CN106140040B - 一种无铜点击交联多聚糖微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无铜点击交联多聚糖微球的制备方法，步骤如下：室温下将壳聚糖和1‑羟基苯并三唑溶于水中，并将环辛炔‑3‑乙醇酸溶于四氢呋喃/水的混合溶剂中；将所得两种溶液混合后，加入二异丙基乙胺，搅拌反应，透析冻干得到环辛炔化壳聚糖；将海藻酸钠和碳化二亚胺溶于水中，加入11‑叠氮‑3,6,9‑三乙醚‑1‑胺，搅拌反应，透析冻干得到叠氮化海藻酸钠；分别配制环辛炔化壳聚糖和叠氮化海藻酸钠的水溶液，等体积比例混合后，加入含有乳化剂司班80的石蜡油中，超声乳化得乳化液；将乳化液挥发过夜，倒入异丙醇中析出微球，清洗后冷冻干燥得到交联多聚糖微球。本发明工艺简单、产品安全无毒，适用于药物释放、基因治疗和组织工程等医疗领域。
Description
技术领域
本发明属于生物材料的制备技术领域，特别是一种无铜点击交联多聚糖微球的制备方法。
背景技术
具有生物降解性能的微球材料可用于药物、蛋白或基因的包埋和释放，目前已广泛用于药物控释、组织工程和再生医学等领域的研究。选择合适的微球体系，可实现药物在体内的缓慢释放，达到理想的治疗效果。天然聚合物具有优异的生物相容性和可调的生物降解性，是制备微球的理想基体材料。常用的多聚糖包括：壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸、纤维素和肝素等。其中，壳聚糖和海藻酸是制备细胞和药物载体的理想材料，一方面它们价格低廉且具有良好的生物相容性，另一方面其分子链上具有多种可反应的活性官能团，可轻易通过接枝等改性手段进行化学修饰，能有效改善微球的性能和质量。
在组织工程和再生医学领域，多聚糖微球材料常用于包埋细胞生长因子和基因，以提高细胞支架的生物活性，增加支架在体内的组织诱导能力。采用生物相容性的交联手段，比如静电吸附等物理交联，可实现细胞生长因子在活性包埋。但是，物理交联手段难以得到具有稳定结构的多聚糖微球材料，无法实现细胞生长因子等活性蛋白药物在体内的稳定释放。此外，多聚糖微球在制备过程中也普遍使用化学交联剂，但这容易导致包埋的蛋白药物变性而失活，另外微球中残留的交联剂具有毒性，对人体会造成危害。最近发展了点击化学来交联多聚糖材料，其中均涉及到金属离子催化剂(如亚铜离子等)的使用，容易造成试剂残留，从而降低材料的细胞相容性和使用安全性。因此，避免使用有毒的金属催化剂，是提高微球细胞相容性的有效途径。
文献1(中成药，2014，36(3)：620～622)报道了以辣椒碱提取液为原料，制备了辣椒碱-壳聚糖/海藻酸钠微球，采用因素法优化了制备工艺，并研究了其体外缓释效果。最佳制备工艺条件为：海藻酸钠质量浓度为15g/L、氯化钙用量为4倍辣椒碱海藻酸钠混合液体积、壳聚糖用量为2倍辣椒碱海藻酸钠混合液体积、辣椒碱浓缩液质量浓度为1.49g/L，制备的辣椒碱-壳聚糖/海藻酸钠微球包封率达到43.6％，载药量为18.2mg/g。
文献2(解放军药学学报，2012，28(4)：311～314)报道了一种海藻酸钠-壳聚糖微球的合成及其在固定化凝血酶方面的应用，以液体石蜡与司班80的混合溶液为油相，1.5％海藻酸钠溶液为水相，壳聚糖醋酸(1％)溶液中加入适量的氯化钙作为交联剂，采用乳化交联法制备微球。将水相逐滴加入到油相中，搅拌成O/W型乳剂，将交联剂滴加到处于搅拌状态的乳剂中，滴毕继续搅拌30min，离心弃去上层油相，石油醚洗涤下层微球两次后，冷冻干燥。结果显示该微球具有一定的吸附凝血酶的能力。
文献3(高分子材料科学与工程，2007，23(1)：189～191)报道了一种磁性壳聚糖微粒材料用于负载5-氟尿嘧啶的研究，采用交联-聚合法，将四氧化三铁颗粒、5-氟尿嘧啶和100mL壳聚糖的醋酸溶液一起剧烈搅拌使其充分混合，然后在超声波的作用下，缓慢滴加到80mL的橄榄油和阴离子分散剂中，随后加入浓度50％的戊二醛溶液为交联剂，在60℃～90℃条件下反应1～2小时，得到了具有磁感应性能的纳米微球，测得其载药量为21.3％，药物包封率为55.4％，30小时内的累积释药率为67.6％。
文献4(Acta Biomaterialia，2011，7：1618～1626)合成了含有叠氮基团的透明质酸、硫酸软骨素和含有炔基的明胶。在氯化亚铜的催化下，通过叠氮基团和炔基的点击化学反应制备了具有软骨细胞外基质结构特征的仿生水凝胶。这种水凝胶具有较大的平衡溶胀比和典型弹性体的特征。水凝胶4周的失重为50％左右，两周内大约有20％的明胶和10％的硫酸软骨素从水凝胶中释放出来。水凝胶表面较为平整，软骨细胞可以在水凝胶表面能存活。
上述多聚糖的交联方法存在以下缺陷：
(1)含有海藻酸钠的微球多采用氯化钙进行离子交联，这种物理交联的多聚糖微球稳定性较差。由于在生理条件下，钙离子将不可避免与其它二价离子发生置换，这导致微球极易发生溶解而失去缓释能力。
(2)所制备的多聚糖微球或水凝胶多采用戊二醛或亚铜离子等化学试剂进行交联，这些化学交联剂具有细胞毒性，交联过程导致蛋白变性，毒性残留还将对人体产生毒副作用，难以进行临床使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速高效、生物相容性好的无铜点击交联多聚糖微球的制备方法。
实现本发明目的的技术解决方案为：一种无铜点击交联多聚糖微球的制备方法，以壳聚糖和海藻酸钠为基体材料，通过生物相容性点击交联成型，具体包括以下步骤：
步骤1、室温下将壳聚糖和1-羟基苯并三唑溶于水中；
步骤2、室温下将环辛炔-3-乙醇酸溶于四氢呋喃/水的混合溶剂中；
步骤3、室温下将步骤1和步骤2所得两种溶液混合后，加入二异丙基乙胺，搅拌反应，透析冻干得到环辛炔化壳聚糖；
步骤4、室温下将海藻酸钠和碳化二亚胺溶于水中，加入11-叠氮-3,6,9-三乙醚-1-胺，搅拌反应，透析冻干得到叠氮化海藻酸钠；
步骤5、分别配制环辛炔化壳聚糖和叠氮化海藻酸钠的水溶液，室温下等体积比例混合后，将该混合溶液加于5～20倍体积的含有乳化剂司班80的石蜡油中，超声乳化得乳化液；
步骤6、将乳化液室温搅拌挥发过夜，然后倒入异丙醇中析出微球，随后依次用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后冷冻干燥得到交联多聚糖微球。
优选地，步骤1所述壳聚糖与1-羟基苯并三唑为等质量比，二者的质量浓度均为0.05～0.15％。
优选地，步骤2中所述四氢呋喃/水的混合溶剂中的四氢呋喃与水的体积比为1:3，环辛炔-3-乙醇酸的质量浓度为0.5～1％。
优选地，步骤3中所述步骤1和步骤2所得两种溶液混合的体积比为1:1，二异丙基乙胺的质量浓度为0.05～0.2％，搅拌反应温度为0℃，搅拌反应时间为10～15小时，透析时间为2～3天。
优选地，步骤4中所述海藻酸钠的质量浓度为0.2％，海藻酸钠与碳化二亚胺的质量比例为1:1～1:3，海藻酸钠与11-叠氮-3,6,9-三乙醚-1-胺的质量比例为1:1～1:3，搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为22～26小时，透析时间为2～3天。
优选地，步骤5所述配制的环辛炔化壳聚糖水溶液和叠氮化海藻酸钠水溶液的质量浓度均为0.5％～1.5％，所述含有乳化剂司班80的石蜡油中乳化剂司班80的体积是石蜡油的1/20～1/10，超声乳化时间为2～5分钟。
本发明与现有技术相比，其显著优点是：(1)采用快速点击交联，对壳聚糖和海藻酸钠分别进行改性处理，使它们各自带有可以进行反应的活性基团，混合后能在温和条件下自动交联成型；(2)避免使用毒性铜催化剂，因此微球中不存在铜离子的残留，保证了支架的细胞相容性和使用安全性；(3)具有交联温度低、固化速度快、操作安全、原材料成本低廉等优点，适合商业化生产。
附图说明
图1为本发明采用无铜催化点击交联多聚糖微球的示意图。
图2为本发明实施例1多聚糖微球的扫描电镜图。
图3为本发明实施例1多聚糖微球的粒径分布图。
图4为本发明实施例1多聚糖微球的失重率曲线图。
图5为本发明实施例1多聚糖微球的溶胀率曲线图。
图6为本发明实施例1多糖微球与成纤维细胞共培养7天后的活性与传统铜催化微球的对照图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但这些实例并不用来限制本发明。
本发明采用的壳聚糖和海藻酸的分子结构中分别含有氨基和羧基，本发明所述制备方法是通过将壳聚糖和海藻酸的分子结构中含有的氨基和羧基进行改性反应，同理含有氨基和羧基的其它天然高分子材料亦可反应。
本发明无铜点击交联多聚糖微球的制备方法，以壳聚糖和海藻酸钠为基体材料，通过生物相容性点击交联成型，具体包括以下步骤：
步骤1、室温下将壳聚糖和1-羟基苯并三唑溶于水中，所述壳聚糖与1-羟基苯并三唑为等质量比，二者的质量浓度均为0.05～0.15％；
步骤2、室温下将环辛炔-3-乙醇酸溶于四氢呋喃/水的混合溶剂中，所述四氢呋喃/水的混合溶剂中的四氢呋喃与水的体积比为1:3，环辛炔-3-乙醇酸的质量浓度为0.5～1％；
步骤3、室温下将步骤1和步骤2所得两种溶液按照体积比1:1混合后，加入二异丙基乙胺，二异丙基乙胺的质量浓度为0.05～0.2％，0℃温度条件下搅拌反应10～15小时，透析2～3天，冻干得到环辛炔化壳聚糖；
步骤4、室温下将质量比例为1:1～1:3的海藻酸钠和碳化二亚胺溶于水中，所述海藻酸钠的质量浓度为0.2％，加入11-叠氮-3,6,9-三乙醚-1-胺，海藻酸钠与11-叠氮-3,6,9-三乙醚-1-胺的质量比例为1:1～1:3，室温下搅拌反应22～26小时，透析2～3天，冻干得到叠氮化海藻酸钠；
步骤5、分别配制质量浓度为0.5％～1.5％的环辛炔化壳聚糖水溶液和叠氮化海藻酸钠的水溶液，室温下等体积比例混合后，将该混合溶液加于5～20倍体积的含有乳化剂司班80的石蜡油中，所述含有乳化剂司班80的石蜡油中乳化剂司班80的体积是石蜡油的1/20～1/10，超声乳化2～5分钟得乳化液；
步骤6、将乳化液室温搅拌挥发过夜，然后倒入异丙醇中析出微球，随后依次用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后冷冻干燥得到交联多聚糖微球。
本发明实施例中使用的原料试剂和表征参数如下：
(1)原料和试剂：壳聚糖、海藻酸钠、1-羟基苯并三唑、二异丙基乙胺、水溶性碳化二亚胺、11-叠氮-3,6,9-三乙醚-1-胺、3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，购于Sigma公司；氯化钠、氯化钾，分析纯，上海试剂三厂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，分析纯，杭州化学试剂有限公司；二甲基亚砜、十二烷基磺酸钠，分析纯，上海化学试剂厂。3T3成纤维细胞，购于上海博谷生物科技有限公司。DMEM培养基，购于美国Giboco公司。
(2)磷酸盐缓冲溶液(PBS)的配制：称取分析纯氯化钠8克、氯化钾0.2克、磷酸氢二钠2.9克、磷酸二氢钾0.2克，溶于1000毫升蒸馏水中，调节pH为7.4。
(3)微球形貌观察：经-50℃冷冻干燥(FD-1A-50，北京博医康)24小时后，将微球喷金(Cressington 108Auto)，然后在扫描电子显微镜(JSM-6330F,JEOL)上观察微球形貌。
(4)微球的体外失重：准确称取一定量微球(W0)，置于离心管中并浸泡在37℃的PBS中，隔一段时间取样品进行离心称量(Wt)，每个样品平行测试5次。按公式(W0–Wt)/W0×100％计算一定时间下微球的失重百分率，式中W0是微球的最初重量，Wt是微球于PBS中孵化处理后的干重。
(5)微球的体外吸水性：准确称取一定量微球(Wd)，置于离心管中并浸泡在37℃的PBS中，隔一段时间取样品进行离心称量(Ww)，每个样品平行测试5次。计算支架吸水性能的公式为(Ww–Wd)/Wd。
(6)微球的细胞相容性：准确称取50mg微球置于离心管中用75％乙醇浸泡2小时消毒，然后用磷酸盐缓冲溶液反复漂洗除去乙醇；在离心管中接种数量为2×104的3T3成纤维细胞，与微球共培养，将其放于37℃下孵育，7天后加入浓度为0.5wt％的MTT溶液，孵育4小时后加入二甲基亚砜，振荡均匀后采用酶标仪(Biorad，Model 550)于570纳米处测定紫色物质的吸光度。
本发明采用ANOVA方差分析法分析实验数据，显著差异值p设为≤0.05。
实施例1
具体操作步骤为：
(1)室温下将0.05克壳聚糖和0.05克1-羟基苯并三唑溶于100毫升水中；
(2)室温下将0.5克环辛炔-3-乙醇酸溶于100毫升四氢呋喃/水(体积比1:3)的混合溶剂中；
(3)室温下将(1)和(2)所得两种溶液充分混合，加入0.1克二异丙基乙胺，在0℃条件下搅拌反应10小时，透析2天后冻干，得到环辛炔化壳聚糖(结构示意图见图1)；
(4)室温下将0.2克海藻酸钠和0.2克水溶性碳化二亚胺溶于100毫升水中，再加入0.2毫升11-叠氮-3,6,9-三乙醚-1-胺，室温搅拌反应22小时，透析2天后冻干，得到叠氮化海藻酸钠(结构示意图见图1)；
(5)分别配制质量浓度为0.5％的环辛炔化壳聚糖水溶液和叠氮化海藻酸钠水溶液，室温下各取1毫升等体积充分混合，再将该混合溶液加于40毫升含有乳化剂司班80的石蜡油中，其中司班80的体积4毫升，超声乳化5分钟得乳化液；
(6)将步骤(5)得到的乳化液以1000rpm搅拌挥发过夜，然后将乳液倒入异丙醇中析出微球，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后冻干得到交联多聚糖微球。所得聚合物微球的形貌见图2，成球性好，直径为10～80μm，呈正态分布，平均直径为44μm，见图3。
测定所得微球的体外失重，随时间变化的失重率见图4。从图中可以看出培养14天后，该微观的失重率为13％左右，结构稳定，满足临床应用。
测定所得微球的吸水率，随时间变化的吸水率见图5，从图中可以看出该微球具有一定的吸水能力，可吸收相当于自身重量1.6～2.7倍的液体。
测定所得微球的细胞相容性，第7天的细胞活性见图6，从图中可以看出无铜点击微球的细胞活性显著高于采用铜催化微球，证明本发明所制备的微球更适用于临床治疗。
实施例2
具体操作步骤为：
(1)室温下将0.08克壳聚糖和0.08克1-羟基苯并三唑溶于100毫升水中；
(2)室温下将0.6克环辛炔-3-乙醇酸溶于100毫升四氢呋喃/水(体积比1:3)的混合溶剂中；
(3)温下将(1)和(2)所得两种溶液充分混合，加入0.15克二异丙基乙胺，在0℃条件下搅拌反应11小时，透析2天后冻干，得到环辛炔化壳聚糖；
(4)室温下将0.2克海藻酸钠和0.5克水溶性碳化二亚胺溶于100毫升水中，再加入0.35毫升11-叠氮-3,6,9-三乙醚-1-胺，室温搅拌反应23小时，透析2天后冻干，得到叠氮化海藻酸钠；
(5)分别配制质量浓度为0.6％的环辛炔化壳聚糖水溶液和叠氮化海藻酸钠水溶液，室温下各取1.5毫升等体积充分混合，再将该混合溶液加于40毫升含有乳化剂司班80的石蜡油中，其中司班80的体积3毫升，超声乳化4分钟得乳化液；
(6)将乳化液以800rpm搅拌挥发过夜，然后将乳液倒入异丙醇中析出微球，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后冻干得到交联多聚糖微球。
实施例3
具体操作步骤为：
(1)室温下将0.1克壳聚糖和0.1克1-羟基苯并三唑溶于100毫升水中；
(2)室温下将0.7克环辛炔-3-乙醇酸溶于100毫升四氢呋喃/水(体积比1:3)的混合溶剂中；
(3)温下将(1)和(2)所得两种溶液充分混合，加入0.2克二异丙基乙胺，在0℃条件下搅拌反应12小时，透析2.5天后冻干，得到环辛炔化壳聚糖；
(4)室温下将0.2克海藻酸钠和0.6克水溶性碳化二亚胺溶于100毫升水中，再加入0.6毫升11-叠氮-3,6,9-三乙醚-1-胺，室温搅拌反应24小时，透析2.5天后冻干，得到叠氮化海藻酸钠；
(5)分别配制质量浓度为0.8％的环辛炔化壳聚糖水溶液和叠氮化海藻酸钠水溶液，室温下各取2毫升等体积充分混合，再将该混合溶液加于40毫升含有乳化剂司班80的石蜡油中，其中司班80的体积3毫升，超声乳化4分钟得乳化液；
(6)将乳化液以900rpm搅拌挥发过夜，然后将乳液倒入异丙醇中析出微球，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后冻干得到交联多聚糖微球。
实施例4
具体操作步骤为：
(1)室温下将0.12克壳聚糖和0.12克1-羟基苯并三唑溶于100毫升水中；
(2)室温下将0.8克环辛炔-3-乙醇酸溶于100毫升四氢呋喃/水(体积比1:3)的混合溶剂中；
(3)温下将(1)和(2)所得两种溶液充分混合，加入0.25克二异丙基乙胺，在0℃条件下搅拌反应13小时，透析2.5天后冻干，得到环辛炔化壳聚糖；
(4)室温下将0.2克海藻酸钠和0.4克水溶性碳化二亚胺溶于100毫升水中，再加入0.5毫升11-叠氮-3,6,9-三乙醚-1-胺，室温搅拌反应25小时，透析2.5天后冻干，得到叠氮化海藻酸钠；
(5)分别配制质量浓度为1.0％的环辛炔化壳聚糖水溶液和叠氮化海藻酸钠水溶液，室温下各取2.5毫升等体积充分混合，再将该混合溶液加于40毫升含有乳化剂司班80的石蜡油中，其中司班80的体积3毫升，超声乳化3分钟得乳化液；
(6)将乳化液以1100rpm搅拌挥发过夜，然后将乳液倒入异丙醇中析出微球，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后冻干得到交联多聚糖微球。
实施例5
具体操作步骤为：
(1)室温下将0.12克壳聚糖和0.12克1-羟基苯并三唑溶于100毫升水中；
(2)室温下将0.9克环辛炔-3-乙醇酸溶于100毫升四氢呋喃/水(体积比1:3)的混合溶剂中；
(3)温下将(1)和(2)所得两种溶液充分混合，加入0.35克二异丙基乙胺，在0℃条件下搅拌反应14小时，透析3天后冻干，得到环辛炔化壳聚糖；
(4)室温下将0.2克海藻酸钠和0.3克水溶性碳化二亚胺溶于100毫升水中，再加入0.3毫升11-叠氮-3,6,9-三乙醚-1-胺，室温搅拌反应26小时，透析3天后冻干，得到叠氮化海藻酸钠；
(5)分别配制质量浓度为1.2％的环辛炔化壳聚糖水溶液和叠氮化海藻酸钠水溶液，室温下各取3毫升等体积充分混合，再将该混合溶液加于40毫升含有乳化剂司班80的石蜡油中，其中司班80的体积2毫升，超声乳化3分钟得乳化液；
(6)将乳化液以1200rpm搅拌挥发过夜，然后将乳液倒入异丙醇中析出微球，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后冻干得到交联多聚糖微球。
实施例6
具体操作步骤为：
(1)室温下将0.15克壳聚糖和0.15克1-羟基苯并三唑溶于100毫升水中；
(2)室温下将1克环辛炔-3-乙醇酸溶于100毫升四氢呋喃/水(体积比1:3)的混合溶剂中；
(3)温下将(1)和(2)所得两种溶液充分混合，加入0.4克二异丙基乙胺，在0℃条件下搅拌反应15小时，透析3天后冻干，得到环辛炔化壳聚糖；
(4)室温下将0.2克海藻酸钠和0.35克水溶性碳化二亚胺溶于100毫升水中，再加入0.4毫升11-叠氮-3,6,9-三乙醚-1-胺，室温搅拌反应26小时，透析3天后冻干，得到叠氮化海藻酸钠；
(5)分别配制质量浓度为1.5％的环辛炔化壳聚糖水溶液和叠氮化海藻酸钠水溶液，室温下各取4毫升等体积充分混合，再将其加于40毫升含有乳化剂司班80的石蜡油中，其中司班80的体积2毫升，超声乳化2分钟得乳化液；
(6)将乳化液以1500rpm搅拌挥发过夜，然后将乳液倒入异丙醇中析出微球，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后冻干得到交联多聚糖微球。
以上实施例涵盖了最具代表性的实验数据。综上，本发明以天然多聚糖—壳聚糖和海藻酸钠为基体材料，通过化学接枝技术，分别对壳聚糖和海藻酸进行改性处理，使它们各自带有环辛炔和叠氮基团，使之能在生理条件下发生点击交联，形成稳定的微球结构。与传统的铜催化点击交联方法相比，本发明采用的方法为无铜点击交联，避免使用了毒性亚铜离子催化剂，能显著改善微球材料的细胞相容性能，提高了材料的使用安全性。本发明工艺简单、成本低廉、交联温度低，适用于药物释放、基因治疗和组织工程等医疗领域。
Claims (1)
1.一种无铜点击交联多聚糖微球的制备方法，其特征在于，以壳聚糖和海藻酸钠为基体材料，通过生物相容性点击交联成型，具体包括以下步骤：
步骤1、室温下将壳聚糖和1-羟基苯并三唑溶于水中；
步骤2、室温下将环辛炔-3-乙醇酸溶于四氢呋喃/水的混合溶剂中；
步骤3、室温下将步骤1和步骤2所得两种溶液混合后，加入二异丙基乙胺，搅拌反应，透析冻干得到环辛炔化壳聚糖；
步骤4、室温下将海藻酸钠和碳化二亚胺溶于水中，加入11-叠氮-3,6,9-三乙醚-1-胺，搅拌反应，透析冻干得到叠氮化海藻酸钠；
步骤5、分别配制环辛炔化壳聚糖和叠氮化海藻酸钠的水溶液，室温下等体积比例混合后，将该混合溶液加于5～20倍体积的含有乳化剂司班80的石蜡油中，超声乳化得乳化液；
步骤6、将乳化液室温搅拌挥发过夜，然后倒入异丙醇中析出微球，随后依次用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后冷冻干燥得到交联多聚糖微球；
步骤1所述壳聚糖与1-羟基苯并三唑为等质量比，二者的质量浓度均为0.05～0.15％；
步骤2中所述四氢呋喃/水的混合溶剂中的四氢呋喃与水的体积比为1:3，环辛炔-3-乙醇酸的质量浓度为0.5～1％；
步骤3中所述步骤1和步骤2所得两种溶液混合的体积比为1:1，二异丙基乙胺的质量浓度为0.05～0.2％，搅拌反应温度为0℃，搅拌反应时间为10～15小时，透析时间为2～3天；
步骤4中所述海藻酸钠的质量浓度为0.2％，海藻酸钠与碳化二亚胺的质量比例为1:1～1:3，海藻酸钠与11-叠氮-3,6,9-三乙醚-1-胺的质量比例为1:1～1:3，搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为22～26小时，透析时间为2～3天；
步骤5所述配制的环辛炔化壳聚糖水溶液和叠氮化海藻酸钠水溶液的质量浓度均为0.5％～1.5％，所述含有乳化剂司班80的石蜡油中乳化剂司班80的体积是石蜡油的1/20～1/10，超声乳化时间为2～5分钟。
Priority Applications (1)
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