CN112386613A

CN112386613A - 鼠李糖乳杆菌tci366及/或其代谢产物改善肌肤状况的用途

Info

Publication number: CN112386613A
Application number: CN202010821387.2A
Authority: CN
Inventors: 黄琡涵; 林咏翔
Original assignee: TCI Co Ltd
Current assignee: TCI Co Ltd
Priority date: 2019-08-14
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2021-02-23
Also published as: US20210047701A1; TWI754350B; TW202106871A; TWI754189B; TW202106318A; CN112391298B; TWI819234B; CN112386618A; CN112391298A; TW202106319A

Abstract

本发明公开一种鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物的用途，其为鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物在制备改善肌肤状况的组合物的用途，其中鼠李糖乳杆菌TCI366寄存于德国微生物保藏中心，且寄存编号为DSM33290。

Description

鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物改善肌肤状况的用途

技术领域

本发明关于一种鼠李糖乳杆菌的用途，特别是关于一种鼠李糖乳杆菌 TCI366(Lactobacillus rhamnosus TCI366)及/或其代谢产物，其用于制备改善肌肤状况的组合物。

背景技术

肌肤由外向内依序包含表皮层、真皮层及皮下组织，并作为人类个体提供对抗阳光中紫外线(ultraviolet，UV)辐射、病原体、摩擦力等环境因子的第一层保护，进而降低肌肤产生受损状态发生的机率。

常见的肌肤受损状态，例如肌肤弹力下降、保肌肤含水量不足(肌肤较为干燥、无光泽)、毛孔粗大、皱纹、肌肤产生斑点及/或整体较为暗沉、蜡黄等。

并且，除了因正常岁年龄增长造成的肌肤受损外，在某些环境因素下，则会加速肌肤受损的进程。举例而言，一般常见的自然因素例如阳光中的紫外线。当暴露于紫外线中，紫外线刺激皮肤病形成黑色素，更会加速产生前述受损的肌肤状态。

此外，由于在现代生活中，人们使用带有屏幕的电子产品的时间大幅增加，屏幕所发出的具有较短波长、较高能量的可见光(后称蓝光)在长时间照射肌肤的情况下，也加速产生前述受损的肌肤状态。

发明内容

在一些实施例中，一种鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物在制备改善肌肤状况的组合物的用途，其中鼠李糖乳杆菌TCI366(Lactobacillus rhamnosus TCI366)寄存于德国微生物保藏中心，且寄存编号为DSM33290。

在一些实施例中，一种鼠李糖乳杆菌TCI366，其中鼠李糖乳杆菌TCI366(Lactobacillus rhamnosus TCI366)寄存于德国微生物保藏中心，且寄存编号为DSM33290。

综上所述，任一实施例的鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物可用于制备组合物。并且，鼠李糖乳杆菌TCI366寄存于德国微生物保藏中心，且寄存编号为DSM33290。在一些实施例中，鼠李糖乳杆菌TCI366具有耐胃酸胆盐的功能。在一些实施例中，鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物所制备组合物可用于改善肌肤状况。在一些实施例中，鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物具有以下至少一项功能：降低小眼畸形相关转录因子(MITF)基因表现量、抑制酪胺酸酶活性、抑制黑色素形成、减少肌肤斑点、减少肌肤紫外线色斑形成、提高肌肤含水量或其组合。

以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。

附图说明

图1是鼠李糖乳杆菌TCI366于胃肠模拟环境中的存活率实验的结果图；

图2是MITF基因相对表现倍率的结果图；

图3是酪胺酸酶活性实验的结果图；

图4是黑色素含量相对百分比的结果图；

图5是蓝光造成的黑色素含量相对百分比的结果图；

图6是第0周及第6周的斑点数据结果图；

图7是第0周及第6周的紫外线色斑数据结果图；

图8是第0周及第6周的肌肤光泽度数据结果图；以及

图9是第0周及第6周的肌肤含水量数据结果图。

具体实施方式

鼠李糖乳杆菌TCI366(Lactobacillus rhamnosus TCI366)是分离自人体肠道的乳杆菌属的菌株。鼠李糖乳杆菌TCI366以寄存编号DSM33290寄存于德国微生物保藏中心。并且，此鼠李糖乳杆菌TCI366具有良好的改善宿主或受体肌肤状况的作用。其中，改善肌肤状况的情形为抑制宿主或受体的酪胺酸酶活性、降低宿主或受体的黑色素形成、提升宿主或受体的肌肤光泽度、提升宿主或受体的肌肤含水量或其组合。其中，宿主或受体为人。

鼠李糖乳杆菌TCI366为格兰氏阳性菌，可于厌氧环境下生长，为厌氧细菌。鼠李糖乳杆菌TCI366的菌落边缘平整且表面光滑，其菌落成白色。鼠李糖乳杆菌TCI366生长的温度为35℃至37℃。并且，可于酸碱值(pH值)为3 至7的环境下生存。

在一些实施例中，鼠李糖乳杆菌TCI366具有耐胃酸胆盐的功能。举例来说，鼠李糖乳杆菌TCI366于胃模拟环境(pH值3-4)的存活率为88％，且于肠道模拟环境(pH值7)的存活率为97％。因此，鼠李糖乳杆菌TCI366可在人体肠胃道环境定殖。

在一些实施例中，透过培养鼠李糖乳杆菌TCI366，并透过离心分离鼠李糖乳杆菌TCI366菌体及上清液后，将上清液经过滤后可取得鼠李糖乳杆菌 TCI366的代谢产物。换言之鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物包括鼠李糖乳杆菌TCI366进行代谢后分泌至培养液中的物质。在一些实施例中，鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物更包括用以培养鼠李糖乳杆菌TCI366的培养液，且此培养液已培养过鼠李糖乳杆菌TCI366，但此培养液不包含鼠李糖乳杆菌TCI366 菌体。在一示范例中，将鼠李糖乳杆菌TCI366以乳杆菌MRS培养基(BD Difco^TMLactobacilli MRS Broth)于37℃下16小时得到含有鼠李糖乳杆菌TCI366 菌体及其代谢产物的菌液。接着，将菌液以转速5000rpm离心15分钟以分离鼠李糖乳杆菌TCI366菌体及含有鼠李糖乳杆菌TCI366代谢产物的上清液。取上清液以0.22微米(μm)的滤网过滤上清液以得到鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物。

于此，用语「代谢产物」意为培养鼠李糖乳杆菌时，经此鼠李糖乳杆菌代谢后所分泌至培养液中的物质，或者为经此鼠李糖乳杆菌代谢后所分泌至培养液中的物质与培养此鼠李糖乳杆菌的乳杆菌培养液，但不包含此鼠李糖乳杆菌本体。

在一些实施例中，鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物能用以降低宿主或受体的黑色素形成基因的表现量。其中，黑色素形成基因可以为但不限于小眼畸形相关转录因子(MITF)基因。基此，当宿主服用鼠李糖乳杆菌TCI366 及/或鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物时，可抑制宿主体内的MITF基因的表现量，进而降低黑色素形成。

在一些实施例中，鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物具有抑制宿主或受体的酪胺酸酶活性的功能。举例来说，当宿主服用鼠李糖乳杆菌TCI366及/ 或鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物时，可抑制宿主体内的酪胺酸酶活性，进而降低黑色素形成，以减少宿主肌肤斑点数量及/或减少宿主肌肤紫外线色斑形成。

于此，在一些实施例中，鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物具有抑制黑色素形成的功能。其中，黑色素形成的原因包括自然形成(例如自然老化、自然光照射等)及蓝光照射形成。基此，当宿主服用鼠李糖乳杆菌TCI366及/ 或鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物时，可用以抑制黑色素形成，进而降低宿主肌肤的斑点数量及/或减少宿主肌肤紫外线色斑形成。其中，此黑色素形成包括自然老化导致的黑色素形成、自然光照射导致的黑色素形成、蓝光照射导致的黑色素形成或其组合。

在一些实施例中，鼠李糖乳杆菌TCI366具有提高宿主肌肤光泽的功能。举例来说，当宿主服用鼠李糖乳杆菌TCI366时，可提高宿主的肌肤的光泽度。

在一些实施例中，鼠李糖乳杆菌TCI366具有提高宿主肌肤含水量的功能。举例来说，当宿主服用鼠李糖乳杆菌TCI366时，可提高宿主的肌肤的含水量。

因此，在一些实施例中，鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物可用于制备改善肌肤状况的组合物。其中，改善肌肤状况可为提升肌肤的光泽度、提升肌肤的含水量、降低肌肤黑色素形成、减少肌肤斑点形成、减少肌肤斑点数量、减少肌肤紫外光色斑形成或其组合。

在一些实施例中，前述的任一组合物可为医药品。换言之，此医药品包含有效含量的鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物。

在一些实施例中，前述的医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于经肠地道、非经肠地道(parenterally)、口服的、或局部地(topically) 投药剂型。

在一些实施例中，经肠道或口服的投药剂型可为，但不限于，锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)或类似之物。举例来说，当组合物的剂型为胶囊状时，组合物的剂量为5×10⁹菌落形成单位 /胶囊(CFU/cap)的鼠李糖乳杆菌TCI366。

在一些实施例中，非经肠地道或局部地投药剂型可为，但不限于，注射品(injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation) 或类似之物。在一些实施例中，注射品的投药方式可为皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection) 或病灶内注射(intralesional injection)。

在一些实施例中，前述的医药品可包含被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。在一些实施例中，医药上可接受的载剂可为下列载剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂 (wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。关于选用的载剂的种类与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。在一些实施例中，作为医药上可接受的载剂的溶剂可为水、生理盐水(normalsaline)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)、或含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。

在一些实施例中，前述的任一组合物可为食品。换言之，食品包含特定含量的鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物。在一些实施例中，前述的食品可为食用产品或食品添加物(food additive)。在一些实施例中，食用产品可为但不限于：饮料(beverages)、乳制品(dairy products)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及饮食补充品(dietary supplements)。

在一些实施例中，前述的任一组合物可为化妆品或保养品。换言之，化妆品或保养品包含特定含量的鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物。

在一些实施例中，前述的化妆品或保养品可为下列任一种型态：化妆水、凝胶、冻膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉饼、蜜粉、卸妆油、卸妆乳、洗面奶、沐浴乳、洗发精、护发乳、防晒乳、护手霜、指甲油、香水、精华液及面膜。在一些实施例中，前述的化妆品或保养品可视需要更包含外用品可接受成分。在一些实施例中，外用品可接受成分可例如为乳化剂、渗透促进剂、软化剂、溶剂、赋型剂、抗氧化剂、或其组合。

例一：菌种鉴定

首先，将分离自人类肠道的分离菌株以乳酸菌的16S核醣体基因 (16SrDNA)序列进行菌种鉴定。透过聚合酶连锁反应(PCR)得到此分离菌株的16SrDNA序列(即SEQID NO:1)。接着，利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站，将SEQID NO:1所示的基因序列分别与其他鼠李糖乳杆菌亚种的16SrDNA序列进行序列比对后，可知分离菌株的16SrDNA序列与其他鼠李糖乳杆菌亚种的16SrDNA序列的相似性如表1所示。因此，将此分离菌株命名为鼠李糖乳杆菌TCI366。并且，将此鼠李糖乳杆菌TCI366以寄存编号 DSM33290寄存于德国微生物保藏中心。

表1

鼠李糖乳杆菌亚种	相似度
		Lactobacillus rhamnosus strain LRB	97％
Lactobacillus rhamnosus strain LV108	97％
		Lactobacillus rhamnosus strain 6577	96％
Lactobacillus rhamnosus strain 6366	97％
		Lactobacillus rhamnosus strain SKB1311	97％
Lactobacillus rhamnosus strain BIO5366	97％
		Lactobacillus rhamnosus strain L20	97％

例二：耐胃酸胆盐试验

于此，将鼠李糖乳杆菌TCI366以缓冲液、人工胃液(pH 3)及人工肠液 (pH 7)进行测试，以确认鼠李糖乳杆菌TCI366于生物体肠胃消化道中的酸碱耐受性。其中，缓冲液为0.2穆尔浓度(M)氯化钾(KCL,品牌Sigma-Aldrich) 且pH值为7。人工胃液为0.2M氯化钾且pH值为3。人工肠液为0.2M氯化钾及0.3重量％的牛胆盐(品牌Difco^TMOxgall)且pH值为7。

进行一活化程序将鼠李糖乳杆菌TCI366活化。首先，将鼠李糖乳杆菌 TCI366冻菌以10体积％的菌量培养于液态乳杆菌MRS培养基(BD Difco^TM Lactobacilli MRS Broth)中，并于37下培养16小时，以活化鼠李糖乳杆菌TCI366。

接着，将活化后的鼠李糖乳杆菌TCI366菌液取1体积％的浓度接种至20 毫升的待测溶液中，然后以转速50rpm于37℃下震荡培养3小时。其中，三个组别的待测溶液分别为人工胃液(实验组)、人工肠液(实验组)及氯化钾缓冲液(控制组)。从培养后的菌液取100微升(μL)的菌液涂盘，并于28℃ 下静置培养3天，并于3天后以肉眼计数各组别的活菌数(计算固态乳杆菌 MRS培养基上的菌落数)。

请参阅图1。图式中鼠李糖乳杆菌TCI366的存活率为计数后的活菌数，并以logCFU/mL表示。其中，log CFU/mL代表每毫升菌液含有的菌落形成单位 (CFU，colony-forming unit)并以对数(log₁₀)表示。由图1可知，控制组的鼠李糖乳杆菌TCI366的存活率为7.79log CFU/mL、人工胃液实验组的鼠李糖乳杆菌TCI366的存活率为6.85log CFU/mL，及人工肠液实验组的鼠李糖乳杆菌TCI366的存活率为7.59log CFU/mL。由此可知，人工胃液实验组的活菌数为控制组的88％，且人工肠液实验组的活菌数为控制组的97％。

基此，鼠李糖乳杆菌TCI366具有耐胃酸胆盐的功能，代表鼠李糖乳杆菌 TCI366可通过宿主肠胃道的酸碱值压力，定殖于宿主肠道中。

例三：鼠李糖乳杆菌TCI366代谢产物的制备

以前述活化程序将鼠李糖乳杆菌TCI366活化后，将10体积％的活化后的鼠李糖乳杆菌TCI366接种于液态乳杆菌MRS培养基中，并于37下培养16小时。接着，以转速5000rpm离心15分钟以分离鼠李糖乳杆菌TCI366菌体及含有鼠李糖乳杆菌TCI366代谢产物的上清液。取上清液并以0.22微米(μm) 的滤网过滤以得到鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物。

于此，可知鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物为鼠李糖乳杆菌TCI366进行代谢后分泌至培养液中的物质以及用以培养此鼠李糖乳杆菌TCI366的液态乳杆菌MRS培养基(但不含菌体)。

例四：黑色素形成基因的表现量分析

于此，所使用培养基为含有90体积％Eagle’s最低限度基本培养基-非必需胺基酸(MEM-Non-Essential Amino Acids；品牌Gibco)、10体积％胎牛血清蛋白(fetalbovine serum，FBS；品牌：Gibco)及1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate，品牌：Gibco)的细胞培养基(以下称MEM培养基)。所使用的细胞株为人类黑色素瘤细胞(品牌：

CRL-1872)，以下称A375.S2细胞。所分析的黑色素形成基因为小眼畸形相关转录因子(MITF)基因。

将A375.S2细胞以每孔1×10⁵个的数量接种于每孔含2毫升MEM培养基的6孔培养盘中，并于37℃下培养24小时，并分为实验组及控制组。接着，更换MEM培养基为实验培养基，并培养24小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.25体积％例3所制备的鼠李糖乳杆菌TCI366代谢产物的MEM培养基。控制组的实验培养基为单纯的MEM培养基(即不含鼠李糖乳杆菌TCI366 的代谢产物)。

接着，以RNA萃取套组(RNA extraction kit；品牌GeneAid)萃取以各组经实验培养基培养过的A375.S2细胞的RNA。将各组RNA转译成cDNA后，以MITF-F(SEQID NO:2)引子及MITF-R(SEQID NO:3)引子(如表2所示)，结合nCounter分析系统(nCounter AnalysisSystems)进行分析，分析结果如图 2所示。需要特别说明的是，图2中的基因表现是以相对倍率呈现，其中使用 Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，且各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析。

表2

序列编号	序列名称	序列
			SEQID NO:2	MITF-F	GCCTCCAAGCCTCCGATAAG
SEQID NO:3	MITF-R	GCACTCTCTGTTGCATGAACT

其中，序列名称中R(REVERSE)代表反向，F(FORWARD)代表顺向。

请参阅图2。将控制组的MITF基因的表现量视为1，代表将未经鼠李糖乳杆菌TCI366代谢产物处理的A375.S2细胞内的MITF基因的表现量视为100％。基此，实验组的MITF基因的表现量为0.31。换言之，经鼠李糖乳杆菌TCI366 代谢产物处理的A375.S2细胞内的MITF基因被抑制69％的表现量。

基此，鼠李糖乳杆菌TCI366分泌的鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物具有降低MITF基因的表现量的作用。换言之，鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物可用以降低MITF基因的表现量，进而减少黑色素合成。

例五：酪胺酸酶活性检测

于此，所使用培养基为添加有10体积％胎牛血清蛋白(fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco)及1体积％盘尼西林-链霉素(penicillin/streptomycin，品牌：Gibco)的DMEM培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；品牌：Gibco)，以下称基础培养基。所使用的细胞株为小鼠黑色素瘤细胞株B16F10(购自美国典型培养物保存中心(ATCC)，编号CRL-6475)，以下称B16F10细胞。所使用的溶液包括裂解缓冲液(Lysis buffer)，其中裂解缓冲液是以0.1M磷酸缓冲液、0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF；品牌：Sigma)及1％曲拉通X-100(Triton X-100，pH6.8：品牌：J.T.Baker)配制而成。

将B16F10细胞以每孔1.5×10⁵个细胞的细胞数接种于含有2mL基础培养基的6孔培养盘的各孔中，并置于37℃下培养24小时。

在培养24小时后，将B16F10细胞分成3个组别：一个实验组、一个对照组以及一个控制组。移除各组别的基础培养基，并更换成每孔2mL实验培养基，然后置于37℃下接续培养48小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.25 体积％例3所制备的鼠李糖乳杆菌TCI366代谢产物的基础培养基。对照组的实验培养基为含有0.25体积％曲酸(kojicacid)的基础培养基。控制组的实验培养基为单纯的基础培养基(即不含鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物，也不含曲酸)。

于培养48小时后，移除各孔中的实验培养基并以1倍(1x)的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS，品牌：Gibco)润洗二次。于冲洗后，将胰蛋白酶(trypsin)加入至各孔中以处理细胞3分钟。于3分钟处理后，将各孔的悬浮的细胞个别收集于15mL离心管中，接而以400xg离心5分钟以分离第一细胞沉淀物(cell pellet)与上清液。透过1xPBS再悬浮细胞沉淀物及离心反复进行二次后，以50μL的裂解缓冲液再悬浮细胞沉淀物，以得到细胞悬浮溶液。震荡含有细胞悬浮溶液的离心管并以12,000xg离心20分钟以收分离第二细胞沉淀物及细胞溶液。将各组细胞溶液进行蛋白质定量后，取400μg/well 细胞溶液至96孔盘中，并以裂解缓冲液定量至每孔体积为90μL。接着，添加 10μL的10mM L-多巴(L-Dopa)至各孔中以形成反应溶液，并于37℃及避光状态下，每10分观察至每孔反应溶液的颜色由透明变深色。接着于405nm的波长下以ELISA(enzyme-linkedimmunosorbent assay，酵素结合免疫吸附法) 读取仪(厂牌：BioTek)来读取96孔培养盘中各孔的吸光值(OD₄₀₅)。

于量测后，将所测得的吸光值代入下列公式(1)计算酪胺酸酶活性百分比 (％)。换言之，于此，是将控制组的酪胺酸酶活性视为100％来计算各组别的相对酪胺酸酶活性百分比(％)。并且，各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验(student t-test)来统计分析，如图3所示。在图3中，「***」代表在与控制组比较下其p值小于0.001、「▲▲▲」代表在与对照组比较下其p值小于0.001。

公式(1)

相对酪胺酸酶活性百分比(％)＝(OD_{405 sample}/OD_{405 control})×100％ (1)

其中，OD_{405 sample}代表欲换算的组别的吸光值，而OD_{405 control}代表控制组的吸光值。

请参考图3。相较于控制组，实验组的酪胺酸酶活性百分比为33.21％，代表其酪胺酸酶活性被抑制66.79％，而对照组的酪胺酸酶活性百分比为78.04％，代表其酪胺酸酶活性被抑制21.96％。并且，相较于对照组，实验组的酪胺酸酶活性百分比有显著地降低。换言之，相较于曲酸，鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物能有效抑制酪胺酸酶活性，进而有效地抑制黑色素生成。

基此，鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物能用以抑制酪胺酸酶活性，进而具有改善肌肤状况的作用。

例六：黑色素含量检测

于此，所使用培养基为添加有10体积％胎牛血清蛋白(fetal bovine serum，FBS；品牌：Gibco)及1体积％盘尼西林-链霉素(penicillin/streptomycin，品牌：Gibco)的DMEM培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；品牌：Gibco)，以下称基础培养基。所使用的细胞株为小鼠黑色素瘤细胞株B16F10(购自美国典型培养物保存中心(ATCC)，编号CRL-6475)，以下称B16F10细胞。

将B16F10细胞以每孔1.5×10⁵个细胞的细胞数接种于含有3mL基础培养基的6孔培养盘的各孔中，并置于37℃下培养24小时。

在培养24小时后，将B16F10细胞分成3个组别：一个实验组、一个对照组以及一个控制组。移除各组别的基础培养基，并更换成每孔3mL实验培养基，然后置于37℃下接续培养48小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.25 体积％例3所制备的鼠李糖乳杆菌TCI366代谢产物的基础培养基。对照组的实验培养基为含有0.25体积％曲酸(kojicacid)的基础培养基。控制组的实验培养基为单纯的基础培养基(即不含鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物，也不含曲酸)。

于培养48小时后，移除各孔中的实验培养基并以1倍(1x)的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS，品牌：Gibco)润洗二次。于冲洗后，将胰蛋白酶(trypsin)加入至各孔中以处理细胞3分钟。于3分钟处理后，将各孔的悬浮的细胞个别收集于15mL离心管中，接而以400xg离心5分钟以分离细胞沉淀物(cell pellet)与上清液。透过1xPBS再悬浮细胞沉淀物及离心反复进行二次后，以200μL的1xPBS再悬浮细胞沉淀物，以得到细胞溶液。接着，将细胞溶液于液态氮中放置10分钟，接而于室温下静置30分钟进行解冻。在解冻完全之后，各离心管以12,000xg离心30分钟。于30分钟离心后，移除各离心管中上清液并添加入120μL 1N NaOH(配于ddH₂O)以与各离心管中的沉淀物进行混合。在混合均匀之后，将含有混合溶液的各离心管于60℃干浴槽中静置1小时。之后，从各离心管中取100μL混合溶液至96孔培养盘中并于 405nm的波长下以ELISA(enzyme-linkedimmunosorbent assay，酵素结合免疫吸附法)读取仪(厂牌：BioTek)来读取96孔培养盘中各孔的吸光值(OD₄₀₅)。

于量测后，将所测得的吸光值代入下列公式(2)计算出黑色素含量相对百分比(％)。换言之，于此，是将控制组的黑色素含量视为1(即控制组的黑色素含量相对百分比为100％)来计算各组别的相对黑色素含相对百分比(％)。并且，各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验(student t-test)来统计分析，如图4所示。在图4中，「*」代表在与控制组比较下其p值小于0.05，「**」代表在与控制组比较下其p值小于0.01。

公式(2)

黑色素含量相对百分比(％)＝(OD_{405 sample}/OD_{405 control})×100％ (2)

请参照图4。相较于控制组，实验组的黑色素含量相对百分比为79.51％，而对照组的黑色素含量相对百分比为98.62％。换言之，实验组降低21.49％的黑色素生成，而对照组降低1.38％的黑色素生成。于此，相较于控制组及对照组，实验组的黑色素含量相对百分比均有显著地降低。由此可知，相较于曲酸，鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物能有效抑制黑色素生成。

基此，鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物能用以抑制黑色素生成，进而具有改善肌肤状况的作用。

例七：蓝光造成的黑色素含量检测

在培养24小时后，将B16F10细胞分成3个组别：一个实验组、一个对照组以及一个控制组。移除各组别的基础培养基，并更换成每孔3mL实验培养基，然后将对照组及实验组置于蓝光LED上照射3小时(控制组并未以蓝光LED 照射)，接着将各组于37℃下接续培养24小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.25体积％例3所制备的鼠李糖乳杆菌TCI366代谢产物的基础培养基。对照组及控制组的实验培养基为单纯的基础培养基(即不含鼠李糖乳杆菌 TCI366的代谢产物)。

于培养24小时后，移除各孔中的实验培养基并以1倍(1x)的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS，品牌：Gibco)润洗二次。于冲洗后，将胰蛋白酶(trypsin)加入至各孔中以处理细胞3分钟。于3分钟处理后，将各孔的悬浮的细胞个别收集于15mL离心管中，接而以400xg离心5分钟以分离细胞沉淀物(cell pellet)与上清液。透过1xPBS再悬浮细胞沉淀物及离心反复进行二次后，以200μL的1xPBS再悬浮细胞沉淀物，以得到细胞溶液。接着，将细胞溶液于液态氮中急冻30秒后，接而于室温下静置30分钟进行解冻。在解冻完全之后，各离心管以14,000xg离心30分钟。于30分钟离心后，移除各离心管中上清液并添加入120μL 1N NaOH(配于ddH₂O)以与各离心管中的沉淀物进行混合。在混合均匀之后，将含有混合溶液的各离心管于60℃干浴槽中静置1小时。之后，从各离心管中取100μL混合溶液至96孔培养盘中并于 405nm的波长下以ELISA(enzyme-linkedimmunosorbent assay，酵素结合免疫吸附法)读取仪(厂牌：BioTek)来读取96孔培养盘中各孔的吸光值(OD₄₀₅)。

于量测后，将所测得的吸光值代入下列公式(3)计算出蓝光造成的黑色素含量相对百分比(％)，如图5所示(图5及公式(3)标示为「黑色素含量相对百分比」)。换言之，于此，是将控制组的黑色素含量视为1(即控制组的黑色素含量相对百分比为100％)来计算各组别的相对黑色素含相对百分比 (％)。并且，各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验(student t-test) 来统计分析。在图5中，「▲▲」代表在与对照组比较下其p值小于0.01、「***」代表在与控制组比较下其p值小于0.001。

公式(3)

黑色素含量相对百分比(％)＝(OD_{405 sample}/OD_{405 control})×100％ (3)

请参照图5。相较于控制组，实验组的黑色素含量相对百分比为108.08％，而对照组的黑色素含量相对百分比为130.28％。换言之，当以蓝光处理后，对照组的黑色素含量相对百分比相较于控制组提高了30.28％，而实验组以蓝光及鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物共同处理后，实验组的黑色素含量相对百分比相较于控制组仅提高了8.08％。由此可知，相较于对照组，实验组的蓝光造成的黑色素生成有显著地被抑制22.2％，代表鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物能有效抑制蓝光造成的黑色素生成。

基此，鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物能用以抑制蓝光造成的黑色素生成，进而具有改善肌肤状况的作用。

例八：人体试验

为进一步确认鼠李糖乳杆菌TCI366对于人体的影响。以每颗胶囊含有5 ×10⁹CFU(即5×10⁹CFU/cap)的鼠李糖乳杆菌TCI366的活菌胶囊提供给受试者每日服用一颗(50毫克菌粉/日，指每日服用一颗含有50毫克鼠李糖乳杆菌TCI366菌粉的胶囊)，并服用6周。并于服用前(视为第0周)及服用6 周后(视为第6周)以肌肤分析仪器(

ComboSkin Analyzer)进行分析。其中分析项目包括肌肤斑点、肌肤紫外线色斑、肌肤光泽度及肌肤含水量。

受试者有8位，且为年龄为20-55岁的女性及男性。并且，此些受试者的肤色黯沉、面部肌肤上有斑点。

测试结果以第0周及第6周的数值一起比较。第0周为试验前量测的数值，代表受试者未服用含有鼠李糖乳杆菌TCI366的活菌胶囊的肌肤状态。第6周系为连续服用六周后量测的数值，代表受试者服用含有鼠李糖乳杆菌TCI366 的活菌胶囊后的肌肤状态。需要特别说明的是，各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验(student t-test)来统计分析。在图式中，「*」代表在与第0 周比较下其p值小于0.05、「**」代表在与第0周比较下其p值小于0.01。

请参阅图6。将8位受试者于第0周测量到的肌肤斑点数量的平均数值视为100％，且8位受试者于第6周测量到的肌肤斑点数量的平均数值相较于第0 周的数值为92.7％。换言之，在连续服用6周的含有鼠李糖乳杆菌TCI366的活菌胶囊后，8位受试者肌肤斑点数量下降7.3％。由此可知，鼠李糖乳杆菌TCI366 能减少受试者肌肤的斑点数量，具有改善肌肤状况的功效。

请参阅图7。将8位受试者于第0周测量到的肌肤紫外线色斑的平均数值视为100％，且8位受试者于第6周测量到的紫外线色斑的平均数值相较于第0 周的数值为94.4％。换言之，在连续服用6周的含有鼠李糖乳杆菌TCI366的活菌胶囊后，8位受试者肌肤紫外线色斑减少5.6％。由此可知，鼠李糖乳杆菌 TCI366能减少受试者肌肤的紫外线色斑分布情形，具有改善肌肤状况的功效。

请参阅图8。将8位受试者于第0周测量到的肌肤光泽度的平均数值视为 100％，且8位受试者于第6周测量到的肌肤光泽度的平均数值相较于第0周的数值为109.8％。换言之，在连续服用6周的含有鼠李糖乳杆菌TCI366的活菌胶囊后，8位受试者肌肤光泽度提高9.8％。由此可知，鼠李糖乳杆菌TCI366 能提高受试者肌肤的光泽度，具有改善肌肤状况的功效。

请参阅图9。将8位受试者于第0周测量到的肌肤含水量的平均数值视为 100％，且8位受试者于第6周测量到的肌肤含水量的平均数值相较于第0周的数值为105.8％。换言之，在连续服用6周的含有鼠李糖乳杆菌TCI366的活菌胶囊后，8位受试者肌肤含水量提高5.8％。由此可知，鼠李糖乳杆菌TCI366 能提高受试者肌肤的含水量，具有改善肌肤状况的功效。

于此，透过例二可知，鼠李糖乳杆菌TCI366可适应于人体肠胃环境。透过例四可知，鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物具有降低黑色素形成基因(如， MITF基因)的表现量的作用。透过例五可知，鼠李糖乳杆菌TCI366的代谢产物具有降低酪胺酸活性的作用。透过例六及例七可知，鼠李糖乳杆菌TCI366 的代谢产物具有抑制黑色素形成(自然形成、自然光造成及蓝光造成的黑色素) 的作用。透过例八可知，鼠李糖乳杆菌TCI366具有改善肌肤状态的作用，其中改善肌肤状态包括减少斑点数量、减少紫外线色斑、提高肌肤光泽度、提高肌肤含水量或其组合。

综上所述，根据本发明任一实施例的鼠李糖乳杆菌TCI366，其可制备改善肌肤状况的组合物。并且，鼠李糖乳杆菌TCI366具有耐胃酸胆盐的功能，可生存于肠胃道环境。由于鼠李糖乳杆菌TCI366可用以降低受体的MITF基因表现及/或抑制酪胺酸酶活性，其能有效地抑制黑色素形成，进而改善受体肌肤状态(如，渐少肌肤斑点、减少肌肤紫外线色斑等)。在一些实施例中，鼠李糖乳杆菌TCI366可用以提高受体肌肤光泽度及/或受体肌肤含水量，进而改善受体肌肤状态。

虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神所作些许的更动与润饰，皆应涵盖于本发明的范畴内，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

【生物材料寄存】

德国微生物保藏中心(德国)；2019年9月19日；寄存编号：DSM33290。

【序列表】

<110> 大江生医股份有限公司

<120> 鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物用于改善肌肤状况的用途

<150> US62886397

<151> 2019-08-14

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1203

<212> DNA

<213> Lactobacillus rhamnosus TCI366

<400> 1

ctaagcggta tgcctaatac atgcaagtcg aacgagttct gattattgaa aggtgcttgc 60

atcttgattt aattttgaac gagtggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgccct 120

taagtgggga taacatttgg aaacagatgc taataccgca taaatccaag aaccgcatgg 180

ttcttggctg aaagatggcg taagctatcg cttttggatg gacccgcggc gtattagcta 240

gttggtgagg taacgctcac caaggcaatg atacgtagcc gaactgagag gttgatcggc 300

cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca 360

caatggacgc aagtctgatg ggcaacgccg cgtgagtgaa gaaggctttc gggtcgtaaa 420

actctgttgt tggagaagaa tggtcggcag agtaactgtt gtcggcgtga cggtatccaa 480

ccagaaagcc acggctaact acgtgccaca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta 540

tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat gtgaaagccc 600

tcggcttaac cgaggaagtg catcggaaac tgggaacttg agtgcagaag aggacagtgg 660

aactccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg 720

ctgtctggtc tgtaactgac gctgaggctc gaaagcatgg gtgcgaacag gattagatac 780

cctggtagtc catgccgtaa acgatgaatg ctaggtgttg gagggtttcc gcccttcagt 840

gccgcagcta acgcattaag cattccgcct ggggagtacg accgcaaggt gaaactcaaa 900

ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatggtgg tttaattcga agcaacgcga 960

agaaccttac cagtcttgac atcttttgat cactgaagat cagtttcccc ttcgggcaaa 1020

tgacaggtgg tgcatgttgt cgtcagcctc gtgtctgaga atgttggtaa gtcccgccaa 1080

cgagcgccac cctatgacta ggtggcagca atttagtggc acctctagta gactggcgtg 1140

acacgtagaa ggtgggatga cgtcaatcat catgccttag aacttggact tacaccggtg 1200

ctc 1203

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> MITF-F

<400> 2

gcctccaagc ctccgataag 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> MITF-R

<400> 3

gcactctctg ttgcatgaac t 21

Claims

1.一种鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物的用途，其特征在于，其为鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物在制备改善肌肤状况的组合物的用途，其中鼠李糖乳杆菌TCI366寄存于德国微生物保藏中心，且寄存编号为DSM33290。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该鼠李糖乳杆菌TCI366具有耐胃酸胆盐的功能。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物具有降低小眼畸形相关转录因子基因表现量的功能。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物具有抑制酪胺酸酶活性的功能。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该鼠李糖乳杆菌TCI366及/或其代谢产物具有抑制黑色素形成的功能。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该鼠李糖乳杆菌TCI366具有减少肌肤斑点的功能。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该鼠李糖乳杆菌TCI366具有减少肌肤紫外线色斑形成的功能。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该鼠李糖乳杆菌TCI366具有提高肌肤光泽的功能。

9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该鼠李糖乳杆菌TCI366具有提高肌肤含水量的功能。

10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物为食品、保养品或医药品。