CN112782301A - 药物中基因毒性杂质亚硝酸盐含量的准确定量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及亚硝酸盐测试技术领域，更具体地，本发明涉及药物中基因毒性杂质亚硝酸盐含量的准确定量测定方法。包括：标准曲线绘制，亚硝酸盐含量测定。申请人通过在顶空的参数中，使得衍生剂在无机酸的作用下和亚硝酸发生重氮化反应，使得亚硝酸盐反应生成重氮化合物，作为衍生产物，并通过气相色谱‑质谱的方式进行检测，具有高的检测灵敏度和准确性；通过控制样品制备过程中的无机酸和衍生剂的添加量，在顶空的参数反应时，可避免甲硝唑药物的分解和重氮衍生产物在无机酸的作用下重新回到脂肪胺的反应，从而具有高的准确度和回收率，且本发明的测定的具有好的可重复性和样品溶液稳定性，可用于亚硝酸盐的准确定量测定。

Description

药物中基因毒性杂质亚硝酸盐含量的准确定量测定方法

技术领域

本发明涉及亚硝酸盐测试技术领域，更具体地，本发明涉及药物中基因毒性杂质亚硝酸盐含量的准确定量测定方法。

背景技术

甲硝唑，是一种抗生素和抗原虫剂。主要用于治疗或预防厌氧菌引起的系统或局部感染，如腹腔、消化道、女性生殖系、下呼吸道、皮肤及软组织、骨和关节等部位的厌氧菌感染，对败血症、心内膜炎、脑膜感染以及使用抗生素引起的结肠炎也有效。治疗破伤风常与破伤风抗毒素(TAT)联用。还可用于口腔厌氧菌感染。

甲硝唑注射液中可能含有微量亚硝酸盐降解产物亚硝酸盐，其中亚硝酸盐是一种剧毒物质，故为了保证安全，一般规定在0.5％甲硝唑注射液中含亚硝酸根的最高限量确定为不超过20μg/mL，故需要建立对甲硝唑中亚硝酸盐含量的准确定量的测试方法。

目前虽然有一些亚硝酸盐的测试方法，如采用离子色谱等，但是一般是用于水体系中亚硝酸盐的检测，且离子色谱的测试方法是通过电导检测亚硝酸银离子的浓度，但容易受到氯离子等的影响，造成假阳性结果。而目前也有采用气相色谱-质谱的方法，如CN108008033A，但是适用于水体的检测，且在测定甲硝唑中亚硝酸盐的检测时，因为可能存在的甲硝唑的分解以及在检测过程中使用的目标产物，如重氮的稳定性较差，对甲硝唑中亚硝酸盐的测定产生不利影响，从而较难获得较好准确度、重复性、稳定性等的亚硝酸盐测定结果。

发明内容

为了解决上述问题，本发明第一个方面提供了一种亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，包括：

标准曲线绘制：取亚硝酸盐-水混合物，加入无机酸和衍生剂，配置得到不同亚硝酸盐质量浓度的标准溶液，通过顶空-气相色谱-质谱仪进行测试，得到标准溶液中衍生产物质谱信号峰面积和亚硝酸盐质量浓度的标准曲线；

亚硝酸盐含量测定：将药品加入水后，加入无机酸和衍生剂，混合后，得到样品溶液，放入顶空-气相色谱-质谱仪进行测试，测得样品溶液中衍生产物质谱信号峰面积，并根据标准曲线得到样品溶液中亚硝酸盐的质量浓度。

作为本发明一种优选的技术方案，所述无机酸选自盐酸、硫酸、过氯酸、氟硼酸中的一种或多种。

作为本发明一种优选的技术方案，所述衍生剂为胺的水溶液。

作为本发明一种优选的技术方案，所述胺选自环己基氨基磺酸钠、2,3-二氨基萘、2,4-二硝基苯胺、3-氨基-N-苯基苯磺酰胺、2-硝基-4-氯苯胺中的一种或多种。

作为本发明一种优选的技术方案，所述无机酸和衍生剂的物质的量比为(100～10)：1。

作为本发明一种优选的技术方案，所述标准曲线绘制中，衍生剂和亚硝酸盐的物质的量比为(500～10)：1。

作为本发明一种优选的技术方案，所述顶空的加热箱温度为45～55℃。

作为本发明一种优选的技术方案，所述顶空的加热平衡时间为25～40min。

作为本发明一种优选的技术方案，所述气相色谱的色谱柱：DB-WAX UI，30m×0.25mm×0.25μm。

本发明第二个方面提供了一种所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，用于药物中基因毒性杂质亚硝酸盐的测试。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：本发明提供一种亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，可用于甲硝唑药物中亚硝酸盐的测定，其中申请人通过在顶空的参数中，使得衍生剂在无机酸的作用下和亚硝酸发生重氮化反应，使得亚硝酸盐反应生成亚硝酸酯，作为衍生产物，并通过气相色谱-质谱的方式进行检测，具有高的检测灵敏度和准确性；且申请人发现，通过控制样品制备过程中的无机酸和衍生剂的添加量，在顶空的参数下重氮反应时，可避免甲硝唑药物的分解，从而具有高的准确度和回收率，且本发明的测定的具有好的可重复性和样品溶液稳定性，可用于亚硝酸盐的准确定量测定。

附图说明

图1为试剂空白溶液的色谱图。

图2为标准曲线溶液(L-3)的色谱图。

图3为定量限加标溶液的色谱图。

图4为实施例1提供的样品溶液的色谱图。

具体实施方式

参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。

说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。

此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。

以下通过具体实施方式说明本发明，但不局限于以下给出的具体实施例。

本发明第一个方面提供了一种亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，包括：

标准曲线绘制：取亚硝酸盐-水混合物，加入无机酸和衍生剂，配置得到不同亚硝酸盐质量浓度的标准溶液，通过顶空-气相色谱-质谱仪进行测试，得到标准溶液中衍生产物质谱信号峰面积和亚硝酸盐质量浓度的标准曲线；

亚硝酸盐含量测定：将药品加入水后，加入无机酸和衍生剂，混合后，得到样品溶液，放入顶空-气相色谱-质谱仪进行测试，测得样品溶液中衍生产物质谱信号峰面积，并根据标准曲线得到样品溶液中亚硝酸盐的质量浓度。

为了使亚硝酸盐可以在气相色谱-质谱中出峰，申请人通过采用亚硝酸盐和脂肪族胺反应，生成重氮化的衍生产物，如亚硝酸盐和环己基氨基磺酸钠生成亚硝酸环己酯作为衍生产物，申请人通过测定衍生产物的峰，可绘制和亚硝酸盐浓度的标准曲线，本发明在绘制标准曲线时，不对标准溶液的浓度做具体限定，可列举的有，1.5μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL、10μg/mL。

优选地，本发明所述无机酸选自盐酸、硫酸、过氯酸、氟硼酸中的一种或多种，优选的为，盐酸、硫酸。

进一步优选地，本发明所述胺选自环己基氨基磺酸钠、2,3-二氨基萘、2,4-二硝基苯胺、3-氨基-N-苯基苯磺酰胺、2-硝基-4-氯苯胺中的一种或多种，优选的为，环己基氨基磺酸钠、2,3-二氨基萘。本发明不对衍生剂中胺的重量百分数做具体限定，为本领域熟知的重量百分数，如8～15wt％。

更进一步优选地，本发明所述无机酸和衍生剂的物质的量比为(100～10)：1，可列举的有，100：1、90：1、80：1、70：1、60：1、50：1、40：1、30：1、20：1、10：1。

在一种实施方式中，本发明所述标准曲线绘制中，衍生剂和亚硝酸盐的物质的量比为(500：10)：1，500：1、450：1、400：1、350：1、300：1、250：1、200：1、150：1、100：1、90：1、80：1、70：1、60：1、50：1、40：1、30：1、20：1、10：1。

申请人在进行标准曲线绘制，并测定其线性时，申请人发现，需要选择合适的无机酸和胺，并控制标准曲线中无机酸和衍生剂的添加量，一般情况下，重氮化反应需要控制胺和亚硝酸盐的摩尔比，且酸的含量不宜太多，因为胺一方面和亚硝酸盐发生重氮化反应，一方面也会和酸成铵盐，但是出于避免样品测定中甲硝唑的分解，且因为药品中亚硝酸盐的含量未知，故需采用大量过量的脂肪胺和无机酸，来促进亚硝酸盐的反应，而申请人发现，通过采用盐酸或硫酸等作为无机酸，并采用环己基氨基磺酸钠等作为衍生剂，可促进亚硝酸盐重氮化的反应的同时，减少标准溶液中重氮化衍生反应的分解，从而使得标准曲线具有高的线性。

且申请人发现，衍生剂和酸在标准溶液中的浓度也会对线性产生影响，尤其是申请人意外发现，在本发明的标准溶液中，使用相比于衍生剂大量过量的硫酸、盐酸等无机酸时，在促进重氮化进行的同时也有利于保证衍生产物的稳定，避免重新回到胺的结构，而当硫酸等无机酸的量较少时，重氮化反应会不充分，从而影响线性和准确度和专属性等。

本发明不对亚硝酸盐含量测定中，衍生剂和水的用量做具体限定，如1：(90～110)体积比等，不做具体限定。

此外，申请人发现，通过使用和标准溶液相同的无机酸和衍生剂，制备样品溶液，进行重氮化反应时，也有利于避免甲硝唑的分解，进行测定时具有好的准确性和回收率，且申请人发现，需要控制无机酸不能太多，可能会造成甲硝唑分解，影响测定的准确性和回收率。此外，申请人意外发现，当采用本发明提供的样品溶液时，可放置较长时间不会发生甲硝唑的分解，提高样品溶液的稳定性，而当酸用量不当时，会对稳定性产生影响。

本发明重氮化反应是在顶空中进行的，其中申请人发现，需要控制顶空的加热箱温度为45～55℃，加热平衡时间为25～40min，可以在促进药品中亚硝酸盐完全反应的同时，避免甲硝唑的分解，且申请人意外发现，较低温度和较高温度时，均会对样品溶液的专属性产生影响，这可能是因为较活泼的重氮化衍生试剂和甲硝唑等的副反应造成的。在一种实施方式中，本发明所述顶空的加热箱温度为45～55℃，优选的为，50℃，加热平衡时间为25～40min，优选的为，30min。

更优选地，本发明所述顶空的定量环温度为65～75℃；传输线温度为85～95℃；进样时间为0.3～1min，GC循环时间为10～15min，瓶充模式为Flow to Pressure，瓶充压力为10～20psi，瓶充时间为0.1～0.5min；在一种优选的实施方式中，本发明所述顶空的定量环温度为70℃；传输线温度为90℃，进样时间为0.5min，GC循环时间为13min，瓶充模式为Flowto Pressure，瓶充压力为15psi，瓶充时间为0.2min。

申请人发现，色谱柱的选择对于峰形等有重要影响，当选择HP-5MS UI,30m×0.25mm×0.25μm作为色谱柱时，有拖尾的现象，而当采用DB-WAX UI，30m×0.25mm×0.25μm时，具有好的峰形，在一种实施方式中，本发明所述气相色谱的参数为：色谱柱：DB-WAX UI，30m×0.25mm×0.25μm。

在一种实施方式中，本发明所述气相色谱的参数为：进样口温度：140～160℃；分流比：(15～25):1；传输线温度：180～220℃；柱流速：0.8～1.2mL/min；升温程序：初始温度55～65℃，以(15～25)℃/min升至180～220℃，保持0.5～2min。

优选地，本发明所述气相色谱的参数为：色谱柱：DB-WAX UI，30m×0.25mm×0.25μm；进样口温度：150℃；进样模式：分流；分流比：20:1；载气：He；传输线温度：200℃；柱流速：1mL/min；升温程序：初始温度60℃，以20℃/min升至200℃，保持1min。

当本发明采用环己基氨基磺酸钠作为衍生剂的脂肪胺时，在一种实施方式中，本发明所述质谱的参数为：扫描离子模式：SIM；定量离子：57m/z；定性离子：82、98m/z；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；溶剂延迟：1～3min。优选地，本发明所述质谱的参数为：扫描离子模式：SIM；定量离子：57m/z；定性离子：82、98m/z；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；溶剂延迟：2min。

本发明第二个方面提供一种如上所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，用于药物中基因毒性杂质亚硝酸盐的测试。

实施例

下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

本例提供一种亚硝酸盐含量的测定方法，包括：

标准曲线绘制：取亚硝酸盐-水混合物10.00mL，加入无机酸100.0μL、衍生剂100.0μL，配置得到不同亚硝酸盐质量浓度的标准溶液，通过顶空-气相色谱-质谱仪进行测试，得到标准溶液中衍生产物质谱信号峰面积和亚硝酸盐质量浓度的标准曲线；

亚硝酸盐含量测定：将药品加入水10.00mL后，加入无机酸100.0μL、衍生剂100.0μL，混合后，得到样品溶液，放入顶空-气相色谱-质谱仪进行测试，测得样品溶液中衍生产物质谱信号峰面积，并根据标准曲线得到样品溶液中亚硝酸盐的质量浓度；

所述无机酸为盐酸；

所述衍生剂为9wt％环己基氨基磺酸钠-水溶液；

所述顶空的参数：加热箱温度为45℃，加热平衡时间为35min，定量环温度为68℃，传输线温度为88℃，进样时间为0.5min，GC循环时间为13min，瓶充模式为Flow toPressure，瓶充压力为15psi，瓶充时间为0.2min；

所述气相色谱的参数为：色谱柱：DB-WAX UI，30m×0.25mm×0.25μm；进样口温度：140℃；进样模式：分流；分流比：20:1；载气：He；传输线温度：190℃；柱流速：1mL/min；升温程序：初始温度60℃，以20℃/min升至190℃，保持1min。

所述质谱的参数为：扫描离子模式：SIM；定量离子：57m/z；定性离子：82、98m/z；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；溶剂延迟：2min。

实施例2

本例提供一种亚硝酸盐含量的测定方法，包括：

标准曲线绘制：取亚硝酸盐-水混合物10.00mL，加入无机酸100.0μL、衍生剂100.0μL，配置得到不同亚硝酸盐质量浓度的标准溶液，通过顶空-气相色谱-质谱仪进行测试，得到标准溶液中衍生产物质谱信号峰面积和亚硝酸盐质量浓度的标准曲线；

亚硝酸盐含量测定：将药品加入水10.00mL后，加入无机酸100.0μL、衍生剂100.0μL，混合后，得到样品溶液，放入顶空-气相色谱-质谱仪进行测试，测得样品溶液中衍生产物质谱信号峰面积，并根据标准曲线得到样品溶液中亚硝酸盐的质量浓度；

所述无机酸为硫酸；

所述衍生剂为12wt％环己基氨基磺酸钠-水溶液；

所述顶空的参数：加热箱温度为55℃，加热平衡时间为25min，定量环温度为75℃，传输线温度为95℃，进样时间为0.5min，GC循环时间为13min，瓶充模式为Flow toPressure，瓶充压力为15psi，瓶充时间为0.2min；

所述气相色谱的参数为：色谱柱：DB-WAX UI，30m×0.25mm×0.25μm；进样口温度：160℃；进样模式：分流；分流比：20:1；载气：He；传输线温度：200℃；柱流速：1mL/min；升温程序：初始温度60℃，以20℃/min升至200℃，保持1min。

所述质谱的参数为：扫描离子模式：SIM；定量离子：57m/z；定性离子：82、98m/z；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；溶剂延迟：2min。

实施例3

本例提供一种亚硝酸盐含量的测定方法，包括：

标准曲线绘制：取亚硝酸盐-水混合物10.00mL，加入无机酸100.0μL、衍生剂100.0μL，配置得到不同亚硝酸盐质量浓度的标准溶液，通过顶空-气相色谱-质谱仪进行测试，得到标准溶液中衍生产物质谱信号峰面积和亚硝酸盐质量浓度的标准曲线；

亚硝酸盐含量测定：将药品加入水10.00mL后，加入无机酸100.0μL、衍生剂100.0μL，混合后，得到样品溶液，放入顶空-气相色谱-质谱仪进行测试，测得样品溶液中衍生产物质谱信号峰面积，并根据标准曲线得到样品溶液中亚硝酸盐的质量浓度；

所述无机酸为硫酸；

所述衍生剂为10wt％环己基氨基磺酸钠-水溶液；

所述顶空的参数：加热箱温度为50℃，加热平衡时间为30min，定量环温度为70℃，传输线温度为90℃，进样时间为0.5min，GC循环时间为13min，瓶充模式为Flow toPressure，瓶充压力为15psi，瓶充时间为0.2min；

所述气相色谱的参数为：色谱柱：DB-WAX UI，30m×0.25mm×0.25μm；进样口温度：150℃；进样模式：分流；分流比：20:1；载气：He；传输线温度：200℃；柱流速：1mL/min；升温程序：初始温度60℃，以20℃/min升至200℃，保持1min。

所述质谱的参数为：扫描离子模式：SIM；定量离子：57m/z；定性离子：82、98m/z；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；溶剂延迟：2min。

实施例4

本例提供一种亚硝酸盐含量的测定方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述无机酸为10wt％硫酸-水溶液。

实施例5

本例提供一种亚硝酸盐含量的测定方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述顶空的参数：加热箱温度为40℃，加热平衡时间为50min，定量环温度为70℃，传输线温度为90℃，进样时间为0.5min，GC循环时间为13min，瓶充模式为Flow to Pressure，瓶充压力为15psi，瓶充时间为0.2min。

实施例6

本例提供一种亚硝酸盐含量的测定方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述顶空的参数：加热箱温度为70℃，加热平衡时间为20min，定量环温度为70℃，传输线温度为90℃，进样时间为0.5min，GC循环时间为13min，瓶充模式为Flow to Pressure，瓶充压力为15psi，瓶充时间为0.2min。

实施例7

本例提供一种亚硝酸盐含量的测定方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述顶空的参数：加热箱温度为50℃，加热平衡时间为30min，定量环温度为60℃，传输线温度为90℃，进样时间为0.5min，GC循环时间为13min，瓶充模式为Flow to Pressure，瓶充压力为15psi，瓶充时间为0.2min。

实施例8

本例提供一种亚硝酸盐含量的测定方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述顶空的参数：加热箱温度为50℃，加热平衡时间为30min，定量环温度为80℃，传输线温度为100℃，进样时间为0.5min，GC循环时间为13min，瓶充模式为Flow to Pressure，瓶充压力为15psi，瓶充时间为0.2min。

实施例9

本例提供一种亚硝酸盐含量的测定方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述气相色谱的参数为：色谱柱：DB-WAX UI，30m×0.25mm×0.25μm；进样口温度：120℃；进样模式：分流；分流比：20:1；载气：He；传输线温度：200℃；柱流速：1mL/min；升温程序：初始温度60℃，以20℃/min升至200℃，保持1min。

实施例10

本例提供一种亚硝酸盐含量的测定方法，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述气相色谱的参数为：色谱柱：DB-WAX UI，30m×0.25mm×0.25μm；进样口温度：180℃；进样模式：分流；分流比：20:1；载气：He；传输线温度：200℃；柱流速：1mL/min；升温程序：初始温度60℃，以20℃/min升至200℃，保持1min。

性能评价

分别制备如下溶剂作为样品溶液，根据实施例提供的测定方法分别进行专属性、线性、检测限、定量限、准确度、精密度(重复性)、精密度(中间精密度)、溶液稳定性、耐用性的测试，其中测试中的样品为甲硝唑原料药：

1.1标准物质溶液

1.1.1亚硝酸钠标准物质溶液A

称取亚硝酸钠标准物质112.625mg于10mL量瓶中，用纯化水溶解后稀释至刻度，摇匀；量取上述溶液4.440mL于20mL量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，得到浓度为2500μg/mL的亚硝酸钠标准物质溶液A。

该溶液用于专属性、线性、定量限、准确度、精密度(重复性)、耐用性试验、LOD溶液。

1.1.2亚硝酸钠标准物质溶液B

称取亚硝酸钠标准物质95.130mg于10mL量瓶中，用纯化水溶解后稀释至刻度，摇匀；量取上述溶液1315μL于5mL量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，得到浓度为2502μg/mL的亚硝酸钠标准物质溶液B。

该溶液用于线性和精密度(中间精密度)。

1.2标准曲线溶液

按照表1，分别量取亚硝酸钠标准物质溶液A于100mL量瓶中，加入纯化水稀释至刻度，分别量取上述溶液10.00mL至20mL顶空瓶中，加入无机酸100.0μL，衍生剂100.0μL，立即压盖，混匀。配制成标准曲线溶液。

标准曲线溶液的配制参见下表。

标准曲线溶液的配制参见表1。

标准曲线溶液中标准物质的浓度参见表2。

表格1标准曲线溶液配制表

表格2标准曲线溶液中标准物质的浓度

名称	L-1(μg/L)	L-2(μg/L)	L-3(μg/L)	L-4(μg/L)	L-5(μg/L)
						亚硝酸钠	1.50	2.500	5.000	7.500	10.00

1.3系统适用性(SST)溶液

分别量取L-3溶液10.00mL至20mL顶空瓶中，加入无机酸100.0μL，衍生剂100.0μL，立即压盖，混匀。

1.4质控(QC)溶液

分别量取L-3溶液10.00mL至20mL顶空瓶中，加入无机酸100.0μL，衍生剂100.0μL，立即压盖，混匀。

1.5检测限(LOD)溶液

量取亚硝酸钠标准物质溶液A20.0μL于100mL量瓶中，加入纯化水稀释至刻度，摇匀，得到中浓度标准物质加标溶液。称取样品约50mg至20mL顶空瓶中，量取上述溶液10.00mL至顶空瓶中，加入无机酸100.0μL，衍生剂100.0μL，立即压盖，混匀。

1.6定量限(LOQ)溶液

以L-1作为定量限溶液

1.7样品溶液

称取样品约50mg至20mL顶空瓶中，加入纯化水10.00mL，再加入无机酸100.0μL，衍生剂100.0μL，立即压盖，混匀。

同法平行制备共2份溶液，依次得到样品溶液1和样品溶液2。

1.8试剂空白溶液

量取纯化水10.00mL，再加入无机酸100.0μL，衍生剂100.0μL，立即压盖，混匀。

1.9准确度溶液

1.9.1低浓度水平准确度溶液

量取亚硝酸钠标准物质溶液A60.0μL于100mL量瓶中，加入纯化水稀释至刻度，摇匀，得到低浓度标准物质加标溶液。称取样品约50mg至20mL顶空瓶中，量取上述溶液10.00mL至顶空瓶中，加入无机酸100.0μL，衍生剂100.0μL，立即压盖，混匀。

同法平行制备共3份溶液，依次得到低浓度水平准确度溶液1～低浓度水平准确度溶液3。

1.9.2中浓度水平准确度溶液

量取亚硝酸钠标准物质溶液A200.0μL于100mL量瓶中，加入纯化水稀释至刻度，摇匀，得到中浓度标准物质加标溶液。称取样品约50mg至20mL顶空瓶中，量取上述溶液10.00mL至顶空瓶中，加入无机酸100.0μL，衍生剂100.0μL，立即压盖，混匀。

同法平行制备共3份溶液，依次得到中浓度水平准确度溶液1～中浓度水平准确度溶液3。

1.9.3高浓度水平准确度溶液

取亚硝酸钠标准物质溶液A300.0μL于100mL量瓶中，加入纯化水稀释至刻度，摇匀，得到高浓度标准物质加标溶液。称取样品约50mg至20mL顶空瓶中，量取上述溶液10.00mL至顶空瓶中，加入无机酸100.0μL，衍生剂100.0μL，立即压盖，混匀。

同法平行制备共3份溶液，依次得到高浓度水平准确度溶液1～高浓度水平准确度溶液3。

准确度溶液中目标物的加标浓度参见表。

表3准确度溶液的加标浓度

1.10专属性溶液

以试剂空白溶液、样品溶液1、标准曲线溶液L-3和定量限加标溶液1作为专属性溶液。

1.11重复性溶液

中浓度水平准确度溶液1～中浓度水平准确度溶液3同重复性溶液1～重复性溶液3。

量取亚硝酸钠标准物质溶液A200.0μL于100mL量瓶中，加入纯化水稀释至刻度，摇匀，得到重复性标准物质加标溶液。称取样品约50mg至20mL顶空瓶中，量取上述溶液10.00mL至顶空瓶中，加入无机酸100.0μL，衍生剂100.0μL，立即压盖，混匀。

同法平行制备共3份溶液，依次得到重复性溶液4～重复性溶液6。

1.12耐用性溶液

分别考察流速变化±0.1mL/min、柱温变化±1℃、进样口温度±1℃。每个条件下分别进样1针或多针空白，2针SST，中浓度水平的准确度溶液2针，计算同一参数波动中，6份溶液中(原标准条件下取重复性前2针，正负波动条件下各2针)目标物的浓度RSD应不超过10％。

1.13溶液稳定性溶液

取新鲜配制的样品溶液，每隔一段时间进样分析这些溶液。与零点的浓度比值应在80％～120％之间。

1.14中间精密度溶液

由第二名分析员于不同天配制，同一仪器进样分析样品。

量取亚硝酸钠标准物质溶液B200.0μL于100mL量瓶中，加入纯化水稀释至刻度，摇匀，得到中间精密度标准物质加标溶液。称取样品约50mg至20mL顶空瓶中，量取上述溶液10.00mL至顶空瓶中，加入无机酸100.0μL，衍生剂100.0μL，立即压盖，混匀。

同法平行制备共6份溶液，依次得到中间精密度溶液1～中间精密度溶液6。

2性能测试结果

2.1性能测试标准：对实施例1～3进行专属性、线性、检测限、定量限、准确度、精密度(重复性)、精密度(中间精密度)、溶液稳定性、耐用性测定，发现均符合验证标准，其中验证标准和实施例3的验证结构如表4所示。

表4性能测试标准

2.2线性：分别测定实施例的标准曲线，并确定回归方程，其中回归方程的相关系数不得小于0.995，对相关系数进行评价，O为相关系数大于等于0.995，X为相关系数小于0.995，结果见表5。

2.3专属性：观察试剂空白溶液、标准曲线溶液(L-3)、定量限加标溶液和实施例提供的样品溶液的衍生产物出峰位置附近是否有干扰峰，其中如图1～4所示，可观察到试剂空白溶液、标准曲线溶液(L-3)、定量限加标溶液和实施例1提供的样品溶液无干扰峰，并对实施例的样品溶液并进行评价，其中在衍生产物出峰位置附近无干扰峰为O，有干扰峰为X，并对干扰峰和衍生产物出峰位置的分离度进行测试，结果见表5。

表5性能表征测试

实施例	线性	专属性
			1	O	O
2	O	O
			3	O	O
4	X	-
			5	X	X，分离度>1.5
6	X	X，分离度<1.5

2.4重复性：对实施例提供的6份重复性溶液中目标物测定结果的RSD进行计算，其中RSD不得大于8％，若RSD小于等于8％，记为O，若RSD大于8％，记为X，结果见表6。

2.5准确性和回收率：对实施例提供的测定方法的准确度和回收率进行测试，并判断是否符合规定，其中低浓度水平准确度溶液的标准为：目标物的回收率在80％～115％之间；目标物回收率的RSD不得大于8％。中浓度水平准确度溶液的标准为：目标物的回收率在80％～115％之间；目标物回收率的RSD不得大于8％。高浓度水平准确度溶液的标准为：目标物的回收率在80％～115％之间；目标物回收率的RSD不得大于8％，其中符合规定记为O，否则记为X，结果见表6。

表6性能表征测试

由表4～6测试结果可知，本发明提供的测定方法可用于测定甲硝唑中亚硝酸盐的含量，且具有线性、准确度和回收率、重复性、耐用性、稳定性等多种好的测定结果。

前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (10)

1.一种亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，包括：

标准曲线绘制：取亚硝酸盐-水混合物，加入无机酸和衍生剂，配置得到不同亚硝酸盐质量浓度的标准溶液，通过顶空-气相色谱-质谱仪进行测试，得到标准溶液中衍生产物质谱信号峰面积和亚硝酸盐质量浓度的标准曲线；

亚硝酸盐含量测定：将药品加入水后，加入无机酸和衍生剂，混合后，得到样品溶液，放入顶空-气相色谱-质谱仪进行测试，测得样品溶液中衍生产物质谱信号峰面积，并根据标准曲线得到样品溶液中亚硝酸盐的质量浓度。

2.根据权利要求1所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，所述无机酸选自盐酸、硫酸、过氯酸、氟硼酸中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，所述衍生剂为胺的水溶液。

4.根据权利要求3所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，所述胺选自环己基氨基磺酸钠、2,3-二氨基萘、2,4-二硝基苯胺、3-氨基-N-苯基苯磺酰胺、2-硝基-4-氯苯胺中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，所述无机酸和衍生剂的物质的量比为(100～10)：1。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，所述标准曲线绘制中，衍生剂和亚硝酸盐的物质的量比为(500～10)：1。

7.根据权利要求1任意一项所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，所述顶空的加热箱温度为45～55℃。

8.根据权利要求1所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，所述顶空的加热平衡时间为25～40min。

9.根据权利要求1所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，所述气相色谱的色谱柱：DB-WAX UI，30m×0.25mm×0.25μm。

10.一种根据权利要求1～9任意一项所述的亚硝酸盐含量的准确定量测定方法，其特征在于，用于药物中基因毒性杂质亚硝酸盐的测试。

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