TWI754350B - 釀酒酵母tci907、組合物以及釀酒酵母tci907及/或其代謝產物的用途 - Google Patents
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Abstract
一種釀酒酵母TCI907（Saccharomyces cerevisiae TCI907），其中釀酒酵母TCI907寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 920118。基此，釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物可用於製備調節血糖、減肥或降低醣化終產物的產生的組合物。
Description
本發明關於一種釀酒酵母，特別是關於一種釀酒酵母TCI907（Saccharomyces cerevisiae TCI907）及/或其代謝產物、其組合物，及其用於製備調節血糖、減肥或降低醣化終產物的產生的組合物。
世界衛生組織（WHO）建議糖的攝取量在總熱量的10%以下，等同於每天糖攝取量不可超過25克。
研究指出，攝取過量糖類，除了提高蛀牙的機率外，還會誘發攝取者的胰島素抗性、增加肥胖機率、代謝症候群機率及罹患脂肪肝的機率，並使血壓、血糖、血脂升高，進而增加心血管疾病風險。
當人體攝取糖後，在人體中糖與蛋白質相互聚合並經過一不可逆反應後產生不可還原的物質，即醣化終產物（Advanced glycation end products, AGEs）。
醣化終產物會改變及影響蛋白質的正常功能。舉例來說，醣化終產物會與其他蛋白質連成大分子，進而降低蛋白質被代謝的機會。此外，醣化終產物也會使DNA產生移位現象，造成DNA損傷，進而影響DNA正常功能。並且，醣化終產物除了於人體內自行生成外，亦充斥於日常飲食中。除了影響肌膚外，醣化終產物會透過腸道吸收而影響人體全身器官。
因此，減少糖類的攝取可降低對身體的危害，如降低慢性疾病的風險。
在一些實施例中，一種釀酒酵母TCI907（Saccharomyces cerevisiae TCI907），其中釀酒酵母TCI907寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 920118。
在一些實施例中，一種組合物，其包括釀酒酵母菌TCI907、釀酒酵母菌TCI907的代謝產物或其組合，其中釀酒酵母TCI907寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 920118。
在一些實施例中，一種釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物在製備一調節血糖的組合物之用途，其中釀酒酵母TCI907寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 920118。
在一些實施例中，一種釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物在製備一減肥的組合物之用途，其中釀酒酵母TCI907寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 920118。
在一些實施例中，一種釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物在製備一降低醣化終產物的產生的組合物之用途，其中釀酒酵母TCI907寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 920118。
綜上所述，任一實施例的釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物可用以製備組合物。並且，釀酒酵母TCI907寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 920118。在一些實施例中，組合物包括釀酒酵母菌TCI907、釀酒酵母菌TCI907的代謝產物或其組合。在一些實施例中，釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物可用於製備調節血糖、減肥或降低醣化終產物的產生的組合物。並且，釀酒酵母菌TCI907及/或釀酒酵母菌TCI907的代謝產物具有抑制澱粉分解酶活性或/及消耗糖類的功能。在一些實施例中，釀酒酵母菌TCI907具有提高宿主基礎代謝力及降低宿主體內醣化終產物的產生的功能。
釀酒酵母TCI907（Saccharomyces cerevisiae TCI907），是分離自生啤酒的釀酒酵母的菌株。釀酒酵母TCI907以寄存編號BCRC 920118寄存於財團法人食品工業發展研究所。並且，此釀酒酵母TCI907具有良好的消耗糖類的能力。此外，當宿主服用釀酒酵母TCI907時，此釀酒酵母TCI907具有與宿主競爭糖類的能力，進而調控宿主的血糖。
需要特別說明的是，「消耗糖類」是指釀酒酵母TCI907自身「消耗單醣」的能力，也是指釀酒酵母TCI907與宿主「競爭單醣」的能力。
釀酒酵母TCI907為好氧酵母，呈卵形。釀酒酵母TCI907的菌落為不透明乳白色狀，且其菌落的表面光滑、邊緣整齊。釀酒酵母TCI907生長的溫度為28℃至37℃。並且，可於酸鹼值（pH值）為3至7的環境下生存。
在一些實施例中，釀酒酵母TCI907具有耐胃酸膽鹽之功能。舉例來說，釀酒酵母TCI907於胃模擬環境（pH值3-4）的存活率為99.4%，且於腸道模擬環境（pH值7）的存活率為99.8%。
因此，釀酒酵母TCI907可在人體腸胃道環境定殖，進而與宿主競爭所攝取的糖類，以降低宿主吸收糖類的能力及協助人提消耗所吸收的糖類（如葡萄糖）。並且，釀酒酵母TCI907更具有降低醣化終產物產生的能力。舉例來說，當宿主對於糖類的吸收能力降低時，可降低宿主體內醣化終產物的產生。
在一些實施例中，透過培養釀酒酵母TCI907，並透過離心分離釀酒酵母TCI907菌體及上清液後，將上清液經過濾後可取得釀酒酵母TCI907的代謝產物。換言之，釀酒酵母TCI907的代謝產物包括釀酒酵母TCI907進行代謝後分泌至培養液中的物質。在一些實施例中，釀酒酵母TCI907的代謝產物更包括用以培養釀酒酵母TCI907的酵母培養液，且此酵母培養液已培養過釀酒酵母TCI907，但此酵母培養液不包含釀酒酵母TCI907菌體。在一示範例中，將釀酒酵母TCI907以酵母提取物蛋白腖葡萄糖培養基（YPD培養基）於28℃下16小時得到含有釀酒酵母TCI907菌體及其代謝產物的菌液。接著，將菌液以轉速5000rpm離心15分鐘以分離釀酒酵母TCI907菌體及含有釀酒酵母TCI907代謝產物的上清液。取上清液以0.22微米（μm）的濾網過濾上清液以得到釀酒酵母TCI907的代謝產物。
於此，用語「代謝產物」意為培養酵母時，經此酵母代謝後所分泌至培養液中之物質，或者為經此酵母代謝後所分泌至培養液中之物質與培養此酵母的酵母培養液，但不包含此酵母本體。
在一些實施例中，釀酒酵母菌TCI907及/或釀酒酵母TCI907的代謝產物具有抑制澱粉分解酶活性的功能。舉例來說，當宿主服用釀酒酵母菌TCI907及/或釀酒酵母TCI907的代謝產物時，可抑制宿主體內的澱粉分解酶，並減少宿主攝取的澱粉於體內轉化為糖類的效率，進而達到降低血糖的效果。
在一些實施例中，釀酒酵母菌TCI907及/或釀酒酵母TCI907的代謝產物具有消耗糖類的功能。舉例來說，於宿主體內定植的釀酒酵母菌TCI907可與宿主爭取糖類，並協助宿主消耗糖類（如葡萄糖）。
在一些實施例中，釀酒酵母菌TCI907及/或釀酒酵母TCI907的代謝產物具有降低脂肪累積的功能。舉例來說，釀酒酵母菌TCI907的代謝產物可降低脂肪細胞內脂質油滴的含量，進而可以降低脂肪堆積。
在一些實施例中，釀酒酵母菌TCI907具有降低宿主體內醣化終產物的產生的功能，進而降低該醣化終產物造成的氧化壓力。在一些實施例中，釀酒酵母菌TCI907的代謝產物可用以降低醣化終產物對於細胞所產生的傷害。
在一些實施例中，釀酒酵母菌TCI907具有提高宿主基礎代謝力的功能。在一些實施例中，釀酒酵母菌TCI907的代謝產物可提高丙酮酸含量，並可提高肌肉細胞對熱量的消耗。
基此，釀酒酵母菌TCI907及/或釀酒酵母TCI907的代謝產物可用以製備一組合物。換言之，組合物包括釀酒酵母菌TCI907、釀酒酵母菌TCI907的代謝產物或其組合。
並且，在一些實施例中，釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物在製備調節血糖的組合物。
在一些實施例中，釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物在製備減肥的組合物。
在一些實施例中，釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物在製備降低醣化終產物的產生的組合物。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有效含量的釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地（parenterally）、口服的、或局部地（topically）投藥劑型。
在一些實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）或類似之物。
舉例來說，當組合物的劑型為膠囊狀時，組合物的劑量為5x107
菌落形成單位/膠囊（CFU/cap）的該釀酒酵母TCI907。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為食用組合物。換言之，食用組合物包含特定含量的釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物。在一些實施例中，前述之食用組合物可為食品產品或食品添加物（food additive）。在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、健康食品（health foods）以及膳食補充品（dietary supplements）。
例一：菌種篩選及鑑定
自生啤酒及韓國濁酒中分別取適量酒液於固態YPD培養基（BD Difco™ YPD Broth，型號DF0428-17-5）上塗盤並於28℃下培養至單一菌落形成。各別從生啤酒塗盤的固態YPD培養盤上及韓國濁酒塗盤的固態YPD培養盤上挑取多個單一菌落，並以酵母菌內轉錄間隔區（internal transcribed spacer, ITS）基因進行菌種鑑定。透過聚合酶連鎖反應（PCR）得到此些單一菌落的ITS基因（即SEQID NO:1至SEQID NO:5），接著，利用美國國家生物技術資訊中心（NCBI）網站，將SEQID NO:1至SEQID NO:5所示的基因序列分別與其他釀酒酵母亞種（如，Saccharomyces cerevisiae YJM1383（如表1標示YJM1383）、Saccharomyces cerevisiae YJM693（如表1標示YJM693）等）之ITS基因進行序列比對後可知，此些單一菌落的ITS基因序列與其他釀酒酵母亞種（Saccharomyces cerevisiae）相似性如表1所示。基此，此些單一菌落為釀酒酵母的菌株，並且依照表1編號命名。
表1
| 菌株編號 | 分離來源 | ITS基因的序列編號 | 相似性 | 釀酒酵母亞種 （以亞種編號標示） |
| TCI907 | 生啤酒 | SEQ NO:1 | 97%-98% | YJM1383、YJM693、10-1358 |
| Y01 | 韓國濁酒 | SEQ NO:2 | 96% | bcpca-qj-6 |
| Y02 | 韓國濁酒 | SEQ NO:3 | 96% | M01614、TU74、K46A、bcpca-qj-6 |
| Y12 | 生啤酒 | SEQ NO:4 | 92%-93% | TU121、CP1、TU14、TU9、YMA1 |
| Y17 | 生啤酒 | SEQ NO:5 | 96%-97% | bcpca-qj-6、TU14 |
其中，將分離自生啤酒且與其他釀酒酵母亞種的相似性達97%至98%的單一菌落，命名為釀酒酵母TCI907。並且，將釀酒酵母TCI907以寄存編號BCRC 920118寄存於財團法人食品工業發展研究所。
例二：耐胃酸膽鹽試驗
於此，將釀酒酵母TCI907以緩衝液、人工胃液（pH 3）及人工腸液（pH 7）進行測試，以確認釀酒酵母TCI907於生物體消化道中的酸鹼耐受性。其中，緩衝液為0.2莫爾濃度（M）氯化鉀（KCL, 型號Sigma-Aldrich P9333）且pH值為7。人工胃液為0.2 M氯化鉀且pH值為3。人工腸液為0.2 M氯化鉀及0.3重量%的牛膽鹽（購自Difco™ Oxgall，型號212820）且pH值為7。
進行一活化程序將釀酒酵母TCI907活化。首先，將釀酒酵母TCI907凍菌以10體積%的菌量培養於液態YPD培養基（BD Difco™ YPD Broth，型號DF0428-17-5）中，並於28℃下培養16小時，以活化釀酒酵母TCI907。
接著，將活化後的釀酒酵母TCI907菌液取1體積%的濃度接種至20毫升的待測溶液中，然後以轉速50rpm於37℃下震盪培養3小時。其中，三個組別的待測溶液分別為人工胃液（實驗組）、人工腸液（實驗組）及氯化鉀緩衝液（控制組）。從培養後的菌液取100微升（μL）的菌液塗盤，並於28℃下靜置培養3天，並於3天後以肉眼計數各組別的活菌數（計算固態YPD培養基上的菌落數）。
請參閱圖1及圖2。圖式中釀酒酵母TCI907的存活力為計數後的活菌數，並以log CFU/mL表示。其中，log CFU/mL代表每毫升菌液含有的菌落形成單位（CFU，colony-forming unit）並以對數（log10
）表示。由圖1可知，控制組的釀酒酵母TCI907的存活力為7.75 log CFU/mL，及人工胃液實驗組的釀酒酵母TCI907的存活力為7.70 log CFU/mL。由此可知，人工胃液實驗組的活菌數為控制組的99.4%。由圖2可知控制組的釀酒酵母TCI907的存活力為7.75 log CFU/mL，及人工腸液實驗組的釀酒酵母TCI907的存活力為7.74 log CFU/mL。由此可知，人工腸液實驗組的活菌數為控制組的99.8%。
因此，釀酒酵母TCI907具有耐胃酸膽鹽之功能。
例三：糖類消耗試驗
將釀酒酵母TCI907、釀酒酵母Y01、釀酒酵母Y02、釀酒酵母Y12及釀酒酵母Y17以前述活化程序分別活化，以利進行後續試驗。
將YPD培養液的糖度以葡萄糖（Sigma-Aldrich，型號G8270）調整為每升的YPD培養液中含有20克的葡萄糖（即葡萄糖的濃度為20克/升（g/L）），以形成調整後YPD培養液。接著，分別調整活化後的釀酒酵母TCI907、釀酒酵母Y01、釀酒酵母Y02、釀酒酵母Y12及釀酒酵母Y17的菌量，使其吸光值（OD600
）為1。接著，將1體積%之調整菌量後的各釀酒酵母的菌株接種於調整後YPD培養液，並於28℃下培養18小時，以形成各釀酒酵母菌株的培養後菌液。將各培養後菌液以轉速5000rpm離心15分鐘，並取離心後得到的上清液稀釋10倍後，並以血糖計（瑞特血糖機，型號GM550）檢測葡萄糖濃度。控制組則以血糖計（瑞特血糖機，型號GM550）檢測稀釋10倍後之調整後YPD培養液的葡萄糖濃度。
請參閱圖3。各釀酒酵母菌株分別以其編號TCI907、Y01、Y02、Y12及Y17標示於圖3。
控制組（其葡萄糖未經釀酒酵母消耗）的葡萄糖濃度為20 g/L。釀酒酵母TCI907組別的上清液測得的葡萄糖濃度為5.3 g/L。釀酒酵母Y01組別的上清液測得的葡萄糖濃度為10.3 g/L。釀酒酵母Y02組別的上清液測得的葡萄糖濃度為11.5 g/L。釀酒酵母Y12組別的上清液測得的葡萄糖濃度為10.5 g/L。釀酒酵母Y17組別的上清液測得的葡萄糖濃度為11.2 g/L。換言之，釀酒酵母TCI907組別的上清液測得的葡萄糖濃度最低，即釀酒酵母TCI907耗糖率達73.5%，具有較其他釀酒酵母菌株佳的耗糖能力。
由此可知，釀酒酵母TCI907具有消耗葡萄糖的能力。當宿主服用釀酒酵母TCI907後，定殖於宿主體內的釀酒酵母TCI907能協助宿主消耗葡萄糖。
例四：釀酒酵母TCI907代謝產物的製備
以前述活化程序將釀酒酵母TCI907活化後，將10體積%的活化後的釀酒酵母TCI907接種於YPD培養基中，並於28℃下培養16小時。接著，以轉速5000rpm離心15分鐘以分離釀酒酵母TCI907菌體及含有釀酒酵母TCI907代謝產物的上清液。取上清液並以0.22微米（μm）的濾網過濾以得到釀酒酵母TCI907的代謝產物。
於此，可知釀酒酵母TCI907的代謝產物為釀酒酵母TCI907進行代謝後分泌至培養液中的物質以及用以培養此釀酒酵母TCI907的YPD培養基（但不含菌體）。
例五：澱粉分解酶抑制試驗
於此，所使用的溶液包括含有6mM氯化鈉的0.02莫爾濃度（M）磷酸鈉緩衝溶液（Sodium phosphate buffer）（以下簡稱NaCl-Pi緩衝溶液）、1%澱粉溶液、二硝基水楊酸顏色試劑（Dinitrosalicylic acid color reagent，以下稱終止劑）及α-澱粉分解酶（α-amylase）溶液（5單位/毫升）。其中，NaCl-Pi緩衝溶液以磷酸一氫鈉（購自J.T.Baker，編號3828-01）、磷酸二氫鈉（購自Sigma，編號04270）、氯化鈉（購自第一化工，編號C4B07）及水配置而成。1%澱粉溶液以可溶性澱粉（Soluble starch，購自Sigma，型號S9765）溶解於NaCl-Pi緩衝溶液而得之。終止劑以3,5-二硝基水楊酸（Sigma，型號D0550）、2當量濃度（N）氫氧化鈉（NaOH，購自Macron，編號7708-10）溶液及去離子水配置。α-澱粉分解酶溶液是以α-澱粉分解酶（購自Sigma，型號A3176）及NaCl-Pi緩衝溶液配置，進而得到每毫升5單位的α-澱粉分解酶溶液。
於此，分別以釀酒酵母TCI907的代謝產物（由例四所製備）與NaCl-Pi緩衝溶液做為測試樣本，並依據下表2進行澱粉分解酶的酵素活性測試。
表2
| 測試組別 | 測試樣品 | 反應酵素 | 反應基質 |
| 實驗組（0分鐘） | 釀酒酵母TCI907的代謝產物 | α-澱粉分解酶 | 澱粉 |
| 實驗組（10分鐘） | 釀酒酵母TCI907的代謝產物 | α-澱粉分解酶 | 澱粉 |
| 控制組（0分鐘） | NaCl-Pi緩衝溶液 | α-澱粉分解酶 | 澱粉 |
| 控制組（10分鐘） | NaCl-Pi緩衝溶液 | α-澱粉分解酶 | 澱粉 |
其中，實驗組（0分鐘）及控制組（0分鐘）為反應起始點（0分鐘）的測試組別，其代表α-澱粉分解酶並無與澱粉反應。而實驗組（10分鐘）及控制組（10分鐘）為反應終止點（10分鐘）的測試組別，其代表α-澱粉分解酶與澱粉進行10分鐘反應。並且，各測試組別皆進行三重覆實驗。
依照表2，分別取200μL的測試樣品至離心管中，接著分別於各離心管中加入200μL的α-澱粉分解酶溶液（5單位/毫升），並將裝有測試樣品及α-澱粉分解酶溶液的離心管進行震盪使測試樣品及α-澱粉分解酶溶液混合均勻以形成待反應溶液，並將裝有待反應溶液的離心管置於25℃環境下反應10分鐘。
接著，將反應起始點（0分鐘）的測試組別加入400μL的終止劑至離心管中與待反應溶液混合均勻，再分別加入200μL的1%澱粉溶液並於25℃下靜置10分鐘以形成未反應溶液。
而反應終止點（10分鐘）的測試組別則加入200μL的1%澱粉溶液至離心管中，使1%澱粉溶液與待反應溶液混合均勻以形成混合溶液。裝有混合溶液的離心管置於25℃下反應10分鐘，然後再加入400μL的終止劑與反應溶液混合均勻，以停止澱粉與α-澱粉分解酶反應，以形成反應溶液。
然後，將裝有未反應溶液的離心管與裝有反應溶液的離心管置於沸水（100℃）中5分鐘，然後再冷卻至室溫（25℃），以形成待測溶液。
從離心管中分別取出150μL待測溶液與850μL水混合以稀釋待測溶液。接著取200μL稀釋後的待測溶液至96孔盤中，並以ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酵素結合免疫吸附法）讀取儀（廠牌：BioTek）測量其在540nm下之吸光值。
根據下列公式（1）計算各測試組別相對於控制組的澱粉分解酶的活性百分比（%）。換言之，是將控制組的澱粉分解酶的活性百分比視為100%，來計算實驗組與對照組的澱粉分解酶的活性百分比（%）。
公式（1）
% α-Amylase 活性 =
×100% （1）
其中，% α-Amylase活性代表澱粉分解酶活性百分比（%）；A540nm
（Sample10min
-Sample0min
）代表反應終止點（10分鐘）的測試組別在540nm下之吸光值與反應起始點（0分鐘）的測試組別在540nm下之吸光值之間的差值，且此測試組別為實驗組。A540nm
（Control10min
-Control0min
）代表反應終止點（10分鐘）的控制組在540nm下之吸光值與反應起始點（0分鐘）的控制組在540nm下之吸光值之間的差值。
由實驗組的測量結果可知，A540nm
（Sample10min
-Sample0min
）的數值為0.482，且A540nm
（Control10min
-Control0min
）的數值為0.563。並且，依照公式（1）可以得到實驗組的澱粉分解酶活性百分比為85.6%。換言之，當控制組的澱粉分解酶的活性百分比視為100%時，澱粉分解酶活性被抑制的百分比為14.4%。
由此可知，釀酒酵母TCI907的代謝產物具有抑制澱粉分解酶的活性的功能。因此，當宿主服用釀酒酵母TCI907時，定殖於宿主體內的釀酒酵母TCI907可協助宿主減少宿主所攝取的澱粉於體內轉化為糖的效率，進而達成降低宿主血糖的功效。
基此，釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物可用於製備調節血糖的組合物。
例六：細胞氧化程度測試
於此，以螢光探針DCFH-DA（Sigma/SI-D6883-50MG）配合流式細胞儀（廠牌BD Accuri），測定人類單核細胞（THP1細胞；購自ATCC®
TIB-202™
）因醣化終產物導致的活性氧物質含量的變化。
並且，所使用的溶液包括添加有10體積%胎牛血清（FBS, fetal bovine serum；購自Gibco）、1體積%抗生素-抗真菌藥（Antibiotic-Antimycotic）、10mM兩性離子磺酸緩衝劑（HEPES）、1mM丙酮酸鈉（sodium pyruvat）及0.05mM2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol）的1640羅斯威爾帕克紀念研究所培養基（Roswell Park Memorial Institute 1640, RPMI 1640）（以下稱RPMI培養基）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（PBS, Phosphate-buffered saline；購自Gibco）、DCFH-DA溶液及醣化終產物（AGEs）。DCFH-DA溶液是將二氯二氫螢光素二乙酸酯（2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA；產品編號SI-D6883-50MG，購自Sigma）溶於二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide，DMSO；購自Sigma）以配製成5毫克/毫升的DCFH-DA溶液。並且，醣化終產物是將0.1M磷酸緩衝液（phosphate buffer, pH7.4）、濃度為3毫克/毫升的牛皮膠原蛋白第一型（Bovine skin collagen type I）溶液、2M果糖（fructose）溶液及去離子水以5：2：2：1的體積比混合，並於60℃反應一週得之。
細胞氧化程度測試分為實驗組（添加釀酒酵母TCI907的代謝產物，且添加醣化終產物）、對照組（未添加釀酒酵母TCI907的代謝產物，但添加醣化終產物）及控制組（未添加釀酒酵母TCI907的代謝產物，且未添加醣化終產物）三組進行。其中，釀酒酵母TCI907的代謝產物為例四所製備。
首先，將人類單核細胞以每孔2×105
個的數量接種於每孔含2毫升RPMI培養基之6孔培養盤中，並於37℃下培養24小時。接著，更換培養過人類單核細胞的RPMI培養基，並加入2毫升測試RPMI培養基於各孔中，並於37℃下培養24小時。其中，實驗組的測試RPMI培養基為添加0.25體積%例四製備的釀酒酵母TCI907的代謝產物的RPMI培養基。對照組及控制組的測試RPMI培養基為單純的RPMI培養基。
更換測試RPMI培養基為反應培養基，並於37℃下培養24小時。其中，實驗組及對照組的反應培養基為含有160μg/mL醣化終產物的RPMI培養基，而控制組的反應培養基為單純RPMI培養基。
於反應培養基中以每毫升反應培養基添加5微克DCFH-DA的比例添加DCFH-DA溶液，並於37℃下培養30分鐘。
接著，收集並以轉速400xg離心5分鐘以得到三組的人類單核細胞。並且各組分別進行三次的1毫升1XPBS回溶、離心及去除上清液的清洗步驟後，以1毫升1XPBS回溶清洗後的人類單核細胞，以形成三組的待測細胞液。
使用流式細胞儀（廠牌BD Accuri）偵測三組的待測細胞液中DCFH-DA的螢光信號。進行螢光偵測之激發波長為450奈米（nm），放射波長為550 nm。由於DCFH-DA進入細胞後會先被水解為二氯二氫螢光素（DCFH），再被醣化終產物生成的活性氧物質氧化為可發出綠色螢光的二氯螢光素（DCF），經DCFH-DA處理之細胞的螢光強度可反應人類單核細胞內活性氧物質含量，進而得到細胞內氧化程度的百分比，如圖4所示。需要特別說明的是，圖4中的細胞內氧化程度是以百分比呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，且各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析。在圖4中，「***」代表其p值小於0.001 。
請參閱圖4。控制組的細胞內氧化程度為0.33%，代表未添加醣化終產物的人類單核細胞並未受到氧化壓力的影響。對照組的細胞內氧化程度為59.63%，代表醣化終產物對人類單核細胞產生氧化壓力。實驗組的細胞內氧化程度為25.23%，其細胞內氧化程度低於對照組的細胞內氧化程度34.4%，代表釀酒酵母TCI907的代謝產物可降低醣化終產物對人類單核細胞造成的氧化壓力。換言之，相較於對照組的氧化程度，實驗組的氧化程度下降58%。由此可知，釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物可降低醣化終產物對於細胞所產生之傷害。
基此，釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物可用於製備降低醣化終產物的產生的組合物。
例七：脂肪堆積檢測
於此，所使用的前脂肪細胞增殖培養基（pre-adipocyte expansion medium）為添加有20體積% FBS（品牌：Gibco）及1體積%盤尼西林-鏈黴素之最低必需培養基α（Minimum Essential Medium Alpha，MEM α，品牌：Gibco)。所使用的分化培養基（differentiation medium）為添加有20體積% FBS（品牌：Gibco）及1體積%盤尼西林-鏈黴素之MEMα（品牌：Gibco)。並且，將油-紅O染色試劑（品牌：Sigma）徹底溶解於100%異丙醇（isopropanol，供應商：ECHO）以配製3mg/mL之油-紅O染色試劑的儲備溶液。為獲得可供使用的油-紅O工作溶液（oil-red O working solution），於使用前即時將油-紅O染色試劑的儲備溶液以二次水（ddH2O）稀釋至濃度1.8mg/mL，即為60%油-紅O染色試劑的儲備溶液。
首先，以每孔8×104
個細胞的細胞數，將小鼠骨髓基質細胞株OP9（購自ATCC®
，編號CRL-2749™）接種於含有500μL前脂肪細胞增殖培養基的24孔培養盤的各孔中，並置於37°C下培養7天。於7天的培養期間，每3天更換一次新鮮的500μL分化培養基。於培養7天後，使用顯微鏡（廠牌：ZEISS）觀察各孔中的細胞內的油滴（lipid droplet）形成以確認細胞完全分化成脂肪細胞，供後續實驗使用。
在培養7天後，將脂肪細胞分成2個組別：實驗組以及控制組。移除各組別的分化培養基，並更換成每孔500μL實驗培養基，然後置於37°C下接續培養7天。於7天的培養期間，每3天更換一次新鮮的500μL實驗培養基。其中，實驗組的實驗培養基為含有0.25體積%例四中所得到的釀酒酵母TCI907代謝產物的分化培養基。控制組的實驗培養基為單純的分化培養基（即不含釀酒酵母TCI907代謝產物）。
接著，移除各孔中的實驗培養基並以1xPBS（杜氏磷酸緩沖鹽溶液，Dulbecco’s phosphate buffered saline；購自Gibco）潤洗二次。繼而，於各孔內添加1mL的10%甲醛（formaldehyde，供應商：ECHO）並於室溫下培養30分鐘，藉以固定細胞。之後，移除各孔內的甲醛並以1mL PBS對各孔潤洗二次。於再次潤洗後，添加1mL的60%異丙醇至每孔中並作用1分鐘。接著，移除異丙醇，再添加1mL油-紅O工作溶液並於室溫下作用1小時。於作用1小時候，移除油-紅O工作溶液並以1mL的60%異丙醇快速退染5秒。接著，加入100%異丙醇至各孔中，並置於振盪器（shaker）上反應10分鐘以溶解染劑。然後，從各孔中取100μL前述之染劑-異丙醇溶液至96孔培養盤並於510nm的波長下以ELISA讀取儀（廠牌：BioTek）讀取各孔的吸光值（OD510
）。
於量測後，計算脂質油滴相百分比（%），如圖5所示。換言之，於此，是將控制組的脂質油滴百分比視為100%來計算實驗組的脂質油滴百分比。並且，實驗組及控制組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析。在圖5中，「**」代表在與控制組比較下其p值小於0.01。
請參閱圖5。相較於控制組，實驗組的脂質油滴百分比為91.8%，且其可減少8.2%的油滴量。於此，實驗組的脂質油滴百分比相較於控制組有顯著地降低。由此可知，釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物能有效地抑制脂肪累積，具有減少受體的脂肪形成的功能，進而達成減肥之功效。
因此，釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物可用於製備減肥的組合物。
例八：丙酮酸含量檢測
於此，所使用的前處理培養基為添加有3.7克/升碳酸氫鈉（sodium bicarbonate）、10體積% FBS（品牌：Gibco）及1體積%盤尼西林-鏈黴素的DMEM培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）。所使用的處理培養基為含有1體積% FBS及1體積%馬血清（horse serum）的DMEM培養基。
首先，將小鼠骨骼肌肉細胞（mouse skeletal muscle cells, 以下稱C2C12細胞；購自ATCC®
CRL-1772™）以每孔1×105
個細胞的細胞數接種至每孔含有2毫升前處理培養基的6孔盤中，並於37°C下培養至細胞於每孔培養盤底部成均勻的單細胞層（即，細胞匯合率（confluence）達100%）。接著，更換培養基為處理培養基繼續培養C2C12細胞直到C2C12細胞分化融合為多核的肌小管（myotubes）。
接著，將分化後的肌小管分為2個組別：實驗組以及控制組。移除各組別的處理培養基，並更換成每孔2毫升測試培養基，然後置於37°C下接續培養48小時。其中，實驗組的測試培養基為含有0.25體積%例四中所得到的釀酒酵母TCI907代謝產物的處理培養基。控制組的測試培養基為單純的處理培養基（即不含釀酒酵母TCI907代謝產物）。
於培養48小時後，以丙酮酸比色/螢光試劑套組（Pyruvate Colorimetric/Fluorometric Assay Kit，購自BioVision）的丙酮酸測定緩衝液（Pyruvate Assay Buffer）取100μL至各孔以裂解培養後的肌小管，並形成細胞溶液。將細胞溶液以轉速10000g在4°C離心10分鐘後，收集上清液。接著。各組分別取20μL的上清液至96孔盤中，並以丙酮酸測定緩衝液調整至每孔體積為50μL。接著，各孔中加入50μL的反應混合物（Reaction Mix），並於混合後於室溫反應30分鐘。其中，每50μL反應混合物包括46μL丙酮酸測定緩衝液、2μL丙酮酸探針（Pyruvate Probe）及2μL酵素混合物（Enzyme Mix）。
並且，針對比色測定，利用丙酮酸比色/螢光試劑套組的丙酮酸標準品（濃度為nmol/μL）製作標準曲線。然後，配置0 nmol/孔（well）、2 nmol/well、4 nmol/well、6 nmol/well、8 nmol/well、及10 nmol/well之丙酮酸的標準溶液，並以丙酮酸測定緩衝液調整至每孔體積為50μL，再於各孔中加入50μL的反應混合物（Reaction Mix）混合均勻後反應30分鐘以得到標準反應溶液。接著，測量其在570nm下之吸光值，以獲得標準曲線。
並且，於570nm的波長下測量實驗組及對照組的吸光值，並利用標準曲線以線性內插法換算出各組的丙酮酸含量，進而得到控制組及實驗組的丙酮酸含量相對倍率，如圖6所示。需要特別說明的是，圖6中的丙酮酸含量是以相對倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，且各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析。在圖6中，「***」代表其p值小於0.001 。
請參閱圖6。將控制組的丙酮酸相對含量視為1時（即控制組的丙酮酸相對含量為100%），實驗組的丙酮酸相對含量為2.67（即控制組的丙酮酸相對含量為267%）。換言之，實驗組的丙酮酸含量高於控制組，代表實驗組的肌肉細胞（肌小管）對熱量的消耗相較於控制組達2.67倍。丙酮酸作為基礎代謝的指標，基此，釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物能有效提高宿主肌肉細胞的基礎代謝率。
例九：人體試驗
為進一步確認釀酒酵母TCI907對於人體的影響，令8位受試者每日於飯前30分鐘服用1顆釀酒酵母TCI907的活酵母膠囊（每顆膠囊含有5X107
CFU（即5x107
CFU/cap）的釀酒酵母TCI907），並服用4週。其中，8位受使者的身高體重指數（BMI）大於或小等於24，或為體脂高的族群（男性體脂率大於或等於25重量%、女性體脂率大於或等於30重量%）。並且，每顆膠囊含有50毫克釀酒酵母TCI907之酵母粉。
並且，於試驗前（即未開始服用釀酒酵母TCI907膠囊前，並視為第0週）及於試驗後（即服用釀酒酵母TCI907膠囊4週後，並視為第4週）分別進行體重、全身體脂率、空腹血糖值及餐後血糖值的檢測。其中，體重和全身體脂率是利用體重體脂計（TANITA四肢與軀幹體組成計BC601）進行檢測，如圖7及圖8所示。空腹血糖值是於試驗前及試驗後令8位受試者空腹8小時後，以採血管指尖採血，並將血液送至檢驗所（立人醫事檢驗所）測定空腹血糖值，如圖9所示。飯後血糖值則是於試驗前及試驗後令8位受試者採完空腹血液後，服用4片土司（固定糖量），並於服用吐司後第30、60、120分鐘以採血管指尖採血，並將血液送至檢驗所測定餐後血糖值，如圖10所示。
需要特別說明的是，第0週的量測結果與第4週的量測結果之間及飯後各時間點之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析，如圖7、圖9及圖10所示。在圖7中，「*」代表在與第0週比較下其p值小於0.05。在圖9及圖10中，「*」代表在與第0週比較下其p值小於0.05，且「**」代表在與第0週比較下其p值小於0.01。
請參閱圖7。於試驗前（即圖7第0週），8位受試者的平均體重為72.6公斤，而在試驗後（即圖7第4週），8位受試者的平均體重為72.1公斤。換言之，經過4週每日服用釀酒酵母TCI907的活酵母膠囊後，受試者的平均體重下降0.5公斤。基此，釀酒酵母TCI907能降低體重。
請參閱圖8。於試驗前（即圖8第0週），8位受試者的平均全身體脂率為37.9%，而在試驗後（即圖8第4週），8位受試者的平均全身體脂率為37.3%。換言之，經過4週每日服用釀酒酵母TCI907的活酵母膠囊後，受試者的平均全身體脂率下降0.6%。基此，釀酒酵母TCI907能降低全身體脂率。
因此，釀酒酵母TCI907具有減肥的功效。
請參閱9。於試驗前（即圖9第0週），8位受試者的平均空腹血糖值為101.9毫克/公合，而在試驗後（即圖9第4週），8位受試者的平均空腹血糖值為95.1毫克/公合。換言之，經過4週每日服用釀酒酵母TCI907的活酵母膠囊後，受試者的平均空腹血糖值下降6.8毫克/公合。請參閱圖10。比較試驗前（即圖10第0週曲線）及試驗後（即圖10第4週曲線）可知，8位受試者的平均餐後血糖值在經過4週每日服用釀酒酵母TCI907的活酵母膠囊後均降低。換言之，釀酒酵母TCI907能改善餐後血糖變化。
基此，釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物具有調節血糖的功效。
綜上所述，根據本發明任一實施例的釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物，其可用以製備組合物。在一些實施例中，釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物可用於製備調節血糖、減肥或降低醣化終產物的產生的組合物。並且，釀酒酵母菌TCI907及/或釀酒酵母菌TCI907的代謝產物具有抑制澱粉分解酶活性的功能。釀酒酵母菌TCI907及/或釀酒酵母菌TCI907的代謝產物具有消耗糖類的功能。在一些實施例中，釀酒酵母菌TCI907具有提高宿主基礎代謝力及降低宿主體內醣化終產物的產生的功能。基此，以釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物製備的組合物，具有以下至少一項作用：調節血糖、降低全身體脂率、降低體重、提高基礎代謝力、降低醣化終產物造成的傷害或其組合。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
圖1是釀酒酵母TCI907於胃模擬環境中的存活力實驗的結果圖；
圖2是釀酒酵母TCI907於腸模擬環境中的存活力實驗的結果圖；
圖3是釀酒酵母TCI907及其他釀酒酵母菌株的耗糖能力實驗的結果圖；
圖4是釀酒酵母TCI907的代謝產物抑制細胞內氧化的結果圖；
圖5是脂質油滴百分比的相對測量結果圖；
圖6是丙酮酸含量的相對倍率結果圖；
圖7是第0週及第4週的體重數據結果圖；
圖8是第0週及第4週的全身體脂率數據結果圖；
圖9是第0週及第4週的空腹血糖數據結果圖；以及
圖10是第0週及第4週的餐後血糖數據結果圖。
TW中華民國 財團法人食品工業發展研究所 2019/10/24 BCRC 920118。
Claims (10)
- 一種釀酒酵母TCI907(Saccharomyces cerevisiae TCI907)，其中釀酒酵母TCI907寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 920118。
- 一種組合物，其包括釀酒酵母菌TCI907、該釀酒酵母菌TCI907的代謝產物或其組合，其中該釀酒酵母TCI907寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 920118。
- 如請求項2所述之組合物，其中該釀酒酵母菌TCI907及/或該釀酒酵母菌TCI907的該代謝產物具有抑制澱粉分解酶活性的功能。
- 如請求項2所述之組合物，其中該釀酒酵母菌TCI907及/或該釀酒酵母菌TCI907的該代謝產物具有消耗糖類的功能。
- 如請求項2所述之組合物，其中該釀酒酵母菌TCI907具有降低細胞內的氧化壓力。
- 如請求項2所述之組合物，其中該釀酒酵母菌TCI907具有提高宿主基礎代謝力的功能。
- 如請求項2所述之組合物，其中該釀酒酵母菌TCI907及/或該釀酒酵母菌TCI907的該代謝產物具有降低脂肪累積的功能。
- 一種釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物在製備一調節血糖的組合物之用途，其中釀酒酵母TCI907寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 920118。
- 一種釀酒酵母TCI907及/或其代謝產物在製備一降低細胞內氧化壓力的組合物之用途，其中釀酒酵母TCI907寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 920118。
- 如請求項8或請求項9所述之用途，其中該組合物的劑型為膠囊狀，且該組合物的劑量為5x107菌落形成單位/膠囊(CFU/cap)的該釀酒酵母TCI907。
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