CN112236457B - 新型交联海藻酸 - Google Patents

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Abstract

根据本发明，可提供式(I)和式(II)所示的海藻酸衍生物、和使用式(I)的海藻酸衍生物和式(II)的海藻酸衍生物进行惠斯根反应而得到的新型交联海藻酸。由此，可提供新型海藻酸衍生物和新型交联海藻酸。[化201]

Description

新型交联海藻酸
技术领域
本发明涉及新型海藻酸衍生物、新型交联海藻酸、它们的制造方法等。
背景技术
海藻酸是从巨藻（レッソニア）、巨囊藻（マクロシスティス）、海带（ラミナリア）、泡叶藻（アスコフィラム）、丛梗藻（ダービリア）、褐藻苷苔(Ecklonia cava)、黑海带（アラメ）、昆布等天然褐藻类的细胞壁中提取的高分子酸性多糖分子，是β-D-甘露糖醛酸( M成分)和作为其C-5差向异构体的α-L-葡糖醛酸( G成分)这2种糖醛酸1-4键合而成的直链状的杂聚物。具体而言，其化学结构是由甘露糖醛酸的均聚物嵌段( MM )、葡糖醛酸的均聚物嵌段(GG )、以及甘露糖醛酸和葡糖醛酸随机配列而得的嵌段(MG)以任意的排列和比例复杂地进行键合而得的嵌段共聚物。海藻酸在医疗、生物技术、化妆品、纤维、造纸、食品等领域中被广泛利用。
海藻酸的1价盐的海藻酸碱金属盐类(例如，海藻酸钠等)为水溶性，但2价盐的海藻酸碱土金属盐类(例如，海藻酸钙等)具有通过金属离子交联而凝胶化(不溶化)的性质，利用该性质进行了改变或成形为适于各种用途的海藻酸碱金属盐类的尝试。
为了探索多糖类(例如，透明质酸、硫酸软骨素、海藻酸等)改变或成形为各种材料的可能性和其物性(例如，强度、溶胀性等)的改良，迄今进行了各种例如关于通过共价键交联而得的交联多糖的研究等。
作为获得交联多糖的方法，具体而言，已知(1)使用甲醛等醛交联剂的交联法(专利文献1：国际公开第2011/028031号小册子)、(2)利用多糖中的羧基和羟基的自交联法(专利文献2：国际公开第1989/10941号小册子)、(3)使用同双官能性交联剂(二环氧化物、二乙烯基砜、二胺、或二酰肼等)或异双官能性交联剂(表卤代醇等)的交联法(专利文献3：国际公开第2009/073437号小册子)。
此外，已知(4)通过导入了光反应性基团(肉桂酸、取代肉桂酸、丙烯酸、马来酸、富马酸、呋喃基丙烯酸、噻吩丙烯酸、亚肉桂基乙酸、山梨酸、胸腺嘧啶、或香豆素等)后进行光照射的交联法(专利文献4、5：国际公开第2005/026214号小册子、日本特开平09-87236号公报)、和(5)导入了硫醇基的多糖彼此以二硫化物键进行交联的交联法和通过使用导入了硫醇基的多糖类和导入了马来酰亚胺基的多糖类进行迈克尔加成反应的交联法(专利文献6：国际公开第2008/071058号小册子)等。
进而，作为通过共价键使多糖类交联的方法，已知(6)通过使用导入了炔基的多糖类和导入了叠氮基的多糖类进行惠斯根（Huisgen）反应(1,3-偶极加成环化反应)的交联法。
使多糖类通过惠斯根反应进行交联的交联多糖在(i)国际公开第2008/031525号小册子(专利文献7)、(ii)国际公开第2012/165462号小册子(专利文献8)、(iii)国际公开第2015/020206号小册子(专利文献9)、和(iv)中国专利申请公开第106140040号说明书(专利文献10)等中被公开。
但是，(i)专利文献7涉及交联多糖，其中，通过使第1多糖为透明质酸、第2多糖为选自软骨素、硫酸化皮肤素、海藻酸或其盐等中的多糖，使在各多糖中介由连接基而导入的链状炔基和叠氮基在铜催化剂存在下进行惠斯根反应而得到，没有公开后述新型交联海藻酸。
此外，(ii)专利文献8涉及交联多糖，其中，通过使第1多糖和第2多糖为选自透明质酸、羧甲基葡聚糖、纤维素衍生物、和壳聚糖中多糖(第1多糖和第2多糖可以为同种，也可以为不同种)，使在各多糖中介由连接基(多糖与连接基以酯键键合)而导入的环状炔基和叠氮基进行惠斯根反应而得到，没有公开后述新型交联海藻酸。
此外，(iii)专利文献9涉及交联多糖，其中，通过使第1多糖为透明质酸、第2多糖为软骨素硫酸，使在各多糖中介由连接基而导入的环状炔基和叠氮基进行惠斯根反应而得到，没有公开后述新型交联海藻酸。
进而，(iv)专利文献10涉及交联多糖，其中，通过使第1多糖为壳聚糖、第2多糖为海藻酸钠，使在各多糖中介由连接基(多糖与连接基以酯键键合)而导入的环状炔基和叠氮基进行惠斯根反应而得到，没有公开后述新型交联海藻酸。
(v)专利文献11涉及使糖类与8元环炔基键合而使糖类进行衍生物化的方法，糖类为非天然的糖类(源自链球菌琼脂菌的荚膜糖类)，不是海藻酸，而且，所键合的8元环炔基的末端相对于糖类的羧基未形成酰胺键，因此与后述新型海藻酸衍生物和其制造方法不同。
(vi)非专利文献1记载了在侧链导入了环辛炔侧链的支链型海藻酸(bAlg-DBCO)，但其是由海藻酸和支链型聚乙二醇(4-arm PEG-NH2)合成的支链型海藻酸(Branchedalginic acid：bAlg)与氨基化环辛炔(DBCO-PEG-amine)反应而得到的，与后述新型海藻酸衍生物的结构不同，其使用目的也不同。
现有技术文献
专利文献
[专利文献1]国际公开第2011/028031号小册子
[专利文献2]国际公开第1989/10941号小册子
[专利文献3]国际公开第2009/073437号小册子
[专利文献4]国际公开第2005/026214号小册子
[专利文献5]日本特开平09-87236号公报
[专利文献6]国际公开第2008/071058号小册子
[专利文献7]国际公开第2008/031525号小册子
[专利文献8]国际公开第2012/165462号小册子
[专利文献9]国际公开第2015/020206号小册子
[专利文献10]中国专利申请公开第106140040号说明书
[专利文献11]国际公开第2014/111344号小册子
非专利文献
[专利文献1]Nat Commun.9(1),p2195-,2018年。
发明内容
发明要解决的课题
在上述情况下，需求获得新型的海藻酸衍生物或新型交联海藻酸。另外，也需求它们的制造方法。
用于解决问题的手段
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果分别发现了式(I)或式(II)所示的新型海藻酸衍生物。进而，使用通过使式(I)和式(II)的新型海藻酸衍生物进行惠斯根反应而得到的新型交联海藻酸，成形作为1种交联海藻酸结构体的珠(含色素的珠)，结果该珠具有高稳定性，并且与以往的凝胶相比，能够调整为具有与目标相应的透过率的凝胶等，从而完成了本发明。
在此提供的新型海藻酸衍生物(式(I)和式(II))例如可用于化学交联形成，即，导入可用于化学交联形成的反应性基团或该反应性基团的互补的反应性基团而得的基团。
前述化学交联形成例如可利用基于惠斯根反应(1,3-偶极加成环化反应)的交联反应进行，例如可在式(I)和式(II)的海藻酸衍生物间进行，或例如可在式(I)的海藻酸衍生物和具有叠氮基的其他分子间进行，或可在式(II)的海藻酸衍生物和具有炔基的其他分子间进行。
基于末端炔基和末端叠氮基的惠斯根反应由于一般需要100℃ 以上的加热，因此对于在生物体分子的化学修饰中使用本反应而言是不适合的。但是，该反应中铜催化剂(例如，通过使Cu(I))共存，发现在室温下以几乎100%的收率形成环化加成体(三唑环)的反应条件(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,14,p2596-2599,2002年；J.Org.Chem.,9,p3057-3064,2002年)，能利用于生物体分子的化学修饰。另一方面，要利用前述在铜催化剂存在下的惠斯根反应得到交联海藻酸时，有该交联海藻酸中残留微量的铜催化剂的可能性，有在交联海藻酸或交联海藻酸结构体中发生源自铜的细胞毒性的担忧。
优选方式中，为了避免交联海藻酸中源自铜的细胞毒性的发生，利用不需要铜催化剂的惠斯根反应，得到交联海藻酸。具体而言，通过在海藻酸衍生物中导入的炔基中使用环辛炔衍生物(高应变的环状炔基)，不需要在100℃以上的高温条件和铜催化剂，可进行反应。因此，优选方式的新型交联海藻酸不含有铜催化剂，由此即使在成形为最终形体物(交联海藻酸结构体)时，从不发生源自铜的毒性的观点出发，也是优异的。
在此，提供以下方式所示的在海藻酸的任意1个以上的羧基上介由酰胺键和2价连接基而导入了环状炔基或叠氮基的式(I)或式(II)的海藻酸衍生物、通过使用式(I)和式(II)的海藻酸衍生物进行惠斯根反应(1,3-偶极加成环化反应)而得到的新型交联海藻酸、和前述各海藻酸衍生物以及交联海藻酸的制造方法。即，例示的方式如以下〔1〕~〔17〕所述。
〔1〕下述式(I)所示的海藻酸衍生物,其中，在海藻酸的任意1个以上的羧基上介由酰胺键和2价连接基(-L1-)而导入了环状炔基(Akn)，
[化1]
[式(I)中，(ALG)、-L1-、Akn的定义与后述第1方式中的定义相同]。
〔2〕〔1〕所述的式(I)所示的海藻酸衍生物，其中，Akn-L1-NH2基(Akn、和-L1-与后述第1方式中的定义相同)的导入率为0.1%~30%。
〔3〕〔1〕所述的式(I)所示的海藻酸衍生物，其中，海藻酸衍生物的利用凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量为10万Da~300万Da。
〔4〕下述式(II)所示的海藻酸衍生物，其中，在海藻酸的任意1个以上的羧基上介由酰胺键和2价连接基(-L2-)而导入了叠氮基，
[化2]
[式(II)中，(ALG)、-L2-的定义与后述第4方式中的定义相同]。
〔5〕〔4〕所述的式(II)所示的海藻酸衍生物，其中，N3-L2-NH2基(-L2-与后述第4方式中的定义相同)的导入率为0.1%~30%。
〔6〕〔4〕所述的式(II)所示的海藻酸衍生物，其中，海藻酸衍生物的利用凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量为10万Da~300万Da。
〔7〕交联海藻酸，其中，第1海藻酸的任意羧基和第2海藻酸的任意羧基通过下述式(III-L)而键合：
[化3]
[式(III-L)中，两端的-CONH-和-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基而得的酰胺键；-L1-、-L2-、和X与后述第7方式中的定义相同]。
〔8〕制造交联海藻酸的方法，其包括通过混合前述〔1〕~〔3〕中任一项所述的式(I)的海藻酸衍生物和前述〔4〕~〔6〕中任一项所述的式(II)的海藻酸衍生物进行惠斯根反应从而得到前述〔7〕所述的交联海藻酸。
〔8-1〕交联海藻酸，其包含利用惠斯根反应形成的基于三唑环的化学交联、和利用钙离子而部分地形成的离子交联作为交联。
〔9〕交联海藻酸结构体，其通过将混合前述〔1〕~〔3〕中任一项所述的式(I)的海藻酸衍生物和前述〔4〕~〔6〕中任一项所述的式(II)的海藻酸衍生物而得的海藻酸衍生物的混合溶液滴加在氯化钙溶液中而得到。
〔10〕前述〔9〕所述的交联海藻酸结构体，其包含利用惠斯根反应形成的基于三唑环的化学交联、和利用钙离子而部分地形成的离子交联作为交联。
〔11〕制造交联海藻酸结构体的方法，其包括将混合前述〔1〕~〔3〕中任一项所述的式(I)的海藻酸衍生物和前述〔4〕~〔6〕中任一项所述的式(II)的海藻酸衍生物而得的海藻酸衍生物的混合溶液滴加在氯化钙溶液中从而得到前述〔9〕或〔10〕所述的交联海藻酸结构体。
〔12〕前述〔9〕或〔10〕所述的交联海藻酸结构体，其为珠或近球形的凝胶。
〔13〕医疗用材料，其包含前述〔9〕或〔10〕所述的交联海藻酸结构体。
〔14〕前述〔13〕所述的医疗用材料，其为珠或近球形的凝胶。
〔15〕前述〔1〕~〔6〕中任一项所述的海藻酸衍生物、前述〔7〕或〔8-1〕所述的交联海藻酸、和前述〔9〕、〔10〕和〔12〕中任一项所述的交联海藻酸结构体，其具有生物适应性。
〔16〕下述式(AM-1)所示的氨基化合物、或制药学上可接受的它的盐、或它们的溶剂合物，
[化4]
[式(AM-1)中，-L1-、和Akn的定义与后述第16方式中的定义相同]。
〔17〕下述式(AM-2)所示的氨基化合物、或制药学上可接受的它的盐、或它们的溶剂合物，
[化5]
[式(II)中，-L2-的定义与后述第17方式中的定义相同]。
发明效果
本发明提供例如可用于化学交联形成的新型海藻酸衍生物、新型交联海藻酸等。
优选海藻酸衍生物即使导入了在生物体内不存在的反应基团，且残留未反应的基团，对于不存在与细胞等生物体成分进行交联反应的风险的生体生物而言，也可期待安全性。此外，优选交联反应在常温下完成反应而不使用金属催化剂，因此可安全且容易地使用。
一些方式的交联海藻酸通过惠斯根反应(1,3-偶极加成环化反应)而进行化学交联。可以组合使用化学交联和例如利用钙离子的利用了2价金属离子的交联，调整反应条件，由此优选其稳定性与非交联海藻酸或非化学交联海藻酸(例如，钙离子交联而得的交联海藻酸)相比得到改善。
此外，优选可调整交联体的凝胶物性，也可调整物质透过性。
本发明至少具有这些效果中的1种以上。
附图说明
[图1]显示交联海藻酸结构体的凝胶的稳定性的评价的图。
[图2]显示交联海藻酸结构体的凝胶的透过率的评价的图。
[图3]显示交联海藻酸结构体的凝胶的透过率的评价的图。
[图4]显示交联海藻酸结构体的凝胶的稳定性的评价的图。
[图5]显示交联海藻酸结构体的凝胶的透过率的评价的图。
[图6]显示交联海藻酸结构体的凝胶的透过率的评价的图。
[图7]显示交联海藻酸衍生物的凝胶的生物适应性评价的图。
[图8]显示交联海藻酸结构体的凝胶的稳定性的评价的图。
[图9]显示交联海藻酸结构体的EDTA下的凝胶的稳定性的评价的图。
[图10]显示交联海藻酸结构体的凝胶的稳定性的评价的图。
[图11]显示交联海藻酸结构体的EDTA下的凝胶的稳定性的评价的图。
[图12]显示交联海藻酸结构体的凝胶的稳定性的评价的图。
[图13]显示交联海藻酸结构体的EDTA下的凝胶的稳定性的评价的图。
[图14]显示交联海藻酸结构体的凝胶的透过率的评价的图。
[图15]显示交联海藻酸结构体的凝胶的透过率的评价的图。
[图16]显示交联海藻酸结构体的凝胶的透过率的评价的图。
[图17]显示交联海藻酸衍生物的凝胶的生物适应性评价的图。
具体实施方式
[具体方式]
包括以下方式[1]~[17]。
[1]第1方式如下所述。下述式(I)所示的海藻酸衍生物，其中，在海藻酸的任意1个以上的羧基上介由酰胺键和2价连接基(-L1-)而导入了环状炔基(Akn)，
[化6]
[式(I)中，(ALG)表示海藻酸；-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基而得的酰胺键；-L1-表示选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化7]
Akn表示选自下述部分结构式中的环状炔基[各式中，虚线右侧不包括在内]：
[化8]
星号表示手性中心]。
[1-1]前述方式[1]的前述式(I)的海藻酸衍生物中，-L1-优选为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化9]
更优选为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化10]
进一步优选为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化11]
。
[1-2]前述方式[1]的前述式(I)的海藻酸衍生物中，
Akn优选为选自下述部分结构式中的环状炔基[各式中，虚线右侧不包括在内]：
[化12]
更优选为选自下述部分结构式中的环状炔基[各式中，虚线右侧不包括在内]：
[化13]
。
[1-3]前述方式[1]的前述式(I)的海藻酸衍生物中，Akn和-L1-的组合优选为如选自下述部分结构式中的基团所示[各式中，虚线右侧(亚氨基侧)不包括在内]：
[化14]
[化15]
更优选为如选自下述部分结构式中的基团所示[各式中，虚线右侧(亚氨基侧)不包括在内]：
[化16]
进一步优选为如选自下述部分结构式中的基团所示[各式中，虚线右侧(亚氨基侧)不包括在内]：
[化17]
。
[1-1a]前述方式[1]的前述式(I)的海藻酸衍生物中，-L1-优选为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化18]
更优选为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化19]
进一步优选为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化20]
。
[1-2a]前述方式[1]的前述式(I)的海藻酸衍生物中，Akn优选为选自下述部分结构式中的环状炔基[各式中，虚线右侧不包括在内]：
[化21]
更优选为选自下述部分结构式中的环状炔基[各式中，虚线右侧不包括在内]：
[化22]
。
[1-3a]前述方式[1]的前述式(I)的海藻酸衍生物中，Akn和-L1-的组合优选为如选自下述部分结构式中的基团所示[各式中，虚线右侧(亚氨基侧)不包括在内]：
[化23]
[化24]
更优选为如选自下述部分结构式中的基团所示[各式中，虚线右侧(亚氨基侧)不包括在内]：
[化25]
[化26]
进一步优选为如选自下述部分结构式中的基团所示[各式中，虚线右侧(亚氨基侧)不包括在内]：
[化27]
。
[1-1b]前述方式[1]的前述式(I)的海藻酸衍生物中，-L1-优选为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化28]
更优选为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化29]
进一步优选为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化30]
。
[1-2b]前述方式[1]的前述式(I)的海藻酸衍生物中，Akn优选为选自下述部分结构式中的环状炔基[各式中，虚线右侧不包括在内]：
[化31]
更优选为选自下述部分结构式中的环状炔基[各式中，虚线右侧不包括在内]：
[化32]
。
[1-3b]前述方式[1]的前述式(I)的海藻酸衍生物中，Akn和-L1-的组合优选为如下表：
[表1]
中任一项的组合(表中的-L1-或Akn的各式如前述方式[1]、[1-1]、[1-1a]、[1-2]、[1-2a]、和[1-1b]所述)、或选自下述式中的基团[各式中，虚线右侧(亚氨基侧)不包括在内]所示；
[化33]
更优选为如下表：
[表2]
中任一项的组合(表中的-L1-或Akn的各式如前述方式[1]、[1-1]、[1-1a]、[1-2]、[1-2a]、和[1-1b]所述)所示；
进一步优选为如下表：
[表3]
中任一项的组合(表中的-L1-或Akn的各式如前述方式[1]、[1-1]、[1-1a]、[1-2]、[1-2a]、和[1-1b]所述)所示；
特别优选为如选自下述部分结构式中的基团所示[各式中，虚线右侧(亚氨基侧)不包括在内]：
[化34]
。
前述方式[1]的优选方式通过进一步适当组合Akn、和-L1-的定义，能任选地形成前述方式[1]的前述式(I)所示的海藻酸衍生物的优选方式。
[2]第2方式如下所述。前述方式[1]所述的式(I)的海藻酸衍生物，其中，Akn-L1-NH2基(Akn、和-L1-与前述方式[1]中的定义相同)的导入率为0.1%~30%。
[2-1]前述方式[2]中，Akn-L1-NH2基的导入率优选为2%~20%；更优选为3~10%。
[2-1a]前述方式[2]中，Akn-L1-NH2基的导入率优选为0.3%~20%；更优选为0.5~10%。
[3]第3方式如下所述。前述方式[1]所述的式(I)的海藻酸衍生物，海藻酸衍生物的利用凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量为10万Da~300万Da。
[3-1]前述方式[3]中，海藻酸衍生物的利用凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量为优选为30万Da~250万Da，更优选为50万Da~200万Da。
[3-1a]前述方式[3]中，海藻酸衍生物的利用凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量为优选为30万Da~250万Da，更优选为100万Da~200万Da。
[4]第4方式如下所述。下述式(II)所示的海藻酸衍生物，其中，在海藻酸的任意1个以上的羧基上介由酰胺键和2价连接基(-L2-)而导入了叠氮基，
[化35]
[式(II)中，(ALG)表示海藻酸；-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基而得的酰胺键；-L2-表示选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化36]
。
[4-1]前述方式[4]的前述式(II)的海藻酸衍生物中，-L2-优选为选自下述部分结构式中的连接基：
[化37]
[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]；
更优选为选自下述部分结构式中的连接基：
[化38]
。
[4-1a]前述方式[4]的前述式(II)的海藻酸衍生物中，-L2-优选为选自下述部分结构式中的连接基：
[化39]
[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]；
更优选为选自下述部分结构式中的连接基：
[化40]
。
[4-1b]前述方式[4]的前述式(II)的海藻酸衍生物中，-L2-优选为选自下述部分结构式中的连接基：
[化41]
[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]；
更优选为选自下述部分结构式中的连接基：
[化42]
[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]。
前述方式[4]的优选方式通过进一步适当组合叠氮基、和-L2-的定义，能任选形成前述方式[4]的前述式(II)所示的海藻酸衍生物的优选方式。
[5]第5方式如下所述。前述方式[4]所述的式(II)的海藻酸衍生物，其中，N3-L2-NH2基(-L2-与前述方式[4]中的定义相同)的导入率为0.1%~30%。
[5-1]前述方式[5]中，N3-L2-NH2基的导入率优选为2%~20%；更优选为3~10%。
[5-1a]前述方式[5]中，N3-L2-NH2基的导入率优选为0.3%~20%；更优选为0.5~15%。
[6]第6方式如下所述。前述方式[4]所述的式(II)的海藻酸衍生物，其中，海藻酸衍生物的利用凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量为10万Da~300万Da。
[6-1]前述方式[6]中，式(II)的海藻酸衍生物的利用凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量优选为30万Da~250万Da，更优选为50万Da~200万Da。
[6-1a]前述方式[6]中，式(II)的海藻酸衍生物的利用凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量优选为30万Da~250万Da，更优选为100万Da~200万Da。
[7]第7方式如下所述。交联海藻酸，其是第1海藻酸的任意羧基和第2海藻酸的任意羧基通过下述式(III-L)键合而得：
[化43]
[式(III-L)中，两端的-CONH-和-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基而得的酰胺键；
-L1-与前述方式[1]中的定义相同；
-L2-与前述方式[4]中的定义相同；
X为选自下述部分结构式中的环状基：
[化44]
(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)，星号表示手性中心]。
[7-1]前述方式[7]的前述式(III-L)中，优选-L1-为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化45]
；
-L2-为选自下述部分结构式中的2价连接基：
[化46]
[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]；
X为选自下述部分结构式中的环状基：
[化47]
(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)]。
[7-2]前述方式[7]的前述式(III-L)中，更优选为-L1-为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化48]
；
-L2-为选自下述部分结构式中的2价连接基：
[化49]
[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]；
X为选自下述部分结构式中的环状基：
[化50]
(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)]。
[7-3]前述方式[7]的前述式(III-L)中，进一步优选为-L1-为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化51]
；
-L2-为选自下述部分结构式中的2价连接基：
[化52]
(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)；
X为选自下述部分结构式中的环状基：
[化53]
(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)。
[7-3-1]前述方式[7]的前述式(III-L)中，特别优选-L1-为下述部分结构式的2价连接基：
[化54]
(式中，两端的虚线外侧不包括在内)；
-L2-为下述部分结构式的2价连接基：
[化55]
(式中，两端的虚线外侧不包括在内)；
X为下述部分结构式的任一环状基：
[化56]
(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)。
[7-4]前述方式[7]的前述式(III-L)中，优选为-L2-X-L1-的组合如选自下述部分结构式中的部分结构所示[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化57]
；
更优选为-L2-X-L1-的组合如下述部分结构式中任一项所示[式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化58]
。
[7-1a]前述方式[7]的前述式(III-L)中，优选-L1-为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化59]
；
-L2-为选自下述部分结构式中的2价连接基：
[化60]
[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]；
X为选自下述部分结构式中的环状基：
[化61]
(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)]。
[7-2a]前述方式[7]的前述式(III-L)中，更优选为-L1-为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化62]
；
-L2-为选自下述部分结构式中的2价连接基：
[化63]
[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]；
X为选自下述部分结构式中的环状基：
[化64]
(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)]。
[7-3a]前述方式[7]的前述式(III-L)中，进一步优选为-L1-为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化65]
；
-L2-为选自下述部分结构式中的2价连接基：
[化66]
(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)；
X为选自下述部分结构式中的环状基：
[化67]
(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)。
[7-3a-1]前述方式[7]的前述式(III-L)中，特别优选为-L1-为选自下述部分结构式中的2价连接基：
[化68]
(式中，两端的虚线外侧不包括在内)；
-L2-为选自下述部分结构式中的2价连接基：
[化69]
(式中，两端的虚线外侧不包括在内)；
X为选自下述部分结构式中的环状基：
[化70]
(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)。
[7-4a]前述方式[7]的前述式(III-L)中，优选为-L2-X-L1-的组合如选自下表的式中的部分结构所示：
[表4]
/>
(表中的-L1-、-L2-或-X-各式如前述方式[1]、[1-1]、[1-1a]、[1-1b]、[4]、[4-1]、[4-1a]、[4-1b]、[7]、[7-1]、[7-2]、[7-3]、[7-3-1]、[7-1a]、[7-2a]、[7-3a]、和[7-3a-1]所述)；
更优选为-L2-X-L1-的组合如选自下述部分结构式中的部分结构所示[式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化71]
[7-1b]前述方式[7]的前述式(III-L)中，优选-L1-为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化72]
；
-L2-为选自下述部分结构式中的2价连接基：
[化73]
[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]；
X为选自下述部分结构式中的环状基：
[化74]
(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)]。
[7-2b]前述方式[7]的前述式(III-L)中，更优选为-L1-为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化75]
；
-L2-为选自下述部分结构式中的2价连接基：
[化76]
/>
[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]；
X为选自下述部分结构式中的环状基：
[化77]
(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)]。
[7-3b]前述方式[7]的前述式(III-L)中，进一步优选为-L1-为选自下述部分结构式中的2价连接基[各式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化78]
；
-L2-为选自下述部分结构式中的2价连接基：
[化79]
(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)；
X为选自下述部分结构式中的环状基：
[化80]
(各式中，两端的虚线外侧不包括在内)。
[7-4b]前述方式[7]的前述式(III-L)中，优选为-L1-X-L2-的组合如选自下表式的组合中的部分结构所示：
[表5]
/>
/>
/>
/>
/>
(表中的-L1-、-L2-或-X-各式如前述方式[1]、[1-1]、[1-1a]、[1-1b]、[4]、[4-1]、[4-1a]、[4-1b]、[7][7-1]、[7-2]、[7-3]、[7-3-1]、[7-1a]、[7-2a]、[7-3a]、[7-3a-1]、[7-1b]、[7-2b]、和[7-3b]所述)；
更优选为-L2-X-L1-的组合如下述部分结构式中的部分结构所示[式中，两端的虚线外侧不包括在内]：
[化81]
[化82]
。
方式[7]的优选方式通过进一步适当组合-L1-、-L2-、和X的定义，能任选形成前述方式[7]的交联海藻酸衍生物的优选方式。
[8]第8方式如下所述。制造交联海藻酸的方法，其包括通过混合前述方式[1]所述的式(I)的海藻酸衍生物和前述方式[4]所述的式(II)的海藻酸衍生物进行惠斯根反应从而得到前述方式[7]所述的交联海藻酸。
[8-1]第8-1方式如下所述。交联海藻酸，其包含利用惠斯根反应形成的基于三唑环的化学交联、和利用钙离子而部分地形成的离子交联作为交联。
[9]第9方式如下所述。交联海藻酸结构体，其通过将混合前述方式[1]所述的式(I)的海藻酸衍生物和前述方式[4]所述的式(II)的海藻酸衍生物而得的海藻酸衍生物的混合溶液滴加在氯化钙溶液中而得到。
[10]第10的方式如下所述。前述方式[9]所述的交联海藻酸结构体，其包含利用惠斯根反应形成的基于三唑环的化学交联、和利用钙离子而部分地形成的离子交联作为交联。
[11]第11方式如下所述。制造交联海藻酸结构体的方法，其包括将混合前述方式[1]所述的式(I)的海藻酸衍生物和前述方式[4]所述的式(II)的海藻酸衍生物而得的海藻酸衍生物的混合溶液滴加在氯化钙溶液中从而得到前述方式[9]或[10]所述的交联海藻酸结构体。
[12]第12方式如下所述。前述方式[9]或[10]所述的交联海藻酸结构体，其为珠或近球形的凝胶。
[13]第13方式如下所述。医疗用材料，其包含前述方式[9]、[10]和[12]中任一项所述的交联海藻酸结构体。
[14]第14方式如下所述。前述方式[13]所述的医疗用材料，其为珠或近球形的凝胶。
[15]第15方式如下所述。前述方式[1]~[6]中任一项所述的海藻酸衍生物、前述方式[7]或[8-1]所述的交联海藻酸、和前述方式[9]、[10]和[12]中任一项所述的交联海藻酸结构体，其具有生物适应性。
[16]第16方式如下所述。下述式(AM-1)所示的氨基化合物、或制药学上可接受的它的盐、或它们的溶剂合物：
[化83]
[式(AM-1)中，-L1-和Akn的组合为下表中任一项的组合：
[表6-1]
/>
[表6-2]
/>
(各式与前述方式[1]的定义相同)]。
[16-1]前述方式[16]的前述式(AM-1)中，优选Akn-L1-的组合为下表中任一项的组合：
[表7]
/>
(各式如前述方式[1-1]、[1-2]、[1-1a]、[1-2a]、[1-1b]、和[1-2b]所述)；
更优选为下表中任一项的组合：
[表8]
(各式与前述方式[1-1]、[1-2]、[1-1a]、[1-2a]、[1-1b]、和[1-2b]的定义相同)；
进一步优选为下表中任一项的组合：
[表9]
(各式与前述方式[1-1]、[1-2]、[1-1a]、[1-2a]、[1-1b]、和[1-2b]的定义相同)；
例如如下述结构式中任一结构式所示：
[化84]
。
方式[16]的优选方式通过进一步适当组合Akn、和-L1-的定义，能任选地形成前述方式[16]的交联海藻酸衍生物的优选方式。
[17]第17方式如下所述。下述式(AM-2)所示的氨基化合物、或制药学上可接受的它的盐、或它们的溶剂合物：
[化85]
[式(II)中，-L2-为式(LK-1)(其中，式中苯环的取代方式为对位取代、n1=1和n2=3除外)、式(LK-2)、式(LK-3)、式(LK-4)(其中，式中苯环的取代方式为对位取代、n7=3、和式中苯环的取代方式为对位取代、n7=2、3、4、6除外)、式(LK-5)(其中，式中苯环的取代方式为对位取代、n8=1和n9=2除外)、式(LK-6)、和式(LK-7)[各式与前述方式[4]的定义相同]]。
[17-1]前述方式[17]的前述式(AM-2)中，优选为-L2-为式(LK-1-1)(其中，式中n1=1和n2=3除外)、式(LK-2-1)、式(LK-3-1)、式(LK-4-1)(其中，n7=2、3、4、6除外)、式(LK-5-1)(其中，式中n8=1和n9=2除外)、式(LK-6-1)、和式(LK-7-1)[各式与前述方式[4-1]、[4-1a]或[4-1b]的定义相同]；
更优选为式(LK-1-1-a)、式(LK-2-1-a)、式(LK-3-1-a)、式(LK-5-1-a)、式(LK-6-1-a)、式(LK-7-1-a)和式(LK-7-1-b)[各式与前述方式[4-1]、[4-1a]或[4-1b]的定义相同]。
方式[17]的优选方式通过进一步适当组合叠氮基和-L2-的定义，能任选地形成前述方式[17]的交联海藻酸衍生物的优选方式。
以下更详细地说明各方式。
1.海藻酸
本说明书中，记载为海藻酸时，是指选自海藻酸、海藻酸酯、和它们的盐(例如，海藻酸钠)中的至少1种海藻酸(有时称为“海藻酸类”)。所使用的海藻酸可以源自天然，也可以为合成物，优选源自天然。优选使用的海藻酸类为由巨藻、巨囊藻、海带、泡叶藻、丛梗藻、褐藻苷苔、黑海带、昆布等褐藻类提取的生物体内吸收性的多糖类，是D-甘露糖醛酸(M)和L-葡糖醛酸(G)这2种糖醛酸聚合为直链状的聚合物。更具体而言，是D-甘露糖醛酸的均聚物组分(MM组分)、L-葡糖醛酸的均聚物组分(GG组分)、和D-甘露糖醛酸与L-葡糖醛酸无规排列而得的组分(M/G组分)任意键合而得的嵌段共聚物。
本说明书中，对于海藻酸，有时将海藻酸记作(ALG)，海藻酸的任意1个羧基记作-COOH，将海藻酸记作(ALG)-COOH。
一些方式中，海藻酸为海藻酸钠。海藻酸钠可使用市售品的海藻酸钠。在此，后述实施例中，海藻酸钠使用下表所述的A-1、A-2、A-3、B-1、B-2和B-3的海藻酸钠(发售方 持田制药株式会公司)。各海藻酸钠的1w/w%的水溶液的粘度、重均分子量和M/G比示于表1。
[表10]
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前述海藻酸钠A-1、A-2、A-3、B-1、B-2、和B-3的各物性值利用下述各种方法测定。测定方法不限于该方法，根据测定方法不同有时各物性值与上述不同。
[海藻酸钠的粘度测定]
根据日本药典(第16版)的粘度测定法，使用旋转粘度计法(锥板型旋转粘度计)测定。具体的测定条件如以下所示。试样溶液的制备使用MilliQ水进行。测定机器使用锥板型旋转粘度计(粘度粘弹性测定装置レオストレスRS600(Thermo Haake GmbH)传感器：35/1)。转速在1w/w%海藻酸钠溶液测定时为1rpm。读取时间设为测定2分钟，从开始1分钟至2分钟的平均值。将3次测定的平均值作为测定值。测定温度设为20℃。
[海藻酸钠的重均分子量测定]
利用(1)凝胶浸透色谱(GPC)、和(2)GPC-MALS2种测定法测定。测定条件如以下所示。
[前处理方法]
在试样中加入溶离液而溶解后，将0.45μm膜过滤器过滤而得的溶液作为测定溶液。
(1)凝胶浸透色谱(GPC)测定
[测定条件(相对分子量分布测定)]
柱：TSKgel GMPW-XL×2＋G2500PW-XL(7.8mm I.D.×300mm×3根)
洗脱液：200mM硝酸钠水溶液
流量：1.0mL/min
浓度：0.05%
检测器：RI检测器
柱温度：40℃
注入量：200μL
分子量标准：标准支链淀粉、葡萄糖。
(2)GPC-MALS测定
[折射率增量(dn/dc)测定(测定条件)]
差示折射率计：Optilab T-rEX
测定波长：658nm
测定温度：40℃
溶剂：200mM硝酸钠水溶液
试样浓度：0.5~2.5mg/mL(5浓度)。
[测定条件(绝对分子量分布测定)]
柱：TSKgel GMPW-XL×2＋G2500PW-XL(7.8mm I.D.×300mm×3本)
洗脱液：200mM硝酸钠水溶液
流量：1.0mL/min
浓度：0.05%
检测器：RI检测器、光散射检测器(MALS)
柱温度：40℃
注入量：200μL
本说明书中，海藻酸、海藻酸衍生物、交联海藻酸、和交联海藻酸的分子量中，作为单位有时记作Da(道尔顿)。
海藻酸类的D-甘露糖醛酸和L-葡糖醛酸的构成比(M/G比)主要根据源自海藻等的生物的种类而不同，此外，受到由该生物的生育场所、季节带来的影响，遍及M/G比为约0.2的高G型至M/G比为约5的高M型的高范围。海藻酸类的凝胶化能力和所生成的凝胶的性质根据M/G比而受到影响，一般已知G比率高时凝胶强度变高。除此之外，M/G比对凝胶的硬度、脆度、吸水性、柔软性等也带来影响。所使用的海藻酸类和/或其盐的M/G比通常为0.2~4.0，更优选为0.4~3.0、进一步优选为0.5~3.0。
本说明书中，使用“~”表示的数值范围表示包含“~”前后记载的数值作为各自最小值和最大值的范围。
本说明书中，所使用的“海藻酸酯”、“海藻酸盐”没有特别限定，为了与交联剂反应，需要不具有阻碍交联反应的官能团。作为海藻酸酯，优选举出海藻酸丙二醇酯等。
本说明书中，作为海藻酸盐，可举出例如海藻酸的1价盐、海藻酸的2价盐。作为海藻酸的1价盐，优选举出海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸铵等，更优选为海藻酸钠或海藻酸钾，特别优选为海藻酸钠。作为海藻酸的2价盐，优选举出海藻酸钙、海藻酸镁、海藻酸钡、海藻酸锶等。
海藻酸为高分子多糖类，难以正确地确定分子量，一般为重均分子量为1000~1000万、优选为1万~800万、更优选为2万~300万的范围。源自天然物的高分子物质的分子量测定中，已知根据测定方法不同会产生值的差异。
例如，通过凝胶浸透色谱(GPC)或凝胶过滤色谱(它们也被统称为尺寸排除色谱)测得的重均分子量优选为10万以上、更优选为50万以上，且优选为500万以下、更优选为300万以下。其优选范围为10万~500万，更优选为15万~300万。
此外，例如，根据GPC-MALS法，可以测定绝对重均分子量。通过GPC-MALS法测得的重均分子量(绝对分子量)优选为1万以上、更优选为5万以上、进一步优选为6万以上，且优选为100万以下、更优选为80万以下、进一步优选为70万以下、特别优选为50万以下。其优选范围为1万~100万，更优选为5万~80万，进一步优选为6万~70万、特别优选为6万~50万。
通常利用上述方法计算高分子多糖类的分子量时，会产生10%~20%的测定误差。例如，若为40万，则在32万~48万左右的范围产生值的浮动，若为50万，则在40万~60万左右的范围产生值的浮动，若为100万，则在80万~120万左右的范围产生值的浮动。
海藻酸类的分子量的测定可根据常规方法测定。
分子量测定中使用凝胶过滤色谱时的代表的条件如后述本说明书的实施例所述。柱例如可使用Superose6 Increase10/300 GL柱(GE医疗科学公司)，作为展开溶剂，例如可使用包含0.15mol/L NaCl的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)，作为分子量标准，可以使用蓝色葡聚糖、甲状腺球蛋白、铁蛋白、醛缩酶、伴白蛋白、卵白蛋白、核糖核酸酶A和抑肽酶。
本说明书中中使用的海藻酸的粘度没有特别限定，测定粘度作为1w/w%的海藻酸类的水溶液时，优选为10mPa・s~1000mPa・s、更优选为50mPa・s~800mPa・s。
海藻酸的水溶液的粘度的测定可以根据常规方法测定。例如，可以使用旋转粘度计法的同轴双筒型形旋转粘度计、单筒型旋转粘度计Brookfield型粘度计)、圆锥-平板型旋转粘度计(锥板型粘度计)等测定。优选期望根据日本药典(第16版)的粘度测定法。更优选使用锥板型粘度计。
海藻酸类由褐藻类提取而得，最初分子量大、粘度高，但通过基于热的干燥、纯化等过程中，分子量变小，粘度变低。通过制造步骤的温度等条件管理、作为原料的褐藻类的选择、制造步骤中的分子量的分级等方法可制造分子量不同的海藻酸类。进一步，通过与具有不同分子量或者粘度的其他种类的海藻酸类混合，也能形成具有目标分子量的海藻酸类。
本说明书中使用的海藻酸在一些方式中为未经低内毒素处理的海藻酸，或在另一些方式中，为经低内毒素处理的海藻酸。低内毒素是指内毒素水平低至不实质性引发炎症、或发热的程度。更优选期望为经低内毒素处理的海藻酸类。
低内毒素处理可以通过公知的方法或基于其的方法进行。例如，可以通过纯化透明质酸钠的菅等的方法(例如，参照日本特开平9-324001号公报等)、纯化β1,3-葡聚糖的吉田等的方法(例如，参照日本特开平8-269102号公报等)、纯化海藻酸钠、结冷胶等生物体高分子盐的威廉等的方法(例如，参照特表2002-530440号公报等)、纯化多糖的詹姆斯等的方法(例如，参照国际公开第93/13136号小册子等)、路易斯等的方法(例如，参照美国特許第5589591号说明书等)、纯化海藻酸盐的赫尔曼弗兰克等的方法(例如，参照Appl MicrobiolBiotechnol(1994)40：638-643等)等或基于它们的的方法而实施。低内毒素处理不限于它们，可以通过洗涤、基于过滤器(除去内毒素的过滤器、帯电过滤器等)的过滤、超滤、使用柱(内毒素吸附亲和柱、凝胶过滤柱、基于离子交换树脂的柱等)的纯化、在疏水性物质、树脂或活性炭等中的吸附、有机溶剂处理(基于有机溶剂的提取、添加有机溶剂导致的的析出・沉降等)、表面活性剂处理(例如，参照日本特开2005-036036号公报等)等公知的方法、或者适当组合它们而实施。在这些处理的步骤中可以适当组合离心分离等公知的方法。期望根据海藻酸的种类而适当选择。
内毒素水平可利用公知的方法确认，例如，可以通过利用鲎试剂(LAL)的方法、使用エンドスペシー(注册商标)ES-24S Set(生化学工业株式会公司)的方法等测定。
所使用的内毒素的处理方法没有特别限定，作为其结果，进行利用鲎试剂(LAL)的内毒素测定时，海藻酸类的内毒素含量优选为500内毒素单位(EU)/g以下，进一步优选为100EU/g以下，尤其优选为50EU/g以下，特别优选为30EU/g以下。经低内毒素处理的海藻酸钠可通过例如Sea Matrix(注册商标)(持田制药株式会公司)、PRONOVATM UP LVG(FMCBioPolymer)等市售品而获得。
2.海藻酸衍生物
本说明书中，可提供新型海藻酸衍生物。本说明书中，作为海藻酸衍生物，是在海藻酸的任意1个以上的羧基上介由酰胺键和2价连接基导入了惠斯根反应中的反应性基团或该反应性基团的互补的反应性基团而得的海藻酸衍生物。
更具体而言，下述式(I)所示的海藻酸衍生物：
[化86]
[式(I)中，(ALG)、-L1-、Akn的定义与前述第1方式中的定义相同]、和下述式(II)所示的海藻酸衍生物：
[化87]
[式(II)中，(ALG)、-L2-的定义与前述第4方式中的定义相同]。
前述2价连接基(-L1-或-L2-)只要不损害反应性基团和与该反应性基团互补的反应性基团的反应，则可使用任意的直链状基团。具体而言，可举出直链的亚烷基(-(CH2)n-、n=1~30)(该基团中的-CH2-可以被多个(例如1~10个、或1~5个)-C(=O)-、-CONH-、-O-、-NH-、-S-、苯环、杂环(吡啶环、哌啶环、哌嗪环等5~6元芳族杂环或5~6元非芳族杂环)等基团取代，该-CH2-的氢原子可以被选自氧代基(=O)、C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基等基团)、卤素原子(例如氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等)、羟基(-OH)等基团中的多个(例如1~10个、或1~5个)基团取代)。
本说明书中的新型海藻酸衍生物即式(I)和式(II)所示的海藻酸衍生物例如可利用下述式的方法(详情参照后述一般的制造方法)制造。
[化88]
本说明书的式(I)或式(II)所示的海藻酸衍生物的重均分子量为10万Da~300万Da，优选为30万Da~250万Da，更优选为50万Da~200万Da。该两海藻酸衍生物的分子量可利用后述方法求出。
本说明书中，式(I)的Akn-L1-NH-基不需要与海藻酸构成单元的全部羧基键合，而且式(II)的N3-L2-NH-基不需要与海藻酸构成单元的全部羧基键合。
本说明书中，将式(I)的Akn-L1-NH-基称为反应性基团时，式(II)的N3-L2-NH-基作为互补的反应性基团。而且，相反将式(II)的N3-L2-NH-基称为反应性基团时，式(I)的Akn-L1-NH-基作为互补的反应性基团。
本说明书中，反应性基团或互补的反应性基团的导入率分别为0.1%~30%或1%~30%，优选为2%~20%，更优选为3%~10%。
前述反应性基团或互补的反应性基团的导入率是在作为海藻酸类的重复单元的糖醛酸单糖单元中将导入了各反应性基团的糖醛酸单糖单元的数以百分数表示的值。本说明书中，只要没有特别限定，海藻酸衍生物(式(I)或式(II))中的反应性基团或互补的反应性基团的导入率所用的%指mol%。各反应性基团或互补的反应性基团的导入率可利用后述实施例所述的方法求出。
本说明书中，式(I)中的环状炔基(Akn)和式(II)中的叠氮基通过惠斯根反应而形成三唑环，由此形成交联。
3.惠斯根反应
惠斯根反应(1,3-偶极加成环化反应)为具有如下述式所示的末端叠氮基和末端炔基的化合物间的缩合反应。反应结果具有可收率良好地得到二取代1,2,3-三唑环，且不生成其余的副产物的特征。认为该反应可生成1,4-或1,5-二取代三唑环，可通过使用铜催化剂而位置选择性地得到三唑环。
[化89]
此外，Wittig和Krebs报告有不使用铜催化剂的惠斯根反应。即，仅混合环辛炔和苯基叠氮化物而得到环化加成体的反应(下述式中，R3=苯基)。本反应由于环辛炔的三键发生较大扭曲，因此由与苯基叠氮化物的反应而消除扭曲而成为驱动力，反应自发地进行，因此不需要催化剂。
[化90]
如以上那样，惠斯根反应可使用具有取代的伯叠氮基、仲叠氮基、叔叠氮基、芳族叠氮基等的叠氮化合物、和作为叠氮基的互补的反应性基团的具有末端或环状炔基的化合物。此外，惠斯根反应中，由于基本仅叠氮基和炔基反应，反应基质中能取代各种官能团(例如酯基、羧基、烯基、羟基、氨基等)。
一些方式中，为了不生成不期望的副产物、且避免基于铜催化剂的细胞毒性而不使用铜催化剂，为了在短时间、容易且高效地在海藻酸分子间形成基于1,2,3-三唑环的交联，作为惠斯根反应的炔基，例如使用前述方式[1]所述的环状炔基(环辛基)。
优选方式的海藻酸衍生物的交联方法中，利用该反应(惠斯根反应)基本不形成不期望的副产物。此时，在使用了海藻酸的新型方式的生物适应性材料的制备、和海藻酸水凝胶的形成中，能导入各种生物活性分子，此外，利用重建手术用或基因疗法用的海藻酸水凝胶，能导入细胞物质。
4.交联海藻酸
交联海藻酸存在(i)介由2价金属离子键合而得的交联海藻酸、(ii)介由化学键合而得的交联海藻酸、或(iii)介由2价金属离子键合和化学键合二者而得的交联海藻酸。任何交联海藻酸均具有由凝胶状形成半固体、有时形成海绵样的形态的特性。
介由2价金属离子键合而得的交联海藻酸以超高速进行反应，是可逆的，与此相对，介由化学键合而得的交联海藻酸在比较温和的条件缓慢进行反应，是不可逆的。交联海藻酸的物性可通过例如改变所使用的包含2价金属离子的水溶液(例如，氯化钙水溶液)的浓度、或导入海藻酸的反应性基团的导入率等方法而调整。
通过利用前述交联反应，能制成各种海藻酸结构体。例如，利用离子交联反应，可由海藻酸溶液瞬时制成特定的结构体，为了该结构体的结构强化(例如，长期稳定性的获得等)，可利用基于化学键合的交联反应。而且，例如，在介由2价金属离子键合和化学键合二者的交联海藻酸结构体中，利用离子交联获得的2价金属离子可逆地释放，也能制作仅残留基于化学键合的交联的结构体。
某方式的交联海藻酸可通过混合前述式(I)和前述式(II)的海藻酸衍生物进行惠斯根反应而得到。
某方式的交联海藻酸通过化学交联(基于由炔基和叠氮基形成的三唑环的交联)而形成三维网眼结构。优选海藻酸衍生物为交联后的交联海藻酸的稳定性得到改善的物质。
一些方式的交联海藻酸为第1海藻酸的任意羧基和第2海藻酸的任意羧基间介由下述式(III-L)：
[化91]
[式(III-L)中，两端的-CONH-和-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基而得的酰胺键；-L1-、-L2-、和X与前述第7方式中的定义相同]进行酰胺键合而得的交联海藻酸。
一些方式中，制备交联海藻酸时的式(I)的海藻酸衍生物与式(II)的海藻酸衍生物的混合比以式(I)的衍生物与式(II)衍生物的重量比计，例如为1~1.5：1、优选为1.2~1.5：1、或1~1.2：1、更优选为1：1。
一些方式中，制备交联海藻酸时的式(II)的海藻酸衍生物与式(I)的海藻酸衍生物的混合比以式(II)的衍生物与式(I)衍生物的重量比计，例如为1~4.0：1、优选为1.5~4.0：1、或1.2~1.5：1、或1~1.2：1、更优选为1：1。
一些方式中，制备交联海藻酸时的式(I)的海藻酸衍生物与式(II)的海藻酸衍生物的混合比更优选为以式(I)的海藻酸衍生物与式(II)的海藻酸衍生物的反应性基团的导入率(mol%)比计，例如为1~1.5：1、优选为1.2~1.5：1、或1~1.2：1、更优选为1：1。
一些方式中，制备交联海藻酸时的式(II)的海藻酸衍生物与式(I)的海藻酸衍生物的混合比更优选为以式(II)的海藻酸衍生物与式(I)的海藻酸衍生物的反应性基团的导入率(mol%)比计，例如为1~4.0：1、优选为1.5~4.0：1、或1.2~1.5：1、或1~1.2：1、更优选为1：1。
应予说明，前述混合比中，也可分别将式(I)的海藻酸衍生物替换为式(II)的海藻酸衍生物，将式(II)的海藻酸衍生物替换为式(I)的衍生物。
交联海藻酸不需要海藻酸的构成单元的全部羧基具有上述式(III-L)的交联。交联海藻酸中的上述式(III-L)所示的交联的导入率(也称为交联率)例如为0.1~80%、0.3~60%、0.5~30%、或1.0~10%的范围。
用于得到交联海藻酸的惠斯根反应中的式(I)或式(II)的海藻酸衍生物的浓度通常为1~500mg/mL，优选为5~100mg/mL的范围。
惠斯根反应的反应温度通常为外温4~60℃，优选为外温15~40℃的范围。
用于形成交联海藻酸(水凝胶)的搅拌时间例如为数秒~24小时、数秒~12小时、数秒~30分钟、或数秒~10分钟。
惠斯根反应中使用的反应溶剂或反应溶液没有特别限定，例如可举出自来水、纯水(例如蒸馏水、离子交换水、RO水、RO-EDI水等)、超纯水、细胞培养用培养基、磷酸缓冲生理食盐水(PBS)、和生理食盐水等，优选为超纯水。
一些方式的交联海藻酸为包含利用惠斯根反应形成的基于三唑环的化学交联、和利用钙离子而部分地形成的离子交联作为交联的交联海藻酸。
5.交联海藻酸结构体
交联海藻酸结构体可以通过包括对前述海藻酸衍生物实施交联反应的方法而得到。例如，可利用以下方法制备，但不限定于它们。
[混合法]
通过将混合式(I)的海藻酸衍生物和式(II)的海藻酸衍生物而得到的海藻酸衍生物的混合溶液滴加在包含2价金属离子的溶液中，从而可得到形成化学交联(通过惠斯根反应基于由炔基和叠氮基形成的三唑环的交联)和离子交联(通过2价金属离子而部分形成的交联)的特定结构体即交联海藻酸结构体。
[涂布法]
将包含式(I)的海藻酸衍生物的溶液滴加在包含2价金属离子的溶液中等而得到部分地进行交联的特定结构体。通过将前述得到的例如凝胶等结构体添加在前述包含式(II)的海藻酸衍生物的溶液中，通过在前述结构体的表面等进一步实施交联反应(惠斯根反应)，由此可得到交联海藻酸结构体。应予说明，该方法也可分别将式(I)的海藻酸衍生物替换为式(II)的海藻酸衍生物、将式(II)的海藻酸衍生物替换为式(I)的海藻酸衍生物而实施。
作为前述方法中使用的2价金属离子，没有特别限定，例如，可举出钙离子、镁离子、钡离子、锶离子、锌离子等，优选为钙离子。
作为前述方法中使用的包含钙离子溶液，没有特别限定，例如，可举出氯化钙水溶液、碳酸钙水溶液、葡萄糖酸钙水溶液等水溶液，优选为氯化钙水溶液。
前述方法中使用的包含钙离子的溶液的钙离子浓度没有特别限定，例如，可举出1mM~1M，优选为5mM~500mM，更优选为10mM~300mM。
前述方法中使用的溶剂或溶液也没有特别限定，例如，可举出自来水、纯水(例如，蒸馏水、离子交换水、RO水、RO-EDI水等)、超纯水、细胞培养用培养基、磷酸缓冲生理食盐水(PBS)、和生理食盐水等，优选为超纯水。
作为特定的交联海藻酸结构体，可举出例如纤维状结构体、纤维、珠、凝胶、近球形的凝胶等。优选交联海藻酸结构体为稳定性得到改善的物质。而且，交联海藻酸结构体可具有在其内部保持内容物的能力(内容物保持性)。
海藻酸凝胶的物性可通过硬度、弹性、排斥力、断裂力、破裂时应力等物性值而调节。
6. 海藻酸衍生物、交联海藻酸的生物适应性
本说明书中，海藻酸衍生物、或交联海藻酸结构体具有生物适应性。本说明书中，生物适应性是指将不引起生物体用材料(在此，是指导入了式(I)所示的反应性基团的海藻酸衍生物、和使用该海藻酸衍生物制造的交联海藻酸结构体)与生物体间的相互作用、与前述生物体用材料邻接的组织的局部反应、或全身反应等反应的性质称为具有生物适应性(biocompatibility)。
本说明书中，关于海藻酸衍生物、或交联海藻酸结构体的生物适应性，利用后述关于生物适应性的实施例确认。
7.交联海藻酸结构体的稳定性
交联海藻酸结构体的稳定性可以通过例如测定凝胶稳定性确认、透过性可以通过测定凝胶透过率等确认。
[凝胶稳定性的测定法]
在装入容器的交联海藻酸结构体凝胶中添加磷酸缓冲生理食盐水(PBS)，测定PBS中泄漏的海藻酸的浓度(μg/mL)。将所测定的海藻酸浓度除以通过分解交联海藻酸结构体凝胶而得的总海藻酸浓度而得到的值以百分值表示的值作为崩解率。凝胶稳定性具体而言可利用后述实施例所述的方法求出。
本说明书中，交联海藻酸结构体的凝胶崩解率优选为0%~90%，更优选为0%~70%，进一步优选为0%~50%。交联海藻酸结构体的稳定性是指水溶液中泄漏的海藻酸的浓度越低、即凝胶崩解率越低，稳定性越高。
[凝胶透过率的测定法]
制备内包异硫氰酸荧光素-葡聚糖的交联海藻酸结构体凝胶，在装入容器的前述凝胶中添加生理食盐水，测定生理食盐水中泄漏的葡聚糖浓度。将所测定的葡聚糖的浓度除以通过分解内包异硫氰酸荧光素-葡聚糖的交联海藻酸结构体凝胶而得的总葡聚糖浓度而得到的值以百分数表示的值为凝胶透过率。凝胶透过率具体而言可利用后述实施例所述的方法求出。
对于交联海藻酸的生理食盐水添加24小时后的凝胶透过率，例如内包分子量200万的葡聚糖时，优选为0%~90%，更优选为0%~70%，进一步优选为0%~50%。此外，内包分子量15万的葡聚糖时，例如，若该交联海藻酸结构体凝胶的使用目的为蛋白质、抗体的释放・产生，则优选为1%~100%，更优选为10%~100%，进一步优选为30%~100%。此外，若使用目的为免疫屏障，则优选为0%~90%，更优选为0%~70%，进一步优选为0%~50%。
交联海藻酸结构体的透过性是指透过率越低，是指内容物、凝胶外物质的透过性越低，透过率越高，内容物、凝胶外物质的透过性越高。
凝胶的透过率可以根据所使用的海藻酸的分子量、浓度、导入海藻酸的交联基的种类、导入率、凝胶化中使用的2价金属离子的种类、浓度、或它们的组合而调整。
[内包内容物的交联海藻酸结构体凝胶的制备方法]
例如，作为内容物内包异硫氰酸荧光素-葡聚糖的交联海藻酸结构体凝胶可利用以下的方法制备。
(1)混合式(I)所示的海藻酸衍生物的溶液和异硫氰酸荧光素-葡聚糖溶液。
(2)在(1)中得到的混合溶液中混合式(II)所示的海藻酸衍生物的溶液。
(将(1)的式(I)变更为式(II)时，(2)的式(II)变更为式(I))
(3)将(2)中得到的混合溶液滴加在包含钙离子的溶液中而得到的凝胶在溶液中形成化学交联和离子交联，由此可得到内包异硫氰酸荧光素的葡聚糖的交联海藻酸结构体凝胶。
8.海藻酸衍生物的合成方法
本说明书中，式(I)或式(II)所示的海藻酸衍生物可分别使H2N-L1-Akn(式中，L1和Akn与前述方式[1]中的定义相同)所示的胺衍生物(AM-1)、或H2N-L2-N3(式中，L2与前述方式[4]中的定义相同)所示的胺衍生物(AM-2)与海藻酸类的任意羧基通过使用缩合剂的缩合反应而制造。
[化92]
[式(I)的海藻酸衍生物的制备方法]
使用0.5重量%~1重量%的海藻酸水溶液和式(AM-1)所示的胺，根据文献公知的方法，例如“实验化学讲座 第5版 16、有机化合物的合成IV、羧酸和衍生物、酯类、p35-70、酸酰胺和酸酰亚胺、p118-154、氨基酸・肽、p258-283、2007年、丸善”等记载的方法，在选自1,3-二环己基碳二酰亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐(WSC・HCl)、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP试剂)、双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BOP-Cl)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓六氟磷酸盐(CIP)、或4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)等中的缩合剂的存在下，在选自海藻酸不析出程度的四氢呋喃、1、4-二氧杂环己烷等醚系溶剂、甲醇、乙醇、2-丙醇等醇系溶剂、N,N-二甲基甲酰胺等极性溶剂等中的溶剂和水的混合溶剂中，在碳酸氢钠、碳酸钠等无机碱、或三乙基胺、吡啶等有机碱的存在下或非存在下，在0℃至50℃间的温度下进行缩合反应，由此可制造式(I)的海藻酸衍生物。
[式(II)的海藻酸衍生物的制备方法]
使用0.5重量%~1重量%的海藻酸水溶液和式(AM-2)所示的胺，根据前述[式(I)的海藻酸衍生物的制备方法]进行反应，由此可制造式(II)的海藻酸衍生物。
前述式(I)的海藻酸衍生物或式(II)的海藻酸衍生物的制备方法中，式(AM-1)或式(AM-2)的胺的导入率由于考虑了该胺的性质等，可通过适当选择下述(i)~(v)等反应条件而组合来调节。(i)缩合剂的等量增减、(ii)反应温度的上升・下降、(iii)反应时间的延长・缩短、(iv)反应基质的海藻酸的浓度的调整，为了提高(v)式(AM-1)或式(AM-2)的胺的溶解度而添加与水混合的有机溶剂等。
以下在式(AM-1)或式(AM-2)所示的胺中示出更具体的胺的制造方法。
应予说明，以下的各制造方法中，RA=甲基、乙基等C1~6烷基；P1为选自-C(O)O-叔Bu基、-C(O)O-Bn基、-C(O)CH3基、-C(O)CF3基等中的氨基的保护基； P2为选自-C(O)O-叔Bu基、-C(O)O-Bn基、-C(O)CH3基、-C(O)CF3基、-SO2Ph、-SO2PhMe基、-SO2Ph(NO2)基等中的氨基的保护基；E=卤素原子(氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等)、-OTs基、-OMs基等脱离基。
此外，以下的各制造方法中，保护基P1和P2的保护・脱保护可根据文献公知的方法，例如“有机合成中的保护基(Protective Groups in Organic Synthesis 4thEdition) 第4版、2007年、ジョン ウィリー アンド サンズ(John Wiley ＆ Sons)、グリーン(Greene)等”书中记载的脱保护的方法，进行保护・脱保护。
[制造方法A]
式(AM-OL-1)所示的胺的制造方法：
[化93]
使用式(SM-1)的化合物[式(SM-1)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物]和式(RG-1)的化合物[式(RG-1)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；m1=2~6的整数]，根据文献公知的方法，例如“Carbohydrate Polymers、169、p332-340、2017年”等记载的方法，(i)在AgO3SCF3存在下，在甲苯等不参与反应的溶剂中使(RG-1)取代，接着，(ii)使用DBU进行脱溴化反应，由此形成炔基，进一步(iii)通过使保护基P1脱保护，由此可制造式(AM-OL-1)所示的胺化合物、或式(AM-OL-1)的盐。
[制造方法B]
式(AM-OL-2)所示的胺的制造方法：
[化94]
＜步骤1＞
使用式(SM-2)的化合物[式(SM-2)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物]和式(RG-2)[式(RG-2)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物]的化合物，根据文献公知的方法，例如“European Journal of Organic Chemistry, 2014(6), p1280-1286； 2014年”等记载的方法，(i)在PPh3、和N2(CO2CHMe2)2试剂的存在下，在四氢呋喃等不参与反应的溶剂中，进行光延反应，接着(ii)在氢氧化钠等碱存在下，在甲醇、乙醇、四氢呋喃、水等不参与反应的溶剂或它们的混合溶剂中，进行水解，由此可制造式(IM-1)所示的化合物。
＜步骤2＞
使用通过[制造方法B]＜步骤1＞得到的式(IM-1)的化合物和式(RG-3)[式(RG-3)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；m5=2~6的整数]的化合物，(iii)进行与前述[式(I)的海藻酸衍生物的制备方法]相同的缩合反应，接着(iv)通过使保护基P1脱保护，可制造式(AM-OL-2)所示的胺化合物、或式(AM-OL-2)的盐。
[制造方法C]
式(AM-OL-3)所示的胺的制造方法：
[化95]
＜步骤1＞
使用式(SM-1)的化合物和式(RG-4)的化合物[式(RG-4)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；m8=1~6的整数]，根据文献公知的方法，例如“Journal of the American Chemical Society、126(46)、p15046-15047、2004年”等记载的方法，(i)在AgClO4存在下，在甲苯等不参与反应的溶剂中，使式(RG-4)的化合物取代，接着，(ii)使用NaOMe进行脱溴化反应，由此形成炔基，(iii)在氢氧化锂、氢氧化钠等碱存在下，在甲醇、乙醇、四氢呋喃、水等不参与反应的溶剂或它们的混合溶剂中，进行水解，由此可制造式(IM-2)所示的化合物。
＜步骤2＞
使用通过[制造方法C]＜步骤1＞得到的式(IM-2)的化合物和式(RG-5)的化合物[式(RG-5)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；m9=2~6的整数]，进行与前述[式(I)的海藻酸衍生物的制备方法]相同的缩合反应，接着，使保护基P1脱保护，由此可制造式(AM-OL-3)所示的胺化合物、或式(AM-OL-3)的盐。
[制造方法D]
式(AM-OL-5)所示的胺的制造方法：
[化96]
＜步骤1＞
使用式(SM-3)的化合物[式(SM-3)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物]，根据文献公知的方法，例如“Faming ZhuanliShenqing, 104529898, 22 Apr 2015年”等记载的方法，(i)在吡啶等碱存在下，在乙醇等不参与反应的溶剂中，使H2NOH-HCl反应而形成肟基，接着，(ii)P2O5, 在甲烷磺酸中使五氧化二磷反应，进行贝克曼重排，由此形成8元环内酰胺，接着，(iii)在二乙基醚等不参与反应的溶剂中，使用BH3、LiAlH4等还原剂进行酰胺基的还原，由此可制造式(IM-3)所示的化合物。
＜步骤2＞
使用通过[制造方法D]＜步骤1＞得到的式(IM-3)和式(RG-6)[式(RG-6)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；m3=1~6的整数]的化合物，(iv)进行与前述[式(I)的海藻酸衍生物的制备方法]相同的缩合反应而得到缩合体，接着，(v)使溴加成后，使用叔BuOK进行脱溴化反应，由此形成炔基，接着，(vi)使保护基P1脱保护，由此可制造式(AM-OL-5)所示的胺化合物、或式(AM-OL-5)的盐。
[制造方法E]
式(AM-OL-6)和式(AM-OL-7)所示的胺的制造方法：
[化97]
＜步骤1＞
使用[制造方法D]＜步骤1＞的(ii)中得到的式(IM-4)的化合物和式(RG-7)的化合物[式(RG-7)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；m2’=2~6的整数]，根据文献公知的方法，例如“Synthesis、46(5)、p669-677、2014年”等记载的方法，在氢氧化钠等碱和四丁基溴化铵等相间移动催化剂的存在下，在甲苯等不参与反应的溶剂中反应，由此可制造式(IM-5)所示的化合物。
＜步骤2＞
使[制造方法E]＜步骤1＞中得到的式(IM-5)的化合物与溴加成后，使用叔BuOK等碱进行脱溴化反应，由此形成炔基，接着，通过使保护基P2脱保护，由此可制造式(AM-OL-6)所示的胺化合物、或式(AM-OL-6)的盐。
＜步骤3＞
使用[制造方法E]＜步骤1＞中得到的式(IM-5)的化合物，根据[制造方法D]＜步骤1＞的(iii)的还原法进行反应，由此可制造式(IM-6)的化合物。
＜步骤4＞
使用[制造方法E]＜步骤3＞中得到的式(IM-6)的化合物进行与[制造方法E]＜步骤2＞相同的反应，由此可制造式(AM-OL-7)所示的胺化合物、或式(AM-OL-7)的盐。
[制造方法F]
式(AM-OL-8)所示的胺的制造方法：
[化98]
＜步骤1＞
使用式(SM-4)的化合物[式(SM-4)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物]，根据文献公知的方法，例如“Synthesis, (9),p1191-1194； 2002年”等记载的方法，使溴加成后，使用叔BuOK进行脱溴化反应而形成炔基，由此可制造式(IM-7)所示的化合物。
＜步骤2＞
使用[制造方法F]＜步骤1＞中得到的式(IM-7)的化合物和式(RG-8)的化合物[式(RG-8)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物(详情参照后述的制造方法H)；m6=1~6的整数；m7=2~6的整数]，根据文献公知的方法，例如“Journal.American.Chemical.Society.,126、p15046-15047、2004年”或“Chem.Ber.,94、p3260-3275、1961年”等记载的方法，进行惠斯根反应，接着，使保护基P1脱保护，由此可制造式(AM-OL-8)所示的胺化合物、或式(AM-OL-8)的盐。
[制造方法G]
式(AM-OL-9)所示的胺的制造方法：
[化99]
使用式(SM-5)的化合物[式(SM-5)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物]，根据文献公知的方法，例如“美国专利申请公开2013-0137861号说明书”等记载的方法，在二氯甲烷等不参与反应的溶剂中，在吡啶等碱存在下/非存在下，与氯甲酸对硝基苯反应从而得到碳酸酯体。接着，在三乙基胺存在下，在N、N-二甲基甲酰胺溶剂中，与式(RG-9)的化合物[式(RG-9)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；m4=1~6的整数]反应从而得到氨基甲酰基体。进一步通过使保护基P1脱保护，由此可制造式(AM-OL-9)所示的胺化合物、或式(AM-OL-9)的盐。
[制造方法H]
式(AM-LK-1)所示的胺的制造方法[式(AM-LK-1)中，n1=1,n2=3的对位取代胺也可根据国际公开第2016/152980号小册子等记载的方法制造。]：
[化100]
＜步骤1＞
使用式(SM-6)的化合物[式(SM-6)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；n1=1~6的整数]和式(RG-10)的化合物[式(RG-10)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；n2=2~6的整数]，进行与前述[式(I)的海藻酸衍生物的制备方法]相同的缩合反应，由此可制造式(IM-8)。
＜步骤2＞
使用[制造方法H]＜步骤1＞中得到的式(IM-8)的化合物，根据文献公知的方法，例如“Organometallics,29(23),p6619-6622；2010年”等记载的方法，在二甲基亚砜等不参与反应的溶剂中，与NaN3反应而导入叠氮基后，使保护基P1脱保护，由此可制造式(AM-LK-1)所示的胺化合物、或式(AM-LK-1)的盐。
[制造方法J]
式(AM-LK-2)所示的胺的制造方法：
[化101]
＜步骤1＞
使用式(SM-7)的化合物[式(SM-7)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物]和式(RG-11)的化合物[式(RG-11)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；n4=2~6的整数]，进行基于[制造方法B]＜步骤1＞的光延反应，接着，在氢氧化钠等碱存在下，在甲醇、乙醇、四氢呋喃、水等不参与反应的溶剂或它们的混合溶剂中，进行酯基的水解，由此可制造式(IM-9)所示的化合物。
＜步骤2＞
使用[制造方法J]＜步骤1＞中得到的式(IM-9)的化合物和式(RG-12)[式(RG-12)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；n3=2~6的整数]的化合物，进行与前述[式(I)的海藻酸衍生物的制备方法]相同的缩合反应而得到缩合体，接着，使保护基P1脱保护，由此可制造式(AM-LK-2)所示的胺化合物、或式(AM-LK-2)的盐。
[制造方法K]
式(AM-LK-3)所示的胺的制造方法：
[化102]
＜步骤1＞
使用[制造方法J]＜步骤1＞的式(SM-7)的化合物和式(RG-13)的化合物[式(RG-13)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；n6=2~6的整数]，进行基于[制造方法B]＜步骤1＞的光延反应，接着，在氢氧化钠等碱存在下，在甲醇、乙醇、四氢呋喃、水等不参与反应的溶剂或它们的混合溶剂中，进行酯基的水解，由此可制造式(IM-10)所示的化合物。
＜步骤2＞
使用[制造方法K]＜步骤1＞中得到的式(IM-10)的化合物和式(RG-14)[式(RG-14)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；n5=1~6的整数]的化合物，进行与前述[式(I)的海藻酸衍生物的制备方法]相同的缩合反应而得到缩合体，接着，使保护基P1脱保护，由此可制造式(AM-LK-3)所示的胺化合物、或式(AM-LK-3)的盐。
[制造方法L]
式(AM-OL-4)所示的胺的制造方法：
[化103]
＜步骤1＞
使用式(SM-8)的化合物[式(SM-8)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物]，根据文献公知的方法，例如“国际公开第2009/067663号小册子”等记载的方法，与溴加成后，使用LiN(i-Pr)2进行脱溴化，由此可制造式(IM-11)的化合物。
＜步骤2＞
使用[制造方法L]＜步骤1＞中得到的式(IM-11)的化合物和式(RG-15)所示的化合物[式(RG-15)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；m1=2~6的整数]，在氢化钠等碱存在下，在四氢呋喃等不参与反应的溶剂中反应，由此得到导入了侧链的化合物。接着，使保护基P1脱保护，由此可制造式(AM-OL-4)所示的胺化合物、或式(AM-OL-4)的盐。
[制造方法M]
式(AM-LK-4)所示的胺的制造方法：
[化104]
＜步骤1＞
使用式(SM-M)的化合物和式(RG-M-1)的化合物[式(SM-M)的化合物和式(RG-M-1)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；n7=2~6的整数]，进行与前述[式(I)的海藻酸衍生物的制备方法]相同的缩合反应，由此可制造式(IM-M-1)所示的化合物。
此外，根据文献公知的方法，例如、“实验化学讲座 第5版 16、羧酸和衍生物、酸卤化物、酸酐、99-118页、2007年、丸善”、等记载的方法，将式(SM-M)所示的羧酸转换为酸卤化物、酸酐，使用式(RG-M-1)的化合物，在三乙基胺、吡啶等碱的存在下，在选自二氯甲烷、氯仿等卤素系溶剂、二乙基醚、四氢呋喃等醚系溶剂、甲苯、苯等芳族烃系溶剂、N,N-二甲基甲酰胺等极性溶剂等中的溶剂中，在0℃至溶剂回流的温度下反应，由此可同样地制造式(IM-M-1)的化合物。
＜步骤2＞
使用[制造方法M]＜步骤1＞中得到的式(IM-M-1)的化合物，根据文献公知的方法，例如利用“グリーン(Greene)等的“有机合成中的保护基(Protective Groups inOrganic Synthesis) 第4版、2007年、ジョン ウィリー アンド サンズ(John Wiley ＆Sons)”书中所述的方法，根据保护基的种类选择适当脱保护法而进行反应，由此可制造式(AM-LK-4)所示的化合物、或式(AM-LK-4)的盐。
[制造方法N]
式(AM-OL-17)所示的胺的制造方法：
[化105]
＜步骤1＞
使用式(SM-N)的化合物和式(RG-N-1)的化合物[式(SM-N)的化合物和式(RG-N-1)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；m10=1~4、m11=1~6、m12=1~6的整数]，进行与前述[制造方法M]＜步骤1＞相同的缩合反应，由此可制造式(IM-N-1)所示的化合物。
＜步骤2＞
使用[制造方法N]＜步骤1＞中得到的式(IM-N-1)的化合物，根据文献公知的方法，例如利用“グリーン(Greene)等的“有机合成中的保护基(Protective Groups inOrganic Synthesis) 第4版、2007年、ジョン ウィリー アンド サンズ(John Wiley ＆Sons)”书中所述的方法，根据保护基的种类选择适当脱保护法而进行反应，由此可制造式(AM-OL-17)所示的化合物、或式(AM-OL-17)的盐。
[制造方法P]
式(AM-OL-18)所示的胺的制造方法[式(AM-OL-18)中，m13=1、m14=2的胺也可根据国际公开第2015/143092号小册子等记载的方法制造。]：
[化106]
＜步骤1＞
使用式(SM-P)的化合物和式(RG-P-1)的化合物[式(SM-P)的化合物和式(RG-P-1)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；m13=1~4、m14=2~6的整数]，进行与前述[制造方法M]＜步骤1＞相同的缩合反应，由此可制造式(IM-P-1)所示的化合物。
＜步骤2＞
使用[制造方法P]＜步骤1＞中得到的式(IM-P-1)的化合物，根据文献公知的方法，例如利用“グリーン(Greene)等的“有机合成中的保护基(Protective Groups inOrganic Synthesis) 第4版、2007年、ジョン ウィリー アンド サンズ(John Wiley ＆Sons)”书中所述的方法，根据保护基的种类选择适当脱保护法而进行反应，由此可制造式(AM-OL-18)所示的化合物、或式(AM-OL-18)的盐。
[制造方法Q]
式(AM-OL-19)所示的胺的制造方法：
[化107]
＜步骤1＞
使用式(SM-Q)的化合物和式(RG-Q-1)的化合物[式(SM-Q)的化合物和式(RG-Q-1)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；m15=1~4、m16=1~6的整数]，进行与前述[制造方法M]＜步骤1＞相同的缩合反应，由此可制造式(IM-Q-1)所示的化合物。
＜步骤2＞
使用[制造方法Q]＜步骤1＞中得到的式(IM-Q-1)的化合物，根据文献公知的方法，例如利用“グリーン(Greene)等的“有机合成中的保护基(Protective Groups inOrganic Synthesis) 第4版、2007年、ジョン ウィリー アンド サンズ(John Wiley ＆Sons)”书中所述的方法，根据保护基的种类选择适当脱保护法而进行反应，由此可制造式(AM-OL-19)所示的化合物、或式(AM-OL-19)的盐。
[制造方法R]
式(AM-LK-5)所示的胺的制造方法[式(AM-LK-5)中，n8=1、n9=2的胺也可根据国际公开第2016/152980号小册子等记载的方法制造。]：
[化108]
＜步骤1＞
使用式(SM-R)的化合物[式(SM-R)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；n8=1~4的整数]和式(RG-R-1)的化合物[式(RG-R-1)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；n9=1~6的整数]，进行与前述[制造方法M]＜步骤1＞相同的缩合反应，由此可制造式(IM-R-1)所示的化合物。
＜步骤2＞
使用[制造方法R]＜步骤1＞中得到的式(IM-R-1)的化合物，与前述[制造方法H]＜步骤2＞相同地与NaN3反应而导入叠氮基后，使保护基P1脱保护，由此可制造式(AM-LK-5)所示的胺化合物、或式(AM-LK-5)的盐。
[制造方法S]
式(AM-LK-6)所示的胺的制造方法：
[化109]
＜步骤1＞
[E=OTs基或OMs基时]：
使用式(SM-S)的化合物[式(SM-S)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；n10=1~4的整数]和甲磺酰氯、甲苯磺酰氯、甲苯磺酸酐等试剂，根据文献公知的方法，例如“Journal of the American Chemical Society、136(29)、p10450-10459、2014年”等记载的方法，在三乙基胺、N,N-二异丙基乙基胺、吡啶等碱存在下，使用二氯甲烷、氯仿等卤素系溶剂、二乙基醚、四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、1,4-二氧杂环己烷等醚系溶剂、苯、甲苯等芳族烃系溶剂等不参与反应的溶剂、或它们的混合溶剂或在无溶剂下，在-78℃至溶剂回流的温度下进行反应，由此可制造式(IM-S-1)所示的化合物。
[E=卤素(氯、溴、碘时)]：
使用式(SM-S)的化合物，根据文献公知的方法、例如、“实验化学讲座 第4版 19、有机合成I、烃・卤化合物、363-482页、1992年、丸善”等记载的方法，适当选择下述所示的各种卤化剂(氯化剂、溴化剂、碘化剂)和不参与反应的溶剂，在0℃至溶剂回流的温度下进行反应，由此可制造式(IM-S-1)所示的卤化化合物(E=氯、溴、碘)。
＜E=氯时＞
作为氯化剂，使用氯化氢/氯化锌(HCl/ZnCl2)、氯化氢/六甲基磷酸三酰胺(HCl/HMPA)、亚硫酰氯(SOCl2)、四氯化碳/三苯基膦(CCl4/PPh3)、三光气/三苯基膦((CCl3)2CO/PPh3)、三光气/N,N-二甲基甲酰胺(POCl3/DMF)等试剂，由此可制造期望的氯化物。
＜X=溴时＞
作为溴化剂，使用48%氢溴酸(48%HBr)、48%氢溴酸/硫酸(48%HBr/H2SO4)、溴化氢/溴化锂(HBr/LiBr)、溴化钠/硫酸(NaBr/H2SO4)、三溴化磷(PBr3)等试剂，由此可制造期望的溴化物。此外，式(IM-S-1)中，使E=OTs或OMs的化合物与溴化钠(NaBr)反应，由此也可制造期望的溴化物。
＜X=碘时＞
作为碘化剂，使用氢碘酸(HI)、碘/三苯基膦(I2/PPh3)等试剂，由此可制造期望的碘化物。此外， 式(IM-S-1)中，使E=OTs或OMs的化合物与碘化钠(NaI)反应，由此也可制造期望的碘化物。
＜步骤2＞
使用[制造方法S]＜步骤1＞中得到的式(IM-S-1)的化合物，与前述[制造方法H]＜步骤2＞同样地与NaN3反应，由此可制造式(IM-S-2)的化合物。
＜步骤3＞
使用[制造方法S]＜步骤2＞中得到的式(IM-S-2)的化合物，与前述[制造方法B]＜步骤1＞的酯基的水解反应相同地进行水解，由此可制造式(IM-S-3)的化合物。
＜步骤4＞
使用[制造方法S]＜步骤3＞中得到的式(IM-S-3)和式(RG-S-1)的化合物[式(RG-S-1)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；n11=1~6的整数]，进行与前述[制造方法M]＜步骤1＞相同的缩合反应，由此可制造式(IM-S-4)所示的化合物。
＜步骤5＞
使[制造方法S]＜步骤4＞中得到的式(IM-S-4)的化合物的保护基P1脱保护，由此可制造式(AM-LK-6)所示的胺化合物、或式(AM-LK-6)的盐。
[制造方法T]
式(AM-LK-7)所示的胺的制造方法：
[化110]
＜步骤1＞
使用式(SM-M)的化合物和式(RG-T-1)的化合物[式(SM-M)的化合物和式(RG-T-1)的化合物为市售化合物或可由市售化合物利用文献公知的制造方法制造的化合物；n12=1~6的整数]，进行与前述[制造方法M]＜步骤1＞相同的缩合反应，由此可制造式(IM-T-1)所示的化合物。
此外，根据文献公知的方法、例如、“实验化学讲座 第5版 16、羧酸和衍生物、酸卤化物、酸酐、99-118页、2007年、丸善”、等记载的方法，将式(SM-M)所示的羧酸转换为酸卤化物、酸酐，使用式(RG-T-1)的化合物，在三乙基胺、吡啶等碱的存在下，在选自二氯甲烷、氯仿等卤素系溶剂、二乙基醚、四氢呋喃等醚系溶剂、甲苯、苯等芳族烃系溶剂、N,N-二甲基甲酰胺等极性溶剂等中的溶剂中，在0℃至溶剂回流的温度下反应，由此可同样地制造式(IM-T-1)的化合物。
＜步骤2＞
使用[制造方法T]＜步骤1＞中得到的式(IM-T-1)的化合物，根据文献公知的方法，例如利用“グリーン(Greene)等的“有机合成中的保护基(Protective Groups inOrganic Synthesis) 第4版、2007年、ジョン ウィリー アンド サンズ(John Wiley ＆Sons)”书中所述的方法，根据保护基的种类选择适当脱保护法而进行反应，由此可制造式(AM-LK-7)所示的化合物、或式(AM-LK-7)的盐。
关于为了制造式(I)或式(II)所示的海藻酸衍生物而使用的导入了炔基的胺(Akn-L1-NH2)或导入了叠氮基的胺(N3-L2-NH2)，前述[制造方法A]~[制造方法N]和[制造方法P]~[制造方法T]记载的各反应可通过适当组合文献公知的方法例如、“实验化学讲座 第5版、各本、2007年、丸善”、“Comprehensive Organic Transformations, A Guide toFunctional Group Preparations, 3rd Edition (Edited by Richard C. Larock),2018年”、“Strategic Applications of Named Reactions in Organic Synthesis,(Edited by Laszlo Kurti, Barbara Czako), Academic Press, 2005年”等记载的方法，由此可制造期望的胺。应予说明，关于下述表中的胺，通过表中所述的现有技术文献所述的方法也可制造。
[表11]
本说明书中，式(AM-1)或式(AM-2)所示的胺化合物(也包括各式的下位式子)有时形成制药学上可接受的盐(例如，酸加成盐)。作为这样的盐，只要为制药学上可接受的盐则没有特别限定，例如，可举出与无机酸的盐、与有机酸的盐、与酸性氨基酸的盐等。作为与无机酸的盐的适合例，可举出例如与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磷酸等的盐。作为与有机酸的盐的适合例，可举出例如与甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、庚酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、乳酸、山梨酸、扁桃酸等脂肪族单羧酸等的盐、与草酸、丙二酸、丁二酸、富马酸、马来酸、苹果酸、酒石酸等脂肪族二羧酸的盐、与柠檬酸等脂肪族三羧酸的盐、与苯甲酸、水杨酸等芳族单羧酸的盐、与邻苯二甲酸等芳族二羧酸的盐、与肉桂酸、乙醇酸、丙酮酸、肉铁质酸（オキシル酸）、水杨酸、N-乙酰基半胱氨酸等有机羧酸的盐、与甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等有机磺酸的盐、与天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸类的酸加成盐。作为与酸性氨基酸的盐的适合例，可举出例如与天冬氨酸、谷氨酸等的盐。其中，优选为药学上可接受的盐。
根据常规方法，例如，混合本发明的化合物和包含适量的酸或碱的溶液，形成目标的盐后分别滤取、或馏去该混合溶剂，由此可得到前述盐。作为关于盐的总论，已出版Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties, Selection, and Use、Stahl＆Wermuth (Wiley-VCH、2002)，该书中详细进行了记载。
本说明书中，式(AM-1)或式(AM-2)所示的胺化合物(也包括各式的下位式子)或它的盐可以与水、乙醇、甘油等溶剂形成溶剂合物。
本说明书中，除非另有限定，环状基取代为可变取代基时，该可变取代基指不与环状基的特定碳原子键合。例如，下述式A中的可变取代基Rs指可取代于该式A中的碳原子i、ii、iii、iv或v中任一者。
[化111]
9.海藻酸衍生物、交联海藻酸结构体的用途
海藻酸衍生物在食品、医疗、化妆品、纤维、制纸等广泛的领域中可代替以往的海藻酸使用。作为海藻酸衍生物或光交联海藻酸结构体的优选用途，具体而言，可举出创伤包覆材料、术后防粘连材料、药剂缓释用基材、细胞培养用基材、细胞移植用基材等医疗用材料。
作为用作医疗用材料时的交联海藻酸结构体的形状，可举出管状、纤维状、纤维、珠、凝胶、近球形的凝胶等，优选制成珠、凝胶或近球形的凝胶，更优选制成近球形的凝胶。
应予说明，本说明书中记载的全部文献和刊行物不管其目的如何通过参照将其全部引入本说明书。
并且，本发明的目的、特征、优点及其构思通过本说明书的记载，对于本领域技术人员来说是显而易见的，根据本说明书的记载，只要是本领域技术人员，就能够容易地实施本发明。用于实施发明的最佳方式以及具体的实施例等表示本发明的优选实施方式，是为了例示或者说明而示出的，本发明不限于它们。对于本领域技术人员来说显而易见的是，在本说明书公开的本发明的意图和范围内，基于本说明书的记载，可以进行各种修改。
实施例
接着，为了进一步详细地说明本发明而举出实施例、试验例，这些例子仅为实施例、试验例，不限定本发明，而且可在不超过本发明的范围的范围内变化。
核磁共振光谱(NMR)的测定中，使用JEOL JNM-ECX400 FT-NMR(日本电子)。液相色谱质谱(LC-Mass)利用以下的方法测定。使用[UPLC]Waters AQUITY UPLC系统和BEH C18柱(2.1mm×50mm、1.7μm)(Waters)，使用乙腈：0.05%三氟乙酸水溶液=5：95(0分)~95：5(1.0分)~95：5(1.6分)~5：95(2.0分)的流动相和梯度条件。
1H-NMR数据中，NMR信号模式中，s表示单重态，d表示双重态，t表示三重态，q表示四重态，m表示多重态，br表示宽范围，J表示偶联常数，Hz表示赫兹、CDCl3表示氘代氯仿、DMSO-D6表示氘代二甲基亚砜、D2O表示氘代水。1H-NMR数据中，关于羟基(OH)、氨基(NH2)、羧基(COOH)的质子等由于为宽带而无法确认的信号，未记载数据。
LC-Mass数据中，M指分子量、RT指保留时间、[M＋H]＋,[M＋Na]＋指分子离子峰。
实施例中的“室温”通常表示约0℃至约35℃的温度。
实施例中的反应性取代基导入率(摩尔%)表示导入的反应性取代基的摩尔数相对于由1H-NMR(D2O)算出的构成海藻酸的单糖葡糖醛酸和甘露糖醛酸)单元的摩尔数的比例。
实施例中，导入反应性基团或互补的反应性基团前的海藻酸钠使用示出前述表10所述的物性值的海藻酸钠。
表12中示出(实施例1)~(实施例15)中得到的导入了反应性基团的海藻酸衍生物(实施例1a、实施例1b、实施例1c、实施例1d、实施例1e、实施例1f、实施例2、实施例3a、实施例3b、实施例3c、实施例3d、实施例3e、实施例3f、实施例4、实施例5a、实施例5b、实施例6、实施例7a、实施例7b、实施例8、实施例9a、实施例9b、实施例9c、实施例10、实施例11、实施例12、实施例13、实施例14和实施例15的物性值(具体而言为反应性基团导入率(mol%)、分子量、和重均分子量(万Da))。
(实施例1)
导入二苯并环辛炔-胺基的海藻酸(实施例1a、实施例1b、实施例1c、实施例1d、实施例1e、实施例1f、和实施例1g)的合成：
[化112]
(实施例1a)导入二苯并环辛炔-胺基的海藻酸(EX1-(I)-A-2)的合成：
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：A-2)水溶液(43.6 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(111.65 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(403.5 μL)。在该溶液中滴加市售的二苯并环辛炔-胺[CAS：1255942-06-3](EX1-SM、83.62 mg)的乙醇溶液(2 mL)，在室温下搅拌18小时。加入氯化钠(400 mg)后，加入乙醇(87.2 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以淡黄色固体形式得到标题化合物EX1-(I)-A-2(376 mg)。
反应性取代基(二苯并环辛炔-氨基)的导入率为6.9mol%(NMR积分比)。
(实施例1b)导入二苯并环辛炔-胺基的海藻酸(EX1-(I)-A-1)的合成：
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：A-1)水溶液(19.32 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(49.47 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(178.8 μL)。在该溶液中滴加市售的二苯并环辛炔-胺[CAS：1255942-06-3](EX1-SM、37.05 mg)的乙醇溶液(4 mL)，在室温下搅拌20小时。加入氯化钠(200 mg)后，加入乙醇(38.64 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以淡黄色固体形式得到标题化合物EX1-(I)-A-1(184 mg)。
反应性取代基(二苯并环辛炔-氨基)的导入率为6.5mol%(NMR积分比)。
(实施例1c)导入二苯并环辛炔-胺基的海藻酸(EX1-(I)-A-3)的合成：
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：A-3)水溶液(15.06 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(38.57 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(139.4 μL)。在该溶液中滴加市售的二苯并环辛炔-胺[CAS：1255942-06-3](EX1-SM、28.88 mg)的乙醇溶液(2 mL)，在室温下搅拌23小时。加入氯化钠(150 mg)后，加入乙醇(60.24 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以淡黄色固体形式得到标题化合物EX1-(I)-A-3(164 mg)。
反应性取代基(二苯并环辛炔-氨基)的导入率为6.6摩尔%(NMR积分比)。
(实施例1d)导入二苯并环辛炔-胺基的海藻酸(EX1-(I)-B-2a)的合成：
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：B-2)水溶液(53.0 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(111.0 mg)、二苯并环辛炔-胺[CAS：1255942-06-3](EX1-SM、36.9 mg)的乙醇(5.3 mL)溶液、1摩尔浓度-小苏打水(113.7 μL)，在30℃下搅拌3小时。加入氯化钠(530 mg)后，加入乙醇(101 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX1-(I)-B-2a(465 mg)。
反应性取代基(二苯并环辛炔-氨基)的导入率为4.9mol%(NMR积分比)。
(实施例1e)导入二苯并环辛炔-胺基的海藻酸(EX1-(I)-B-2b)的合成：
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：B-2)水溶液(35.0 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(14.7 mg)、二苯并环辛炔-胺[CAS：1255942-06-3](EX1-SM、4.9 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(17.7 μL)、乙醇(3.5 mL)，在30℃下搅拌3.5小时。加入氯化钠(350 mg)后，加入乙醇(70 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX1-(I)-B-2(329 mg)。
反应性取代基(二苯并环辛炔-氨基)的导入率为0.8mol%(NMR积分比)。
(实施例1f)导入二苯并环辛炔-胺基的海藻酸(EX1-(I)-B-2c)的合成：
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：B-2)水溶液(60.0 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(67.0 mg)、二苯并环辛炔-胺[CAS：1255942-06-3](EX1-SM、16.7 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(60.5 μL)、乙醇(6.0 mL)，在30℃下搅拌3小时。加入氯化钠(600 mg)后，加入乙醇(120 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX1-(I)-B-2c(558 mg)。
反应性取代基(二苯并环辛炔-氨基)的导入率为1.9mol%(NMR积分比)。
(实施例1g)导入二苯并环辛炔-胺基的海藻酸(EX1-(I)-A-2b)的合成：
利用与(实施例1a)相同的方法，得到反应性取代基的导入率(NMR积分比)=4.9mol%的标题化合物(EX1-(I)-A-2b)。
(实施例2)导入N-(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基羰基-1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷基的海藻酸(化合物EX2-(I)-A-2)的合成：
[化113]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：A-2)水溶液(10.9 mL)中在室温下加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(27.91mg)、1摩尔浓度-小苏打水(100.9 μL)。在该溶液中在室温下滴加市售的N-(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基羰基-1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷[CAS1263166-93-3](EX-2-SM、24.54 mg)的乙醇(2 mL)和水(1 mL)溶液，在相同温度下搅拌21小时。加入氯化钠(100 mg)后，加入乙醇(21.8 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以淡黄色固体形式得到标题化合物EX2-(I)-A-2(100 mg)。
反应性取代基(N-(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基羰基-1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷基)的导入率为5.8mol%(NMR积分比)。
(实施例3) 导入4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺基的海藻酸(实施例3a、实施例3b、实施例3c、实施例3d、实施例3e、实施例3f、和实施例3g)的合成：
[化114]
＜步骤1＞4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)苯甲酸甲酯(化合物EX3-IM-1)的合成：
[化115]
在三苯基膦(0.96 g)的四氢呋喃(2.59 mL)溶液中在冰冷却搅拌下加入偶氮二羧酸二乙基酯(40%甲苯溶液,1.92 mL)溶液，在室温下搅拌20分钟。对该溶液，在冰冷却搅拌下加入市售的4-羟基苯甲酸甲酯[CAS：99-76-3](化合物EX3-SM、0.37 g)和2-(叔丁氧基羰基)乙醇胺[CAS：26690-80-2](0.39 g)的四氢呋喃(1.1 mL)溶液，在室温下搅拌17小时。将反应液在减压下浓缩，将残留物利用硅胶柱色谱(5%乙酸乙酯/正庚烷~40%乙酸乙酯/正庚烷)纯化，得到EX3-SM和EX3-IM-1的混合物。使该混合物溶于甲基叔丁基醚(20 mL)，依次用1当量浓度-氢氧化钠水溶液(5 mL)洗涤2次、用饱和食盐水(5 mL)洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂，以粉色的油状物质形式得到化合物EX3-IM-1(0.45 g)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)：7.98 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.90 (2H, d, J = 8.8Hz), 4.97 (1H, br s), 4.07 (2H, t, J = 5.2 Hz), 3.88 (3H, s), 3.56 (2H, q, J= 5.2 Hz), 1.45 (9H, s)
＜步骤2＞4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺盐酸盐(化合物EX3-IM-3)的合成：
[化116]
在(实施例3)＜步骤1＞中得到的化合物EX3-IM-1(0.44 g)的甲醇(4.4 mL)溶液中加入氢氧化锂一水合物(0.25 g)，在60度下搅拌3小时30分钟。在反应液中加入1当量浓度-盐酸(5 mL)，用乙酸乙酯(10 mL)提取3次。将有机层依次用水(5 mL)、饱和食盐水(5mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。将残留物溶于乙腈(4.4 mL)，加入3-叠氮基丙烷-1-胺[CAS：88192-19-2](0.15 g)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(0.57 g)。接着，在冰冷却搅拌下加入N,N-二异丙基乙基胺(0.52 mL)，在室温下搅拌5小时。在反应液中加入水(10 mL)，用乙酸乙酯(15 mL)提取3次，使有机层用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱色谱(16%乙酸乙酯/正庚烷~100%乙酸乙酯)纯化，得到包含化合物EX3-IM-2(0.71 g)的组分。
对包含化合物EX3-IM-2的组分(0.71 g)，加入4当量浓度-氯化氢/1,4-二氧杂环己烷(4.9 mL)，在室温下搅拌20分钟。在反应液中加入二异丙基醚后，过滤析出物，由此以白色固体形式得到标题化合物EX3-IM-3(0.49 g)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)：7.60 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.93 (2H, d, J = 8.8Hz), 4.19 (2H, t, J = 4.8 Hz), 3.31-3.29 (6H, m), 1.77-1.71 (2H, m).LC-MS：M(游离胺)=263、RT=0.54(分)、[M＋H]＋=264
(实施例3a) 导入4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺基的海藻酸(化合物EX3-(II)-A-2)的合成：
[化117]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：A-2)水溶液(19.6 mL)中在冰冷却搅拌下加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(50.19 mg)、(实施例3)＜步骤2＞中得到的化合物EX3-IM-3(54.37 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(181.4 μL)，在室温下搅拌5小时。加入氯化钠(200 mg)后，加入乙醇(39.2 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX3-(II)-A-2(198 mg)。
反应性取代基(4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺基)的导入率为6.1mol%(NMR积分比)。
(实施例3b) 导入4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺基的海藻酸(化合物EX3-(II)-A-1)的合成：
[化118]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：A-1)水溶液(19.32 mL)中在冰冷却搅拌下加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(49.47 mg)、(实施例3)＜步骤2＞中得到的化合物EX3-IM-3(53.39 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(178.8 μL)，在室温下搅拌20小时。加入氯化钠(200 mg)后，加入乙醇(38.64 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到化合物EX3-(II)-A-1(221 mg)。
反应性取代基(4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺基)的导入率为9.4mol%(NMR积分比)。
(实施例3c) 导入4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺基的海藻酸(化合物EX3-(II)-A-3)的合成：
[化119]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：A-3)水溶液(15.06 mL)中在冰冷却搅拌下加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(38.57 mg)、(实施例3)＜步骤2＞中得到的化合物EX3-IM-3(41.78 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(139.4 μL)，在室温下搅拌5小时。加入氯化钠(150 mg)后，加入乙醇(60.24 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到化合物EX3-(II)-A-3(155 mg)。
反应性取代基(4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺基)的导入率为6.9mol%(NMR积分比)。
(实施例3d) 导入4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺基的海藻酸(化合物EX3-(II)-B-2a)的合成：
[化120]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：B-2)水溶液(60.0 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(125.6 mg)、(实施例3)＜步骤2＞中得到的化合物EX3-IM-3(45.4 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(211.8 μL)，在30℃下搅拌3小时。加入氯化钠(600 mg)后，加入乙醇(120 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX3-(II)-B-2a(553mg)。
反应性取代基(4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺基)的导入率为3.7mol%(NMR积分比)。
(实施例3e) 导入4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺基的海藻酸(化合物EX3-(II)-B-2b)的合成：
[化121]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：B-2)水溶液(35.0 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(14.7 mg)、(实施例3)＜步骤2＞中得到的化合物EX3-IM-3(5.3 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(26.5 μL)，在30℃下搅拌3.5小时。加入氯化钠(350 mg)后，加入乙醇(70 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX3-(II)-B-2b(304mg)。
反应性取代基(4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺基)的导入率为0.6摩尔%(NMR积分比)。
(实施例3f) 导入4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺基的海藻酸(化合物EX3-(II)-B-2c)的合成：
[化122]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：B-2)水溶液(60.0 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(67.0 mg)、(实施例3)＜步骤2＞中得到的化合物EX3-IM-3(18.1 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(90.8 μL)，在30℃下搅拌3小时。加入氯化钠(600 mg)后，加入乙醇(120 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX3-(II)-B-2c(568mg)。
反应性取代基(4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺基)的导入率为1.5mol%(NMR积分比)。
(实施例3g)导入4-(2-氨基乙氧基)-N-(3-叠氮基丙基)苯甲酰胺基的海藻酸(EX3-(II)-A-2b)的合成：
利用与(实施例3a)相同的方法，得到反应性取代基的导入率(NMR积分比)=4.3mol%的标题化合物(EX3-(II)-A-2b)。
(实施例4)导入4-(3-氨基丙氧基)-N-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺基的海藻酸(化合物EX4-(II)-A-2)的合成：
[化123]
＜步骤1＞ 4-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙氧基)苯甲酸(化合物EX4-IM-2)的合成：
[化124]
在三苯基膦(2.07 g)的四氢呋喃(7 mL)溶液中加入偶氮二羧酸二异丙基酯 (40%甲苯溶液,4.15 mL)，搅拌直至形成析出物。进一步搅拌1小时后，加入市售的(3-羟基丙基)氨基甲酸叔丁基酯[CAS：58885-58-8](1.15 g)和4-羟基苯甲酸甲基酯[CAS:99-76-3](化合物EX4-SM、1 g)的四氢呋喃(3 mL)溶液，搅拌3小时。将反应液减压下浓缩，将残留物利用硅胶柱色谱(8%乙酸乙酯/正庚烷~66%乙酸乙酯/正庚烷)纯化。使该纯化物溶于甲基叔丁基醚(20 mL，依次用1当量浓度-氢氧化钠水溶液(5 mL)洗涤2次、用饱和食盐水(5 mL)洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂，以白色固体形式得到包含化合物EX4-IM-1(2.94 g)的组分。
对于包含化合物EX4-IM-1的组分(2.94 g)的甲醇(15.6 mL)溶液，在室温搅拌下加入氢氧化锂・一水合物(1.06 g)，在60℃下搅拌3小时。冷却至室温后，在减压下馏去溶剂。对于该残留物，加入水(20 mL)，用甲基叔丁基醚(20 mL)提取2次。将水层用1当量浓度-盐酸(25 mL)制成酸性，用乙酸乙酯(20 mL)提取3次，用水(10 mL)和饱和食盐水(10 mL)依次洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。在残留物中加入甲基叔丁基醚(30 mL)和1当量浓度-氢氧化钠水溶液(20 m)，用甲基叔丁基醚(20 mL)提取2次。将水层用1当量浓度-盐酸(20 mL)制成酸性，用乙酸乙酯(20 mL)提取2次。将有机层用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂，以白色固体形式得到化合物EX4-IM-2(1.4 g)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)：8.03 (2H, d, J = 7.6 Hz), 6.92 (2H, d, J = 8.8Hz), 4.73 (1H, br s), 4.09 (2H, t, J = 6.0 Hz), 3.34 (2H, q, J = 6.3 Hz),2.05-1.98 (2H, m), 1.45 (9H, s)
＜步骤2＞ 4-(3-氨基丙氧基)-N-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺盐酸盐(化合物EX4-IM-4)的合成：
[化125]
对于(实施例4)＜步骤1＞中得到的化合物EX4-IM-2(1 g)、市售的2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙烷-1-胺[CAS：166388-57-4](0.62 g)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(1.35 g)的乙腈(20 mL)溶液，在冰冷却搅拌下滴加N,N-二异丙基乙基胺(1.24 mL)，在室温下搅拌1小时。在反应液中加入水(20 mL)，用乙酸乙酯(20 mL)提取3次，用水(10 mL)和饱和食盐水(10 mL)依次洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱色谱(16%乙酸乙酯/正庚烷~100%乙酸乙酯)纯化，得到包含化合物EX4-IM-3(1.37 g)的组分。
对于包含化合物EX4-IM-3的组分(1.37 g)，加入1,4-二氧杂环己烷(9.58 mL)。对于该溶液，在水冷却搅拌下加入4当量浓度-氯化氢/1,4-二氧杂环己烷(9.58 mL)，在室温下搅拌1小时。在反应液中加入二异丙基醚(100 mL)后，将悬浮液在室温下搅拌1小时。将溶剂在减压下馏去，将残留物利用乙酸乙酯(20 mL)和甲基 叔丁基醚(10 mL)磨碎。过滤所得固体，减压下干燥，由此以白色固体形式得到标题化合物EX4-IM-4(1.23 g)。
NMR数据(D2O)(δ：ppm)：7.66-7.64 (2H, m), 6.98-6.94 (2H, m), 4.12 (2H,t, J = 5.6 Hz), 3.66-3.57 (6H, m), 3.57-3.52 (2H, m), 3.47 (2H, t, J = 5.2Hz), 3.29 (2H, t, J = 4.8 Hz), 3.12 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.10-2.04 (2H, m)、LC-MS：M(游离胺)=351、RT=0.57(分)、[M＋H]＋=352
＜步骤3＞ 导入4-(3-氨基丙氧基)-N-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺基的海藻酸(化合物EX4-(II)-A-2)的合成：
[化126]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：A-2)水溶液(19.6 mL)中在冰冷却搅拌下加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(50.19 mg)、(实施例4)＜步骤2＞中得到的化合物EX4-IM-4(70.35 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(181.4 μL)，在室温下搅拌5小时。加入氯化钠(200 mg)后，加入乙醇(39.2 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX4-(II)-A-2(199 mg)。
反应性取代基(4-(3-氨基丙氧基)-N-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺基)的导入率为4.3mol%(NMR积分比)。
(实施例5)导入N-(2-氨基乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基的海藻酸(实施例5a、实施例5b和实施例5c)的合成：
[化127]
＜步骤1＞ (2-(4-(氯甲基)苯甲酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(化合物EX5-IM-1)的合成：
[化128]
将EX5-SM(4-(氯甲基)苯甲酰氯、[CAS：876-08-4](2.0 g)溶于四氢呋喃(10.0mL)，在冰水冷却下滴加(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁基酯[CAS：57260-73-8](1.7 g)和N,N‘-二异丙基乙基胺(3.7 mL)的四氢呋喃(10.0 mL)溶液，在室温下搅拌1.5小时。在反应液中加入乙酸乙酯(30 mL)和水(10 mL)，分液。将有机层依次用半饱和小苏打水(10 mL)、水(10 mL)、饱和食盐水(5 mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。将残渣用叔丁基甲基醚磨碎后，滤取所得固体，用叔丁基甲基醚洗涤，以白色固体形式得到标题化合物EX5-IM-1(2.9 g)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 7.81(2H、d、J = 8 Hz)、7.44(2H、d、J = 8 Hz)、7.24(1H、brs)、4.96(1H、brs)、4.60(2H、s)、3.56(2H、q、J = 5 Hz)、3.45-3.38(2H、m)、1.43(9H、s)
＜步骤2＞ (2-(4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(EX5-IM-2)的合成：
[化129]
将叠氮化钠(100 mg)溶于二甲基亚砜(6.0 mL)，加入(实施例5)＜步骤1＞中得到的化合物EX5-IM-1(400 mg)，在室温下搅拌2.5小时。在反应液中在冰水冷却下，加入水(12mL)，过滤析出的固体，水洗。将所得固体在50℃下减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX5-IM-2(380 mg)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 7.84(2H、d、J = 8 Hz)、7.37(2H、d、J = 8 Hz)、7.22(1H、brs)、4.95(1H、brs)、4.39(2H、s)、3.56(2H、q、J = 5 Hz)、3.45-3.38(2H、m)、1.43(9H、s)
＜步骤3＞ N-(2-氨基乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺 盐酸盐(化合物EX5-IM-3)的合成：
[化130]
在(实施例5)＜步骤2＞中得到的化合物EX5-IM-2(250 mg)中在冰水冷却下加入4当量浓度-氯化氢/1,4-二氧杂环己烷(1.75 mL)，在室温下搅拌1小时。在反应液中加入二异丙基醚(5.25 mL)，滤取所得沉淀，用二异丙基醚洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX5-IM-3(192 mg)。
NMR数据(DMSO-d6)(δ：ppm)： 8.68(1H、t、J = 6 Hz)、7.91(2H、d、J = 8 Hz)、7.80(3H、brs)、7.47(2H、d、J = 8 Hz)、4.53(2H、s)、3.51(2H、q、J = 6 Hz)、2.98(2H、t、J = 6Hz)、LC-MS：M(游离胺)=219、RT=0.56(分)、[M＋H]＋=220
＜步骤4-1＞(实施例5a)导入N-(2-氨基乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基的海藻酸(化合物EX5-(II)-A-2)的合成：
[化131]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：A-2)水溶液(20 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(84 mg)、(实施例5)＜步骤3＞中得到的化合物EX5-IM-3(52 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(252 μL)，在30℃下搅拌3小时。加入氯化钠(200 mg)后，加入乙醇(40 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX5-(II)-A-2(185 mg)。
反应性取代基(N-(2-氨基乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基)的导入率为9.4mol%(NMR积分比)。
＜步骤4-2＞(实施例5b)导入 N-(2-氨基乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基的海藻酸(化合物EX5-(II)-B-2)的合成：
[化132]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：B-2)水溶液(20 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(84 mg)、(实施例5)＜步骤3＞中得到的化合物EX5-IM-3(26 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(151 μL)，在30℃下搅拌3小时。加入氯化钠(200 mg)后，加入乙醇(40 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX5-(II)-B-2(187 mg)。
反应性基团(N-(2-氨基乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基)的导入率为11 mol%(NMR积分比)。
(实施例5c)导入N-(2-氨基乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基的海藻酸(EX5-(II)-A-2b)的合成：
利用与(实施例5a)相同的方法，得到反应性取代基的导入率(NMR积分比)=4.9mol%的标题化合物(EX5-(II)-A-2b)。
(实施例6) 导入5-氨基-1-(11,12-二脱氢二苯[b,f]氮杂环辛烯-5(6H)-基)-1-戊酮基(ADIBO-C5-胺)海藻酸(化合物EX6-(I)-B-2)的合成：[化133]
＜步骤1＞ N-三氟乙酰基-5-氨基戊酸(EX6-IM-1)的合成：
[化134]
将5-氨基戊酸(EX6-SM1、[CAS：660-88-8]2.0 g)、三氟乙酸 乙基酯(3.1mL)、三乙基胺(3.6 mL)溶于甲醇(90.0 mL)，在40℃下搅拌5小时。将反应液减压浓缩，在残余物中加入乙醇(10 mL)进行减压浓缩的操作2次。将浓缩残余物溶于乙酸乙酯(200 mL)，用0.1摩尔浓度的磷酸2氢钠水溶液(70 mL)洗涤3次、用饱和食盐水(50mL)洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX6-IM-1(1.8 g)。
NMR数据(DMSO-d6)(δ：ppm)： 12.04(1H、brs)、9.43(1H、brs)、3.17(2H、q、J = 6Hz)、2.22(2H、H、tt、J = 7、2 Hz)、1.51-1.46(4H、m)
＜步骤2＞ (Z)-N-(5-(二苯并[b、f]氮杂环辛烯-5(6H)-基)-5-氧代戊基-三氟乙酰胺(化合物EX6-IM-2)的合成：
[化135]
在(实施例6)＜步骤1＞中得到的化合物EX6-IM-1(617 mg)中加入亚硫酰氯(440μL)和N,N-二甲基甲酰胺(2 μL)，在80℃下搅拌1.5小时，将反应液减压浓缩。将残余的二氯甲烷(1.0 mL)溶液在冰水冷却下加入按照[制造法D]＜步骤1＞记载的方法由5-二苯并环庚烯酮[CAS:2222-33-5]合成的化合物EX6-SM2[CAS:23294-93-6](500 mg)、吡啶(585 μL)的二氯甲烷(5.0 mL)溶液中，在室温下搅拌30分钟。将反应液用叔丁基甲基甲基醚(20 mL)稀释，用水(10 mL)、1当量浓度-盐酸(10 mL)、水(10 mL)、饱和食盐水(5 mL)依次洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。将所得残余物利用硅胶柱色谱(庚烷~60%乙酸乙酯/庚烷)纯化后，将所得固体用叔丁基甲基醚/庚烷磨碎。过滤固体后，用庚烷洗涤，以白色固体形式得到标题化合物EX6-IM-2(840 mg)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 7.37-7.27(4H、m)、7.22-7.14(4H、m)、7.08(1H、brs)、6.76(1H、d、J = 13 Hz)、6.57(1H、d、J = 13 Hz)、5.43(1H、d、J = 15 Hz)、4.17(1H、d、J =15 Hz)、3.22(1H、dt、J = 13、6 Hz)、2.83(1H、dt、J = 13、6 Hz)、2.22-2.12(1H、m)、1.87(1H、dq、J = 16、5 Hz)、1.68-1.58(1H、m)、1.52-1.36(2H、m)、1.28-1.16(1H,m)、LC-MS：M=402、RT=1.05(分)、[M＋H]＋=403
＜步骤3＞ N-(5-(11,12-二溴-11,12-二氢二苯并[b、f]氮杂环辛烯-5(6H)-基)-5-氧代戊基-三氟乙酰胺(化合物EX6-IM-3)的合成：
[化136]
在(实施例6)＜步骤2＞中得到的化合物EX6-IM-2(700 mg)的二氯甲烷(2.8 mL)溶液中在冰水冷却下加入吡啶鎓三溴化物(612 mg)，在室温下搅拌1.5小时后，加入吡啶鎓三溴化物(111 mg)，在室温下进一步搅拌1小时。将反应液用乙酸乙酯(20 mL)稀释，用2当量浓度-盐酸(10 mL)、饱和食盐水(5mL)依次洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，以黄色无定形的形式得到标题粗化合物EX6-IM-3(1.03 g)。
LC-MS：M=562、RT=1.10(分)、[M＋H]＋=563(561：563：565=1：2：1)
＜步骤4＞N-[5-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]氮杂环辛烯-5(6H)-基)-5-氧代戊基-2,2,2-三氟乙酰胺(EX6-IM-4)的合成：
[化137]
在(实施例6)＜步骤3＞中得到的粗化合物EX6-IM-3(100 mg)的四氢呋喃(1.5mL)溶液中在室温搅拌下花费8小时每次少量地加入叔丁氧基钾(100 mg)。将反应液用乙酸乙酯(15 mL)稀释，用水(3 mL)、饱和食盐水(2 mL)依次洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，以淡茶色胶状物质形式得到标题粗化合物EX6-IM-4(58 mg)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 7.69(1H、d、J = 7 Hz)、7.44-7.23(7H、m)、5.17(1H、d、J = 14 Hz)、3.70(1H、d、J = 14 Hz)、3.21(1H、dt、J = 13、6 Hz)、2.57(1H、dq、J = 19、5Hz)、2.36-2.28(1H、m)、1.82(1H、dq、J = 16、5 Hz)、1.46-1.34(2H、m)、1.29-1.24(1H,m)、1.15-1.05(1H,m)、LC-MS：M=400、RT=1.08(分)、[M＋H]＋=401、[M＋Na]＋=423
＜步骤5＞ 5-氨基-1-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]氮杂环辛烯-5(6H)-基)-1-戊酮(化合物EX6-IM-5)的合成：
[化138]
在(实施例6)＜步骤4＞中得到的粗化合物EX6-IM-4(58 mg)的甲醇(1.2 mL)溶液中加入碳酸钾(40 mg)的水(0.25 mL)溶液，在室温下搅拌23小时。浓缩反应液，加入乙酸乙酯(10 mL)、二氯甲烷(1mL)、半饱和食盐水(2 mL)，分液。将有机层用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。将所得胶利用硅胶色谱(乙酸乙酯~50%甲醇/乙酸乙酯)纯化，以无色胶状物质得到标题化合物EX6-IM-5(22 mg)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 7.70(1H、d、J = 8 Hz)、7.43-7.23(7H、m)、5.18(1H、d、J = 14 Hz)、3.65(1H、d、J = 14 Hz)、2.45(2H、t、J = 7 Hz)、2.24-2.16(1H、m)、1.96-1.89(1H、m)、1.48-1.38(2H、m)、1.21-1.10(2H,m)、LC-MS：M=304、RT=0.76(分)、[M＋H]＋=305
＜步骤6＞ 导入5-氨基-1-(11,12-二脱氢二苯[b,f]氮杂环辛烯-5(6H)-基)-1-戊酮(ADIBO-C5-氨基)基的海藻酸(EX6-(I)-B-2)的合成：
[化139]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：B-2)水溶液(28.5 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(60 mg)、(实施例6)＜步骤5＞中得到的化合物EX6-IM-5(22 mg)的乙醇(2.9 mL)溶液、1摩尔浓度-小苏打水(72 μL)，在30℃下搅拌3小时。加入氯化钠(285 mg)后，加入乙醇(57 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX6-(I)-B-2(277 mg)。
反应性基团(N-(3-氨基戊炔基)-5,6-二氢-11,12-二脱氢二苯并[b,f]氮杂环辛烯(ADIBO-C3-氨基)基)的导入率为2.7 mol%(NMR积分比)。
(实施例7) 导入N-(2-氨基乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基的海藻酸(实施例7a、实施例7b、和实施例7c)的合成：
[化140]
＜步骤1＞ (2-(4-叠氮基苯甲酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(化合物EX7-IM-1)的合成：
[化141]
在4-叠氮基苯甲酸(EX7-SM、[CAS：6427-66-3]700 mg)中加入亚硫酰氯(783 μL)、N,N-二甲基甲酰胺(3 μL)，在70℃下搅拌1小时。将反应液减压浓缩，在残余物中加入二氯甲烷(1 mL)，在冰水冷却下加入(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁基酯[CAS：57260-73-8](825mg)、吡啶(1.04 mL)的二氯甲烷(7.0 mL)溶液，在室温下搅拌1小时。将反应液用叔丁基甲基甲基醚(30 mL)稀释，用水(10mL)、饱和小苏打水(5 mL)、0.5当量浓度-柠檬酸(5mL，2次)、水(5mL)、饱和食盐水(5 mL)依次洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。将残余物用叔丁基甲基甲基醚/庚烷磨碎，过滤固体后，用叔丁基甲基醚/庚烷洗涤，以白色固体形式得到标题化合物EX7-IM-1(1.1 g)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 7.83(2H、d、J = 8 Hz)、7.26(1H、brs)、7.05(2H、d、J =8 Hz)、4.97(1H、brs)、3.55(2H、q、J = 5 Hz)、3.45-3.37(2H、m)、1.43(9H、s)、LC-MS：M=305、RT=0.90(分)、[M＋H]＋=306、[M＋Na]＋=328
＜步骤2＞N-(2-氨基乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基 盐酸盐(化合物EX7-IM-2)的合成：
[化142]
将(实施例7)＜步骤1＞中得到的化合物(EX7-IM-1、500 mg)悬浮于1,4-二氧杂环己烷(1.5 mL)。在冰水冷却下加入4当量浓度-氯化氢/二氧杂环己烷溶液(3.5 mL)，在室温下搅拌1小时。在反应液中加入二异丙基醚(10.5 mL)，在室温下搅拌50分钟。过滤固体，用二异丙基醚洗涤后，减压干燥，以淡米色固体形式得到标题化合物EX7-IM-2(365 mg)。
NMR数据(DMSO-d6)(δ：ppm)： 8.68(1H、t、J = 6 Hz)、7.93(2H、d、J = 9 Hz)、7.82(1H、brs)、7.22(2H、d、J = 9 Hz)、3.49(2H、q、J = 6 Hz)、2.97(2H、t、J = 6 Hz)、LC-MS：M(游离胺)=205、RT=0.56(分)、[M＋H]＋=206
＜步骤3-1＞(实施例7a) 导入N-(2-氨基乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基的海藻酸(EX7-(II)-B-2a)的合成：
[化143]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：B-2)水溶液(30.0 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(63 mg)、(实施例7)＜步骤2＞中得到的化合物EX7-IM-2(18 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(114 μL)，在30℃下搅拌3小时。加入氯化钠(300 mg)后，加入乙醇(60 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX7-(II)-B-2a(282 mg)。
反应性基团(N-(2-氨基乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基)的导入率为5.1 mol%(NMR积分比)。
＜步骤3-2＞(实施例7b) 导入N-(2-氨基乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基的海藻酸(EX7-(II)-B-2b)的合成：
[化144]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：B-2)水溶液(60.0 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(67 mg)、(实施例7)＜步骤2＞中得到的化合物EX7-IM-2(15 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(91 μL)，在30℃下搅拌3小时。加入氯化钠(600 mg)后，加入乙醇(120 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX7-(II)-B-2b(560 mg)。
反应性基团(N-(2-氨基乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基)的导入率为2.0 mol%(NMR积分比)。
(实施例7c) 导入N-(2-氨基乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基的海藻酸(EX7-(II)-A-2)的合成：
将海藻酸改变为A-2，利用与(实施例7a)相同的方法，得到反应性取代基的导入率(NMR积分比)=5.0 mol%的标题化合物(EX7-(II)-A-2)。
(实施例8)导入N-(4-(氨基乙基)苯甲基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基的海藻酸(EX8-(I)-B-2)的合成：
[化145]
＜步骤1＞ (4-((2,2,2-三氟乙酰胺)甲基)苯甲基)氨基甲酸叔丁基酯(化合物EX8-IM-1)的合成：
[化146]
对于参考文献公知的方法(Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry(2003)11：4189-4206)由1,4-双(氨基甲基)苯[CAS：539-48-0]合成的(4-(氨基甲基)苯甲基)氨基甲酸叔丁基酯[CAS:108468-80-4](EX8-SM1、0.67 g)、三乙基胺(0.39 mL)和甲醇(6.67 mL)的混合物，在冰冷却搅拌下滴加三氟乙酸乙酯(0.44 mL)。将反应混合物升温至室温，在相同温度下搅拌5小时。将反应用水(10 mL)停止，用乙酸乙酯(10mL)提取3次。将回収的有机层用饱和食盐水(5 mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥。将干燥的有机层过滤后，浓缩，以淡黄色无定形的形式得到标题粗化合物EX8-IM-1(0.671 g)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)：δ: 7.29 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.25 (2H, d, J =7.6 Hz), 6.51 (1H, br s), 4.86 (1H, br s), 4.51 (2H, d, J = 5.2 Hz), 4.31(2H, d, J = 6.0 Hz), 1.46 (9H, s).LC-MS：M=332,RT=0.97(分),[M＋Na]＋=355.
＜步骤2＞ N-(4-(氨基甲基)苯甲基)-2,2,2-三氟乙酰胺盐酸盐(化合物EX8-IM-2)的合成：
[化147]
对于(实施例8)＜步骤1＞中得到的化合物EX8-IM-1(0.5 g)的1,4-二氧杂环己烷溶液(3.5 mL)，在水冷却搅拌下加入4当量浓度-氯化氢/1,4-二氧杂环己烷(3.5 mL)，在室温下搅拌3小时。在反应液中加入二异丙基醚(40 mL)后，过滤析出物，由此以白色固体形式得到标题化合物EX8-IM-2(0.36 g)。
NMR数据(D2O)(δ：ppm)：δ: 7.29 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.25 (2H, d, J = 8.4Hz), 4.38 (2H, s), 4.02 (2H, s).LC-MS：M(游离胺)=232,RT=0.53(分),[M＋H]＋=233.
＜步骤3＞ N-(4-((2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺)甲基)苯甲基)-2,2,2-三氟乙酰胺(化合物EX8-IM-3)的合成：
[化148]
对于根据文献公知的方法(Org. Process Res. Dev.(2018)22：108-110)由环庚烯[CAS:628-92-2]合成的羧酸[CAS:917756-42-4](EX8-SM2、0.17 g)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(0.26 g)的乙腈(1.7 mL)溶液，在冰冷却搅拌下滴加(实施例8)＜步骤2＞中得到的EX8-IM-2(0.26 g)和N,N-二异丙基乙基胺(0.51mL)，在室温下搅拌1小时30分钟。加入水(5 mL)而使反应停止后，用乙酸乙酯(5 mL)提取3次。将有机层用饱和食盐水(3 mL)洗涤后，用无水硫酸钠干燥。过滤干燥的有机层后，在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱色谱(12%乙酸乙酯/正庚烷~100%乙酸乙酯)纯化，以白色无定形的形式得到标题化合物EX8-IM-3(0.189 g)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)：δ： 7.31 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.26 (2H, d, J =8.0 Hz, 与溶剂峰重叠.), 6.84 (1H, br s), 6.52 (1H, br s), 4.52 (2H, d, J =6.0 Hz), 4.49 (2H, d, J = 6.4 Hz), 4.26-4.23 (1H, m), 4.11 (1H, d, J = 15.2Hz), 3.94 (1H, d, J = 15.2 Hz), 2.26-2.09 (3H, m), 2.00-1.58 (6H, m), 1.48-1.44 (1H, m).LC-MS：M=396,RT=0.99(分),[M＋H]＋=397.
＜步骤4＞ N-(4-(氨基甲基)苯甲基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺(化合物EX8-IM-4)的合成：
[化149]
对于(实施例8)＜步骤3＞中得到的化合物EX8-IM-3(0.18 g)和甲醇(1.8 mL)的混合物，在冰冷却搅拌下滴加碳酸钾(0.126 g)水溶液(0.9 mL)，在室温下搅拌17小时30分钟。将甲醇在减压下馏去，用乙酸乙酯(5 mL)提取3次。将有机层用饱和食盐水(5 mL)洗涤后，用无水硫酸钠干燥。过滤有机层后，在减压下馏去溶剂，以淡黄色油状物形式得到标题粗化合物EX8-IM-4(0.13 g)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)：δ： 7.28-7.28 (4H, m), 6.80 (1H, br s), 4.48(2H, d, J = 6.0 Hz), 4.26-4.21 (1H, m), 4.11 (1H, d, J = 15.2 Hz), 3.93 (1H,d, J = 15.2 Hz), 3.86 (2H, s), 2.28-2.07 (3H, m), 1.99-1.40 (7H, m, 与溶剂峰重叠.).LC-MS：M=300,RT=0.68(分),[M＋H]＋=301.
＜步骤5＞ 导入N-(4-(氨基乙基)苯甲基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基的海藻酸(EX8-(I)-B-2)的合成：
[化150]
在调整为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制、B-2)水溶液(50.86 mL)中在室温搅拌下加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(0.118 g)。接着，在相同温度下滴加(实施例8)＜步骤4＞中得到的化合物EX8-IM-4(0.035g)的乙醇(3 mL)溶液，在40度下搅拌4小时。冷却至室温后，加入氯化钠(500 mg)后，加入乙醇(101.72 mL)，搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇(2 mL)洗涤3次后，减压下干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX8-(I)-B-2(521 mg)。
反应性取代基(N-(4-(氨基乙基)苯甲基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基)的导入率为4.46mol%(NMR积分比)。
(实施例8b)导入N-(4-(氨基乙基)苯甲基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基的海藻酸(EX8-(I)-A-2)的合成：
将海藻酸改为A-2，利用与(实施例8)相同的方法，得到反应性取代基的导入率(NMR积分比)=4.4 mol%的标题化合物(EX8-(I)-A-2)。
(实施例9)导入N-(2-氨基乙基)-2-(环辛-2-炔-1-氧基)乙酰胺基的海藻酸(9a、9b、9c)的合成：
[化151]
(实施例9a)导入N-(2-氨基乙基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基的海藻酸(EX9-(I)-A-2)的合成：
＜步骤1＞ (2-(2,2,2-三氟乙酰胺)氨基甲酸叔丁基酯(EX9-IM-1)的合成：
[化152]
在市售的(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁基酯(EX9-SM1、3.00 g、[CAS：57260-73-8])的四氢呋喃(12.0 mL)溶液中滴加三氟乙酸乙酯(2.24 mL)。将反应混合物在室温下搅拌14.5小时。将反应液减压下浓缩，向残渣中加入叔丁基甲基醚(5 mL)和庚烷(25 mL)，磨碎。过滤固体后，用庚烷洗涤，以白色固体形式得到标题化合物EX9-IM-1(4.36 g)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 7.80(1H,brs)、4.93(1H,brs)、3.45(2H、q、J = 5 Hz)、3.41-3.34(2H、m)、1.44(9H、s)
＜步骤2＞ N-(2-氨基乙基)-2,2,2-三氟乙酰胺 盐酸盐(EX9-IM-2)的合成：
[化153]
在(实施例9a)＜步骤1＞中得到的化合物EX9-IM-1(0.50 g)中加入甲酸(3.1mL)，在室温下搅拌22.5小时。馏去甲酸，用甲苯共沸。在所得油状物中加入氯化氢/甲醇，减压浓缩。用乙酸乙酯、叔丁基甲基醚依次共沸后，减压干燥，以无色油状物形式得到标题粗化合物EX9-IM-2(0.35 g)。
NMR数据(DMSO-d6)(δ：ppm)： 3.42(2H、d、J = 6 Hz)、2.92(2H、d、J = 6 Hz)
＜步骤3＞ N-(2-(2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺)乙基)-2,2,2-三氟乙酰胺(EX9-IM-3)的合成：
[化154]
在根据文献公知的方法(Org. Process Res. Dev.(2018)22：108-110)合成的羧酸(EX8-SM2、100 mg)中加入乙醇(1.0 mL)、4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(304 mg)、(实施例9a)＜步骤2＞中得到的化合物EX9-IM-2(159mg)、三乙基胺(153 μL)，在室温下搅拌3.5小时。加入水(4 mL)，用乙酸乙酯(15 mL、5 mL)提取。将有机层用0.5当量浓度-柠檬酸(5 mL)、水(5 mL×2)、饱和食盐水(3 mL)依次洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压馏去溶剂。将残渣用硅胶柱色谱(10%乙酸乙酯/正庚烷~60%乙酸乙酯/正庚烷)纯化，以白色固体形式得到标题化合物EX9-IM-3(103 mg)。
NMR数据(DMSO-d6)(δ：ppm)： 9.42(1H、brs)、7.83(1H、brs)、4.29-4.24(1H、m)、3.87(2H、d、J = 15 Hz)、3.73(1H、d、J = 15 Hz)、3.28-3.20(4H、 m)、2.27-2.04(3H、m)、1.96-1.70(4H、m)、1.67-1.50(2H、m)、1.43-1.34(1H、m)
＜步骤4＞ N-(2-氨基乙基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺(EX9-IM-4)的合成：
[化155]
在(实施例9a)＜步骤3＞中得到的化合物EX9-IM-3(103 mg)的甲醇(1.55 mL)溶液中加入碳酸钾(89 mg)的水(515 μL)溶液，在室温下搅拌6小时。将甲醇在减压下馏去，加入水(2 mL)后，使氯化钠成为饱和。用乙酸乙酯(15 mL、10 mL×5)提取，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂，以无色油状物形式得到标题化合物EX9-IM-4(75 mg)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 6.83(1H、brs)、4.28-4.22(1H、m)、4.06(1H、d、J = 15Hz)、3.90(1H、d、J = 15 Hz)、3.42-3.30(2H、m)、2.86(2H、t、J = 6 Hz)、2.31-2.12(3H、m)、2.04-1.78(4H,m)、1.75-1.57(2H、m)、1.51-1.43(1H、m)
＜步骤5＞ 导入N-(2-氨基乙基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基的海藻酸(EX9-(I)-A-2)的合成：
[化156]
在调整为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制、A-2)水溶液(30 mL)中在室温搅拌下依次加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(84 mg)、(实施例9a)＜步骤4＞中得到的化合物EX9-IM-4(17 mg)的乙醇(3 mL)溶液、1摩尔%小苏打水(76 μL)，在30度下搅拌3小时。在反应液中加入氯化钠(0.3 g)后，加入乙醇(60 mL)，搅拌1.5小时。滤取所得沉淀，用乙醇(10 mL×5)洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX9-(I)-A-2(290 mg)。
反应性取代基(N-(2-氨基乙基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基)的导入率为4.3mol%(NMR积分比)。
(实施例9b)导入N-(2-氨基乙基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基的海藻酸(EX9-(I)-B-2a)的合成：
＜步骤1＞ N-(2-氨基乙基)-2,2,2-三氟乙酰胺 盐酸盐(EX9-IM-2)的合成：
[化157]
将(实施例9a)＜步骤1＞中得到的化合物EX9-IM-1(0.50 g)悬浮于1,4-二氧杂环己烷(3.0 mL)。在冰水冷却下，加入4当量浓度-氯化氢/1,4-二氧杂环己烷(7.0 mL)，在室温下搅拌3小时。在反应液中加入二异丙基醚(30.0 mL)，在室温下搅拌50分钟。滤取固体，用二异丙基醚洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX9-IM-2(0.70 g)。
NMR数据(DMSO-d6)(δ：ppm)： 9.56(1H、brs)、8.00(3H、brs)、3.45(2H、d、J = 6Hz)、2.95(2H、d、J = 6 Hz)
＜步骤2＞ N-(2-(2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺)乙基)-2,2,2-三氟乙酰胺(EX9-IM-3)的合成：
[化158]
/>
使用根据文献公知的方法(Org. Process Res. Dev.(2018)22：108-110)合成的羧酸(EX8-SM2、300 mg)和(实施例9b)＜步骤1＞中得到的化合物EX9-IM-2(380 mg)，进行与(实施例9a)＜步骤3＞相同的操作，以白色固体形式得到标题化合物EX9-IM-3(322 mg)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 7.95(1H、brs)、6.95(1H、brs)、4.28-4.23(1H、m)、4.08(2H、d、J = 15 Hz)、3.91(1H、d、J = 15 Hz)、3.56-3.50(4H、 m)、2.31-2.12(3H、m)、2.03-1.78(4H、m)、1.75-1.61(2H、m)、1.52-1.42(1H、m)
＜步骤3＞ N-(2-氨基乙基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺(EX9-IM-4)的合成：
[化159]
将(实施例9b)＜步骤2＞中得到的化合物EX9-IM-3(322 mg)进行与(实施例9b)＜步骤4＞相同的操作，以无色油状物形式得到标题化合物EX9-IM-4(238 mg)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 6.82(1H、brs)、4.28-4.22(1H、m)、4.06(1H、d、J = 15Hz)、3.90(1H、d、J = 15 Hz)、3.40-3.31(2H、m)、2.86(2H、t、J = 6 Hz)、2.31-2.12(3H、m)、2.02-1.78(4H,m)、1.75-1.57(2H、m)、1.52-1.41(1H、m)
＜步骤4＞ 导入N-(2-氨基乙基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基的海藻酸(EX9-(I)-B-2a)的合成：
[化160]
在调整为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制、B-2)水溶液(120 mL)中在室温搅拌下依次加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(335 mg)、(实施例9b)＜步骤3＞中得到的化合物EX9-IM-4(68 mg)的乙醇(12 mL)溶液、1摩尔%小苏打水(303 μL)，在30度下搅拌3小时。在反应液中加入氯化钠(1.2 g)后，加入乙醇(240 mL)，搅拌1.5小时。滤取所得沉淀，用乙醇(20 mL×5)洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX9-(I)-B-2a(1.16 g)。
反应性取代基(N-(2-氨基乙基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基)的导入率为4.2mol%(NMR积分比)。
(实施例9c)导入N-(2-氨基乙基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基的海藻酸(EX9-(I)-B-2b)的合成：
[化161]
在调整为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制、B-2)水溶液(120 mL)中在室温搅拌下依次加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(167 mg)、(实施例9b)＜步骤3＞中得到的化合物EX9-IM-4(34 mg)的乙醇(12 mL)溶液、1摩尔%小苏打水(151 μL)，在30度下搅拌3小时。在反应液中加入氯化钠(1.2 g)后，加入乙醇(240 mL)，搅拌1.5小时。滤取所得沉淀，用乙醇(20 mL×5)洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX9-(I)-B-2b(1.12 g)。
反应性取代基(N-(2-氨基乙基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基)的导入率为2.1mol%(NMR积分比)。
(实施例10)导入N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基的海藻酸(EX10-(II)-A-2)的合成：
[化162]
＜步骤1＞ (2-(2-(4-(氯甲基)苯甲酰胺基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(EX10-IM-1)的合成：
[化163]
将EX5-SM(4-(氯甲基)苯甲酰氯、0.50 g)溶于四氢呋喃(5.0 mL)，加入(2-(2-氨基乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(0.54 g、[CAS：127828-22-2])和N,N-二异丙基乙基胺(0.92 mL)的四氢呋喃(5.0 mL)溶液，在室温下搅拌3小时。在反应液中加入乙酸乙酯(25mL)和水(10 mL)，分液。将有机层依次用水(5 mL)、饱和食盐水(5 mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。将残渣用叔丁基甲基醚/正庚烷的混合溶剂磨碎后，滤取所得固体，用正庚烷洗涤，以白色固体形式得到标题化合物EX10-IM-1(0.79 g)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 7.79(2H、d、J = 8 Hz)、7.46(2H、d、J = 8 Hz)、6.62(1H、brs)、4.83(1H、brs)、4.61(2H、s)、3.68-3.62(4H、m)、3.55(2H、t、J = 5 Hz)、3.33(2H、t、J = 5 Hz)、1.42(9H、s)
＜步骤2＞(2-(2-(4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(EX10-IM-2)的合成：
[化164]
将叠氮化钠(109 mg)溶于二甲基亚砜(7.5 mL)，加入(实施例10)＜步骤1＞中得到的化合物EX10-IM-1(500 mg)，在室温下搅拌3小时。在反应液中在冰水冷却下加入水(15mL)，过滤析出的固体，水洗。干燥所得固体，以白色固体形式得到标题化合物EX10-IM-2(478 mg)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 7.82(2H、d、J = 8 Hz)、7.39(2H、d、J = 8 Hz)、6.63(1H、brs)、4.83(1H、brs)、4.40(2H、s)、3.68-3.62(4H、m)、3.55(2H、t、J = 5 Hz)、3.33(2H、q、J = 5 Hz)、1.42(9H、s)
＜步骤3＞N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺 盐酸盐(EX10-IM-3)的合成：
[化165]
在(实施例10)＜步骤2＞中得到的化合物EX10-IM-2(400 mg)中在冰水冷却下加入4当量浓度-氯化氢/1,4-二氧杂环己烷(2.8 mL)，在室温下搅拌1.75小时。在反应液中加入二异丙基醚(8.4 mL)，得到胶状物。利用倾析除去上清，用二异丙基醚倾析洗涤后，减压干燥，以米色固体形式得到标题化合物EX10-IM-3(298 mg)。
NMR数据(DMSO-d6)(δ：ppm)： 8.60(1H、t、J = 6 Hz)、7.89(2H、d、J = 8 Hz)、7.90(3H、brs)、7.45(2H、d、J = 8 Hz)、4.52(2H、s)、3.62(2H、t、J = 5 Hz)、3.58(2H、t、J = 6Hz)、3.47(2H、q、J = 6 Hz)、2.98(2H、t、J = 5 Hz)、LC-MS(游离胺)：RT=0.58(分)、[M＋H]＋=264
＜步骤4＞导入N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基的海藻酸(EX10-(II)-A-2)的合成：
[化166]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：A-2)水溶液(40 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(112 mg)、(实施例10)＜步骤3＞中得到的化合物EX10-IM-3(30 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(151 μL)，在30℃下搅拌3小时。加入氯化钠(400 mg)后，加入乙醇(80 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX10-(II)-A-2(408 mg)。
反应性取代基(N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基)的导入率为4.7mol%(NMR积分比)。
(实施例11)导入N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基的海藻酸(EX11-(II)-A-2)的合成：
[化167]
＜步骤1＞(2-(2-(2-(4-(氯甲基)苯甲酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(EX11-IM-1)的合成：
[化168]
将EX5-SM(4-(氯甲基)苯甲酰氯、0.50 g)溶于四氢呋喃(5.0 mL)，滴加(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(0.66 g)和N,N-二异丙基乙基胺(0.92 mL)的四氢呋喃(5.0 mL)溶液，在室温下搅拌4.7小时。在反应液中加入乙酸乙酯(25 mL)和水(10 mL)，分液。将有机层用半饱和小苏打水(10 mL)、水(10 mL)、饱和食盐水(5 mL)依次洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。在残渣中加入叔丁基甲基醚，通过过滤除去固体。减压浓缩所得滤液，利用硅胶柱色谱(20%乙酸乙酯/正庚烷~乙酸乙酯)纯化，以无色油状物形式得到标题化合物EX11-IM-1(0.82 g)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 7.79(2H、d、J = 8 Hz)、7.45(2H、d、J = 8 Hz)、6.71(1H、brs)、4.97(1H、brs)、4.60(2H、s)、3.70-3.60(8H、m)、3.55(2H、t、J = 5 Hz)、3.31(2H、q、J = 6 Hz)、1.43(9H、s)
＜步骤2＞(2-(2-(2-(4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(EX11-IM-2)的合成：
[化169]
在(实施例11)＜步骤1＞中得到的化合物EX11-IM-1(0.82 g)的二甲基亚砜(11.7mL)溶液中加入叠氮化钠(152 mg)，在室温下搅拌3.5小时。在反应液中在冰水冷却下，加入水(23 mL)，在相同温度下搅拌30分钟。用乙酸乙酯(30 mL、10 mL)提取，将有机层用水(10mL×3)、饱和食盐水(5 mL)依次洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥后，过滤析出的固体，减压干燥，以无色油状物形式得到标题化合物EX11-IM-2(0.80 g)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 7.81(2H、d、J = 8 Hz)、7.39(2H、d、J = 8 Hz)、6.73(1H、brs)、4.97(1H、brs)、4.40(2H、s)、3.72-3.60(8H、m)、3.55(2H、t、J = 5 Hz)、3.31(2H、q、J = 5 Hz)、1.43(9H、s)
＜步骤3＞ N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺盐酸盐(EX11-IM-3)的合成：
[化170]
在(实施例11)＜步骤2＞中得到的化合物EX11-IM-2(0.80 g)中在冰水冷却下加入4当量浓度-氯化氢/1,4-二氧杂环己烷(5.3 mL)，在室温下搅拌1.75小时。在反应液中加入二异丙基醚(16.0 mL)，搅拌30分钟。利用倾析除去溶剂，将残渣用二异丙基醚洗涤。将所得残渣减压干燥，以无色胶状物形式得到标题化合物EX11-IM-3(0.73 g)。
NMR数据(DMSO-d6)(δ：ppm)： 8.62(1H、t、J = 6 Hz)、7.95(3H、brs)、7.88(2H、d、J= 8 Hz)、7.45(2H、d、J = 8 Hz)、4.52(2H、s)、3.62-3.52(8H、m)、3.43(2H、q、J = 6 Hz)、2.98-2.89(2H、m)、LC-MS(游离胺)：RT=0.59(分)、[M＋H]＋=308
＜步骤4＞ 导入N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基的海藻酸(EX11-(II)-A-2)的合成：
[化171]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：A-2)水溶液(40 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(112 mg)、(实施例11)＜步骤3＞中得到的化合物EX11-IM-3(38 mg)的乙醇(4.0 mL)溶液、1摩尔浓度-小苏打水(151 μL)，在30℃下搅拌3小时。加入氯化钠(0.4 g)后，加入乙醇(80 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX11-(II)-A-2(416 mg)。
反应性取代基(N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4-(叠氮基甲基)苯甲酰胺基)的导入率为4.2mol%(NMR积分比)。
(实施例12)导入N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-6-(叠氮基甲基)烟酰胺基的海藻酸(EX12-(II)-A-2)的合成：
[化172]
＜步骤1＞ 6-(叠氮基甲基)烟酸甲酯(EX12-IM-1)的合成：
[化173]
参考文献公知的方法(Angew. Chem. Int. Ed.(2012)51：5852-5856)，对于市售的 6-(羟基甲基)烟酸甲酯[CAS：56026-36-9](EX12-SM1、0.5 g)和四氢呋喃(5 mL)的混合物，在冰冷却搅拌下加入对甲苯磺酰氯(0.68 g)和三乙基胺(0.63 mL)。将该反应混合物在室温下搅拌20小时30分钟后，在相同温度下加入叠氮化钠(0.29 g)，在室温下搅拌4小时。反应结束后，加入乙酸乙酯(10 mL)和水(10 mL)，将反应液稀释后，将水层用乙酸乙酯(10mL)提取3次。将合并的有机层用水(5 mL)、饱和食盐水(5 mL)依次洗涤，用无水硫酸钠干燥。将有机层过滤后，在减压下浓缩，由此得到粗产物。将该粗产物利用硅胶柱色谱(正庚烷/乙酸乙酯)生成，由此以淡黄色无定形的形式得到标题化合物EX12-IM-1(0.34 g)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)：9.18(1H、d、J = 2.0 Hz)、8.33(1H、dd、J = 8.0、2.0Hz)、7.45(1H、d、J = 8.0 Hz)、4.57(2H、s)、3.96(3H、s).LC-MS：M=192,RT=0.78(分),[M＋H]＋=193.
＜步骤2＞6-(叠氮基甲基)烟酸(EX12-IM-2)的合成：
[化174]
对于(实施例12)＜步骤1＞中得到的化合物EX12-IM-1(0.342 g)和甲醇(6.84mL)的混合物，在室温下加入1摩尔浓度-氢氧化锂・一水合物(5.34 mL)，在相同温度下搅拌30分钟。反应结束后，加入乙酸(0.41 mL)，将反应液在减压下浓缩。将残留物利用硅胶柱色谱(正庚烷/乙酸乙酯~乙酸乙酯/甲醇)纯化，以淡黄色无定形的形式得到标题化合物EX12-IM-2(0.28 g)。
NMR数据(CD3OD)(δ：ppm)：9.09(1H、d、J = 2.4 Hz)、8.38(1H、dd、J = 8.0、2.4Hz)、7.56(1H、d、J = 8.0 Hz)、4.57(2H、s).LC-MS：M=178,RT=0.60(分),[M＋H]＋=179.
＜步骤3＞ (2-(2-(6-(叠氮基甲基)烟酰胺)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(EX12-IM-3)的合成：
[化175]
对于(实施例12)＜步骤2＞中得到的化合物12-IM-2(100 mg)、市售的N-(叔丁氧基羰基)-2-(2-氨基乙氧基)乙基胺[CAS：127828-22-2](108.07 μL)和乙腈(2000 μL)的混合物，在冰冷却搅拌下加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(213.43 mg)和三乙基胺(156.48 μL)，在室温下搅拌1小时45分钟。然后，在室温搅拌下加入N-(叔丁氧基羰基)-2-(2-氨基乙氧基)乙基胺(54 μL)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(106.7 mg)，在相同温度下搅拌17小时。加入水(5 mL)而使反应停止，加入乙酸乙酯(10 mL)。将水层用乙酸乙酯(10 mL)提取3次，用无水硫酸钠干燥。将有机层过滤后，在减压下浓缩，由此得到粗产物。将粗产物利用硅胶柱色谱(正庚烷/乙酸乙酯)纯化，以无色油状化合物形式得到标题化合物EX12-IM-3(187 mg)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)：9.00(1H、d、J = 2.0 Hz)、8.18(1H、dd、J = 8.0、 2.0Hz)、7.43(1H、d、J = 8.0 Hz)、6.83(1H、br s)、4.82(1H、br s)、4.55(2H、s)、3.69-3.65(4H、m)、3.56(2H、t、J = 5.2 Hz)、3.34(1H、d、J = 5.6 Hz)、3.32(1H、d、J = 5.6 Hz)、1.41(9H、s).LC-MS：M=364,RT=0.78(分),[M＋H]＋=365.
＜步骤4＞ N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)6-(叠氮基甲基)烟酰胺 2盐酸盐(EX12-IM-4)的合成：
[化176]
对于(实施例12)＜步骤3＞中得到的化合物EX12-IM-3(0.187 g)和1,4-二氧杂环己烷溶液(1.31 mL)的混合物，在水冷却搅拌下加入4当量浓度-氯化氢/1,4-二氧杂环己烷(1.31 mL)，在室温下搅拌3小时。在反应液中加入二异丙基醚(20 mL)后，过滤析出物，由此以灰白色固体形式得到标题化合物EX12-IM-4(0.16 g)。
NMR数据(DMSO-d6)(δ：ppm)：9.02-9.02(1H、m)、8.80(1H、br s)、8.27-8.25(1H、m)、7.89(3H、br s)、7.54(1H、d、J = 8.4 Hz)、4.59(2H、s)、3.64-3.57(4H、m)、3.51-3.47(2H、m)、3.01-2.97(2H、m).LC-MS(游离胺)：M=264,RT=0.49(分),[M＋H]＋=265.
＜步骤5＞ 导入N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-6-(叠氮基甲基)烟酰胺基海藻酸的合成(EX12-(II)-A-2)：
[化177]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：A-2)水溶液(39.55 mL)中在室温搅拌下加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(91.52 mg)和1摩尔浓度-小苏打水(183 μL)。接着，在相同温度下加入(实施例12)＜步骤4＞中得到的化合物EX12-IM-4(30 mg)、水(1 mL)和乙醇(1 mL)的混合物，在40℃下搅拌4小时。加入氯化钠(400 mg)后，加入乙醇(79.1 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX12-(II)-A-2(378 mg)。
反应性基团N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-6-(叠氮基甲基)烟酰胺基的导入率为4.8 mol%(NMR积分比)。
(实施例13)导入N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基的海藻酸(EX13-(II)-A-2)的合成：
[化178]
＜步骤1＞ (2-(2-(4-叠氮基苯甲酰胺基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(EX13-IM-1)的合成：
[化179]
将4-叠氮基苯甲酸(EX7-SM、300 mg)、(2-(2-氨基乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯[CAS：127828-22-2](376 mg)溶于乙腈(6.0 mL)。加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(0.77 g)、N,N-二异丙基乙基胺(707 μL)，在室温下搅拌16小时。在反应液中加入乙酸乙酯(20 mL)、水(10 mL)，分液。将有机层、水(10mL)、饱和食盐水(5 mL)依次洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。将残余物利用硅胶柱色谱(20%乙酸乙酯/正庚烷~70%乙酸乙酯/正庚烷)纯化，以淡黄色胶状物形式得到标题化合物EX13-IM-1(673 mg)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 7.83(2H、d、J = 9 Hz)、7.08(2H、d、J = 9 Hz)、6.61(1H、brs)、4.84(1H、brs)、3.68-3.64(4H、m)、3.56(2H、t、J = 5 Hz)、3.34(2H、q、J = 5Hz)、1.44(9H、s)
＜步骤2＞ N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基 盐酸盐(EX13-IM-2)的合成：
[化180]
在(实施例13)＜步骤1＞中得到的化合物EX13-IM-1、670 mg)中在冰水冷却下，加入4当量浓度-氯化氢/1,4-二氧杂环己烷(4.7 mL)，在室温下搅拌2小时。在反应液中加入二异丙基醚(14.0 mL)，搅拌30分钟。滤取所得固体，用二异丙基醚洗涤后，减压干燥，以淡米色固体形式得到标题化合物EX13-IM-2(604 mg)。
NMR数据(DMSO-d6)(δ：ppm)： 8.61(1H、t、J = 6 Hz)、7.95(3H、brs)、7.93(2H、d、J= 9 Hz)、7.20(2H、d、J = 9 Hz)、3.62(2H、t、J = 5 Hz)、3.57(2H、t、J = 6 Hz)、3.46(2H、q、J = 6 Hz)、3.02-2.93(2H、m)、LC-MS(游离胺)：RT=0.57(分)、[M＋H]＋=250
＜步骤3＞ 导入N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基的海藻酸(EX13-(II)-A-2)的合成：
[化181]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：A-2)水溶液(40 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(112 mg)、(实施例13)＜步骤2＞中得到的化合物EX13-IM-2(31 mg)、1摩尔浓度-小苏打水(151 μL)，在30℃下搅拌3小时。加入氯化钠(0.4 g)后，加入乙醇(80 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX13-(II)-A-2(400 mg)。
反应性基团(N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基)的导入率为3.9mol%(NMR积分比)。
(实施例14)导入N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基的海藻酸(EX14-(II)-A-2)的合成：
[化182]
＜步骤1＞ (2-(2-(2-(4-叠氮基苯甲酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(EX14-IM-1)的合成：
[化183]
将4-叠氮基苯甲酸(EX7-SM、300 mg)、(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(457 mg)溶于乙腈(6.0 mL)。加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(0.77 g)、N,N-二异丙基乙基胺(707 μL)，在室温下搅拌16小时。在反应液中加入乙酸乙酯(20 mL)、水(10 mL)，分液。将有机层用水(10mL)、饱和食盐水(5 mL)依次洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。将残余物利用硅胶柱色谱(40%乙酸乙酯/正庚烷~90%乙酸乙酯/正庚烷)纯化，以淡黄色油状物形式得到标题化合物EX14-IM-1(603 mg)。
NMR数据(DMSO-d6)(δ：ppm)： 8.53(1H、t、J = 6 Hz)、7.89(2H、d、J = 9 Hz)、7.19(2H、d、J = 9 Hz)、6.76(1H、t、J = 5 Hz)、3.55-3.47(6H、m)、3.42-3.33(4H、m)、3.04(2H、q、J = 6 Hz)、1.36(9H、s)
＜步骤2＞ N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基 盐酸盐(EX14-IM-2)的合成：
[化184]
在(实施例14)＜步骤1＞中得到的化合物(EX14-IM-1、600 mg)中在冰水冷却下加入4当量浓度-氯化氢/1,4-二氧杂环己烷溶液(4.2 mL)，在室温下搅拌2小时。在反应液中加入二异丙基醚(12.0 mL)，在室温下搅拌30分钟。利用倾析除去溶剂，将残渣用二异丙基醚洗涤。将所得残渣减压干燥，以米色胶状物形式得到标题化合物EX14-IM-2(596 mg)。
NMR数据(DMSO-d6)(δ：ppm)： 8.62(1H、t、J = 6 Hz)、7.97(3H、brs)、7.91(2H、d、J= 9 Hz)、7.20(2H、d、J = 9 Hz)、3.62-3.51(8H、m)、3.42(2H、q、J = 6 Hz)、2.97-2.89(2H、m)、LC-MS(游离胺)：RT=0.58(分)、[M＋H]＋=294
＜步骤3＞ 导入N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基的海藻酸(EX14-(II)-A-2)的合成：
[化185]
在制备为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制：A-2)水溶液(40 mL)中加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(112 mg)、(实施例14)＜步骤2＞中得到的化合物EX14-IM-2(45 mg)的乙醇(4.0 mL)溶液、1摩尔浓度-小苏打水(151 μL)，在30℃下搅拌3小时。加入(0.4 g)后，加入乙醇(80 mL)，在室温下搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX14-(II)-A-2(408 mg)。
反应性基团(N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4-叠氮基苯甲酰胺基)的导入率为4.2 mol%(NMR积分比)。
(实施例15)导入N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-2-(环辛-2-炔-1-氧基)乙酰胺基的海藻酸(EX15-(I)-A-2)的合成：
[化186]
＜步骤1＞ (2-(2-(2,2,2-三氟乙酰胺)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁基酯(EX15-IM-1)的合成：
[化187]
在(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁基酯(EX9-SM1、1.0 g、[CAS：57260-73-8])的四氢呋喃(4.0 mL)溶液中滴加三氟乙酸乙酯(0.6 mL)。将反应混合物在室温下搅拌3.5小时。将反应液减压下浓缩，以无色油状物形式得到标题粗化合物EX15-IM-1(1.5 g)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 7.01(1H,brs)、4.84 (1H,brs)、3.62-3.51(6H、m)、3.31(2H、q、J = 5 Hz)、1.45(9H、s)
＜步骤2＞ N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-2,2,2-三氟乙酰胺 盐酸盐(EX15-IM-2)的合成：
[化188]
在(实施例15)＜步骤1＞中得到的化合物EX15-IM-1(1.5 g)中在冰水冷却下加入4当量浓度-氯化氢/1,4-二氧杂环己烷溶液(10.3 mL)，在室温下搅拌1小时。在反应液中加入二异丙基醚(30 mL)，在室温下搅拌30分钟。减压下馏去溶剂，用二异丙基醚共沸后，减压干燥，以无色油状物形式得到标题化合物EX15-IM-2(1.3 g)。
NMR数据(DMSO-d6)(δ：ppm)： 9.55(1H、brs)、8.05(3H、brs)、3.61(2H、d、J = 5Hz)、3.54(2H、t、J = 6 Hz)、3.39(2H、q、J = 6Hz)、3.00-2.91(2H、m)
＜步骤3＞ N-(2-(2-(2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺)乙氧基)乙基)-2,2,2-三氟乙酰胺(EX15-IM-3)的合成：
[化189]
将按照文献公知的方法(Org. Process Res. Dev.(2018)22：108-110)合成的羧酸(EX8-SM2、300 mg)、(实施例14)＜步骤2＞中得到的化合物(443 mg)溶于乙腈(6.0 mL)。加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(0.75 g)、N,N-二异丙基乙基胺(920 μL)，在室温下搅拌2.5小时。在反应液中加入乙酸乙酯(20 mL)、水(10 mL)，分液。将有机层用水(10mL)、饱和食盐水(5 mL)依次洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压浓缩。将残渣用硅胶柱色谱(50%乙酸乙酯/正庚烷~70%乙酸乙酯/正庚烷)纯化，以无色胶状物形式得到标题化合物EX15-IM-3(469 mg)。
NMR数据(DMSO-d6)(δ：ppm)： 9.45(1H、brs)、7.61(1H、t、J = 6 Hz)、4.29-4.25(1H、m)、3.87(2H、d、J = 15 Hz)、3.75(1H、d、J = 15 Hz)、3.50(2H、t、J = 6 Hz)、3.43(2H、t、J = 6 Hz)、3.37-3.31(2H、m)、3.24(2H、q、J = 6 Hz)、2.27-2.03(3H、m)、1.96-1.69(4H、m)、1.67-1.50(2H、m)、1.43-1.35(1H、m)
＜步骤4＞ N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺(EX15-IM-4)的合成：
[化190]
在(实施例15)＜步骤3＞中得到的化合物EX15-IM-3(220 mg)的甲醇(3.0 mL)溶液中加入碳酸钾(103 mg)的水(0.99 mL)溶液，在室温下搅拌4.5小时。将甲醇在减压下馏去，加入水(2 mL)后，用食盐使其饱和。用乙酸乙酯(15 mL、10 mL×4)提取，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残渣溶于乙酸乙酯(10 mL)，过滤除去不溶物后，减压浓缩，以淡黄色胶状物形式得到标题粗化合物EX15-IM-4(140 mg)。
NMR数据(CDCl3)(δ：ppm)： 6.89(1H、brs)、4.27-4.22(1H、m)、4.07(1H、d、J = 15Hz)、3.88(1H、d、J = 15 Hz)、3.58-3.47(6H、m)、2.87(2H、t、J = 5 Hz)、2.31-2.10(3H、m)、2.03-1.77(4H,m)、1.73-1.59(2H、m)、1.51-1.43(1H、m)、LC-MS：RT=0.60(分)、[M＋H]＋=269
＜步骤5＞ 导入N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基的海藻酸(EX15-(I)-A-2)的合成：
[化191]
在调整为1重量%的海藻酸钠(持田制药株式会公司制、A-2)水溶液(40 mL)中在室温搅拌下依次加入4-(4、6-二甲氧基-1、3、5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)(112 mg)、(实施例15)＜步骤4＞中得到的化合物EX15-IM-4(30 mg)的乙醇(4,0 mL)溶液、1摩尔%小苏打水(101 μL)，在30℃下搅拌3小时。在反应液中加入氯化钠(0.4 g)后，加入乙醇(80 mL)，搅拌30分钟。滤取所得沉淀，用乙醇洗涤后，减压干燥，以白色固体形式得到标题化合物EX15-(I)-A-2(410 mg)。
反应性取代基(N-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基)的导入率为3.2mol%(NMR积分比)。
[表12]
实施例 测定波长(nm) 分子量(Da) 重均分子量(Da) 导入率(mol%)
1a 280 1万2千~265万 153万 6.9(*)
1b 280 5千~262万 115万 6.5(*)
1c 280 2万7千~266万Da 171万 6.6(*)
1d 288 3730~285万 141万 4.9(*)
1e 287 1.37万~252万 140万 0.8(*)
1f 287 2230~257万 142万 1.9(*)
2 差示折射计 6千~235万Da 92万Da 5.8(*)
3a 255 1万5千~253万 151万 6.1(*)
3b 255 5千~259万 114万 9.4(*)
3c 255 1万8千~269万 165万 6.9(*)
3d 249 7630~259万 142万 3.7(*)
3e 249 2290~256万 141万 0.6(*)
3f 249 1.18万~254万 142万 1.5(*)
4 255 1万~285万 146万 4.3(*)
5a 255 1万1千万~266万 153万 9.4(*)
5b 232 5190~266万 139万 11(*)
6 287 2080~257万 140万 2.7(*)
7a 267 6430~259万 141万 5.1(*)
7b 267 1820~256万 141万 2.0(*)
8 215 1850~283万 138万 4.46(*)
9a 差示折射计 1万3千~282万 142万 4.3(*)
9b 差示折射计 1万3千~259万 141万 4.2(*)
9c 差示折射计 1万3千~267万 141万 2.1(*)
10 230 7740~266万 143万 4.7(*)
11 230 7120~271万 145万 4.2(*)
12 270 7680~259万 141万 4.8(*)
13 270 5130~269万 141万 3.9(*)
14 270 5020~267万 143万 4.2(*)
15 差示折射计 1万3千~364万 140万 3.2(*)
(*)NMR积分比。
[反应性基团或互补的反应性基团的导入率测定]
反应性基团或互补的反应性基团导入率是指将作为海藻酸的重复单元的每糖醛酸单糖单元所导入的反应性基团或互补的反应性基团的数以百分数表示的值。
本实施例中，反应性基团或互补的反应性基团导入率(mol%)通过1H-NMR的积分比计算。而且，算出导入率所必需的海藻酸的量通过利用校正曲线的咔唑硫酸法进行测定，反应性基团或互补的反应性基团的量也可通过利用校正曲线的吸光度测定法进行测定。
[分子量的测定]
将实施例中得到的导入了反应性基团或互补的反应性基团的海藻酸衍生物的固体溶于包含0.15 mol/L的NaCl的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)而制备0.1%或0.2%溶液，通过孔径0.22μm的聚醚砜制过滤过滤器(Minisart High Flow Filter、Sartorius公司)除去不溶物后，作为凝胶过滤用样品。通过分光光度计DU-800(Beckman-Coulter公司)测定各样品的光谱，确定各化合物的凝胶过滤中的测定波长。关于不具有特异的吸収波长的化合物，使用差示折射计。
将200μL凝胶过滤用样品供于Superose6 Increase10/300 GL柱(GE医疗科学公司)。凝胶过滤使用AKTA Explorer 10S作为色谱装置，使用包含0.15 mol/L NaCl的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)作为展开溶剂，在室温下流速为0.8mL/mim的条件下实施。监测各化合物确定的波长的吸収并制作样品的洗脱曲线。所得色谱图使用Unicorn5.31软件(GE医疗科学公司)进行解析，确定峰范围。
导入了反应性基团或互补的反应性基团的海藻酸的分子量使用蓝色葡聚糖(分子量200万Da、 SIGMA公司)、甲状腺球蛋白(分子量66.9万Da、GE医疗科学公司)铁蛋白(分子量44万Da、GE医疗科学公司)醛缩酶(分子量15.8万Da、GE医疗科学公司)、伴白蛋白(分子量7.5万Da、GE医疗科学公司)、卵白蛋白(分子量4.4万Da、GE医疗科学公司)、核糖核酸酶A(分子量1.37万Da、GE医疗科学公司)和抑肽酶(分子量6500Da、GE医疗科学公司)作为标准品，在与导入了反应性基团或互补的反应性基团的海藻酸相同的条件下进行凝胶过滤，利用Unicorn软件确定各成分的洗脱液量。分别地，将该各成分的洗脱液量在横轴描点，将分子量的对数值在纵轴描点，进行线性回归，制作校正曲线。从蓝色葡聚糖至铁蛋白、从铁蛋白至抑肽酶制作2种校正曲线。
使用该校正曲线，先计算得到的色谱的洗脱时间i中的分子量(Mi)。接着，读取洗脱时间i中的吸光度并作为Hi。根据这些数据由下述求出重均分子量(Mw)。
[数1]
。
[凝胶稳定性的测定]
(凝胶稳定性的测定(1))
将(实施例1a)中得到的海藻酸衍生物(EX1-(I)-A-2)、和(实施例3a＞中得到的海藻酸衍生物(EX3-(II)-A-2)分别以浓度达到1重量%的方式溶于水而得到（海藻酸水溶液1-1）和（海藻酸水溶液2-1）。等量混合（海藻酸水溶液1-1）和（海藻酸水溶液2-1），将该混合而得的水溶液加入装有18规格的注射针的注射筒，将该注射筒设置在设定为流速1mL/分钟的注射泵上，滴加在浓度为30mmol/L的氯化钙溶液中30秒钟，搅拌5分钟，得到海藻酸凝胶。将该凝胶用10mL的磷酸缓冲生理食盐水(PBS)洗涤1次后，在PBS中在37℃下静置10分钟进行化学交联，得到进行了化学交联和离子交联的海藻酸凝胶。在该凝胶中添加20mL的PBS，在37℃下振荡，经时地回收水溶液，补充与回収的量相同量的PBS。试验结束后，在试验溶液中添加5μL海藻酸裂解酶(ニッポンジーン、319-08261)，在37℃振荡2小时使凝胶完全崩解，回收水溶液。通过咔唑硫酸法测定回収的水溶液中的海藻酸浓度，将用已经回收的海藻酸浓度校正各时点的水溶液中海藻酸浓度而得的值除以由全部时点的海藻酸浓度和试验结束后的海藻酸浓度算出的总海藻酸浓度而得的值以百分数表示，将得到的值作为崩解率，作为凝胶稳定性的指标。同样地，作为对照，使用海藻酸(A-2)、(EX1-(I)-A-2)和(A-2)、(A-2)和(EX3-(II)-A-2)制备交联海藻酸凝胶(珠)，测定各崩解率。
将结果示于图1。作为对照使用(A-2)、(EX1-(I)-A-2)和(A-2)、(A-2)和(EX3-(II)-A-2)制备得到的交联海藻酸凝胶用4小时基本溶解，与此相对，使用(EX1-(I)-A-2)和(EX3-(II)-A-2)的各海藻酸衍生物而得到的交联海藻酸即使经过144小时也不会崩解，凝胶的稳定性进一步提高。即，表示通过利用惠斯根反应进行交联形成，所制成的结构体即使在没有钙离子的溶液(根据生体而在生理浓度以下)条件下，经过长期也可维持结构。
应予说明，图1的纵轴的崩解率是指相对崩解率(%)。将崩解率的实测值的最大值(仅(A-2)中制备的海藻酸凝胶：8小时后的实测值)校正为100%，将各点的崩解率设为与该最大值的相对值。
(凝胶稳定性的测定(2))
将(实施例1d)中得到的海藻酸衍生物(EX1-(I)-B-2a)、(实施例3d)中得到的海藻酸衍生物(EX3-(II)-B-2a)、(实施例7a)中得到的海藻酸衍生物(EX7-(II)-B-2a)、(实施例8)中得到的海藻酸衍生物(EX8-(I)-B-2)分别以浓度达到1.0w/w%的方式溶于水而得到海藻酸水溶液(1d-1)、(3d-1)、(7a-1)、和(8a-1)。接着，调整海藻酸水溶液(1d-1)和海藻酸水溶液(3d-1)的等量混合溶液、海藻酸水溶液(1d-1)和海藻酸水溶液(7a-1)的等量混合溶液、海藻酸水溶液(8a-1)和海藻酸水溶液(3d-1)的等量混合溶液、和海藻酸水溶液(8a-1)和海藻酸水溶液(7a-1)的等量混合溶液，使用各混合溶液，根据下述海藻酸凝胶(珠)制作方法，得到进行了化学交联和离子交联的海藻酸凝胶(珠)(A1、B1、C1、D1)(参照表13)。
〔海藻酸凝胶(珠)制作方法〕
将前述制备的混合溶液加入装有18规格的注射针的注射筒，将该注射筒设置在设定为流速1mL/分钟的注射泵上，滴加在浓度为30mmol/L的氯化钙溶液中30秒钟，搅拌5分钟，得到海藻酸凝胶（珠）。将该凝胶用10mL的磷酸缓冲生理食盐水(PBS)洗涤1次后，在纯水中在37℃下静置10分钟进行化学交联，得到进行了化学交联和离子交联的海藻酸凝胶(珠)。
[表13]
〔海藻酸凝胶(A1~D1)的稳定性测定〕
在前述中得到的进行了化学交联和离子交联的各海藻酸凝胶(珠)(A1~D1)中添加19.5 mL的PBS，在37℃下振荡，在1、2、4、8、24、48、72、144小时后回收水溶液，补充与回収的量相同量的PBS。试验结束后，在试验溶液中添加20 μL海藻酸裂解酶(Creative Enzymes、NATE-1563)，在37℃下整夜振荡使凝胶完全崩解，回收水溶液。通过咔唑硫酸法测定回収的水溶液中的海藻酸浓度，将各时点的水溶液中海藻酸浓度除以由全部时点的海藻酸浓度和试验结束后的海藻酸浓度算出的总海藻酸浓度而得的值以百分数表示，将得到的值作为崩解率，作为凝胶稳定性的指标。作为对照使用未导入反应性基团的海藻酸(B-2)，根据前述方法制备海藻酸凝胶(珠)(REF)，测定崩解率。
将结果示于图4。作为对照使用的使用未导入反应性基团的海藻酸(B-2)而制成的海藻酸凝胶(凝胶REF)在144小时崩解90%以上，与此相对，使用各海藻酸衍生物(EX1-(I)-B-2a、EX3-(II)-B-2a、EX7-(II)-B-2a、和EX8-(I)-B-2)得到的前述交联海藻酸凝胶(珠)(A1~D1)即使经过144小时也不会崩解，凝胶的稳定性进一步提高。即，表示通过利用惠斯根反应进行交联形成，所制作的结构体即使在没有钙离子的溶液(根据生体而在生理浓度以下)条件下，经过长期也可维持结构。
(凝胶稳定性的测定(3)：在凝胶EDTA存在下的稳定性的测定)
在利用前述凝胶稳定性的测定(2)的方法得到的进行了化学交联和离子交联的各海藻酸凝胶(珠)(A1~D1)中添加19.5 mL的5 mM乙二胺四乙酸二钾盐二水合物(EDTA・2K)/PBS溶液，在37℃下振荡，24小时后回收水溶液，制成进行了EDTA处理的交联海藻酸凝胶(珠)(A2~D2)。试验结束后，在试验溶液中添加海藻酸裂解酶(CreativeEnzymes、 NATE-1563)10 μL，在37℃下整夜振荡使凝胶完全崩解，回收水溶液。利用咔唑硫酸法测定回収的水溶液中的海藻酸浓度，将24小时后的水溶液中海藻酸浓度除以由24小时后的海藻酸浓度和试验结束后的海藻酸浓度算出的总海藻酸浓度而得的值以百分数表示，将所得值作为崩解率，作为凝胶稳定性的指标。同样地，作为对照使用未导入反应性基团的海藻酸(B-2)制备海藻酸凝胶(珠)(REF2)，测定崩解率。
[表14]
得到表14的结果。将作为对照使用的使用未导入反应性基团的海藻酸(B-2)制备的海藻酸凝胶进行EDTA处理而得的交联海藻酸凝胶(珠)(REF2)在24小时下进行100%崩解，与此相对，将使用各海藻酸衍生物(EX1-(I)-B-2a、EX3-(II)-B-2a、EX7-(II)-B-2a、和EX8-(I)-B-2)得到的前述交联海藻酸凝胶(珠)(A1~D1)进行EDTA处理而得的交联海藻酸凝胶(珠)(A2~D2)即使经过24小时也不会崩解，凝胶的稳定性进一步提高。即，表示通过形成基于惠斯根反应的化学交联，所制作的(珠)结构体即使不存在基于钙离子的离子交联，经过长期也能维持其结构。
(凝胶稳定性的测定(4))
将(实施例1g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX1-(I)-A-2b)、(实施例3g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX3-(II)-A-2b)、(实施例5c)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX5-(II)-A-2b)、(实施例7c)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX7-(II)-A-2)、和(实施例9a)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX9-(I)-A-2)溶于水而制备1.0%浓度的海藻酸水溶液(1g-1)、(3g‐1)、(5c-1)、(7c-1)、和(9a-1)。将前述海藻酸水溶液以(9a-1)和(5c-1)、(9a-1)和(7c-1)、(9a-1)和(3g‐1)、(1g-1)和(3g‐1)的组合等量混合，将各混合溶液加入另一个装有18规格的注射针的注射筒，将注射筒设置在设定为流速1mL/分钟的注射泵上，分别滴加在浓度为30mmol/L的氯化钙溶液中30秒钟，搅拌5分钟，得到各海藻酸凝胶。将所得各凝胶用10 mL的PBS洗涤1次，在PBS中在37℃下静置10分钟进行化学交联，得到化学交联海藻酸凝胶。在前述各凝胶中添加19.5 mL的PBS，在37℃下振荡，经时地回收水溶液，补充与回収的量相同量的PBS。试验结束后，在试验溶液中添加海藻酸裂解酶(ニッポンジーン、319-08261)10 μL，在37℃下整夜振荡使凝胶完全崩解，回收水溶液。利用咔唑硫酸法测定回収的水溶液中的海藻酸浓度，将用已经回收的海藻酸浓度校正各时点的水溶液中海藻酸浓度而得的值除以由全部时点的海藻酸浓度和试验结束后的海藻酸浓度算出的总海藻酸浓度而得的值以百分数表示，将得到的值作为崩解率，作为凝胶稳定性的指标。
将结果示于图8。前述各交联海藻酸凝胶(珠)在96小时后的稳定性为0.3~4.8%，表示经过长期也可维持结构(在(实施例1g)和(实施例3g)中制作的凝胶作为对照。96小时下为0.3%)。
凝胶稳定性的测定(5)：在凝胶EDTA存在下的稳定性的测定
将(实施例1g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX1-(I)-A-2b)、(实施例3g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX3-(II)-A-2b)、(实施例5c)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX5-(II)-A-2b)、(实施例7c)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX7-(II)-A-2)、和(实施例9a)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX9-(I)-A-2)溶于水而制备1.0%浓度的海藻酸水溶液(1g-1)、(3g‐1)、(5c-1)、(7c-1)、和(9a-1)。将前述海藻酸水溶液以(9a-1)和(5c-1)、(9a-1)和(7c-1)、(9a-1)和(3g‐1)、(1g-1)和(3g‐1)的组合等量混合，将各混合溶液加入另一个装有18规格的注射针的注射筒，将注射筒设置在设定为流速1mL/分钟的注射泵上，分别滴加在浓度为30mmol/L的氯化钙溶液中30秒钟，搅拌5分钟，得到各海藻酸凝胶。将所得各凝胶用10 mL的PBS洗涤1次，在PBS中在37℃下静置10分钟进行化学交联，得到化学交联海藻酸凝胶。
在前述各凝胶中添加19.5 mL的5 mM乙二胺四乙酸二钾盐二水合物(EDTA・2K)/生理食盐水，在37℃下振荡，经时地回收水溶液，补充与回收的量相同量的5 mM EDTA・2K/生理食盐水。试验结束后(24小时后)，在试验溶液中添加海藻酸裂解酶(ニッポンジーン、319-08261)30 μL，在37℃下整夜振荡使凝胶完全崩解，回收水溶液。利用咔唑硫酸法测定回収的水溶液中的海藻酸浓度，将用已经回收的海藻酸浓度校正各时点的水溶液中海藻酸浓度而得的值除以由全部时点的海藻酸浓度和试验结束后的海藻酸浓度算出的总海藻酸浓度而得的值以百分数表示，将得到的值作为崩解率，作为凝胶稳定性的指标。
得到图9的结果。前述交联海藻酸凝胶(珠)即使经过24小时也不会崩解，可确认凝胶的稳定性。即，表示通过利用惠斯根反应形成化学交联，所制作的(珠)结构体经过长期也可维持其结构。
(凝胶稳定性的测定(6))
将(实施例1g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX1-(I)-A-2b)、(实施例3g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX3-(II)-A-2b)、(实施例5c)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX5-(II)-A-2b)、(实施例7c)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX7-(II)-A-2)、和(实施例8b)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX8-(I)-A-2)溶于水而制备1.0%浓度的海藻酸水溶液(1g-1)、(3g‐1)、(5c-1)、(7c-1)、和(8b-1)。将前述海藻酸水溶液以(1g-1)和(5c-1)、(1g-1)和(7c-1)、(8b-1)和(5c-1)、(8b-1)和(7c-1)、(8b-1)和(3g‐1)、(1g-1)和(3g‐1)的组合等量混合，将各混合溶液加入另一个装有18规格的注射针的注射筒，将各混合溶液加入另一个装有18规格的注射针的注射筒，将注射筒设置在设定为流速1mL/分钟的注射泵上，分别滴加在浓度为30mmol/L的氯化钙溶液中30秒钟，搅拌5分钟，得到各海藻酸凝胶。将所得各凝胶用10 mL的PBS洗涤1次，在PBS中在37℃下静置10分钟进行化学交联，得到化学交联海藻酸凝胶。在该凝胶中添加19.5 mL的PBS，在37℃下振荡，经时地回收水溶液，补充与回収的量相同量的PBS。试验结束后，在试验溶液中添加海藻酸裂解酶(ニッポンジーン、319-08261)10 μL，在37℃下整夜振荡使凝胶完全崩解，回收水溶液。利用咔唑硫酸法测定回収的水溶液中的海藻酸浓度，将直至各时点的溶出海藻酸量除以由全部时点的海藻酸浓度和试验结束后的海藻酸浓度算出的总海藻酸浓度而得的值以百分数表示，将得到的值作为崩解率，作为凝胶稳定性的指标。
将结果示于图10。前述各交联海藻酸凝胶(珠)在96小时后的稳定性约为20%左右，表示经过长期也可维持结构(作为对照的(实施例1g)和(实施例3g)中制作的凝胶的稳定性在96小时下为20.4%)。
(凝胶稳定性的测定(7)：在凝胶EDTA存在下的稳定性的测定)
将(实施例1g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX1-(I)-A-2b)、(实施例3g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX3-(II)-A-2b)、(实施例5c)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX5-(II)-A-2b)、(实施例7c)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX7-(II)-A-2)、和(实施例8b)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX8-(I)-A-2)溶于水而制备1.0%浓度的海藻酸水溶液(1g-1)、(3g‐1)、(5c-1)、(7c-1)、和(8b-1)。将前述海藻酸水溶液以(1g-1)和(5c-1)、(1g-1)和(7c-1)、(8b-1)和(5c-1)、(8b-1)和(7c-1)、(8b-1)和(3g‐1)、(1g-1)和(3g‐1)的组合等量混合，将各混合溶液加入另一个装有18规格的注射针的注射筒，将各混合溶液加入另一个装有18规格的注射针的注射筒，将注射筒设置在设定为流速1mL/分钟的注射泵上，分别滴加在浓度为30mmol/L的氯化钙溶液中30秒钟，搅拌5分钟，得到各海藻酸凝胶。在该凝胶中添加19.5 mL的5 mM乙二胺四乙酸二钾盐二水合物(EDTA・2K)/生理食盐水，在37℃下振荡，经时地回收水溶液，补充与回收的量相同量的5 mM EDTA・2K/生理食盐水。试验结束后(24小时后)，在试验溶液中添加海藻酸裂解酶(ニッポンジーン、319-08261)30 μL，在37℃下整夜振荡使凝胶完全崩解，回收水溶液。利用咔唑硫酸法测定回収的水溶液中的海藻酸浓度，将直至各时点的溶出海藻酸量除以由全部时点的海藻酸浓度和试验结束后的海藻酸浓度算出的总海藻酸浓度而得的值以百分数表示，将得到的值作为崩解率，作为凝胶稳定性的指标。
得到图11的结果。前述交联海藻酸凝胶(珠)即使经过24小时也不会崩解，可确认凝胶的稳定性。即，表示通过利用惠斯根反应形成化学交联，所制作的(珠)结构体经过长期也可维持其结构。
(凝胶稳定性的测定(8))
将(实施例1g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX1-(I)-A-2b)、(实施例3g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX3-(II)-A-2b)、(实施例10)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX10-(II)-A-2)、(实施例11)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX11-(II)-A-2)、(实施例12)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX12-(II)-A-2)、(实施例13)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX13-(II)-A-2)、(实施例14)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX14-(II)-A-2)、和(实施例15)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX15-(I)-A-2)溶于水而制备1.0%浓度的海藻酸水溶液(1g-1)、(3g‐1)、(10-1)、(11-1)、(12-1)、(13-1)、(14-1)、和(15-1)。将前述海藻酸水溶液以(3g-1)和(15-1)、(1g-1)和(10-1)、(1g-1)和(11-1)、(1g-1)和(12-1)、(1g-1)和(13-1)、(1g-1)和(14-1)、(1g-1)和(3g‐1)的组合等量混合，将各混合溶液加入另一个装有18规格的注射针的注射筒，将各混合溶液加入另一个装有18规格的注射针的注射筒，将注射筒设置在设定为流速1mL/分钟的注射泵上，分别滴加在浓度为30mmol/L的氯化钙溶液中30秒钟，搅拌5分钟，得到各海藻酸凝胶。将该凝胶用10 mL的PBS洗涤1次，在PBS中在37℃下静置10分钟进行化学交联，得到化学交联海藻酸凝胶。在该凝胶中添加19.5 mL的PBS，在37℃下振荡，经时地回收水溶液，补充与回収的量相同量的PBS。试验结束后，在试验溶液中添加海藻酸裂解酶(ニッポンジーン、319-08261)10 μL，在37℃下整夜振荡使凝胶完全崩解，回收水溶液。利用咔唑硫酸法测定回収的水溶液中的海藻酸浓度，将直至各时点的溶出海藻酸量除以由全部时点的海藻酸浓度和试验结束后的海藻酸浓度算出的总海藻酸浓度而得的值以百分数表示，将得到的值作为崩解率，作为凝胶稳定性的指标。
将结果示于图12。前述各交联海藻酸凝胶(珠)在96小时后的稳定性为0.5%以下，表示经过长期也可维持结构(作为对照的(实施例1g)和(实施例3g)中制作的凝胶的稳定性在96小时下为0.3%)。
(凝胶稳定性的测定(9)：在凝胶EDTA存在下的稳定性的测定
将(实施例1g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX1-(I)-A-2b)、(实施例3g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX3-(II)-A-2b)、(实施例10)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX10-(II)-A-2)、(实施例11)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX11-(II)-A-2)、(实施例12)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX12-(II)-A-2)、(实施例13)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX13-(II)-A-2)、(实施例14)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX14-(II)-A-2)、和(实施例15)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX15-(I)-A-2)溶于水而制备1.0%浓度的海藻酸水溶液(1g-1)、(3g‐1)、(10-1)、(11-1)、(12-1)、(13-1)、(14-1)、和(15-1)。将前述海藻酸水溶液以(3g-1)和(15-1)、(1g-1)和(10-1)、(1g-1)和(11-1)、(1g-1)和(12-1)、(1g-1)和(13-1)、(1g-1)和(14-1)、(1g-1)和(3g‐1)的组合等量混合，将各混合溶液加入另一个装有18规格的注射针的注射筒，将各混合溶液加入另一个装有18规格的注射针的注射筒，将注射筒设置在设定为流速1mL/分钟的注射泵上，分别滴加在浓度为30mmol/L的氯化钙溶液中30秒钟，搅拌5分钟，得到各海藻酸凝胶。
在各凝胶中添加19.5 mL的5 mM乙二胺四乙酸二钾盐二水合物(EDTA・2K)/生理食盐水，在37℃下振荡，经时地回收水溶液，补充与回收的量相同量的5 mM EDTA・2K/生理食盐水。试验结束后(24小时后)，在试验溶液中添加海藻酸裂解酶(ニッポンジーン、319-08261)30 μL，在37℃下整夜振荡使凝胶完全崩解，回收水溶液。利用咔唑硫酸法测定回収的水溶液中的海藻酸浓度，将直至各时点的溶出海藻酸量除以由全部时点的海藻酸浓度和试验结束后的海藻酸浓度算出的总海藻酸浓度而得的值以百分数表示，将得到的值作为崩解率，作为凝胶稳定性的指标。
得到图13的结果。前述交联海藻酸凝胶(珠)即使经过24小时也不会崩解，可确认凝胶的稳定性。即，表示通过利用惠斯根反应形成化学交联，所制作的(珠)结构体经过长期也可维持其结构。
[凝胶透过性的测定]
(凝胶透过性的测定(1))
将(实施例1a)中得到的海藻酸衍生物(EX1-(I)-A-2)、和(实施例3a)中得到的海藻酸衍生物(EX3-(II)-A-2)以浓度达到2%的方式溶于水而得到(海藻酸水溶液1-2)和(海藻酸水溶液2-2)。进一步在(海藻酸水溶液1-2)中等量添加制备为1 mg/mL的分子量200万的异硫氰酸荧光素-葡聚糖(シグマアルドリッチ、FD2000S)或分子量15万的异硫氰酸荧光素-葡聚糖(シグマアルドリッチ、FD150S)，得到(海藻酸水溶液3)或(海藻酸水溶液4)。此外，在(海藻酸水溶液2-2)中等量添加生理食盐水，得到(海藻酸水溶液5)。
将(海藻酸水溶液3)和(海藻酸水溶液5)等量混合，将该混合而得的水溶液加入装有18规格的注射针的注射筒，将该注射筒设置在设定为流速1mL/分的注射泵上，滴加在浓度为30mmol/L的氯化钙溶液中30秒钟，搅拌约20分钟，得到海藻酸凝胶。将该凝胶用10 mL的生理食盐水洗涤1次，得到内包异硫氰酸荧光素(分子量200万)-葡聚糖的化学交联海藻酸凝胶(珠)。此外，将(海藻酸水溶液4)和(海藻酸水溶液5)等量混合，利用与前述相同的方法得到内包异硫氰酸荧光素(分子量15万)-葡聚糖的化学交联海藻酸凝胶(珠)。
在所得凝胶（珠）中添加20 mL的生理食盐水，在37℃下振荡，经时地回收水溶液。试验结束后在试验溶液中添加10μL海藻酸裂解酶(ニッポンジーン、319-08261)，在37℃下震荡2小时以上使凝胶完全崩解，回收水溶液。通过荧光定量法(激发光：485nm、荧光：535nm)测定回収的水溶液中的葡聚糖浓度，将各时点的葡聚糖浓度除以试验结束后的葡聚糖浓度而得的值以百分数表示，将所得值作为透过率。
将等量添加(海藻酸水溶液3)和(海藻酸水溶液5)而得到的凝胶(EX1-(I)-A-2/EX3-(II)-A-2/葡聚糖(分子量：200万))的结果示于图2。确认在24小时下为6.4%的透过。
将等量添加(海藻酸水溶液4)和(海藻酸水溶液5)而得到的凝胶(EX1-(I)-A-2/EX3-(II)-A-2/葡聚糖(分子量：15万))的结果示于图3。确认在3小时下为23.6%、在24小时下为31.9%泄漏的透过。
(凝胶透过性的测定(2))
将(实施例1d)中得到的海藻酸衍生物(EX1-(I)-B-2a)、(实施例3d)中得到的海藻酸衍生物(EX3-(II)-B-2a)、(实施例7a)中得到的海藻酸衍生物(EX7-(II)-B-2a)、(实施例8)中得到的海藻酸衍生物(EX8-(I)-B-2)以各自浓度达到1.5 w/w%的方式溶于水而得到海藻酸水溶液(1d-2)、(3d-2)、(7a-2)、和(8a-2)。进一步在(海藻酸水溶液3d-2)中添加制备为1 mg/mL的分子量200万的异硫氰酸荧光素-葡聚糖(シグマアルドリッチ、FD2000S)或分子量15万的异硫氰酸荧光素-葡聚糖(シグマアルドリッチ、FD150S)，得到(海藻酸水溶液3d-2-A)或(海藻酸水溶液3d-2-B)。同样地在(海藻酸水溶液7a-2)中添加制备为1 mg/mL的分子量200万的异硫氰酸荧光素-葡聚糖(シグマアルドリッチ、FD2000S)或分子量15万的异硫氰酸荧光素-葡聚糖(シグマアルドリッチ、FD150S)，得到(海藻酸水溶液7a-2-A)或(海藻酸水溶液7a-2-B)。
将这些水溶液以表15的组合进行混合，以使海藻酸的终浓度为1.0 w/w%、异硫氰酸荧光素-葡聚糖的终浓度为100 μg/mL。将该混合而得的水溶液加入装有18规格的注射针的注射筒，将该注射筒设置在设定为流速1mL/分的注射泵上，滴加在浓度为30mmol/L的氯化钙溶液中30秒钟，搅拌5分钟，得到海藻酸凝胶。将该凝胶用10mL的磷酸缓冲生理食盐水(PBS)洗涤1次后，在纯水中在37℃下静置10分钟进行化学交联，得到内包异硫氰酸荧光素(分子量200万)-葡聚糖的化学交联海藻酸凝胶(珠)和内包异硫氰酸荧光素(分子量15万)-葡聚糖的化学交联海藻酸凝胶(珠)(凝胶a~h)。
[表15]
(1d-2) (8a-2)
(3d-2-A) 凝胶a 凝胶b
(7a-2-A) 凝胶c 凝胶d
(3d-2-B) 凝胶e 凝胶f
(7a-2-B) 凝胶g 凝胶h
在凝胶a~h的各凝胶中添加19.5 mL的生理食盐水，在37℃下振荡，在3、24小时后回收水溶液，补充与回收的量相同量的生理食盐水。试验结束后，在试验溶液添加海藻酸裂解酶(CreativeEnzymes、NATE-1563)20 μL，在37℃下整夜振荡使凝胶完全崩解，回收水溶液。将回収的水溶液中的葡聚糖浓度利用荧光定量法(激发光：485nm、荧光：535nm)进行测定，将各时点的葡聚糖浓度除以由全部时点的葡聚糖浓度和试验结束后的葡聚糖浓度算出的总葡聚糖浓度而得的值以百分数表示，将得到的值作为透过率。
将对(海藻酸水溶液3d-2-A)和(海藻酸水溶液7a-2-A)分别混合(海藻酸水溶液1d-2)、(海藻酸水溶液8a-2)而得到的凝胶(表15的凝胶a、凝胶b、凝胶c、和凝胶d)的结果示于图5。3小时、和24小时下的透过率均为0%。将对(海藻酸水溶液3d-2-B)和(海藻酸水溶液7a-2-B)分别混合(海藻酸水溶液1d-2)、(海藻酸水溶液8a-2)而得到的凝胶(表15的凝胶e、凝胶f、凝胶g、和凝胶h)的结果示于图6。3小时下的透过率为2.5%~4.6%，24小时下的透过率为6.8%~8.6%。
(凝胶透过性的测定(3))
将(实施例3g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX3-(II)-A-2b)、(实施例5c)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX5-(II)-A-2b)、和(实施例7c)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX7-(II)-A-2)以浓度达到2.0%的方式溶于水而制备海藻酸水溶液，在该海藻酸水溶液中添加2/5容量的制备为1 mg/mL的分子量15万的异硫氰酸荧光素-葡聚糖(シグマアルドリッチ、FD150S)、和3/5容量的水，制备含有0.2 mg/mL异硫氰酸荧光素-葡聚糖的1.0%海藻酸水溶液(3g‐2)、(5c-2)、和(7c-2)。进一步将(实施例1g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX1-(I)-A-2b)、和(实施例9a)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX9-(I)-A-2)以浓度达到1.0%的方式溶于水而分别制备海藻酸水溶液(1g-1)、和(9a‐1)。将前述海藻酸水溶液以(9a‐1)和(5c-2)、(9a‐1)和(7c-2)、(9a‐1)和(3g‐2)、(1g-1)和(3g‐2)的组合等量混合，添加浓度为30 mmol/L的氯化钙溶液40 mL，搅拌5分钟，得到海藻酸凝胶。将该凝胶用10 mL的生理食盐水洗涤1次，生理食盐水中，在37℃下静置10分钟进行化学交联，分别得到内包异硫氰酸荧光素-葡聚糖的化学交联海藻酸凝胶。在各凝胶中添加19.5mL的生理食盐水，在37℃下振荡，经时地回收水溶液，补充与回收的量相同量的生理食盐水。试验结束后(24小时后)、在试验溶液中添加海藻酸裂解酶(ニッポンジーン、319-08261)10 μL，在37℃下振荡3小时以上而使凝胶完全崩解，回收水溶液。将回収的水溶液中的葡聚糖浓度利用荧光定量法(激发光：485nm、荧光：535nm)进行测定，将各时点的葡聚糖浓度除以试验结束后的葡聚糖浓度而得的值以百分数表示，将得到的值作为透过率。
得到图14的结果。3小时后的透过率均为约30%左右。此外，24小时后的透过率均为约40%左右。
(凝胶透过性的测定(4))
将(实施例3g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX3-(II)-A-2b)、(实施例5c)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX5-(II)-A-2b)、和(实施例7c)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX7-(II)-A-2)以浓度达到2.0%的方式溶于水而制备海藻酸水溶液，在该海藻酸水溶液中添加2/5容量制备为1 mg/mL的分子量15万的异硫氰酸荧光素-葡聚糖(シグマアルドリッチ、FD150S)、和3/5容量的水，得到含有0.2 mg/mL异硫氰酸荧光素-葡聚糖的1.0%海藻酸水溶液(3g‐2)、(5c-2)、和(7c-2)。进一步将(实施例1g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX1-(I)-A-2b)、和(实施例8b)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX8-(I)-A-2)以浓度达到1.0%的方式溶于而分别制备海藻酸水溶液(1g-1)、和(8b‐1)。将它们分别以(1g-1)和(5c-2)、(1g-1)和(7c-2)、(8b‐1)和(5c-2)、(8b‐1)和(7c-2)、(8b‐1)和(3g‐2)、(1g-1)和(3g‐2)的组合等量混合，添加浓度为30 mmol/L的氯化钙溶液40 mL，搅拌5分钟，得到海藻酸凝胶。将该凝胶用10 mL的生理食盐水洗涤1次，生理食盐水中，在37℃下静置10分钟进行化学交联，分别得到内包异硫氰酸荧光素-葡聚糖的化学交联海藻酸凝胶。在各凝胶中添加19.5 mL的生理食盐水，在37℃下振荡，经时地回收水溶液，补充与回收的量相同量的生理食盐水。试验结束后(24小时后)、在试验溶液中添加海藻酸裂解酶(ニッポンジーン、319-08261)10 μL，在37℃下振荡3小时以上而使凝胶完全崩解，回收水溶液。将回収的水溶液中的葡聚糖浓度利用荧光定量法(激发光：485nm、荧光：535nm)进行测定，将各时点的葡聚糖浓度除以试验结束后的葡聚糖浓度而得的值以百分数表示，将得到的值作为透过率。
得到图15的结果。3小时后的透过率均为约35%左右。此外，24小时后的透过率均为约45%左右。
(凝胶透过性的测定(5))
将(实施例3g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX3-(II)-A-2b)、(实施例10)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX10-(II)-A-2)、(实施例11)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX11-(II)-A-2)、(实施例12)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX12-(II)-A-2)、(实施例13)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX13-(II)-A-2)、和(实施例14)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX14-(II)-A-2)以浓度达到2.0%的方式溶于水而制备海藻酸水溶液，在该海藻酸水溶液中添加2/5容量制备为1 mg/mL的分子量15万的异硫氰酸荧光素-葡聚糖(シグマアルドリッチ、FD150S)、和3/5容量的水，制备含有0.2mg/mL异硫氰酸荧光素-葡聚糖的1.0%海藻酸水溶液(3g‐2)、(10-2)、(11-2)、(12-2)、(13-2)、和(14-2)。进一步将(实施例1g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX1-(I)-A-2b)、和(实施例15)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX15-(I)-A-2)以浓度达到1.0%的方式溶于水而分别制备海藻酸水溶液(1g-1)、和(15‐1)。将它们分别以(15-1)和(3g‐2)、(1g-1)和(10-2)、(1g-1)和(11-2)、(1g-1)和(12-2)、(1g-1)和(13-2)、(1g-1)和(14-2)、(1g-1)和(3g‐2)的组合等量混合，添加浓度为30 mmol/L的氯化钙溶液40 mL，搅拌5分钟，得到海藻酸凝胶。将该凝胶用10 mL的生理食盐水洗涤1次，生理食盐水中，在37℃下静置10分钟进行化学交联，分别得到内包异硫氰酸荧光素-葡聚糖的化学交联海藻酸凝胶。在各凝胶中添加19.5 mL的生理食盐水，在37℃下振荡，经时地回收水溶液，补充与回收的量相同量的生理食盐水。试验结束后(24小时后)、在试验溶液中添加海藻酸裂解酶(ニッポンジーン、319-08261)10 μL，在37℃下振荡3小时以上而使凝胶完全崩解，回收水溶液。将回収的水溶液中的葡聚糖浓度利用荧光定量法(激发光：485nm、荧光：535nm)进行测定，将各时点的葡聚糖浓度除以试验结束后的葡聚糖浓度得到的值以百分数表示，将得到的值作为透过率。
得到图16的结果。3小时后的透过率为约17~约28%左右。此外，24小时后的透过率为约25~约35%左右。
[交联海藻酸衍生物(凝胶)的生物适应性评价]
将利用与(实施例1d)相同的方法制造的导入率(NMR积分比)=0.9 mol%的海藻酸衍生物(EX1-(I)-B-2-L)、利用与(实施例3d)相同的方法制造的导入率(NMR积分比)=0.6mol%的海藻酸衍生物(EX3-(II)-B-2-L)、利用与(实施例7a)相同的方法制造的导入率(NMR积分比)=0.9 mol%的海藻酸衍生物(EX7-(II)-B-2-L)、利用与(实施例8)相同的方法制造的导入率(NMR积分比)=0.3 mol%的海藻酸衍生物(EX8-(I)-B-2-L)分别以浓度达到1.5 w/w%的方式溶于生理食盐水而得到海藻酸水溶液(1d-L)、(3d-L)、(7a-L)、(8a-L)。
进一步在(海藻酸水溶液3d-L)、(海藻酸水溶液7a-L)中分别添加制备为1.5×107细胞/mL的CHO细胞的PBS悬浮液，得到(海藻酸水溶液3d-LC)或(海藻酸水溶液7a-LC)。
将这些水溶液以表16的组合进行混合，以使海藻酸的终浓度达到1.0 w/w%、CHO细胞的终浓度达到5.0×106 细胞/mL。将该混合而得的水溶液加入装有18规格的注射针的注射筒，将该注射筒设置在设定为流速1mL/分钟的注射泵上，在浓度为50 mmol/L的氯化钙溶液中滴加30秒钟，搅拌5分钟后，用10 mL的磷酸缓冲生理食盐水(PBS)洗涤1次，得到内包CHO细胞的海藻酸凝胶(珠)(凝胶CHO-1~凝胶CHO-4)。
[表16]
1d-L 8a-L
3d-LC 凝胶CHO-1 凝胶CHO-2
7a-LC 凝胶CHO-3 凝胶CHO-4
将(凝胶CHO-1)~(凝胶CHO-4)播种于6孔板(FALCON、 Cat＃351146)，以5 mL/孔添加下述表17的组成的培养基，使凝胶含浸后，在37℃、5%CO2保温箱内以125 rpm震荡，同时实施2天培养。试验结束后回收凝胶，再在新的培养基5mL中含浸后，添加海藻酸裂解酶(CreativeEnzymes、 NATE-1563)50 μL，在37℃下振荡1小时，使凝胶完全崩解，回收培养基。将回収的培养基中的活细胞数、死细胞数利用台盼蓝染色而计数，将活细胞数除以活细胞数和死细胞数之和而得的值以百分数表示，将得到的值作为细胞存活率，作为凝胶的生物适应性的指标。同样地，作为对照使用未导入反应性基团的海藻酸(B-2)而制作CHO细胞内包海藻酸凝胶(珠)(REF-CHO)，测定细胞生存率。
[表17]
将结果示于图7。前述表16所述的各海藻酸衍生物的组合中得到的海藻酸凝胶((凝胶CHO-1)~(凝胶CHO-4))中的细胞生存率为87.2%~89.0%。此外，作为对照使用的使用未导入反应性基团的海藻酸(B-2)制作的海藻酸凝胶(REF-CHO)中的细胞生存率为90.5%。根据该结果，表示导入了反应性基团的海藻酸衍生物、和利用惠斯根反应形成化学交联的海藻酸结构体(珠)具有与未导入反应性基团的海藻酸相同程度的高生物适应性。
[交联海藻酸衍生物(凝胶)的生物适应性评价(2)]
将(实施例1g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX1-(I)-A-2b)、(实施例3g)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX3-(II)-A-2b)、(实施例5c)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX5-(II)-A-2b)、(实施例7c)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX7-(II)-A-2)、和(实施例8b)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX8-(I)-A-2)、(实施例9a)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX9-(I)-A-2)、(实施例10)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX10-(II)-A-2)、(实施例11)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX11-(II)-A-2)、(实施例12)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX12-(II)-A-2)、(实施例13)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX13-(II)-A-2)、(实施例14)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX14-(II)-A-2)、和(实施例15)中得到的导入反应性取代基的海藻酸(EX15-(I)-A-2)溶于水而制成导入交联基的海藻酸溶液。将其利用Minisarthighflow(ザルトリウス、16532GUK)过滤灭菌后，制备导入1.0%交联基团的海藻酸/生理食盐水溶液。在以细胞浓度达到5×10＾3 细胞/孔的方式播种在96孔板后培养1天而得的HeLa细胞中，将导入1.0%交联基交联基的海藻酸/生理食盐水溶液以(实施例1g)、(实施例8b)、(实施例9a)、或(实施例15)与(实施例3g)的组合、和(实施例1g)与(实施例5c)、(实施例7c)、(实施例10)、(实施例11)、(实施例12)、(实施例13)、或(实施例14)的组合以终浓度达到0.1%的方式添加，培养1天后，利用CellTiter-Glo 发光细胞活力检测(Promega、G7571)评价ATP活性作为细胞毒性的指标。
得到图17的结果。前述全部交联海藻酸凝胶中可确认ATP活性，由此表示在交联海藻酸凝胶中没有细胞毒性，表示利用惠斯根反应形成化学交联的海藻酸结构体(珠)具有生物适应性。

Claims (14)

1.交联海藻酸结构体，其通过将混合有下述式(I)的海藻酸衍生物和下述式(II)的海藻酸衍生物的海藻酸衍生物的混合溶液滴加在包含2价金属离子的溶液中从而得到，
所述式(I)所示的海藻酸衍生物中，在海藻酸的任意1个以上的羧基上介由酰胺键和2价连接基(-L1-)而导入了环状炔基(Akn)，
[化1]
式(I)中，(ALG)表示海藻酸；-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基而得的酰胺键；-L1-表示选自下述部分结构式中的2价连接基，各式中，两端的虚线外侧不包括在内；
[化2]
Akn表示选自下述部分结构式中的环状炔基，各式中，虚线右侧不包括在内；
[化3]
星号表示手性中心；
所述式(II)的海藻酸衍生物中，在海藻酸的任意1个以上的羧基上介由酰胺键和2价连接基(-L2-)而导入了叠氮基：
[化4]
式(II)中，(ALG)表示海藻酸；-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基而得的酰胺键；-L2-表示选自下述部分结构式中的2价连接基，各式中，两端的虚线外侧不包括在内，
[化5]
2.根据权利要求1的交联海藻酸结构体，其中，所述式(I)的海藻酸衍生物中，Akn-L1-NH2基的导入率为0.1％～30％，其中，Akn和-L1-与权利要求1中的定义相同。
3.根据权利要求1的交联海藻酸结构体，其中，所述式(I)的海藻酸衍生物的利用凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量为10万Da～300万Da。
4.根据权利要求1的交联海藻酸结构体，其中，所述式(II)的海藻酸衍生物中，N3-L2-NH2基的导入率为0.1％～30％，-L2-与权利要求1中的定义相同。
5.根据权利要求1的交联海藻酸结构体，其中，所述式(II)的海藻酸衍生物中，海藻酸衍生物的利用凝胶过滤色谱法测定得到的重均分子量为10万Da～300万Da。
6.根据权利要求1所述的交联海藻酸结构体，其中，所述式(I)的海藻酸衍生物由选自下述式中的式表示，
[化6]
各式中，(ALG)表示海藻酸；-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基而得的酰胺键。
7.根据权利要求1所述的交联海藻酸结构体，其中，所述式(II)的海藻酸衍生物由选自下述式中的式表示，
[化7]
各式中，(ALG)表示海藻酸；-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基而得的酰胺键。
8.根据权利要求1所述的交联海藻酸结构体，其包含利用惠斯根反应形成的基于三唑环的化学交联、和利用2价金属离子而部分地形成的离子交联作为交联。
9.根据权利要求1所述的交联海藻酸结构体，其包含利用惠斯根反应形成的基于三唑环的化学交联。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的交联海藻酸结构体，其中，利用惠斯根反应形成的基于三唑环的化学交联是下述式(III-L)：
[化8]
式(III-L)中，两端的-CONH-和-NHCO-表示介由海藻酸的任意羧基而得的酰胺键；-L1-与权利要求1中的定义相同；-L2-与权利要求1中的定义相同；X表示选自下述部分结构式中的环状基，
[化9]
各式中，两端的虚线外侧不包括在内，星号表示手性中心。
11.根据权利要求1～9中任一项所述的交联海藻酸结构体，其为珠或近球形的凝胶。
12.根据权利要求1～9中任一项所述的交联海藻酸结构体，其具有生物适应性。
13.医疗用材料，其包含权利要求1～12中任一项所述的交联海藻酸结构体。
14.根据权利要求13所述的医疗用材料，其为珠或近球形的凝胶。
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CN116710110A (zh) 2020-12-28 2023-09-05 持田制药株式会社 新型的多层聚合物涂层交联海藻酸凝胶纤维
CA3203302A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Shoji Furusako Novel multilayer polymer-coated crosslinked alginate gel fiber
EP4268856A1 (en) 2020-12-28 2023-11-01 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Multilayer structure using chemically crosslinked alginic acid
CN116003651B (zh) * 2023-01-09 2024-02-13 青岛大学 一种内酰胺荧光物质接枝的海藻酸钠荧光衍生物及其制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011504507A (ja) * 2007-11-21 2011-02-10 ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法
CN102408496A (zh) * 2011-09-13 2012-04-11 武汉理工大学 一种原位交联海藻酸钠水凝胶及其制备方法
JP2013525425A (ja) * 2010-04-27 2013-06-20 シンアフィックス ビー．ブイ． 縮合シクロオクチン化合物及び無金属クリック反応におけるそれらの使用
CN105713106A (zh) * 2015-12-31 2016-06-29 华南理工大学 一种海藻酸钠双交联水凝胶及其制备方法与应用
WO2017165389A2 (en) * 2016-03-24 2017-09-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Alginate hydrogel compositions

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5589591A (en) 1986-07-03 1996-12-31 Advanced Magnetics, Inc. Endotoxin-free polysaccharides
IT1219587B (it) 1988-05-13 1990-05-18 Fidia Farmaceutici Polisaccaridi carbossiilici autoreticolati
NO171069C (no) 1990-05-29 1993-01-20 Protan Biopolymer As Kovalent tverrbundne, sterkt svellende alkalimetall- og ammonium-alginatgeler, samt fremgangsmaate for fremstilling derav
WO1993013136A1 (en) 1991-12-20 1993-07-08 Howmedica Inc. Ultra-pure polysaccharide materials for medical use
JP2991923B2 (ja) 1994-03-19 1999-12-20 山陽特殊製鋼株式会社 被削性に優れたオーステナイト系ステンレス鋼
CA2162957C (en) 1994-11-17 2011-08-02 Michinori Waki Cinnamic acid derivative
JP3343181B2 (ja) 1995-09-20 2002-11-11 生化学工業株式会社 桂皮酸誘導体
JPH09324001A (ja) 1996-04-02 1997-12-16 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒアルロン酸ナトリウムの精製法
AU1726400A (en) 1998-11-13 2000-06-05 Cp Kelco U.S., Inc. Biopolymer salts with low endotoxin levels, biopolymer compositions thereof and methods of making the same
JP2005036036A (ja) 2003-07-16 2005-02-10 Tanabe Seiyaku Co Ltd エンドトキシン除去方法
DE602004027055D1 (de) 2003-09-12 2010-06-17 Seikagaku Kogyo Co Ltd Polysaccharid-pseudoschwamm
ITMI20061726A1 (it) 2006-09-11 2008-03-12 Fidia Farmaceutici Derivati crosslinkati a base di acido ialuronico reticolato via click chemistry
CN101200504B (zh) 2006-12-11 2010-05-12 上海百瑞吉生物医药有限公司 高分子巯基化改性衍生物及其交联材料
US8394782B2 (en) 2007-11-30 2013-03-12 Allergan, Inc. Polysaccharide gel formulation having increased longevity
FR2943344B1 (fr) * 2009-03-18 2011-04-15 Commissariat Energie Atomique Nouveaux composes silanes porteurs d'une chaine carbonee cyclique comprenant une fonction alcyne pour fonctionnaliser des supports solides et immobiliser sur ces supports des molecules biologiques
KR101103423B1 (ko) 2009-09-04 2012-01-06 아주대학교산학협력단 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤 및 이의 생의학적 용도
US20140256831A1 (en) 2011-05-31 2014-09-11 The University Of Tokyo Hydrogel and method for producing same
EP3354665B9 (en) * 2011-06-02 2022-08-03 Massachusetts Institute of Technology Modified alginates for cell encapsulation and cell therapy
CN102408498A (zh) 2011-09-16 2012-04-11 大连大学 一种透明质酸键合聚乙烯亚胺共聚物、其制备方法及应用
EP2599785A1 (en) 2011-11-30 2013-06-05 Agilent Technologies, Inc. Novel methods for the synthesis and purification of oligomers
WO2013148189A1 (en) * 2012-03-30 2013-10-03 Massachusetts Institute Of Technology Probe incorporation mediated by enzymes
WO2013181697A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 The University Of Melbourne Bicyclo[6.1.0]non-4-yne compounds suitable for use as linkers in biological applications
GB201300707D0 (en) 2013-01-15 2013-02-27 Novartis Ag Compounds and processes
JP2016172783A (ja) 2013-08-08 2016-09-29 生化学工業株式会社 組織膨隆材
WO2015065985A1 (en) * 2013-10-31 2015-05-07 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Chemical reagents for attaching affinity molecules on surfaces
BR202013028685U2 (pt) 2013-11-07 2015-10-20 Tecnident Equipamentos Ortodônticos Ltda disposição construtiva aplicada em bráquete autoligado
US10280183B2 (en) 2014-03-18 2019-05-07 The Research Foundation For The State University Of New York Therapeutic agent for treating tumors
CN105713108A (zh) 2014-12-05 2016-06-29 陈华 一种从橘皮中提取果胶的制备方法
JP6667179B2 (ja) 2015-03-24 2020-03-18 国立大学法人岐阜大学 オリゴヌクレオチド誘導体及びそれを用いたオリゴヌクレオチド構築物並びにそれらの製造方法
CN106140040B (zh) 2015-04-17 2019-01-18 南京理工大学 一种无铜点击交联多聚糖微球的制备方法
US10614039B2 (en) 2017-04-04 2020-04-07 International Business Machines Corporation Testing of lock managers in computing environments

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011504507A (ja) * 2007-11-21 2011-02-10 ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法
JP2013525425A (ja) * 2010-04-27 2013-06-20 シンアフィックス ビー．ブイ． 縮合シクロオクチン化合物及び無金属クリック反応におけるそれらの使用
CN102408496A (zh) * 2011-09-13 2012-04-11 武汉理工大学 一种原位交联海藻酸钠水凝胶及其制备方法
CN105713106A (zh) * 2015-12-31 2016-06-29 华南理工大学 一种海藻酸钠双交联水凝胶及其制备方法与应用
WO2017165389A2 (en) * 2016-03-24 2017-09-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Alginate hydrogel compositions

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Living functional hydrogels generated by bioorthogonal cross-linking reactions of azide-modified cells with alkyne-modified polymers;Nagahama K et al.;《NATURE COMMUNICATIONS》;20180606;第9卷;全文 *

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