以抑制病原感染脓毒症导致的细胞因子的增加。缺血和病原感染脓毒症病因和病理机制完全不同。本发明公开的另一实验中结构式(I)中的化合物B也具有和化合物A相似的功效。本发明公开的上述内容不是业内人士可以预测和推知的，应被视为具备新颖性和创造性。

脓毒症发展的结果之一，多器官的功能衰竭。其中肺脏通常是最易和首先受累的器官。本发明实验中公开了，感染诱发脓毒症动物，出现急性肺功能抑制综合征或急性功能衰竭，表现为肺部的炎症浸润，肺功能的下降和血氧饱和度明显降低，气道反应性增加，从HE组织病理染色可以看出脓毒症动物的支气管出现炎性细胞浸润，管腔缩小，肺泡内可见弥漫性慢性炎细胞浸润，肺泡实变，肺泡间隔有明显充血。给予化合物A后，脓毒症动物肺部炎症显著减轻，肺组织结构基本正常，肺功能明显恢复，血氧饱和度显著上升，气道反应性恢复正常。本发明首次公开了化合物A在治疗脓毒症出现的肺损伤，急性肺功能下降和急性肺功能衰竭的显著疗效，此前从无相关报道。本发明还公开了结构式(I)中的化合物B也具有和上述化合物A的相似结果。现有文献报道了化合物A和化合物B在治疗主动脉高压或博来霉素导致的肺损伤和肺功能下降的保护作用。本发明首次报道了化合物A在治疗病原感染造成的脓毒症或急性系统性炎症反应综合症(SIRS)导致的肺损伤和肺功能下降和衰竭的显著作用。博来霉素或主动脉高压在病因学上与病原感染以及和SIRS有着根本的区别，其发病病理机制也不尽相同。因此，业内人士不可能通过现有文献推知化合物A可以保护脓毒症或SIRS导致的肺损伤和肺功能下降和衰竭。本发明应被视为具有新颖性和创造性。

本发明还公开了化合物A在治疗脓毒症导致的心功能减低和心脏衰竭和心律紊乱中的作用。在脓毒症动物，心收缩力减弱，心室壁变薄，室腔扩大，每搏量和心输下降，心室扩大，心律不齐、最终出现心力衰竭，从HE组织病理染色可以看出脓毒症动物的心肌染色表现出炎性细胞的浸润，部分细胞可见空泡状变性，肌原纤维肿胀，排列稀疏。而给予化合物A上述症状得到改善，心律正常、心脏功能明显恢复；炎性细胞浸润减少，心肌纤维组织结构基本正常。此外，在感染导致的脓毒症动物，血浆中心肌损伤指标：血浆中的乳酸脱氢酶(LDH)活性和肌酸激酶(CK)活性显著上升，给予化合物A后血浆上述酶活性性显著下降，接近正常水平，提示化合物A对脓毒症心脏的明显保护作用。

超氧化物(ROS)是造成组织损伤的重要化学介质。本发明在另一实验中还公开了，在脓毒症心脏组织中超氧化物含量较之于正常心脏有数倍的增加，给予化合物A后预后，心脏组织中的超氧化物显著降低，并接近于正常心脏组织。此外，巨噬细胞在介导免疫炎症反应中发挥重大作用。本发明还公开了脓毒症时位于心脏组织的巨噬细胞M1和M2明显增加，巨噬细胞M1生物标记物(IL-1β、MCP-1和CD11c)和M2巨噬细胞生物标记物(Ym1和CD206)水平显著高于正常组织。给予化合物A后上述M1和M2巨噬细胞的生物标记物以及巨噬细胞数量均显著下降。化合物A可以通过抑制M1和M2型巨噬细胞，调节巨噬细胞导致的心脏组织的炎症反应。

本发明公开了化合物A可以通过抑制组织细胞超氧化物(ROS)的产生和抑制心脏组织中的巨噬细胞数量和活化治疗脓毒症导致的心脏损伤和心力衰竭。现有文献报道了化合物A在治疗缺血或主动脉高压导致的心肌损伤和心功能衰竭的作用。本发明首次报道了化合物A在治疗病原感染造成的脓毒症或急性系统性炎症反应综合症(SIRS)导致的心脏损伤和心力衰竭的显著作用。缺血或主动脉高压在病因学上与病原感染以及和SIRS有着根本的区别，其发病病理机制也不尽相同。因此，业内人士不可能通过现有文献推知化合物A可以保护脓毒症或SIRS导致的心肌损伤和心功能衰竭。本发明应被视为具有新颖性和创造性。本发明公开的另一实施中，结构式(I)中的化合物B也具有和化合物A相似的效果。以上公开内容是以往未被报道的，也不是业内人士可以预测和推知的，应被视为具备新颖性和创造性。

本发明公开了化合物A在治疗脓毒症时出现肾功能损伤和衰竭的作用。血浆中肌酐(CREA)和尿素氮(BUN)主要通过肾脏清除，因此血浆肌酐(CREA)和尿素氮(BUN)浓度变化可以反映肾脏功能。在脓毒症动物，血浆肌酐(CREA)和尿素氮(BUN)浓度几乎成倍增加，肾脏功能显著下降，最终衰竭。从HE组织病理染色可以看出脓毒症动物的肾小球体积增大，肾间质可见炎性细胞浸润，肾小管广泛扩张，上皮细胞出现水肿，可见空泡样变性。给予化合物A后，脓毒症动物的血浆肌酐(CREA)和尿素氮(BUN)浓度显著降低，几乎恢复至正常水平；肾小球和肾小管出现部分病变，且病变较模型组轻。表明肾脏功能显著改善。但给予皮质激素后，脓毒症动物肌酐(CREA)变化不显著。与皮质激素相比，化合物A对脓毒症的动物肾脏功能有更好的保护作用。本发明首次公开了化合物A在保护病原感染导致的脓毒症或SIRS所引起的肾脏功能衰竭的治疗作用。本发明公开的另一实施中，结构式(I)中的化合物B也具有和化合物A相似的效果。以上公开内容是以往未被报道的，也不是业内人士可以预测和推知的，应被视为具备新颖性和创造性。

本发明公开了化合物A在治疗脓毒症时出现肝脏能损伤的作用。肝脏功能的损伤通常表现为血浆中来自肝脏的谷丙转氨酶和谷草转氨酶增加。在脓毒症动物，谷丙转氨酶和谷草转氨酶显著上升，提示肝脏损伤；从HE组织病理染色可以看出脓毒症动物的中央经脉肝细胞肿胀变性，多处坏死，大量炎细胞浸润。给予化合物A后，上述转氨酶明显下降，炎性细胞浸润减少，恢复接近正常。本发明首次公开了化合物A在保护病原感染导致的脓毒症或SIRS所引起的肝脏功能衰竭的治疗作用。本发明公开的另一实施中，结构式(I)中的化合物B也具有和化合物A相似的效果。以上公开内容是以往未被报道的，也不是业内人士可以预测和推知的，应被视为具备新颖性和创造性。

本发明公开本发明公开了化合物A在预防和治疗脓毒症痊愈后，受累器官出现纤维化的作用。在发生脓毒症后存活的动物，肺、心、肝、肾均出现明显的纤维化和胶原沉积，而在化合物A治疗的脓毒症动物，上述纤维化则明显减少。现有文献报道了化合物A在治疗高主动脉压或缺血导致的心肌或肺组织纤维化或重构。但高主动脉压或缺血的病因及病理机制与脓毒症或SIRS完全不同。本发明首次公开了化合物A在保护病原感染导致的脓毒症或SIRS所引起的器官，包括肺、心、肝肾等出现纤维化和重构脏的治疗作用。本发明公开的另一实施中，结构式(I)中的化合物B也具有和化合物A相似的效果。以上公开内容是以往未被报道的，也不是业内人士可以预测和推知的，应被视为具备新颖性和创造性。

在脓毒症的发生和发展过程中，巨噬细胞的激活是关键步骤。本发明公开了化合物A在抑制和调控脓毒症中巨噬细胞的激活和极化的作用。公开了化合物A通过调节巨噬细胞的激活和极化实现对脓毒症的缓解和治疗作用。M1型巨噬细胞是经典激活状态的通常以巨噬细胞，LPS和或IFN-γ激活巨噬细胞，激活后会释放TNF-α，IL-6等促炎因子以及NO、ROS等，在发挥杀灭病原菌作用的同时，诱发炎症因子产生，引发脓毒性休克，这是脓毒症早期死亡的主要因素。而M2型常见于IL-4和或IL-13刺激产生，其分泌IL-10，高表达CD206，Yml，Fizzl，ARG1等。M2型巨噬细胞的极化参与了很多疾病的发生发展，许多慢性炎症性疾病，其整个过程都有M1/M2细胞的参与。本发明公开了在LPS诱导的脓毒症，化合物A能够显著的抑制小鼠腹腔M1型和M2型巨噬细胞，从而降低早期促炎性细胞因子的分泌。

线粒体是维持机体正常生理所需的动态细胞器。病原相关分子(PAMP)如LPS可以导致线粒体损伤，生成过量的ROS，同时线粒体膜通透性增加、膜电位下降，大量的细胞色素C释放。进一步加重了细胞损伤和炎症反应。本发明公开了在脓毒症时给予化合物A可以显著保护线粒体、提高线粒体膜电位，减少细胞色素C释放；增加线粒体的数量，减少了细胞内NO等超氧化物的产生，从而达到抑制炎性因子TNF-α和IL-1β。本发明还公开了活化物A通过恢复线粒体功能起到对脓毒症的治疗保护作用。

本发明公开了化合物A通过抑制HIF-1α表达发挥其抑制和调节巨噬细胞的作用。LPS诱发脓毒症导致HIF-1α表达增加，给予化合物A后，HIF-1α的表达明显减少。我们用DMOG，一种HIF-1α脯氨酰羟化酶的竞争性抑制剂，抑制HIF-1α的表达后，化合物A对巨噬细胞的代谢调节作用则消失。本发明公开的另一实施中，结构式(I)中的化合物B也具有和化合物A相似的效果。以上公开关于的结构式(I)中的化合物对巨噬细胞的调节作用以及它作为结构式(I)中化合物的抗脓毒症的主要机制的内容是以往未被报道的，也不是业内人士可以预测和推知的，应被视为具备新颖性和创造性。

附图说明

图1是本发明实施例1中腹腔注射不同剂量LPS后，各组小鼠的生存曲线

图2是本发明实施例2中不同剂量的化合物A腹腔注射对LPS脓毒症Balb/C小鼠死亡率的影响

图3是本发明实施例4中化合物A对LPS诱导的小鼠心功能影响。

图4是本发明实施例5中化合物A对LPS诱导的心功能障碍小鼠血浆CK和LDH的影响。

图5是本发明实施例6中全身体积描记法考察化合物A干预后对肺功能的影响(Penh、EF50、TV)。

图6是本发明实施例7中化合物A对LPS诱导的肝功能紊乱的影响

图7是本发明实施例8中化合物A对LPS诱导的肾功能紊乱的影响

图8是本发明实施例9中化合物A对LPS诱导的小鼠原代腹腔巨噬细胞M1和M2的影响。实施例

在以下实施例中详细提供了本发明的方法和实施方式。

具体实施方式

为了进一步说明用于实现本发明目的的技术，下文描述了关于确定和鉴定本发明中化合物的药物和治疗用途的详细方法，技术，流程和特点。案例提供了用于支持及验证本发明所使用的动物模型的实验方法和结果。涉及的案例均使用了适当的对照组实验及统计分析方法。以下的案例均用于描述而非限制本发明的应用。这些案例所涉及的方法及技术可用于筛选及确定此类化合物制剂的治疗效果。其他此类化合物制剂的治疗效果评价可使用相同的方法。

本发明中列举的案例用于支持本发明的实验方法和结果，并验证本发明中使用的动物模型。本发明的所有实验均采用了适当的对照和统计检验。提供以下实施例来说明而非限制本发明。这些例子说明了用于筛选和确定结构式(I)中某些具有特定药理活性的贝壳杉烷化合物的方法和技术。也可以用相同的方法测定结构式(I)的其他化合物的治疗用途。

实验材料

实验动物：成年雄性Balb/c小鼠，体重20g±5g，6-8周龄。饲养环境包括恒定的温度、湿度以及严格的黑暗光照周期，自由采食。

化学试剂：化合物A(ent-17-norkaurane-16-oxo-18-oic acid，分子式，C₂₀H₄₀O₃，分子量：318.5)是由甜菊糖通过酸性水解、结晶纯化而得到。化合物A的钠盐可以通过加入NaOH或其他含钠碱获得；用高效液相色谱法测得化合物A的钠盐的纯度大于99％。受试化合物的给药方式：静脉注射或腹腔注射或口服。剂量：化合物A(或其钠盐)，5mg/kg至60mg/kg。

统计分析

依次通过方差分析(单因素方差分析)，Fisher检验比较多组间的差异。所有检验的p值均为双尾，以p<0.05被认为是具有统计学差异。

实施例1

本案例建立小鼠腹腔内注射LPS脓毒症模型。

将48只Balb/c小鼠(6-8周，♂)随机分成6组，分别为正常组，10mg/kg LPS组，15mg/kg LPS组，20mg/kg LPS组，25mg/kg LPS组和30mg/kg LPS组，每组8只小鼠。小鼠腹腔内注射内LPS建立小鼠脓毒症模型，分别给予不同剂量的LPS，正常对照组给予相同体积的0.9％生理盐水，观察小鼠的生存率变化。

本研究中选取了10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg五种不同剂量进行研究。图1中10mg/kg属于半数致死量，20-30mg/kg属于致死量。为了探讨化合物A对脓毒症小鼠的生存率的影响，我们选择20mg/kg的LPS急性模型。后续试验我们选择了腹腔注射20mg/kg LPS、6h作为小鼠脓毒症模型的致死剂量和造模时间。

实施例2

本案例主要观察不同剂量的化合物A腹腔注射对LPS脓毒症Balb/C小鼠死亡率的影响。

观察不同剂量化合物A腹腔注射对LPS诱导脓毒症小鼠死亡率的影响

将小鼠随机分成6组:

(1)对照组：腹腔注射生理盐水(药物溶剂)(0.1ml/l0g)1次/d，连续3d，第3d腹腔注射1h后，腹腔注射生理盐水(0.2ml/10g)；

(2)药物溶剂加LPS组：腹腔注射药物溶剂(0.1ml/10g)，l次/d，连续3d，第3d腹腔注射lh后，腹腔注射LPS(20mg/kg，0.1ml/10g)；

(3)化合物A(5mg/kg)+LPS组：腹腔注射化合物A(5mg/kg，0.lml/10g)，l次/d，连续3d，第3d腹腔注射lh后，腹腔注射LPS(20mg/kg，0.1ml/10g)；

(4)化合物A(10mg/kg)+LPS组：腹腔注射化合物A(10mg/kg，0.1ml/10g)，l次/d，连续3d，第3d腹腔注射lh后，腹腔注射LPS(20mg/kg，0.1ml/10g)；

(5)化合物A(20mg/kg)+LPS组：腹腔注射化合物A(20mg/kg，0.1ml/10g)，l次/d，连续3d，第3d腹腔注射lh后，腹腔注射LPS(20mg/kg，0.1ml/10g)；

(6)化合物A(60mg/kg)+LPS组：腹腔注射化合物A(60mg/kg，0.1ml/10g)，l次/d，连续3d，第3d腹腔注射lh后，腹腔注射LPS(20mg/kg，0.1ml/10g)；

腹腔注射LPS后，每12h观察一次各组小鼠生存情况，连续观察6d。

如图2所示，腹腔注射20mg/kgLPS后小鼠的在24h内全部死亡，腹腔注射LPS后6h，5mg/kg化合物A组小鼠全部死亡，与LPS组无显著性差异(p>0.05)，而10mg/kg和20mg/kg的化合物A对小鼠的生存率现在提高，分别为52％和67％，两组与正常组比有显著性差异(p<0.01)，正常组各个时间段均无出现小鼠死亡。通过文献查阅，成人服用剂量5mg/kg是可接受的安全剂量，最大血药浓度达到20μM，相当于小鼠45mg/kg，后续的实验我们选择10mg/kg的化合物A作为研究剂量。

实施例3

本案例主要观察各组实验小鼠的一般行为观察。

用肉眼观察小鼠毛色，意识，肢体活动，饮食等，腹腔注射LPS致炎6h后对小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行称重。

空白组10只小鼠腹腔注射生理盐水后，行为，精神，进食和毛色等都没有明显异常；其余5组小鼠腹腔注射LPS后，逐渐出现乏力，倦怠，食欲降低，怕寒和反应迟钝的现象。

实施例4

本案例主要说明了化合物A在改善脓毒症心功能障碍中的作用。

每组小鼠腹腔注射LPS 6h后，称重麻醉，利用Vevo2100高分辨小动物超声系统检测小鼠心功能。用脱毛膏将小鼠胸部脱毛，并将心率控制在400-500次/分左右。小鼠仰卧放置，固定在恒温加热板上，四肢用胶带固定在四个金属极上，将超声探头放置在小鼠左胸区，并通过2D超声获取胸骨旁左心室短轴，应用M超声在乳头肌水平记录左心室运动情况，测量心率(HR)、左心室收缩期内径(LVID：FS)、左心室舒张期內径(LVID：d)、左心室收缩期内径(LVID：FS)、左心室舒张期内径(LVID：Fd)和左心室舒张期前臂厚度(LVPWF：FdF)。采用Vevo2100小动物超声系统软件对获取的图像上进行数据处理和分析。

小鼠血浆心肌损伤指标(LDH和CK)的测定

射血分数(Ejection Fractions，EF)，是指心每搏输出量占心室舒张末期容积百分比，这是心肌收缩能力指标。如图3A所示，超声心动图结果显示，LPS模型组心脏的射血分数显著低于正常组小鼠(p<0.01)，表明腹腔注射LPS导致小鼠心脏的收缩能力下降，心功能降低。而化合物A干预给药后，EF较LPS模型组的小鼠显著提高(p<0.05)，而地塞米松效果不显著。左室短轴缩短率(缩短分数，fractional shortening，FS)，是指心室收缩末期的内径与心室舒张末期的内径之比，也反应心脏收缩功能(FS＝(左室舒张末期内径(LVDd)-左室收缩末期内径(LVDs))/左心室舒张末期内径×100％)。如图3B所示，LPS模型组小鼠的FS显著低于正常组小鼠(p<0.01)，而化合物A组的FS较LPS模型组组小鼠明显升高(p<0.05)，说明LPS组小鼠心脏收缩功能下降，而Dex组并不显著。

综上所述，腹腔注射LPS会使小鼠左室射血分数和缩短分数下降，发生一定程度的心功能障碍，而化合物A干预后，心功能情况得到改善，可改善LPS引起的心功能障碍。

实施例5

本案例主要说明了化合物A在改善脓毒症心功能障碍中的作用。

血清测定心脏损伤指标乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)等检测步骤南京建成生物科技有限公司提供的说明书进行测定。

血浆中的乳酸脱氢酶(LDH)活性(如图4)LDH是人体能量代谢中的重要糖酵解酶。当发生如病毒性、风湿性心肌炎症等等心肌损伤时，血浆LDH水平升高，因此可作为诊断心肌损伤的有效指标。如图4A所示，LPS模型组小鼠血浆LDH水平较正常组LDH水平升高相比，差异极显著(p<0.01)。经化合物A和Dex干预后，与LPS模型组相比较，血浆中LDH水平均出现了下降趋势，与LPS模型组相比具有统计学意义(p<0.01)。以上结果表明化合物A和Dex对LPS引起的小鼠心肌损伤具有改善效果。

血浆中的肌酸激酶(CK)活性(如图4B)：正常情况下，心肌组织CK存在于心肌细胞中，当血液中CK水平升高时，通常表面或正在发生心肌损伤。如图4B，LPS模型组小鼠血浆CK水平与对照组相比现在升高，具有显著差异(p<0.01)。经化合物A和Dex干预后，与LPS组相比较，血清CK水平均出现了明显的下降，结果具有统计学意义(p<0.01)，说明化合物A和Dex可在一定程度上减轻LPS引起的小鼠心肌损伤，达到治疗效果。

实施例6

本案例说明了化合物A在改善脓毒症肺功能损伤的影响。

于6h测量每组小鼠肺功能。将小鼠置于全身体积描记仪(BUXCO，美国)的封闭的箱内，并且将体描箱与连接到箱外的感应器。当动物呼吸时，胸部的起伏改变了体描箱内容积，压力传感器器和放大器将这种体积变化转换为电信号，在计算机处理后，呼吸曲线显示于计算机屏幕上，经相关软件处理图形，可算出潮气量(tidal volume，TV)、50％潮气量时的呼气流量(50％tidal volume expiratory flow，EF50)、气道反应性(Penh)等。

本实验中，我们使用Buxco的肺功能检测系统，通过全身体积描计法测量和记录了每组小鼠的50％潮气呼气量和潮气量、气道反应性的变化，以评估肺功能。这种评估方法在非侵入性条件下实时检测和分析小鼠的肺功能指标。Penh是与气道阻力和胸膜内压相关的肺功能参数，采用Penh作为评价气道反应的指标。从图5可知，造模6h后，LPS模型组的Penh较正常组显著升高(p<0.01)，EF50和TV值较正常组显著降低(p<0.01)，表明LPS诱导肺损伤模型发生了较明显的气道高反应性，而化合物A和Dex干预后，penh较LPS模型组明显降低(p<0.05)，而EF50和TV较LPS模型组显著升高(p<0.01)，说明化合物A可以改善LPS诱导的肺损伤。

实施例7

这个例子说明化合物A在脓毒症引起肝功能损伤的作用。

取备好的各组血浆，采用酶标仪，测定血浆中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和超氧化物歧化酶(SOD)行操作。将各血浆分别与相应试剂混合，摇匀，反应，空白管校正，酶标仪上读取OD值。

为了观察化合物A对LPS诱导的小鼠全身炎症反应的肝功能的影响，我们分别检测了小鼠血浆ALT、ALT和SOD的变化情况。结果显示如图6所示，与正常相比，化合物A和Dex干预给药后，小鼠血浆的ALT、ALT和SOD明显变化下降(p<0.01)。说明化合物A对LPS诱导小鼠肝功能的紊乱有改善作用。

实施例8

这个例子阐明化合物A改善脓毒症肾功能损伤的影响。

取备好的各组血浆，采用酶标仪，测定血浆中尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)的水平。按照试剂盒使用说明书进行操作。将各血浆分别与相应试剂混合，摇匀，反应，空白管校正，酶标仪上读取OD值。

为了观察化合物A对LPS诱导的小鼠全身炎症反应的肾功能的影响，我们分别检测了小鼠血浆BUN和Crea的变化情况。结果显示如图7显示，与正常相比，化合物A和Dex干预给药后，小鼠血浆的BUN明显变化下降(p<0.01)，但Dex干预后血浆中的Crea变化不显著。说明化合物A对LPS诱导小鼠肾功能的紊乱有改善作用。

实施例9

这个例子说明化合物A对巨噬细胞极化的影响。

(1)实验动物分组：40只6-8周龄Balb/c雄性小鼠适应性喂养一周后，随机分成4组，各组10只，分别为正常组、LPS模型组、化合物A组和地塞米松组。模型组、化合物A组和地塞米松组给予LPS 20mg/kg腹腔注射，6小时后造成脓毒症模型。

(2)原代腹腔巨噬细胞的提取：6h后，引颈处死小鼠，提取原代腹腔巨噬细胞。

(3)流式检测M1型和M2型巨噬细胞：用MACS对巨噬细胞冰上阻断20min后，1000rpm，4℃离心5min，弃上清，细胞悬液中加入0.2μl的PE-抗小鼠的F4/80抗体和BV421-抗CD11c抗体，冰上避光孵育30min后，PBS洗一次，用50μl固定液冰上固定10min，50μl的1x破膜液破膜，1000rpm，4℃离心5min，再加100μl1x破膜液破膜，离心，加入0.2μl的FITC-抗小鼠CD206抗体冰上避光孵育30min后，加100μl破膜液离心后，最后加1ml PBS洗一次，离心，收集沉淀，200μl PBS重悬，FACSCelesta流式细胞仪检测，FlowJo 7.6.1软件分析M1型(F4/80⁺CD11c⁺CD206^-)和M2型(F4/80⁺CD11c^-CD206⁺)。

在体内，采用小鼠腹腔巨噬细胞作为研究对象，给予化合物A预防给药三天后，腹腔注射20mg/kg LPS进行刺激，6h后引颈处死小鼠收集原代腹腔巨噬细胞进行流式分析后发现，如图8所示，和LPS模型组比较，化合物A、阳性药物组地塞米松干预后M1型和M2型腹腔巨噬细胞都显著减少，说明化合物A在M1和M2巨噬细胞的失衡起到调节作用，维持体内巨噬细胞的平衡。

此外，用seahorseXF96细胞外流量分析仪测定巨噬细胞的糖酵解变化(ECAR值)。给予LPS诱导后细胞的ECAR与对照相比显著增加，而同时给予化合物A后ECAR显著下降，(p<0.01)，恢复接近对照水平。化合物A可以抑制LPS诱导的增强的巨噬细胞糖酵解和糖酵解能力，从而调控巨噬细胞的能量代谢方式和水平。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的技术原理的前提下，还可以作出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (18)

1.一种使用贝壳杉烷化合物及其药学上可接受的盐在制备用于预防和治疗脓毒症或系统性炎症反应综合征及其导致的多器官损伤或衰竭的药物制剂中的应用。

2.根据权利要求1中的方法所述的脓毒症，其特征在于诱发脓毒症的病原是细菌、病毒或真菌以及与上述病原相关的病原相关分子模式(PAMPs)包括，LPS，脂蛋白、糖蛋白、脂肽、核酸等。

3.根据权利要求1中所述的系统性炎症反应综合征，其特征在于该综合征为非病原感染原因所引起，包括创伤、烧伤、心梗和心衰、脑梗、炎症性肠病等。

4.根据权利要求1中所述脓毒症或系统性炎症反应综合征，其特征在于出现全身性的细胞因子的大量产生或细胞因子风暴。

5.根据权利要求1中所述的多器官损伤或衰竭，为肺损伤或衰竭、心脏损伤或衰竭、肝损伤或衰竭、肾损伤或衰竭或脾损伤，损伤或衰竭发生在一种或同时合并几种器官。

6.根据权利要求5中的所述的肺损伤或衰竭，其特征为急性肺功能抑制或急性肺功能衰竭。

7.根据权利要求5中的所述的心脏损伤或衰竭，其特征为心脏功能不全或或心力衰竭和心律紊乱。

8.根据权利要求1中所述的多器官损伤，其特征在于因脓毒症造成的器官纤维化及重构。

9.根据权利要求1中所述的预防和治疗，其特征为其预防和治疗的作用机制涉及抑制细胞因子的产生或抑制细胞因子风暴。细胞因子包括TNF-α、IL-1β和IL-6等。

10.根据权利要求1中所述的预防和治疗，其特征为其作用机制涉及抑制和调节巨噬细胞的激活和增殖。

11.根据权利要求1中所述的预防和治疗，其特征为其作用机制涉及抑制炎症细胞包括白细胞、中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的激活和增殖。

12.根据权利要求1中的方法所述的化合物是结构式(I)所代表的化合物。

结构式(I)的化合物可能有一个或多个不对称中心，也有可能以不同的立体异构体存在。

其中

ii.R1:氢、羟基或烷氧基。

iii.R2：羧基、羧酸盐、酰卤、醛基、羟甲基，和可以生成羧基的酯基、丙烯酰胺基、酰基或醚键基团。

iv.R3、R4、R5、R6、R8：氧、羟基、羟甲基和能水解生成羟甲基的酯基或烷氧甲基。

v.R7：甲基、羟基，和能水解生成羟甲基的酯基或烷氧甲基。

vi.R9：亚甲基或氧。

13.根据权利要求12中的方法所述的化合物,其特征在于其中所述的结构式(I)化合物为结构式(II)所示的化合物。所述化合物可能具有多个不对称中心，并存在不同的立体异构体或非对映异构体。位置8和13的绝对构型为(8R，13S)或(8S，13R)。

其中

vii.R2：羧基、羧酸盐、醛基、羟甲基、甲基酯、酰甲基、酰卤。

viii.R7：甲基，羟甲基或甲基醚。

ix.R9：亚甲基或氧。

14.根据权利要求12中所述的化合物，其特征在于其中所述的结构式(I)化合物为结构式A所示的化合物。

15.根据权利要求12中所述的化合物，其特征在于其中所述的结构式(I)化合物为结构式B所示的化合物。

16.根据权利要求1中所述的药物制剂包括：片剂、胶囊剂、颗粒剂、栓剂、软膏剂、贴剂、水针剂以及经口服、非肠道途径或植入的缓控释剂。

17.根据权利要求1中所述的药物制剂，其特征在于经肺或经鼻的吸入雾化剂、定量气雾剂或干粉吸入剂。

18.根据权利要求1中的方法所述药物制剂，其特征在于使用药用标准的液体注射剂或输液剂或其它合适剂型，通过肌肉、静脉、腹腔、介入导管和呼吸机等方法递送到需要的病人。

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